Recherche fondamentale
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- Système urogénital
Evaluation d’un anticorps bloquant la dégradation du vWF dans le cadre d’une procédure d’assistance circulatoire mécanique chez le porc
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
33 mini-porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, trente d'entre eux étant opérés sous anesthésie sans réveil et tués, les trois autres réutilisés pour d'autres études ou l'enseignement. Chaque animal subit une chirurgie de la veine jugulaire, trente recevant en plus une assistance circulatoire mécanique implantée. L'objet est de tester un anticorps censé limiter les hémorragies liées à ces dispositifs de soutien cardiaque. Le porteur affirme que la dégradation du facteur von Willebrand sous assistance circulatoire ne peut pas s'étudier in vitro.
Objectifs
Les dispositifs d'assistance circulatoire mécanique (ACM) ont révolutionné le traitement de l'insuffisance cardiaque et respiratoire. Un nombre croissant de dispositifs peuvent fournir une assistance circulatoire mécanique aux patients souffrant de complications hémodynamiques aiguës et d'insuffisance cardiaque chronique terminale et sauver des vies. En raison de son efficacité (survie globale de 50 %), l'utilisation de l'ECMO (dispositifs d'oxygénation extracorporelle) a augmenté rapidement au cours des quinze dernières années (30 000 procédures/an), mais elle est confrontée à un risque très élevé de complications hémorragiques majeures et potentiellement mortelles (50 %). Les altérations fonctionnelles du facteur de von Willebrand (vWF) contribue aux saignements. Des études menées chez des patients atteints de la maladie de von Willebrand ont montré que les concentrés contenant du vWF ont une efficacité limitée en raison de la courte demi-vie du vWF. Par conséquent, il est nécessaire de développer de nouvelles stratégies de traitement pour prévenir les saignements chez ces patients recevant une ACM. Nous avons développé un anticorps monoclonal de souris interférant avec le clivage du vWF, anticorps que nous avons pu humaniser. Les caractéristiques de cet anticorps permettent une large fenêtre thérapeutique potentielle évitant le risque de thrombose. Des études préliminaires menées ex-vivo nous ont apporté des données sur les capacités de restauration du vWF par cet anticorps. Le but de notre projet est d’évaluer in vivo l’efficacité de cet anticorps dans l’inhibition de la dégradation du vWF dans un modèle animal avec implantation d’une assistance circulatoire. Notre étude sera réalisée chez le porc, espèce reconnue par les sociétés savantes dans les études impliquant des pompes ACM. De plus, le modèle porcin possède une très grande proximité avec l’Homme d’un point de vue hémostase avec la capacité d’effectuer des prélèvements sanguins conséquents et répétés.
Bénéfices attendus
L'objectif de ce projet est de développer de nouvelles stratégies de traitement des complications hémorragiques lors de l'implantation d'une assistance circulatoire mécanique. Ces données chez l’animal viendront constituer une partie du dossier efficacité/sécurité permettant de déposer des demandes d’autorisation d’étude clinique.
Procédures
Les 33 animaux auront une procédure chirurgicale : 3 pour la pose d'une voie centrale jugulaire afin d'injecter des molécules et afin d'effectuer des prélèvements sanguins répétés sur 3 heures. 30 pour la pose d'une voie centrale jugulaire et l'implantation d'une assistance circulatoire mécanique. Une seule intervention chirurgicale sera réalisée par animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances expérimentales directes attendues suite à l’injection d’une molécule d’origine humaine et à la mise en place chirurgicale du dispositif d’assistance circulatoire sont une allergie qui se traduirait par de la fièvre ou l’apparition de boutons, le développement d’un caillot de sang ou un risque de saignement excessif pouvant conduire à une douleur et un stress physique de l’animal.
Devenir
Sur les 33 animaux utilisés, 3 seront utilisés dans d’autres études sans implication cardio-vasculaire ou pour l’enseignement. Les 30 autres animaux seront mis à mort.
Remplacement
Les variations plasmatiques du vWF dépend de son niveau de sécrétion endothéliale (modulée par la pulsatilité artérielle) et de sa protéolyse (modulée par les forces de cisaillement). Il n’est pas possible d’étudier in vitro la protéolyse du vWF sous assistance circulatoire. Une étude in vivo est nécessaire afin d’évaluer l’efficacité de notre anticorps sur la dégradation du vWF dans la circulation et en présence de forces de cisaillement.
Réduction
Dans la procédure 1, 3 animaux sera nécessaire et suffisant pour déterminer la dose optimale de vWF humain à injecter pour être efficace. Pour les procédures 2 et 3 le nombre suffisant d'animaux pour pouvoir réussir à mettre en évidence un effet statistiquement significatif = 5 animaux par groupe minimum. Le choix orienté sur 7 animaux par groupe permet de palier toute défaillance technique, soit au total 42 animaux pour ces 2 procédures.
Raffinement
Le "Raffinement" est envisagé en réalisant un maximum de prélèvements sanguins par individu ainsi qu'en étant attentif à leur bien-être en utilisant des traitements analgésiques avant et pendant toute chirurgie ainsi qu'à leur conditions d'hébergement.
Choix des espèces
Le modèle porcin est le modèle de référence pour tester les dispositifs d'assistance circulatoire mécanique. Le porc présente en effet une physiologie cardiovasculaire et un profil d'hémocompatibilité proche de l'homme. Les axes vasculaires sont d'un calibre suffisant et faciles d'accès. Par ailleurs, notre laboratoire a l'expertise de l'exploration biologique du facteur de von Willebrand chez le porc Mini porcs jeunes adultes de 25 à 30 kg
Etude dynamique de l’implication des interactions neurone-astrocyte dans la genèse de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Transgéniques et porteuses de mutations humaines de la maladie d'Alzheimer, elles reçoivent une injection intraveineuse unique sous anesthésie, sont hébergées quatre semaines puis tuées. L'objet est d'étudier les interactions entre neurones et astrocytes aux stades précoces de la maladie. Le porteur affirme que ce réseau cérébral ne peut être remplacé par des cultures cellulaires.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer est la plus fréquente des maladies neurodégénératives (900 000 personnes atteintes en France en 2021). Elle est caractérisée par une évolution lente mais progressive de l'atteinte neuronale affectant les capacités de mémorisation des patients réduisant progressivement leur autonomie. Cette pathologie complexe est liée à un dysfonctionnement des connections entre neurones qui aboutit à la dégénérescence des neurones de l'hippocampe (structure du cerveau impliquée dans la mémoire) puis de l'ensemble du cerveau. Les patients doivent endurer une perte irréversible de leurs fonctions cognitives puisqu'à l'heure actuelle, aucun traitement ne permet de stopper l'évolution de la pathologie. Nous avons récemment identifié un stade auquel on peut stopper la progression de la maladie avec une substance pharmacologique originale. Ceci nous a permis de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la mise en place de la maladie et nous souhaitons compléter cette étude par un aspect plus structural, permettant une étude morphologique à l’échelle nanométrique des structures impliquées dans la communication neuronale (synapses). Pour cela, nous avons besoin de visualiser les structures d’intérêt et donc d’injecter aux souris des constructions permettant cette visualisation, sans dommage pour l’animal.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier les défauts structuraux accompagnant les défauts fonctionnels que nous avons précédemment mis en évidence. Il permettra une étude à l’échelle de la synapse de la communication cellulaire se produisant au sein du cerveau et des dysfonctions précoces associées à la maladie d’Alzheimer. Une compréhension globale de ces mécanismes précoces permettra de renforcer le développement de stratégies thérapeutiques innovantes neuroprotectrices.
Procédures
Injection intraveineuse unique sous anesthésie générale. Chaque injection dure quelques secondes.
Impact sur les animaux
L’injection intraveineuse peut éventuellement induire une douleur légère au point d’injection et un inconfort pour l’animal. Pour prévenir cela, ce geste sera réalisé sous anesthésie générale.
Devenir
A l’issue de la procédure, les animaux seront stabulés pendant 4 semaines puis mis à mort.
Remplacement
Notre approche méthodologique permet d'avoir accès à l’activité d’une structure dans un réseau complexe au sein du cerveau. Ce modèle ne peut être remplacé par des modèles de culture cellulaire ou d’autres approches in vitro. De plus, la souris permet d’avoir accès à des lignées transgéniques modèles de la pathologie humaine. La similarité moléculaire, cellulaire et fonctionnelle des circuits impliqués dans les processus de mémoire chez la souris en fait un modèle de choix pour ce projet.
Réduction
Plusieurs mesures sont appliquées pour réduire le nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Grâce à une approche statistique, le nombre d'animaux sera limité au minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet.
Raffinement
L’injection intraveineuse en rétro-orbitale peut éventuellement induire une douleur légère au point d’injection et une gêne pour l’animal. Pour prévenir cela, les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane le temps de l’injection (quelques secondes). Les animaux seront élevés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement. Ainsi, les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé avec accès à volonté à l’eau et à la nourriture et présence d’enrichissements dans les cages. Les conditions d'hébergement vont être identiques et homogènes pour tous les groupes qui seront hébergés dans la même pièce. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long des procédures. Des échelles de cotation de la souffrance basées sur des signes indicatifs de gêne et de douleur seront utilisées afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de définir les points limites, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible les mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l’animal.
Choix des espèces
Le modèle souris permet d’avoir accès à des modèles transgéniques mimant certaines pathologies humaines. Dans notre cas, l'existence de modèles transgéniques murins exprimant des mutations humaines de deux protéines impliquées dans les formes familiales génétiques de la maladie et responsables d’une surproduction d'une protéine toxique, permet de mimer la maladie d’Alzheimer et de l'étudier dès les stades précoces asymptomatiques. Cette lignée permet l’utilisation de contrôles issus de la même portée. De plus, la similarité moléculaire, cellulaire et fonctionnelle des circuits impliqués dans les processus mnésiques, notamment l’hippocampe, en fait un modèle de choix pour ce projet. Les animaux seront injectés dès 1 mois post-natal et jusqu’à 2 mois post-natal.
Traitement de la décompensation aigue de l’insuffisance cardiaque chronique
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
388 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une partie subit une ligature chirurgicale d'une artère du cœur pour provoquer un infarctus, geste dont le porteur attend une mortalité de 20 à 30 %, suivie d'un gavage salé pour déclencher une décompensation cardiaque puis d'un cathétérisme qui sert de mise à mort. L'objet est de tester trois molécules sur l'insuffisance cardiaque aiguë décompensée, qui n'a pas de traitement. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne reproduit cette pathologie multifactorielle.
Objectifs
L’insuffisance cardiaque aiguë décompensée (ICAD) représente un challenge thérapeutique majeur puisque, à ce jour, il n'existe pas de traitement. Notre hypothèse est que l'altération du métabolisme énergétique du cœur contribue à aggraver la dysfonction cardiaque menant à l’ICAD. En utilisant un modèle expérimental d’ICAD chez le rat, nous allons déterminer si des traitements pharmacologiques améliorant le métabolisme énergétique cardiaque préviennent la dysfonction cardiaque liée à l'ICAD. Ce projet, en ciblant le métabolisme énergétique cardiaque au cours de l'ICAD, permettra d’approfondir la compréhension des mécanismes physiopathologiques impliqués avec l’objectif de développer de nouvelles stratégies pharmacologiques pour améliorer la prise en charge et le pronostic des patients.
Bénéfices attendus
L'insuffisance cardiaque chronique est une maladie sévère touchant en Europe environ 6.5 millions de patients. Malgré les traitements actuels, l'insuffisance cardiaque chronique reste la première cause de mortalité parmi les maladies cardiovasculaires en France avec 32 000 morts prématurées chaque année. Cette morbi-mortalité élevée est due au fait que les traitements actuels n’empêchent pas la complication majeure de l'insuffiance cardiaque chronique : la décompensation aiguë. Cette dernière représente un challenge thérapeutique majeur puisque les traitements actuels de l’insuffiance cardique sont inefficaces sur celle-ci. Notre hypothèse est que l’altération du métabolisme énergétique cardiaque est un élément déclencheur de la dysfonction cardiaque lors de la décompensation aiguë de l'insuffisance cardiaque. Le but ultime de cette recherche est de démontrer que des traitements visant l’amélioration du métabolisme énergétique cardiaque pourrait donc constituer une nouvelle cible dans la décompensation aigue de l’insuffisance cardiaque. Nous espérons que cette recherche permettra la mise en place d’une nouvelle classe de traitements permettant de limiter le développement de la décompensation aiguë de l’insuffisance cardiaque chez des patients.
Procédures
Les animaux Wistar de la procédure 1 subiront une procédure chirurgicale (ligature coronaire) pour induire un infarctus du myocarde (n=258 ). Des prélèvements sanguins seront effectués une fois par mois sur tous les animaux de la procédure 1 et 2 sous-anesthésie gazeuse (isoflurane 2 %) de courte durée. Sur les rats survivants de la procédure 1 et les rats ZSF-1, un gavage en NaCl permettra d'induire la décompensation aigue. A ce moment, sera initié des traitements innovants (3 molécules) qui serons sans la nouriture donc voie peros et l'analyse des effets fonctionnels (IRM et échocardiographie cardiaque) sera effectué sous anesthésie pour une durée de 10 minutes/rat. La fonction rénale sera évaluée sous anesthésie gazeuse de 10 minutes/rat maximum pour l'injection du traceur fluorescent suivie d'un test à l'effort (durée 20 minutes) qui sera effectué dans la procédure 1 et 2 sur les animaux vigiles. Le protocole invasif (cathétérisme cardiaque) sera réalise sur des animaux profondément anethésiés et sera sans réveil.
Impact sur les animaux
La première procédure est classée sévère et la deuxième est classée modérée. Les deux procédures mènent à une insuffisance cardiaque. La première procédure est réalisée par une chirurgie cardiaque et la deuxième est induite génétiquement. La chirurgie dans la procédure 1 qui est une ligature coronaire entraine un taux de mortalité de 20% à 48h suivant la chirurgie et au court des 3 mois après ligature peut entrainer une mortalité de 20 à 30%. Il faut aussi tenir en compte que la mortalité après la décompensation par le NaCl dans nos deux modèles peut entraine une mortalité de 10%. Comme décrit dans la littérature la ligature coronaire est une chirurgie qui entraine un taux de mortalité important même avec une maitrise du geste donc pour un nombre attendu de 15 animaux dans chaque sous-groupe nous prenons en compte un pourcentage de mortalité de 30%, comme référer dans la littérature . Les naissances des tests d'effort sont une fatigue de l'animal qui est évalué par des chocs électriques, mais tout cela est prise en compte avec une fiche procédure qui d'écrit les points limite du test. Arrêt du test à l'effort au bout de 3 chocs électriques en 30 secondes ou de 5 chocs électrique en 1 minute. On replace l'animal dans sa cage une fois le test fini ou les points limite définie dans le protocole dépasser. Pour le cathétérisme cardiaque, l'animal subira une chirurgie pour insertion d'un capteur de pression dans la carotide pour obtenir les pressions volume au niveau du cœur du rat, chaque animal sera mise à mort à la fin du test. Il se peut que l'animal décède lors du test ce cathétérisme cardiaque.
Devenir
Pour les deux procédures tous les animaux seront mis à mort suite à l'évaluation invasive par cathétérisme cardique.
Remplacement
Dans l’objectif de limiter le nombre d'animaux utilisés dans ce projet, nous mettrons en place certaines expériences in-vitro (tests de prolifération de cellules, interactions cellules-cellules). Cependant, l’utilisation des animaux est rendue nécessaire, car il n’existe pas à ce jour de modèle de décompensation aiguë de l’insuffisance cardiaque in-vitro. Cela n'est pas possible d'appliquer des modèles alternatif puisque le développement de la dysfonction est multifactoriel et aucun approche in silico, in-vitro ou ex vivo ne permet l'implication de tout, c'est facteur dans le développement pour l'étude de ce type de médicament avec une visée cardiovasculaire.
Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude, nous réaliserons séquentiellement des mesures non-invasives de la fonction cardiaque par échographie, IRM, de la fonction rénale, de la capacité d'exercice puis une mesure invasive hémodynamique. A la phase terminale nous avons également mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses ex vivo au moment de la mise à mort. De plus, nous avllons réalisé des tests statistiques appropriés pour calculer le nombre de rats nécessaires afin de détecter une différence de 10% . Nos expériences dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=15 sont nécessaires pour des évaluations fonctionnelles telles que l’échocardiographie. Notamment, l’analyse répétée en échocardiographie / IRM sur le même animal au cours d’une étude permet également de diminuer le nombre d’animaux par groupe nécessaire pour démontrer un effet significatif. Une meilleure survie post-opératoire permet de limiter le nombre d'animaux par groupe dans le modèle d'infractus du myocarde. Les données et prélèvements obtenus des animaux témoins sains et des contrôles (infarctus du myocarde par ligature coronaire sans gavage au NaCl) seront réutilisés entre études pour limiter le nombre d'animaux. Nous allons d'abord évaluer les effets a court termegavage au NaCl, avec un mise à mort pour le groupe 1 à J3 et pour le groupe 2 et 3 à J14.
Raffinement
Tout au long de l’étude, les animaux seront nourris ad libitum et hébergés en groupes sociaux stables dans des portoirs conventionnés au nombre maximum de 4 par cage avec de l’enrichissement (Tunel,Kraft Paper). Les animaux seront maintenus avec un environnement controlé et stabilisé. Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation d’une semaine après réception des rats sera maintenue avant le début du protocole. Les conditions de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Ainsi, un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée du protocole expérimental, ce qui permettra de déceler un éventuel signe de souffrance. Les rats perdant plus de 15 à 20% de leur poids seront euthanasiés. Pendant la chirugie, nous injectons une solution saline en sous- cûtanée pour maintenir l'hydratation de nos animaux. En post- opératoire une injection de glucose à 5% en IP est réalisée en ainsi qu'un ajout dans la cage de nourriture gélifiée qui aide l'animal à mieux se nourrir. Un traitement analgésique en pré-opératoire et en pré et post-opératoire, soit immédiatement après la chirurgie est réalisé suivi d'une injection toutes les 8h pendant 24h qui suivent l’opération. Nous allons dans ce projet utiliser essentiellement des rats mâles, ce qui diminuera les variations dans les réponses immunitaires, et permettra une meilleure comparaison entre nos modèles.
Choix des espèces
Les expériences, in vivo, ne peuvent pas être remplacées par des études in-vitro à cause de la complexité de la pathogenèse de l’insuffisance cardiaque, qui nécessite des études fonctionnelles et physiopathologiques. En effet, des études dans notre modèle animal sont nécessaires pour comprendre les altérations globales cardiaques lors de la décompensation cardiaque (altérations simultanées des lymphatiques, des cellules immunitaires, des fibroblastes et du métabolisme des cardiomyocytes). Ainsi, les procédures expérimentales ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les rats mâles Wistar jeunes adultes (200-220g) seront utilisés pour induire l'infarctus du myocarde. Cet âge est justifié par la meilleure résistance des animaux à la procédure de ligature coronaire permettant de ne pas augmenter le nombre d'animaux utilisés. Les Rats mâles ZSF-1 jeunes adultes arriveront à l'âge de 6 semaines pour une question de coût, mais seront utilisés à l'age de 24 semaines pour que la maladie cardiaque ait le temps de se développer.
Etude du role du collagène XVIII dans la formation/fonction des plaquettes
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la moitié menée sous anesthésie sans réveil. Génétiquement modifiées, elles reçoivent des injections répétées, des prélèvements sanguins sous anesthésie et des modèles de thrombose induits sans réveil. L'objet est d'étudier le rôle du collagène XVIII dans la formation des plaquettes et dans une forme de cancer de la moelle osseuse. Le porteur affirme que la thrombose met en jeu des interactions à étudier sur l'animal vivant.
Objectifs
Le collagène XVIII est une protéine de la matrice extracellulaire, notamment présente au niveau des vaisseaux sanguins. Elle participe à l'organisation des tissus. Par l'un de ses domaines pouvant être libéré, appelé endostatine, elle régule également les phénomènes de développement des vaisseaux sanguins, pouvant être mis en oeuvre dans diverses pathologies telles que l'athérosclérose ou les cancers. Ayant observé de façon inattendue une très forte augmentation de l'expression de ce collagène dans un modèle de souris développant de la myélofibrose primaire, un cancer qui chez l'homme entraine une dégénerescence de la moelle osseuse avec insuffisance médullaire , nous cherchons à comprendre comment la surexpression de ce collagène freine ou au contraire contribue au développement de la maladie. En outre, étant présent dans les vaisseaux sanguins, nous chercherons également un rôle éventuel dans les processus d'arrêt des saignements ou à l'inverse dans le développement des thromboses.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une compréhension des rôles du collagène 18 dans la formation plaquettaires, dans l'initiation ou le développement des myélofibroses, ainsi que dans l'hémostase et la thrombose. Si le collagène 18 est impliqué dans ces processus, cela constituera de nouvelles pistes pour moduler,chez les différents patients, la formation ou la fonction des plaquettes.
Procédures
Pour les expérimentations nécessitant un traitement d'un mois, celui-ce sera administré sur souris vigile, par injection unique 2 fois par semaine pendant 4 semaines. Tous les prélèvements sanguins répétés seront effectués sur animal anesthésié, à J0, après 2 semaines et 4 semaines. Pour les expérimentations impliquant un traitement unique par chimiothérapie, le suivi de la numération sanguine sera effectué à J0, J5, J7, J8, J9, J12, J14. L'anesthésie et le prélèvement de sang dure entre 5 et 10 minutes pour chaque souris. Tous les modèles de thrombose seront mis en place sur animal anesthésié sans réveil.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont essentiellement le stress de la contention qui précède l'injection ou l'anesthésie, ainsi que la piqure d'anesthésie ou de traitement par elle-même. Ce stress est minimisé par le recours dans tous les cas à un professionnel expérimenté et diplômé. Le prélèvement sanguin caudal est susceptible d'entrainer un petit saignement, qui est stoppé par un point de compression de 1 à 2 minutes lorsque la souris est toujours sous anesthésie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements.
Remplacement
Les expériences nécessitent un animal adulte vivant, car elles posent la question du fonctionnement du système hématopoïétique et hémostatique in vivo dans sa totalité, en faisant appel à une multitude de cellules qui interagissent dans toute la complexité du vivant et en particulier la circulation sanguine. En particulier, la thrombose met en œuvre simultanément des interactions entre les plaquettes, les vaisseaux et la circulation sanguine. Ces évènements sont intégrés et demandent à être étudiés sur l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum. Des études pilotes ont permis de déterminer le nombre minimum pour l’obtention de résultats statistiquement analysables. Un certain nombre de souris sont réutilisées au sein de ce même projet. De plus, une fois sacrifiées, les souris seront partagées afin d'utiliser différents organes pour d'autres expérimentations. Les lots sont optimisés afin d'utiliser mâles et femelles. Enfin, dès que possible, nous utilisons des cellules humaines pour nos expériences in vitro qui ne nécessitent pas l'environnement des tissus ou l'animal dans sa globalité.
Raffinement
Les souris sont hébergées par groupe de même sexe et sans défaire les groupes préformés pour éviter le développement de comportements agressifs. Des objets sont placés dans la cage pour enrichir le milieu et permettre une protection contre l'éventuelle agressivité des congénères. De la ouate est également disposée pour favoriser le comportement de fouissage et du coton cardé pour favoriser le maintien de la chaleur corporelle dans le nid. Le stress et la douleur des animaux utilisés dans ce projet seront réduit au maximum, notamment par anesthésie pour toute procédure invasive. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé. Une grille de points limites a été établie pour la procédure expérimentale afin de soustraire l’animal aux procédures si nécessaire afin de limiter la souffrance.
Choix des espèces
L'utilisation de la souris génétiquement modifiée n'exprimant plus le collagène 18 est un modèle unique et précieux pour étudier le rôle de cette protéine par comparaison avec les souris contrôles exprimant cette protéine. De plus, nous possédons une bonne connaissance de la physiologie de la souris et des similitudes avec l'homme, et nous disposons de nombreux modèles d’étude largement maitrisés chez la souris. Cette lignées de souris est donc parfaitement adaptée à cette étude et constitue un outil original et unique. L'absence de collagène 18 n’induit pas d’effet indésirable chez la souris au vu de leur comportement. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte, soit entre 8 et 18 semaines et les mâles et femelle utilisés en quantité similaire, ce qui nous permettra à postériori de déterminer un éventuel effet différent selon le sexe.
Etude de la fonction des gènes de modification et d’aminoacylation des ARN de transfert (ARNt) dans le développement cortical
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
7 553 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes subissent une laparotomie, leur utérus étant transpercé par un capillaire de verre pour injecter le cerveau de chaque embryon, puis les nouveau-nés sont tués à sept jours pour prélever leur cerveau. L'objet est d'étudier des gènes de modification des ARN de transfert dans le développement du cortex. Le porteur affirme que la complexité du cortex ne peut pas être recréée in vitro et met en avant l'efficacité de la souris, qui porte environ huit embryons par portée.
Objectifs
Le cortex cérébral est la partie superficielle du cerveau qui permet à l’homme d'effectuer des tâches complexes. Il est composé de différents types de cellules cérébrales spécialisées dont les neurones. Au cours du développement du cerveau chez l'embryon, un seul groupe de cellules progénitrices génère tous les types de cellules du cerveau qui doivent se former au bon endroit et au bon moment pour avoir un cerveau fonctionnel. Les processus qui régulent la création des différentes cellules du cortex ne sont pas encore entièrement connus et des perturbations dans ces processus pendant le développement conduisent à des maladies rares appelées troubles du neurodéveloppement. Notre équipe souhaite comprendre les processus qui régulent le développement du cortex cérébral et la production des différents types de cellules du cortex. Parmi les processus impliqués, le décodage de l'information génétique des cellules en une succession d'acides aminés formant les protéines, apparait comme un élément clé et sa molécule adaptatrice responsable du décodage, l’ARN de transfert (ARNt) comme une molécule décisive. Pour être pleinement actifs, les ARNt doivent être modifiés puis chargés avec leurs acides aminés. Ces modifications sont effectuées par des molécules appelées enzymes. A ce jour, 84 gènes de modification et 20 gènes de chargement des ARNt ont été identifiés. L'objectif de ce projet est d’étudier l’implication des enzymes de modification et de chargement des ARNt dans le développement cortical et d’identifier quelles enzymes influencent la génération et la diversité des cellules du cortex. Pour ce faire, nous allons utiliser une nouvelle approche chez la souris qui permet d’inactiver une des enzymes de modification des ARNt dans chaque cellule progénitrice du cortex chez l’embryon au début du développement du cortex et d’analyser les effets 7 jours après la naissance lorsque le développement des neurones est terminé. L’intérêt de cette approche est que nous pourrons tester toutes les enzymes de modification des ARNt en même temps chez un même embryon et observer les effets sur les cellules individuellement. Pour chaque cellule, nous identifierons quelle enzyme de modification a été inactivée et les conséquences sur la cellule. Ainsi, nous pourrons déterminer quelles modifications de l'ARNt sont importantes pour la génération et le développement des cellules du cortex.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de mieux comprendre le rôle des molécules adaptatrices de la traduction, les ARNt, et de leurs modifications et leur chargement dans le développement du cortex cérébral. Il permettra d’identifier les gènes de modification des ARNt importants pour le développement du cortex et dont l’inactivation pourrait conduire à des malformations du cerveau. L’identification des tels gènes permettra de proposer de nouveaux gènes candidats dans la recherche des causes génétiques chez les patients atteints de malformations du développement cortical. Enfin, la compréhension des mécanismes pathologiques responsables peut permettre d’envisager des pistes thérapeutiques.
Procédures
Les femelles gestantes vont subir une injection d’anti-douleur (environ 5 secondes), suivie d’une chirurgie abdominale (consistant en l'ouverture de l'abdomen : laparotomie) et leur utérus va être exposé et transpercé par un capillaire en verre très fin à plusieurs reprises (une fois pour chaque embryon pour une durée de 1 à 10 secondes par embryon). La durée totale de la chirurgie n'exèdera pas 45 minutes. Les femelles gestantes seront par la suite placées dans des cages isolées puis avec leur portée jusqu'à la mise à mort des souriceaux. Les embryons au stade embryonnaire E12.5 vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin (entre 1 et 10 secondes).
Impact sur les animaux
La barrière cutanée des femelles gestantes sera rompue en plusieurs endroits (site d'injection dans le dos entre les omoplates avec une aiguille très fine et cicatrice de la laparotomie sur le ventre), il en résulte une plus grande sensibilité aux éventuelles infections. Les femelles seront par la suite placées dans des cages isolées et de ce fait, privées de congénères. L'isolement sera uniquement physique (pas visuel, olfactif et auditif) car les souris verront, sentiront et entendront leurs congénères. Les embryons à 12.5 jours de gestations vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin. Depuis 8 ans que nous effectuons ce type d’injection dans le cerveau au laboratoire, nous n’avons pas observé de phénotypes dommageables chez les souris après la naissance ou à l’âge adulte.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet. Les femelles gestantes sont herbergées jusqu’à la mise à mort des nouveau-nés. Les nouveaux-nés sont herbergés 7 jours, puis mis à mort pour collecter leur cerveau.
Remplacement
L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement du cortex cérébral qui ne peut pas être recréé par des approches in vitro. Le développement du cerveau est très bien caractérisé chez la souris, ce qui nous permet de déterminer efficacement les conséquences de l’inactivation de gènes sur le développement embryonnaire du cortex. Le projet vise à utiliser une approche groupée in vivo afin d’analyser les effets de la perturbation des différents gènes de modification et de chargement des ARNt simultanément sur le développement du cortex et sur la quantité et la diversité des neurones générés. Cette approche a déjà été utilisée chez la souris au cours du développement en 2020 par Jin et ses collaborateurs pour évaluer la fonction de 35 gènes candidats de troubles du spectre autistique et de retard du neurodéveloppement et elle a permis d’identifier des types cellulaires et des gènes communément affectés, justifiant la pertinence de cette approche et sa faisabilité dans le modèle murin.
Réduction
Les approches conventionnelles pour étudier les effets de l’inactivation d’une enzyme sur le développement du cerveau requiert de générer une lignée de souris pour chaque enzyme analysée, ce qui demande de produire un grand nombre d’animaux pour chaque enzyme. Nous avons choisi une stratégie qui nous permet d’utiliser une seule lignée de souris pour tester les effets de l’inactivation d’environ 30 enzymes simultanément dans un même embryon et donc de diminuer considérablement le nombre d’animaux manipulés. De plus, nous avons choisi de générer la lignée de souris utilisée sur un fond génétique présentant un faible taux de cannibalisme des nouveau-nés et un nombre important de nouveau-nés par portée permettant ainsi de réduire le nombre total d’animaux manipulés. Nos croisements de souris seront faits de manière à utiliser 100% des embryons générés pour les expériences. Nous avons prévu une phase de formation à l’injection dans le cerveau des embryons à 12.5 jours de gestation de 2 expérimentateurs sous la supervision de l’assistante ingénieure de l’équipe qui a acquis une très bonne maitrise de cette technique chirurgicale au long de ces 8 dernières années. L’objectif de cette formation est d’avoir un temps de chirurgie de moins de 30 minutes et un bon taux de survie des embryons afin de limiter le nombre de femelles gestantes manipulées. Pour cela, nous avons également investi dans un système de loupe équipé d’un écran afin de mieux visualiser les embryons et ainsi d’optimiser les conditions d’injections. De plus, nous utiliserons des nouveau-nés d’autres expérimentateurs de l’animalerie pour optimiser la collecte et la préparation des cellules au lieu d’élever des souris supplémentaires. Enfin, nous exploiterons les données publiées et l'analyse de puissance pour déterminer le nombre approprié d'animaux pour notre étude et ses analyses statistiques. Les analyses statistiques sont effectuées par l’analyse différentielle au niveau des cellules individuelles. En optimisant le protocole au mieux de nos capacités, nous serons en mesure d'obtenir des cellules de haute qualité et en quantité suffisante pour chaque animal utilisé, augmentant ainsi la taille de notre échantillon pour les tests statistiques tout en maintenant un nombre d'animaux utilisés à un faible niveau.
Raffinement
Nous prendrons en compte avec la plus grande attention le bien-être des animaux utilisés pour ce projet. Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. L’élevage et la reproduction de nos animaux se font dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress pour l’animal. Des nids et des tunnels seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Les animaux seront surveillés quotidiennement. Tout inconfort de la souris détecté durant la gestation ou la mise bas sera traité en fonction des symptômes détectés. Au début de l’expérience, les femelles reçoivent une injection d'un anti-douleur 30 minutes avant l’anesthésie. Durant l’expérimentation, les femelles gestantes sont anesthésiées par voie gazeuse. Leurs yeux sont protégés de la déshydratation par du gel pour les yeux. Nous limitons le temps de manipulation à 45 minutes maximum sur l’animal anesthésié. Le réveil est immédiat une fois l’arrêt de l’anesthésie gazeuse. Un anti-inflammatoire est injecté à la fin de l’opération afin de prendre le relai de l’analgésie pendant 24h. L’animal se réveille dans une cage chauffée à 37°C et est surveillé régulièrement. Nous vérifions que les animaux mangent, s’abreuvent et se toilettent normalement. Les jours suivants, les animaux sont surveillés pour voir notamment si la plaie a besoin de soins et pour détecter d’éventuelles infections post-chirurgicales ou autres complications. L’objectif est de prévenir toute douleur ou détresse. En cas d’infections importantes ou de douleur manifeste, les femelles gestantes sont euthanasiés immédiatement et les embryons sont sortis de leur sac utérin et mis à mort.
Choix des espèces
L'approche utilisée a été mise au point chez la souris et dans le cerveau d'embryons de souris. Cet animal de petite taille avec environ 8 embryons par femelles gestantes rend cette méthode efficace. De plus, la technique utilisée nécessite l’utilisation de souris génétiquement modifiées déjà existantes. Enfin, les étapes du développement du cerveau sont très bien caractérisées chez la souris ce qui nous permet de voir les effets de l’inactivation des gènes analysés dans le développement cortical.
Caractérisation de la contribution des neurones nés dans l’hippocampe à l’âge adulte dans l’apprentissage et le maintien d’informations de nature sociale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
1 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie sous anesthésie sans réveil. Chaque animal subit une chirurgie crânienne d'environ deux heures avec trépanation, des injections et des tests comportementaux de mémoire spatiale, de reconnaissance d'objets et de mémoire sociale. L'objectif est de décrire le rôle de neurones formés à l'âge adulte dans l'hippocampe, chez des souris saines et des souris modèles de la maladie d'Alzheimer. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne permet d'aborder cette voie neuronale de façon intégrée.
Objectifs
Nous avons deux objectifs principaux. Tout d'abord, nous voulons étudier comment les nouveaux neurones dans une partie spécifique du cerveau, sont organisés chez des souris normales et des souris atteintes de la maladie d'Alzheimer. Nous souhaitons découvrir s'ils se connectent uniquement à cette région ou s'ils établissent des connexions à la fois avec cette région et avec une autre région du cerveau. Pour ce faire, nous allons marquer ces nouveaux neurones avec des molécules fluorescentes afin d’identifier l’endroit ou ils se connectent. Ensuite, notre deuxième objectif est d'étudier comment ces nouveaux neurones, qui se forment à l'âge adulte, influencent la mémoire. Pour ce faire, nous allons manipuler ces neurones de manière à les activer ou les désactiver chez des souris normales et des souris atteintes d'Alzheimer, puis nous allons tester leur mémoire. Juste avant les tests de mémoire, nous activerons ou désactiverons ces neurones en utilisant des substances chimiques que nous injecterons aux souris. Nous essayerons également d’augmenter le nombre de nouveaux neurones en plaçant les souris dans un environnement stimulant, à la fois sur le plan cognitif, social et physique puis, nous testerons la mémoire des souris.
Bénéfices attendus
Le premier objectif du projet nous permettra de déterminer si les neurones nouvellement formés envoient des informations au niveau de deux régions de l'hippocampe, ou si les nouveaux neurones se connectent de façon spécifique soit à la première région, soit à la deuxième. Si tel est le cas, cela serait la première démonstration de l’existence d'une voie nerveuse specifique qui se connecte à une région liée à la cognition sociale. Si, en revanche, les nouveaux neurones contactent les deux régions, cela suggérerait que les informations contextuelles, spatiales, et sociales, sont intégrées et codées conjointement au sein des nouveaux neurones. Le deuxième objectif du projet permettra de révéler la contribution des nouveaux neurones projetant à cette région dans la mémoire sociale, et de déterminer si des manipulations de ces nouveaux neurones et/ou des neurones qui contribuent à leur survie sont en mesure de restaurer les capacités de mémoire sociale de souris modèles de la maladie d’Alzheimer.
Procédures
La chirurgie dure environ 2h par animal. Une seule intervention chirurgicale par animal sera réalisée. Les animaux recevront une injection en aigue (une seule injection qui durera environ 10 secondes) d’agent pharmacologique. Pour cela, la souris sera maintenue en contention durant 15 secondes. Les animaux seront soumis à des tests comportementaux n’excédant pas 1h30. Ces tests comportemenaux auront pour objectif d'étudier la mémoire spatiale, la mémoire de reconnaissance d'objets et la mémoire de reconnaissance d'individus (mémoire sociale).
Impact sur les animaux
Pour la chirurgie, l'incision de la peau ainsi que la trépanation osseuse peuvent induire une douleur modérée au stade post opératoire durant 24heures. La contention de l’animal lors des injections peut induire un stress modéré durant une dizaine de minutes. Les injections peuvent induire une douleur modérée lors de l’injection durant les 20minutes qui suivent la manipulation de l’animal. Les test comportementaux n'induisent pas de nuisances.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour prélèvement des cerveaux et /tissus afin de réaliser des marquages immunohistochimiques sur coupes de tissus pour poursuivre les investigations anatomiques, cellulaires et moléculaires.
Remplacement
Les nouveaux neurones naissent dans le cerveau au niveau d'une zone appelé le gyrus denté et se connectent à différentes sous régions de l'hippocampe. Nous comptons explorer le rôle des nouveaux neurones qui se connectent à une sous région bien définie de l'hippocampe. Notre objectif est d'étudier l'impact de ces nouveaux neurones sur les capacités mnésiques des mammifères. De plus, nous nous intéressons à la mémoire sociale qui est altérée dans certaines maladies humaines telles que la maladie d’Alzheimer. L’utilisation du modèle murin nous permet d’étudier les modulations de cette mémoire sociale chez des individus sains et présentant des troubles de mémoire sociale (souris modèles de la maladie d’Alzheimer). A ce jour, il n’existe pas de modèles alternatifs crédibles permettant d’aborder la fonction de cette voie neuronale spécifique de manière intégrée, et ce notamment lorsqu'il s'agit d'études comportementales et neurologiques visant à décrire les mécanismes mis en jeu dans les processus mnésiques.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est le nombre minimum nécessaire pour obtenir une puissance statistique suffisante lors de la réalisation de tests statistiques, d’après nos observations et celles rencontrées dans la littérature.
Raffinement
Tous les animaux sont hébergés selon les normes de bien-être en vigueur (5 individus, présence d'enrichissement). Ils seront observés quotidiennement et des points limites ont été définis à partir de grilles de scoring. En cas de blessure ou de souffrance, les animaux recevront un traitement analgésique adapté. Tous les signes de souffrance détectés lors de l'observation quotidienne tels qu'un isolement et une indifférence par rapport au milieu extérieur, une diminution du comportement exploratoire, une attitude prostrée avec dos voûté, une expression faciale modifiée, une altération de l’état du pelage, une fuite ou défense à la manipulation, ou une perte de poids>20% conduiront à la mise à mort des animaux en accord avec le vétérinaire référent. De plus, nous réaliserons plusieurs tests sur les mêmes animaux pour limiter leur nombre.
Choix des espèces
Nous comptons explorer la fonction biologique des nouveaux neurones formés à l’âge adulte. Nous proposons que ces nouveaux neurones ont un effet sur le comportement de l’animal (mémoire). Il n’existe pas de modèle cellulaire simple permettant d’aborder l’impact de ces nouveaux neurones sur le comportement de l’animal. Nous comptons également faire une description anatomique des voies de projections des nouveaux neurones. Il nous faudra donc prélever des tissus pour voir l’organisation cérébrale. De plus, la souris appartient à la classe des mammifères ce qui la rend proche de l’Humain. Son utilisation nous permettra de mieux comprendre les mécanismes cérébraux sous-tendant les processus mnésiques chez les mammifères. D’autre part, nous utiliserons des souris modèles de la maladie d’Alzheimer. Ce modèle nous permettra d’étudier les éventuels mécanismes à l’origine des troubles mnésiques dans un contexte pathologique. Les animaux que nous utiliserons seront âgés de 3 à 6 mois. En effet, la neurogénèse adulte diminue avec l’âge. Si nous voulons l’étudier nous devons nous placer à une fenêtre de temps ou elle est suffisamment abondante.
Adaptations physiologiques et énergétiques des éléphants de mer aux contraintes environnementales au cours de leur cycle de vie
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
1 437 éléphants de mer vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis relâchés sur leur site de capture. Ils sont capturés, équipés d'appareils enregistreurs fixés sur le poil et soumis à des prises de sang sous anesthésie, dont 200 jeunes et leurs mères. L'étude porte sur leurs adaptations physiologiques et sur la collecte de données océanographiques dans l'océan austral. Le porteur avance que ces adaptations à l'hypoxie pourraient à terme éclairer des affections humaines et revendique un "modèle animal unique".
Objectifs
Les changements climatiques et environnementaux influencent la dynamique et la structure des écosystèmes marins, affectant la distribution et l’abondance des espèces marines. Les éléphants de mer austraux peuvent être particulièrement affectés par cette variabilité spatiale et temporelle, ceux-ci présentant des périodes de recherche alimentaire en mer alternées avec des périodes de jeûne à terre. Phocidés « de l’extrême », les individus passent près de 10 mois de l’année en mer, au cours desquels ils plongent continuellement. Ils s’alimentent au cours de plongées d’une profondeur moyenne de 400 mètres, jusqu’à 2000 mètres. Ils passent le reste de leur cycle annuel à terre, pour les périodes de reproduction et de mue, très contraignantes d’un point de vue énergétique puisque les individus jeûnent pendant quasiment 1 mois. Les éléphants de mer sont des prédateurs majeurs de l’océan austral et nos travaux ont mis en évidence d’importantes différences d’écologie en mer entre mâles et femelles. Ce travail vise 1) à lier les conditions environnementales et les contraintes énergétiques d’un prédateur marin au cours de son cycle de vie, alternant périodes à terre et en mer afin de déterminer si des adaptations individuelles pourraient influencer le succès de chasse, la vitesse de mue, et de manière ultime l’énergétique et la viabilité des individus (OBJECTIF 1), et 2) à étendre le jeu de données environnementales et de comportement des éléphants de mer (OBJECTIF 2). En liant l’étude de paramètres proximaux (adaptations physiologiques, comportementales et énergétiques des individus) et ultimes (succès de chasse, succès reproducteur, vitesse de mue), ce projet permettra de mieux comprendre comment les stress environnementaux tels que le réchauffement des océans peut influencer la balance énergétique de ce prédateur marin ainsi que les adaptations des populations.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à améliorer notre compréhension de l’écologie, la biologie et la physiologie des éléphants de mer, ainsi que des écosystèmes dans lesquels ils évoluent. Phocidés « de l’extrême », les éléphants de mer austraux passent près de 10 mois de l’année en mer, au cours desquels ils plongent continuellement. Ils présentent ainsi des capacités physiologiques extrêmes adaptées aux longues et profondes apnées. Les adaptations physiologiques (hypothermie) et cérébrales (activité neuronale, vascularisation cérébrale) mises en place chez les éléphants de mer via leurs mécanismes de tolérance au manque d’oxygène pourraient aider à la compréhension de la tolérance à l’hypoxie (déficit d’oxygène). L’éléphant de mer fournit donc un modèle animal unique pour étudier les mécanismes physiologiques de tolérance à l'hypoxie et ses effets cumulatifs potentiels. A long terme, ceci pourrait nous permettre de transposer ces adaptations à l’étude des hypoxies chez l’Homme, en lien avec différentes affections (AVC, apnées du sommeil, trauma…) et d'ouvrir la voie à de potentielles nouvelles solutions thérapeutiques. De plus, la collecte de données océanographiques au long cours via ces mammifères « échantillonneurs » de l’océan austral est sans équivalent au niveau mondial. A ce jour, les éléphants de mer de l’archipel de Kerguelen fournissent 80 % des données océanographiques de l’océan Austral au Sud de 60°S et 98% des données associées à la zone de banquise. Ceci est essentiel pour caractériser les changements océanographiques affectant l’océan Austral, et évaluer leurs conséquences sur le comportement de pêche de ces prédateurs, et de façon ultime sur leur démographie et les changements climatiques.
Procédures
Les animaux sont équipés d'appareils enregistreurs à la capture, puis ces appareils sont récupérés à la recapture, après leur voyage en mer ou leur période à terre. Une prise de sang est effectuée à la capture et à la re-capture. OBJECTIF 1. Conditions environnementales et adaptations physiologiques et comportementales des élephants de mer à différents âges et périodes de leur cycle de vie Procédure 1 : Adaptations comportementales et physiologiques des femelles éléphant de mer au cours du voyage post-reproduction 17 femelles pour 1 an = 51 femelles pour 3 ans. Procédure 2 : Adaptations comportementales et physiologiques des femelles éléphant de mer au cours de leur mue 12 femelles pour 1 an = 36 femelles pour 3 ans. Pour ces deux procédures, nous nous intéressons aux adaptations des individus au cours de leur cycle de vie. Des appareils seront fixés sur le poil des animaux, enregistrant des paramètres externes. Procédure 3 : Suivi interannuel de la masse au sevrage des jeunes éléphants de mer 200 jeunes (entre la naissance et le sevrage) mâles et femelles et leurs 200 mères pour 1 an = 400 = 1200 pour 3 ans. Captures des jeunes à la naissance et au sevrage (pesée, prise de sang) et suivi à terre, et biométrie à distance des mères et biopsie. OBJECTIF 2. Données environnementales, voyages et comportement de chasse des éléphants de mer - observatoire Procédure 4 : Etude des voyages et stratégies de pêche des éléphants de mer après la mue : 50 individus (35 mâles et 15 femelles) pour 1 an = 150 individus (105 mâles et 45 femelles) pour 3 ans 50 individus (35 mâles et 15 femelles) seront équipés de balises océanographiques, afin d’étudier les voyages et stratégies de pêche des éléphants de mer après la période de mue (séjour en mer de 7 à 8 mois).
Impact sur les animaux
Stress lié à la capture et à l'injection intra-veineuse ou intramusculaire d'anesthésiques. Potentiel dérangement du comportement (comportement à terre et en mer) lié à l'appareillage.
Devenir
Tous les animaux sont relâchés sur leur site de capture.
Remplacement
Ce projet vise à améliorer notre compréhension de l’écologie, la biologie et la physiologie des éléphants de mer, des écosystèmes dans lesquels ils évoluent, ainsi que de documenter l’évolution au cours du temps de ces systèmes et prédire le devenir des populations de ce prédateur marin. Ce projet ne peut être mis en place sans recours à l’expérimentation sur animaux dans leur milieu naturel, exprimant toutes leurs potentialités comportementales et physiologiques.
Réduction
Afin de répondre aux différents objectifs, nous minimisons le nombre d’animaux équipés. Concernant l’objectif 1, 29 femelles seront équipées afin d’étudier leurs adaptations comportementales et physiologiques au cours de leur voyage en mer et à terre, en mue. Ceci nous permet de pouvoir dégager des différences individuelles en termes d’adaptations. Pour le suivi des jeunes, en lien avec la composition corporelle et l’âge des mère, un minimum de 200 paires (mère-jeune) est requis afin de pouvoir collecter des données populationnelles. Concernant l’objectif 2, 50 individus sont équipés dans le cadre de la collecte de données océanographiques, ce qui permet un échantillonnage adapté.
Raffinement
L’état général de l’animal est évalué avant sa capture (embonpoint, absence de malformation et de plaie) afin de ne pas le mettre en danger. L’animal doit se trouver en périphérie d’un groupe afin de ne compromettre ni sa sécurité, ni celle des expérimentateurs. Les animaux sont capturés, équipés, puis suivis quotidiennement sur la colonie. Toute modification de comportement (réactivité ou apathie) liée aux appareils posés entraînera la re-capture et le déséquipement des animaux. Ceci n’a pour l’instant jamais été observé. Lors des suivis et ce jusqu’à la récupération des balises, toutes les précautions sont prises pour ne pas déranger les animaux (approches lentes et observations à distance). Toutes les précautions seront mises en oeuvre afin de limiter le stress lors des captures et un anesthésique est systématiquement injecté par voie intra-veineuse (veine sacrale), ce qui permet : une induction rapide, une anesthésie facilement gérable et de courte durée. Les individus sont soit 1) anesthésiés à distance. Cette nouvelle méthode développée par l’équipe permet de réduire le stress de l’animal ; soit 2) si l’individu est isolé ou en bordure de mer, une cagoule spéciale est utilisée, permettant la contention de l’animal et l’injection en intraveineux, comme utilisée en routine. Les paramètres cardiaques et respiratoires de l’individu sont surveillés au cours de l’anesthésie. Le suivi longitudinal d’individus marqués réalisé par nos collègues australiens ne révèle aucun effet des balises déployées sur la survie ou le gain de masse en mer des éléphants de mer.
Choix des espèces
Ce projet vise à améliorer notre compréhension de l’écologie, la biologie et la physiologie des éléphants de mer, des écosystèmes dans lesquels ils évoluent, ainsi que de documenter l’évolution au cours du temps de ces systèmes et prédire le devenir des populations de ce prédateur marin. L’espère cible est donc l’éléphant de mer, qui est l’un des meilleurs phoques plongeurs, allant se nourrir dans des zones de l’océan austral (à la fois sub-antarctiques et antarctiques) non explorées par d’autres espèces. Les animaux étudiés sont des adultes (mâles et femelles). Des jeunes de la naissance au sevrage (3 semaines) seront également étudiés.
Rôle de CD44 sur les fonctions des cellules immunitaires au cours des complications hépatiques liées à l’obésité et/ou la prise d’alcool
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
2 464 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont la souffrance va du modéré au sévère, une partie menée sous anesthésie sans réveil. Génétiquement modifiées, elles reçoivent un régime gras ou alcoolisé, des injections de CCl4 pour induire une fibrose du foie, des prélèvements sanguins et un gavage. Le porteur indique que la défaillance hépatique peut provoquer une perte de poids de plus de 20 %, seuil qui déclenche la mise à mort. Il affirme devoir étudier la protéine CD44 dans un "organisme entier", aucune approche in vitro ne tenant compte des interactions entre organes.
Objectifs
L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2, des maladies cardiovasculaires et s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras, avec ou sans inflammation, pouvant progresser jusqu’au cancer du foie. Malgré l'importance clinique de ces pathologies, aucun traitement pharmacologique efficace n’est actuellement disponible. La mise en place d’une inflammation chronique joue un rôle crucial dans le développement de ces maladies. Les cellules immunitaires sont impliquées dans les processus inflammatoires et ces cellules sont retrouvées, entre autres, dans des organes comme le tissu adipeux et l’intestin qui participent au développement des complications hépatiques. En particulier, dans ces maladies du foie, les fonctions de l’intestin sont dégradées et ceci contribue à l’activation des cellules immunitaires hépatiques. Notre objectif est comprendre comment ces cellules contribuent au développement des maladies du foie. Notre équipe de recherche s’intéresse à une protéine clef impliquée dans la régulation des fonctions des cellules immunitaires et dans la progression des maladies chroniques du foie. Par l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés n’exprimant pas cette protéine au sein de certaines cellules immunitaires et soumis à un régime alimentaire favorisant l’apparition des complications hépatiques, nous serons en mesure de démontrer son rôle et d'observer les conséquences biologiques lors de sa suppression au cours des complications hépatiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider in vivo le rôle de notre protéine d'intérêt dans le contexte de complications hépatiques liées à l’obésité et d’autre part de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie
Procédures
En fonction des procédures, les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum. Les animaux nourris avec une alimentation riche en graisses seront soumis à un prélèvement sanguin en milieu et en fin de régime. Ces prélèvements ne dureront pas plus d'une minute maximum. Des injections seront également effectuées pour étudier le développement de la fibrose hépatique. Ces injections ne durent que quelques secondes et leur fréquence ne dépassera pas deux injections par semaine pendant 6 semaines. Une mise à jeun sera effectuée durant l'expérimentation d'une durée maximale de 4h ainsi qu'une seule administration orale de notre composé à l'aide d'une sonde gastrique.
Impact sur les animaux
Le présent projet comporte des contentions, injections intrapéritonéales et prises de sang à la queue qui sont des gestes induisant un léger inconfort ou une légère douleur chez les animaux. Comme conseillé dans la revue laboratory animals, le CCl4 sera administré par voie intra péritonéale (vs inhalation) avec alternance du point d’injection. Ce traitement est associé au développement de la fibrose hépatique sans perte de poids ni développement d’ascite ni trouble digestif attendus. Potentiellement, la conséquence la plus grave que les animaux pourraient subir serait une défaillance des fonctions du foie entrainant une difficulté pour s'alimenter et donc une perte de poids brutale de plus de 20% par rapport à la dernière pesée. Cependant, d'après nos expériences passées ainsi que celles de nos collaborateurs, ceci arrive rarement. Si une perte de poids supérieure à 10% par rapport à la pesée précédente est observée mais sans signe de souffrance (dos voûté, poil non entretenu, indifférence au milieu extérieur…), l’animal sera surveillé et repesé tous les 2 jours. Les animaux auront à disposition dans la cage des croquettes ainsi qu'un boudin de réhydratation. Si aucune reprise de poids la semaine suivante, il sera mis à mort.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure afin d'analyser la réponse immunitaire au sein des organes d'intérêt.
Remplacement
Le but de ce projet est d'étudier le rôle de la protéine CD44 dans les fonctions des cellules immunitaires impliquées dans divers aspects de la physiopathologie des NAFLD et ALD, notamment dans la stéatose, l'inflammation, les lésions hépatocellulaires, la fibrogénèse et l’hépatocarcinogénèse. Les études in vitro ne tiennent pas compte de l'environnement nutritionnel et métabolique ou encore des interactions entre différents types cellulaires ou entre organes. Il nous est donc nécessaire d'étudier le rôle de cette protéine dans un organisme entier.
Réduction
Ce projet utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes. Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront reproduites une seconde fois pour confirmer la significativité statistique quand celle-ci est proche d'être atteinte lors du premier set d'expérience.
Raffinement
La mise en place de points limites précoces, prédictifs, adaptés (perte de poids, état général de la souris) et basés sur une observation détaillée des animaux au cours de l'expérimentation permettra de limiter la sévérité de celles-ci. Les souris seront hébergées selon les mesures réglementaires pour le raffinement : en groupe (6 souris par cage, ou 5 souris par cage si une des souris fait 30g ou plus) dans des cages enrichies (igloos, ouate, baguettes de bois à ronger). La surveillance quotidienne des animaux par les zootechniciens et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir suffisamment de tissu biologique d'intérêt pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Pour la procédure 1 (souris mâles), la mise sous HFD sera effectuée à environ 7-8 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. Pour les procédures 2, 3, 4 et 7(souris mâles ou femelles), la mise sous régime alcool sera effectuée à environ 12-13 semaines d’âge ou lorsque le poids des souris atteint 20g. Pour la procédure 5 (souris mâles), le traitement au CCl4 débutera à environ 7-8 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. Pour la procédure 6 (souris mâles et femelles), l’isolation des cellules sera effectuée sur des souris adultes à partir de 7-8 semaines d’âge.
Etude de l’intérêt d’une composante microbienne proche du lait maternel dans les formules infantiles pour la prévention des allergies alimentaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux sont gavés chaque jour pendant quinze jours et une partie est rendue allergique par trois injections intrapéritonéales, le déclenchement de l'allergie provoquant une baisse de température et des douleurs abdominales. L'objet est d'évaluer l'ajout d'une composante microbienne proche du lait maternel dans des formules infantiles, avec en vue le développement de produits laitiers fermentés pour les personnes allergiques. Le porteur affirme qu'il est "impossible" de reproduire le système immunitaire in vitro.
Objectifs
Les allergies touchent 30 à 40% de la population mondiale et parmi elles, les allergies alimentaires (AA) affectent plus de 6% de la population Européenne. Il n'existe pas à ce jour de stratégie préventive efficace et validée. Elles sont liées à un dysfonctionnement du système immunitaire (SI) et à une diminution de la diversité du microbiote intestinal chez les nouveau-nés. Ce point suggère l’intérêt des stratégies au début de la vie pour induire un microbiote intestinal optimal et ainsi prévenir les allergies. Des études ont suggéré que l’administration de probiotiques (1 à 4 souches) en périnatal avaient un effet bénéfique pour la prévention de l’eczéma. Le microbiote du lait maternel fournit un apport en bactéries dans le tube digestif du nouveau-né. Il est très divers, riche en candidats probiotiques potentiels et représente un intérêt santé certain pour le futur enfant. Il serait potentiellement protecteur des allergies mais les études restent controversées. Aujourd’hui, les formules infantiles n’intègrent pas (ou très peu), de composante microbienne par rapport au lait maternel. L’objectif du projet est d’évaluer l’intérêt d’une composante microbienne issue du lait maternel dans les formules infantiles en comparant l’effet de différentes formules chez des souriceaux sur la prévention de l’allergie alimentaire.
Bénéfices attendus
Ces résultats permettront à terme le développement de produits laitiers fermentés (laits fermentés, fromages) ayant des propriétés modulatrices caractérisées particulièrement bénéfiques pour des populations à risque de pathologies chroniques telles que les allergies. Ces produits laitiers fermentés exploiteront les propriétés « 2-en-1 » des ferments laitiers pour une population cible : les allergiques.
Procédures
Les femelles reproductrices seront pesées tous les 2 jours après la fin de la reproduction pour déterminer la gestation. Gavages tous les jours pendant 15 jours chez la descendance. Lors de la récupération des fèces, les souris sont placées dans une cage individuelle le temps de récupérer un nombre suffisant de fèces pour les analyses. Chez la descendance, les groupes rendus allergiques alimentaires reçoivent 3 injections intrapéritonéales (aiguille 22G) et 1 gavage, espacés chacun d’une semaine.
Impact sur les animaux
Lors des gavages quotidiens, une gêne à l'oesophage peut être ressentie du fait du geste répété. Lors du déclenchement de l’allergie alimentaire (challenge), une baisse de température corporelle des animaux est généralement observée, ainsi que des douleurs abdominales.
Devenir
Mise à mort des animaux afin de récupérer les différents tissus nécessaires à l’étude immunologique et physiologique.
Remplacement
Impossible de prendre des mesures de remplacement. Il est impossible de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes et en particulier le système immunitaire in vitro ou in silico et ce notamment dans le cadre d’interaction complexe comme ici avec l’étude des propriétés immunomodulatrices de probiotiques.
Réduction
Nombre d’animaux réduis au minimum pour être statistiquement relevant c’est-à-dire au moins 10 individus par groupes pour faire des analyses statistiques. De plus, 2 protocoles indépendants seront nécessaires pour valider les différentes études et leurs résultats ce qui fait un total de 20 souris par groupes
Raffinement
Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux mais aussi la mise en place lors des procédures expérimentales d'analgésie et d'anesthésie permet de minimiser l'inconfort et la douleur. L'évaluation des points limites sera faite tous les jours lors de l'observation journalière des animaux et se base sur la présence de signes cliniques notables et sévères. En présence de 3 signes cliniques notables ou 1 seul signe clinique sévère, le responsable SBEA et le responsable de l’étude analyseront l’animal et prendrons la décision de laisser l’animal au sein du protocole en accord avec la cellule du bien-être animal ou de procéder à l’euthanasie. Les souris sont hébergées avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse.
Choix des espèces
Au cours de cette étude seront utilisées des souris femelles de souche Balb/C. Ces souris constituent un modèle de choix, reconnu, dans le cadre d’étude du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de ces souches et servent de modèle pour l'allergie alimentaire. Néanmoins, chaque fois que possible, les études sur les animaux seront remplacées par des systèmes in vitro. Des analyses immunologiques des différentes populations cellulaires (lymphocytes T et B) seront réalisées et l’utilisation de souris nous donne accès à de nombreux outils immunologiques, notamment les anticorps nécessaires aux marquages. Les femelles et males reproducteurs seront utilisés à 8 semaines de vie afin qu’ils soient matures sexuellement. Afin d’étudier s’il y a une action précoce d’une composante microbienne proche du lait maternel dans les formules infantiles pour la prévention des allergies alimentaires, nous utilisons des souriceaux en début de diversification alimentaire (sevrage) c’est-à-dire à 2 semaines de vie.
Thérapie pour les myopathies de type BIN1 & Dynamin 2 par ajout de tamoxifène dans l’alimentation.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
344 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des tests comportementaux répétés chaque semaine, des mesures de force musculaire sous anesthésie et des prélèvements sanguins, pour évaluer le tamoxifène comme traitement de myopathies congénitales. Le RNT ne précise pas lesquels de ces tests comportementaux sont pratiqués. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet d'évaluer la contractilité musculaire sur l'"organisme entier" et décrit une application clinique comme rapide.
Objectifs
Les myopathies congénitales sont des maladies génétiques rares qui affectent notamment la fonction des muscles squelettiques. A ce jour aucun traitement n’est disponible pour les patients atteints de ces maladies qui impactent grandement leur survie ou qui sont handicapantes au quotidien. Le but de ce projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique d’un agent pharmacologique déjà utilisé en clinique dans d’autres maladies pour le traitement de myopathies congénitales.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de fournir des informations relatives aux effets d’une molécule pharmacologique déjà approuvée et utilisée en clinique dans d’autres pathologies pour le traitement de myopathies congénitales. Ce projet permettra de proposer un traitement pouvant avoir une application en clinique rapide.
Procédures
Des tests de comportement peu invasifs seront réalisés une fois par semaine chez l’animal vivant à partir de 3 semaines jusqu’à l’âge de 8 semaines ou 15 semaines. Chaque test sera réalisé 3 fois par jour avec un temps de repos minimal de 10 minutes entre chaque essai. Chaque essai durera entre 10 secondes et 5 minutes selon le test comportemental. La production de force sera mesurée sur une durée maximale de 30 minutes chez l’animal anesthésié par injection intrapéritonéale d’un anesthésique et d’un anti-douleur dont l’administration ne durera pas plus de 5 secondes. Un prélèvement sanguin sera effectué sur animal vigile ou sous anesthésie légère pendant un maximum d’une minute. Un prélèvement sanguin sera effectué sur animal sous anesthésie générale sur une durée maximale de 2 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent présenter une perte de masse corporelle. Les animaux seront mis sous anesthésie générale par injection d’anesthésiques qui pourra provoquer une douleur ou une inflammation au point d’injection. Lors du prélèvement de sang, l’animal pourra ressentir un stress lors de la manipulation et un inconfort au niveau du point de piqure.
Devenir
Les animaux utilisés pour les tests seront euthanasiés après prélèvement des organes nécessaires pour les analyses au niveau cellulaire et moléculaire.
Remplacement
Dans ce projet qui consiste à évaluer les effets d’un agent pharmacologique sur le muscle, le modèle murin est privilégié car l’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer la contractilité du muscle. D’autre part, il n’existe pas de méthode alternative qui permette d’évaluer sur l’organisme entier et dans des conditions in vivo les effets d’une molécule. L’évaluation des effets d’un agent pharmacologique in vivo est un prérequis indispensable avant toute application clinique.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire par groupe (i.e. 10 animaux par groupe), basé sur de précédentes études, a été déterminé à l’aide d’une analyse statistique mettant en évidence une différence phénotypique entre les animaux malades non traités et les animaux contrôles. Les tests comportementaux peu invasifs offrent la possibilité de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. Ce point est essentiel car il permet de réduire de manière drastique le nombre d’animaux. D’autre part, les analyses moléculaires et histologiques seront réalisées uniquement en fin de traitement, ce qui permet non seulement de collecter les différents tissus sur ces mêmes animaux mais également de s’affranchir de générer une cohorte pour chaque point du suivi longitudinal. Enfin, les groupes d’animaux ne recevant pas d’agent pharmacologique serviront de groupe contrôle pour les différentes doses d’agent pharmacologique testées. Ces points sont importants car ils sont à l’origine de la réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. L’analyse de la capacité à se retourner et à se mouvoir, la couleur de la peau, la présence d'une poche de lait seront évalués chez le nouveau-né tous les 2 à 3 jours. A partir du sevrage, les animaux seront hébergés en groupe. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 2 à 3 fois par semaine. Dès lors qu’une perte de poids sera notée, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. Les tests comportementaux seront peu invasifs et permettront un suivi longitudinal. Afin de diminuer le stress lié à ces tests, une session de familiarisation sera effectuée. Pour les tests nécessitant une anesthésie générale de l’animal, la respiration sera contrôlée visuellement, la température de l’animal sera régulée et maintenue à sa valeur basale à l’aide système permettant la circulation d'eau chaude et un gel ophtalmique sera appliquée sur les yeux de l’animal afin de limiter l´assèchement des cornées.
Choix des espèces
Le modèle murin est privilégié car il s’agit de l’espèce la plus proche de l’Homme physiologiquement et structurellement pour laquelle les manipulations génétiques permettent de reproduire les caractéristiques principales de la maladie étudiée. Le traitement des souris mères débutera 14 jours après la naissance des animaux ce qui permet aux animaux nés de recevoir le traitement via le lait maternel dès les premiers jours de vie, et ainsi de traiter au plus tôt la maladie qui est présente dès la naissance. Les mâles et les femelles seront utilisées car la maladie se développent indépendamment du sexe. Les tests comportementaux seront réalisés une fois par semaine sur des animaux âgés de 3 semaines jusqu’à l’âge de 8 ou 15 semaines, i.e. à partir du sevrage et pendant toute la durée du traitement.
Evaluation de l’activité antitumorale des perturbateurs de la liaison cIAP1 – TRAF2 (cITIn)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie, puis trois injections intrapéritonéales par semaine pendant trois semaines, de la chimiothérapie et des injections d'anticorps, pour tester six molécules censées bloquer la liaison cIAP1-TRAF2 dans les cancers. Une partie de ces souris immunodéficientes subit aussi une vaccination avec réinjection de cellules tumorales vivantes. Les retombées annoncées pour les patients restent renvoyées à un éventuel essai chez l'homme, tandis que le porteur affirme que l'analyse des tumeurs dans leur environnement rend l'usage des souris nécessaire.
Objectifs
La thérapie ciblée des cancers est une stratégie thérapeutique très prometteuse permettant de cibler spécifiquement les anomalies des cellules tumorales. En gagnant en spécificité par rapport aux traitements conventionnels, cette stratégie thérapeutique réduit considérablement les effets secondaires et améliore la qualité de vie des patients. La protéine cIAP1 est promotrice de tumeur et a été retrouvée surexprimée dans de nombreux échantillons tumoraux humains de différente origine. Elle constitue une cible thérapeutique pertinente. Il a été montré que l’association de la protéine cIAP1 avec son partenaire TRAF2 était absolument nécessaire à son activité oncogénique. Une recherche de perturbateurs de liaison cIAP1 – TRAF2 en vue d’une utilisation en thérapie anti-cancéreuse a été entreprise. Une première génération de molécules a été obtenue et une seconde génération est en cours d’élaboration. Le présent projet a pour but d’évaluer les propriétés antitumorales des molécules élaborées. Six molécules seront testées en monothérapie ou associées à de la chimiothérapie conventionnelle et/ou immunothérapie.
Bénéfices attendus
Il s’agit d’une étude préclinique d’évaluation de nouvelles molécules à finalité thérapeutique anti-cancéreuse. L’objectif est de sélectionner au moins une molécule qui pourra ensuite faire d’objet d’une optimisation et d’une étude pharmacologique en vue d’essai thérapeutique chez l’homme.
Procédures
Dans la procédure 1, les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane et subiront une injection sous-cutanée de cellules tumorales dans du sérum physiologique. Dans la procédure 2, les souris porteuses de tumeurs recevront trois injections intra-péritonéales par semaine des molécules à tester ou de son contrôle, et ceci pendant 3 semaines. Une injection unique de chimiothérapie sera réalisée en intra-péritonéale. Dans la procédure 2 et 3, l’injection d’anticorps aura lieu 3 fois par semaine pendant 3 semaines à partir du 14ème jour post-injection des cellules tumorales, en même temps que les molécules à tester. Ces injections seront réalisées en intra-péritonéale. Dans l’expérience de vaccination de la procédure 3, des cellules tumorales mortes seront injectées en sous-cutanée dans le flanc de l’animal. Une semaine après la vaccination, des cellules tumorales vivantes seront injectées en sous-cutané (100 µL, 10 secondes) dans le flanc opposé et l’apparition d’une tumeur au deuxième point d’injection sera évaluée.
Impact sur les animaux
- Les molécules testées pourraient occasionner une réaction inflammatoire modérée au moment de l’injection. - Les souris sont immunodéficientes et donc plus sensibles aux infections - Le développement de grosses tumeurs pourrait gêner le mouvement de la souris.
Devenir
Les animaux seront euthanasiées selon les pratiques recommandées pour les souris par l’union Européenne
Remplacement
L’objectif du projet est de vérifier si les molécules en développement peuvent exercer une activité anti-tumorale en agissant directement sur les cellules tumorales ou/et en stimulant la réponse immunitaire anti-tumorale. Ceci nécessite l’utilisation d’animaux pour analyser les tumeurs dans leur environnement. Toutes les procédures chez l’animal seront précédées d’une validation in vitro de l’efficacité des molécules. La procédure 1 sera précédée par une validation in vitro de la capacité des molécules à inhiber la signalisation intracellulaire pro-tumorale et la croissance des cellules tumorales. Seules les molécules montrant une activité anti-proliférative seront évaluées chez l’animal. Nous avons actuellement 2 molécules remplissant ces critères. Au maximum les 6 molécules seront analysées. La molécule la plus efficace sera ensuite utilisée dans la seconde et troisième série d’expériences (procédure 2 et 3). La procédure 3 sera précédée par une analyse in vitro de la capacité des molécules ou de la combinaison molécule-chimiothérapie à induire une mort immunogène. Seules les combinaisons efficaces seront testées in vivo.
Réduction
La première série d’expériences (5 souris / groupe) permettra de définir les concentrations efficaces et de choisir les molécules utilisées dans la seconde série d’expérience. Pour les 2 molécules les plus efficaces, nous répèterons l’expériences 2 fois de manière indépendante. La répétition permettra d’ajuster les concentrations si besoin. Les prises tumorales et la réponse aux traitements peuvent varier d’un individu à l’autre, la seconde et troisième séries d’expériences seront réalisées sur des groupes de 5 souris. Nous répèterons les expériences 2 fois de manière indépendante afin d’avoir suffisamment de puissance pour des analyses statistiques.
Raffinement
Les injections sous-cutanées de cellules tumorales, intrapéritonéales ou intraveineuses des molécules ou agents thérapeutique seront réalisées par des expérimentateurs expérimentés. Les souris auront une phase d’adaptation d’une semaine avant le début de l’expérimentation afin de les habituer à la manipulation et à la contention. Aucune douleur associée à ces gestes n’est attendue. Concernant les points limites adaptés les plus prédictifs, il s’agira des modifications de l’apparence physique, de la perte de poids, de l’apparition d’inflammation, du volume et de l’aspect des tumeurs, et des modifications du comportement L’arbre décisionnel ci-après sera suivi pour la prise en charge des animaux : 1. Si des changements de comportement ou d’apparence physique sont observées, une nourriture gélifiée pourra être rajoutées dans la cage et les animaux seront surveillés quotidiennement. 2. Si une légère inflammation au moment de l’injection des composés est observée, un anti-inflammatoire non stéroïdien pourra alors être administré de manière ponctuelle aux animaux. 3. Si des nécroses apparaissent sur les tumeurs, leur aspect et douleur seront évalués. En cas de nécrose non sèche, ou lorsque les nécroses sont sèches mais douloureuses à la palpation ou creuses, les souris seront mises à mort. Si les nécroses sont sèches, non douloureuses et sans déformation ni signe d’inflammation, les souris seront surveillées quotidiennement et pourront être prise en charge avec l’utilisation d’un produit cicatrisant (alu spray). Dans tous les cas, si les animaux présentent une perte de poids ou une taille de tumeur définie comme point limite, ou si l’aspect des tumeurs le nécessite (nécroses douloureuses ou creuses) ou d’autres signes mettant en évidence une souffrance telle qu’une inflammation persistante, les animaux seront euthanasiés selon les bonnes pratiques.
Choix des espèces
Les souris sont les modèles de choix utilisés pour une analyse de l’efficacité de nouveaux traitements anticancéreux. Nous utiliserons des souris immunodéficientes nude (NMRI) pour la première série d’expérience permettant d’implanter des cellules exprimant cIAP1 ou un mutant invalidé de cIAP1. Lors de la seconde série d’expériences, nous utiliserons des souris immunocompétentes pour l’implantation de cellules cancéreuses d’origine murine et des souris immunodéficientes pour l’implantation des cellules cancéreuses humaines. Pour la troisième série d’expérience, des cellules cancéreuses coliques seront injectées à des souris immunocompétentes pour l’expérience de vaccination. Ensuite, l’analyse de la capacité des molécules ou des combinaisons de traitement à sensibiliser les tumeurs à une immunothérapie se fera sur des tumeurs faiblement immunogènes développées dans des souris immunocompétentes. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant (supérieur à 20g).
Comparaison de deux voies d’injection intraveineuse par fluorescence chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
30 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. La moitié reçoit une injection dans la veine de la queue, l'autre une injection derrière l'œil, suivies de trois séances d'imagerie sous anesthésie, pour comparer deux techniques d'injection et deux traceurs fluorescents. Les souris sont ensuite tuées au CO2 pour analyser la distribution du produit. Le porteur affirme que la validation d'une injection systémique "ne peut être réalisée que sur un organisme entier".
Objectifs
L'administration de médicament chez la souris peut être réalisée par voie oral (dans l'eau de boisson ou par gavage) ou par injection (sous cutanée, intra péritonéale ou intraveineuse). La voie la plus directe et la plus utilisé en clinique est la voie intraveineuse, puisque le composé injecté passe dans tout le corps très rapidement. Pour l'intraveineuse, toujours chez la souris, il existe deux techniques couramment mises en œuvre qui sont l'injection dans la veine caudale (au niveau de la queue) sans anesthésie où les souris sont mises dans un système de contention indolore et rétro orbitale (derrière l'œil) où les souris seront anesthésie. La première permet des injections répétées et nécessite d'immobiliser la souris durant l'opération. Elle peut être compliquée à réaliser sur des animaux de petite taille ou ayant une peau foncée. Dans le cas de l'injection rétro orbitale, la souris est maintenue en contention légère après l'avoir anesthésié et injectée en passant à côté de l'œil. Cette injection ne doit pas être répétée sous peine de causer des lésions à l'animal. Dans notre institut, ces injections sont régulièrement mises en œuvre. Depuis quelques mois, nous sommes équipés d'un appareil de lecture de fluorescence/bioluminescence dans notre service. La lecture de fluorescence sur animal permet de suivre des composés fluorescents en temps réel dans l'animal. Lors d'expériences, nous avons constaté une fluorescence persistante au niveau de la queue lors d'injection en intraveineux caudale. Afin de garantir nos résultats scientifiques, nous devons connaitre précisément la quantité injectée à l'animal que ce soit de cellules ou de médicaments. Dans le cas d'injection en intraveineuse rétro orbitale, nous avons constaté sur un faible nombre d'animaux (1 sur 4 injectées) un échec de l'injection (le liquide ne s'est pas diffusé dans le sang mais est resté localisé au niveau de l'œil). L'objectif de ce projet est de quantifier pour 30 souris (15 souris pour chaque type d'injections) la perte éventuelle de liquide lors d'injection intra caudale et de quantifier le taux d'échec lors d'injection rétro orbitale. Par la même occasion, nous pourrons comparer la distribution de fluorescence entre ces deux techniques et comparer l'efficacité de deux fluorophores que nous utiliserons en parallèle comme traceurs.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont une amélioration de nos techniques d'injection en intraveineuse et du choix des fluorophores dans nos futures études et ainsi l'amélioration continue de la qualité des résultats scientifiques.
Procédures
Avant la procédure, afin de garantir les résultats d'imagerie, les animaux seront rasés et dépilés sous anesthésie générale gazeuse. Cette opération dure une dizaine de minute. La moitié des animaux seront soumis à une injection unique le jour même au niveau de la queue avec maintien en contention dans une boite prévue à cet effet durant une période de 3 à 5 minutes selon la difficulté de l'injection. L'autre moitié des animaux seront maintenu en contention et auront une injection unique en rétro orbital (moins d'une minute). Tous les animaux seront soumis à trois séances d'imagerie sous anesthésie générale (durée de 3 à 5 minutes par séance), cela correspond à 4 séances d'anesthésie par animal. A la fin du projet, les animaux seront euthanasiés par CO2.
Impact sur les animaux
Les souris subiront un stress léger (maximum 3 minutes) lié à la cage de contention et une douleur légère (moins d’une minute) liée à l’injection. Après injection, les souris subiront une anesthésie gazeuse ce qui représentera aussi un stress léger lié aux anesthésies.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour collecter des tissus qui seront analysés pour déterminer la distribution.
Remplacement
La validation d'une injection systémique ne peut être réalisée que sur un organisme entier. Nous ne disposons pas de méthode alternative.
Réduction
Ce projet a été mis en place en réduisant autant que possible la taille des groupes expérimentaux. Cependant, les éventuels problèmes d'injections (échec du manipulateur ou formulation du produit) ne permettent pas de descendre sous le nombre d'une quinzaine d'animaux par groupe. Afin de diminuer le nombre d'animaux, l'injection simultanée de deux fluorophores a été privilégié à des injections sur des animaux différents. Afin d'observer un échec d'injection en rétro orbitale ou calculer une éventuelle perte de produit injecté au niveau caudale demande un effectif important de 15 animaux par groupe. D'après nos observations lors d'une étude précédente sur un très faible effectif d'animaux (un échec d'injection sur 4 souris injectées), ce nombre d'animaux nous permettra d'obtenir une statistique fiable sur l'apparition de ce type d'événement.
Raffinement
Les animaux seront placés dans les conditions optimales d'hébergement. Les examens d'imagerie seront réalisés sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane (5% à l'induction et 2% en entretien). Afin d'éviter l'hypothermie pendant l'anesthésie, l'appareil d'imagerie est équipé d'une plaque thermostatée. De plus, les animaux seront placés dans une cage thermostatée le temps du réveil et de la récupération post examen d'imagerie. Des points limites généraux avec établissement d'une grille d'évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être animal tout le long de l'étude ont été établis pour surveiller l'état général de l'animal, son apparence, son comportement, révélateurs du niveau de douleur.
Choix des espèces
La souris est le modèle principalement utilisé dans nos études. Ce modèle est le plus pertinent pour le test d'injection intraveineuse que nous effectuerons à l'avenir. Nous utiliserons des souris blanches de taille adulte entre 12 et 20 semaines d'âge. On sera dans des conditions optimales pour la taille de la queue des animaux adultes qui permettra une insertion d'une aiguille de 30 G (la mieux adapté pour les injections IV caudal) et pas trop âgées pour que la peau de la queue ne soit pas durcie.