Recherche fondamentale
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Production de souris humanisées pour le système immunitaire
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Environ une souris sur cinq de la partie service, celles dont le sang compte moins de 25 % de globules blancs humains, est mise à mort dans les jours qui suivent le contrôle qualité, les autres étant expédiées à des laboratoires. 5 120 souris immunodéficientes de quatre à cinq semaines vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, et le champ structuré en déclare 5 000 réutilisées, soit 120 seulement mises à mort. Elles reçoivent une molécule chimique deux jours de suite ou une irradiation de 218 secondes, puis une injection intraveineuse de cellules souches humaines sous anesthésie, et jusqu'à neuf prises de sang en 23 semaines pour les nouvelles lignées, dont les souris sont tuées à l'issue de 32 semaines. Six mois après la greffe, environ 5 % des souris maigrissent, blanchissent aux extrémités et perdent leur énergie. Le porteur décrit une production destinée à "un large panel d'utilisateurs finaux", académiques et industriels, et range le transport jusqu'à eux parmi les sources de stress.
Objectifs
Les souris immunodéficientes sont depuis plusieurs décennies des modèles de choix pour la transplantation de cellules souches humaines capables de générer un système immunitaire humain. Le recours à ces souris humanisées permet de proposer et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques pour une large gamme de pathologies nécessitant des modèles expérimentaux plus proches de la situation humaine. Les objectifs du présent projet sont de générer une gamme de souris humanisées pour le système immunitaire afin de les distribuer à un large panel d’utilisateurs finaux (académiques et industriels) aussi bien dans une perspective de recherche fondamentale que d’évaluation préclinique industrielle dans des domaines tels que l’hématopoïèse, l’immunologie, les maladies infectieuses, la vaccinologie, l’oncologie… Ce projet couvrira la génération de souris humanisées déjà validées en tant que "service" et également la génération de nouveaux modèles immunodéficients humanisés en tant que projet « nouveaux modèles en Recherche et Développement "R&D" ». Ceci permettra d’avoir des modèles plus adaptés aux études pré-clinique et participera à la règle des 3R sur la réduction du nombre d’individu pour des statistiques plus robustes.
Bénéfices attendus
Le recours à ces souris humanisées devrait permettre de proposer et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques pour une large gamme de pathologies nécessitant des modèles expérimentaux plus proches de la situation humaine (souris humanisées pour des composants cellulaires et moléculaires du système hématolymphoïde).
Procédures
Aucune procédure chirurgicale ne sera faite sur les animaux dans cette demande. Afin de rendre les souris permissives à la prise de greffe de cellules souches humaines, les animaux immunodéficients seront soit injectés avec une molécule chimique (1 injection par jour pendant 2 jours d’une durée de 30 secondes), soit irradiés 1 seule fois pendant 218 secondes afin de rendre accessible les niches hématopoïétiques. Les animaux seront par la suite humanisés par une unique injection intraveineuse de cellules souches humaines, et ce, après anesthésie générale gazeuse. Cette intervention dure 3 min pour la phase d’endormissement et 30 secondes pour la phase d’injection. Enfin, le contrôle qualité du taux d’humanisation se fera suite à un unique prélèvement sanguin sur souris vigiles pour la partie « Service », ou suite à 9 prélèvements sanguins, toutes les 3 semaines sur une période de 23 semaines pour la partie « nouveaux modèles en recherche et développement "R&D". Le prélèvement sanguin dure 30 secondes par souris.
Impact sur les animaux
Les effets néfastes du pré-conditionnement apparaissent sur environ 5% des animaux adultes humanisés et tardivement (6 mois après la greffe de cellules souches humaine). Ils se manifestent souvent par une perte de poids et une modification de l’apparence (extrémités blanches) et du comportement naturel de l’animal (animal sans énergie). Les animaux seront surveillés quotidiennement pour prévenir tout inconfort animal et prendre la décision appropriée selon notre grille d’évaluation de projet. Notre surveillance sera donc accentuée à 6 mois notamment pour la partie « nouveaux modèles en recherche et développement "R&D" » puisque les souris seront observées jusqu’à 32 semaines. De plus, du stress pourra être généré lors des prises de sang et du transport des animaux vers les utilisateurs finaux.
Devenir
Pour le Service : Tous les animaux humanisés validés par le ‘contrôle qualité’ soit environ 80% des animaux produits, présentant une proportion sanguine de leucocytes d’origine humaine >25% des leucocytes totaux sont expédiés aux utilisateurs finaux. Les animaux ne satisfaisant pas le critère requis sont écartés de tout groupe expérimental ultérieur. Ces animaux sont mis à mort dans les jours suivants le contrôle qualité car ils ne pourront plus être utilisés dans d'autres protocoles expérimentaux. Pour les nouveaux modèles : A l’issue des 32 semaines, les animaux seront mis à mort pour caractérisation du système immunitaire reconstitué (=humain).
Remplacement
Ce projet vise à produire des souris humanisées comme modèle expérimental préclinique à destination d’utilisateurs finaux des secteurs académique et industriel. Un tel modèle correspond à une attente forte pour pouvoir tester de nouvelles approches thérapeutiques transposables à l’Homme. En proposant comme modèle la souris humanisée pour le système immunitaire, nous offrons la possibilité d’utiliser un modèle expérimental préclinique permettant le criblage d’approches thérapeutiques directement adaptées à la situation humaine. Par ailleurs, les souris humanisées permettent d’approcher la situation physiologique humaine sans avoir recours aux modèles de primates non humains.
Réduction
Nous réalisons le projet d’humanisation en fonction des besoins exprimés ou pressentis de nos partenaires utilisateurs finaux. De plus, notre savoir-faire et l’optimisation de nos protocoles permettent d’utiliser peu d’animaux pour un rendement maximum. En exprimant le système immunitaire humain, la souris humanisée permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire dans ses applications ultérieures. Grâce au contrôle qualité systématique sur chaque souris implantée et au retour d’expérience qui en découle, nous optimisons sans cesse notre modèle de souris humanisée pour une meilleure prise de la xénogreffe humaine, ce qui diminue la variabilité intrinsèque au modèle et réduit d’autant le nombre d’animaux à implanter pour obtenir le nombre de souris humanisée souhaité. De plus, la génération de nouvelles lignées humanisées permettra de se rapprocher au plus près du système immunitaire humain et d’avoir des modèles plus adaptés aux études pré-clinique et participera également à la règle des 3R sur la réduction du nombre d’individu pour des statistiques plus robustes.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en zone d’expérimentation, en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu est enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un bâtonnet de papier que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid. Nous veillerons au bienêtre animal par une surveillance quotidienne des animaux par du personnel qualifié. Tout fait notable sera consigné sur une grille de score évaluant la souffrance et le stress des animaux. Les points limites sont clairement déterminés et les animaux identifiés par une alerte feront l’objet d’une surveillance accrue et des actions seront mises en place pour palier à divers problèmes tels qu’une observation bijournalière par le personnel expérimentateur ; l’ajout de gel Diet / pâtée SAFE Energy, l’ajout de coton…
Choix des espèces
Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide et bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. De plus, les conditions zootechniques actuelle et le niveau d’ingénierie génétique des souris de laboratoire sont tels qu’il est possible de construire à façon, des lignées profondément immunodéficientes, une condition sine qua non pour une prise efficace et durable de xénogreffe hématopoïétique humaine. Le projet utilisera des souris juvéniles après sevrage (4 à 5 semaines) pour une meilleure prise de greffe.
Etudes préliminaires des mécanismes d’action sous-tendant l’effet anti-épileptique de GAO-3-02
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
730 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur déclenche pharmacologiquement, sur animal vigile, soit une crise convulsive généralisée suivie pendant trente minutes puis interrompue par la mise à mort, soit un état de mal épileptique arrêté au bout de trente minutes. Tous les rats sont tués pour prélever leur cerveau et mener des analyses ex vivo. Le porteur revendique un "besoin fort" de nouveaux antiépileptiques et affirme que ni les modèles in vitro ni in silico ne peuvent reproduire les crises et les comportements associés.
Objectifs
Les épilepsies regroupent un ensemble de syndromes neurologiques se caractérisant par des crises pouvant se manifester sous des formes diverses, allant des absences aux convulsions. Leur origine peut être génétique mais le plus souvent elle est associée à une agression cérébrale sévère initiale, telle qu'un traumatisme crânien, une infection, ou un état de mal épileptique (EME). Bien qu’une épilepsie puisse se manifester à tout moment de la vie, les pics d’occurrence sont observés avant l’âge de 20 ans et après 60 ans. Plus de 20 médicaments sont disponibles pour contrôler les crises. Toutefois, un patient sur trois continue d’en faire malgré la prise de médicaments, et un grand nombre de ceux dont les crises sont contrôlées par ces médicaments se plaint de comorbidités affectant gravement leur qualité de vie. Il existe donc un besoin fort et urgent de développer de nouveaux candidats médicaments permettant non seulement de contrôler les crises pour ceux qui ne répondent pas aux médicaments, mais aussi de réduire le degré d’inconfort qui compromet une bonne observance thérapeutique. Le candidat médicament CM1 a été récemment développé pour répondre aux besoins non satisfaits des patients. Il s’agit d’un candidat-médicament de nature lipidique, dont le mode d’action diffère totalement des anti-épileptiques classiques. Il possède des effets anti-crises d’épilepsie (occurrence d’une seule crise) et des effets anti-épileptiques (occurrence de plusieurs crises spontanées), tout en protégeant certaines fonctions cognitives. Ces observations ont été réalisées dans le cadre d'un projet précédent. Des études in vitro et ex vivo ont montré : 1) que les effets anti-crises pouvaient passer par une augmentation des processus réduisant l’activité cérébrale ; 2) que l’activation d’un récepteur particulier, appelé ici CM1-R1, pouvait potentiellement être responsable des effets bénéfiques du CM1 ; et 3) que le CM1 pouvait modifier le profil lipidique cérébral. Les objectifs de ce projet sont d'apporter des réponses: 1) quant aux mécanismes par lesquels le CM1 augmente la réduction de l’activité neuronale ; 2) sur l’implication du récepteur CM1-R1 et d’un homologue R2 sur les mécanismes décrits en (1) ; 3) quant aux effets du CM1 sur les mécanismes de neurotransmission GABAergique et Glutamatergique, et l’implication de 2 récepteurs dans ces effets ; et enfin 4) sur les modifications de la composition lipidique cérébrale induites par le CM1.
Bénéfices attendus
Les épilepsies constitutent la seconde maladie neurologique après la migraine, et affectent près de 70 millions de personnes dans le monde. De nombreux traitements existent, mais malgré cela, près d’un tiers de patients continuent de faire de crises malgré la prise de ces traitements. En outre, parmi les personnes qui répondent aux traitements existants, le ralentissement de l’activité cérébrale qu’ils entrainent constitue un effet secondaire fortement handicapant pour une grande part d’entre elles, réduisant de ce fait l’observance du traitement. II est donc impératif de poursuivre le développement de nouveaux traitements, capables non seulement de réduire le nombre de crises ou leur sévérité, mais aussi de maintenir, voire même d’améliorer les capacités cognitives (mémoire). Le projet s’appuie sur le développement d’un potentiel candidat médicament, CM1, dont il a été montré qu’il exerce une activité anti-crise, anti-épileptique et cela sans altérer, voire même en améliorant, les capacités cognitives. L’objectif de ce projet est d’apporter des premiers mécanismes d’action in vivo de cette molécule, étape indispensable à la poursuite du développement de ce potentiel candidat médicament.
Procédures
Dans la procédure n°1, les animaux utilisés seront des rats soumis à un processus de déclenchement unique d’une crise convulsivante généralisée aiguë, induite pharmacologiquement. Les rats sont obligatoirement vigiles, car dans le cas contraire, aucune crise ne pourrait être induite. Dans les procédures 2 à 4, les animaux utilisés seront des jeunes rats soumis à un état de mal épileptique induit pharmacologiquement. Cette induction pharmacologique se fait sur animal vigile. L’état de mal est stoppé au bout de 30 min. Dans les procédures 2 et 4, il est important de chasser le sang des capillaires sanguins de tout l’organisme, en particulier le cerveau.
Impact sur les animaux
Le projet repose sur 4 procédures, réalisées sur le rat. Pour la procédure n°1, les crises d’épilepsies généralisées, de classe sévère, seront suivies sur une période n’excédant pas 30 minutes, au-delà desquelles les rats seront euthanasiés. Les rats développent en général les premières crises tonico-cloniques généralisées (GTCS) dans les 10-20 minutes qui suivent l’administration de l'agent convulsivant. Si le traitement testé a un effet pro-convulsivant, les rats développeront en moyenne les GTCS avant les 10 premières minutes. Au contraire, si le traitement a un effet anti-crise, les GTCS apparaitront après 20 minutes. Ce modèle, très bien standardisé au niveau international, n’excède pas 30 minutes ; en effet, on considère que l’effet protecteur est total quand aucune GTCS n'est observée dans les 30 minutes qui suivent l’administration de l'agent convulsivant. Les procédures 2 à 4 seront réalisées chez le rat après un état de mal épileptique (EME, série de crises convulsivantes en continu sur 30 minutes) induit pharmacologiquement à l’âge de 21 jours. A l’issue des 30 min d’EME, il sera stoppé pharmacologiquement. L’EME induit une douleur de type sévère pendant 3 à 5 jours, pendant laquelle aucun analgésique ne peut être administré en raison du blocage provoqué sur le processus même de développement d’une épilepsie. Sur ces 3 à 5 jours, durant lesquels le poids est contrôlé quotidiennement, les ratons ont une activité réduite, avec dos voussé.
Devenir
Pour la procédure n°1, les rats auront tous été soumis à un protocole d’induction d’une crise convulsivante généralisée. Ils seront tous mis à mort pour éviter de prolonger un état épileptique. Pour les procédures n°2 à 4, les cerveaux de tous les animaux seront prélevés, soit pour des études histologiques, biochimiques ou électrophysiologiques ex vivo.
Remplacement
Compte tenu du fait que les épilepsies regroupent une diversité de syndromes, il existe à ce jour très peu d’alternatives permettant d’évaluer les différents aspects de la pathologie sur des modèles in vitro ou ex vivo. De plus, l’analyse de comportements complexes, comme ceux de l’anxiété et de l’apprentissage spatial, et de surcroît la manifestation de crises épileptiques ne peuvent être appréhendées au niveau préclinique autrement qu’in vivo chez des vertébrés, et ne peut aujourd’hui être remplacée par des méthodes alternatives in vitro ou in silico.
Réduction
Ce projet impliquera l’utilisation d’un total de 730 rats sur une durée de 5 ans. Ce nombre d’animaux a été réduit au minimum tout en ne compromettant pas l’atteinte des objectifs de l’étude. Il a été déterminé à l’aide d’outils statistiques, en tenant compte des résultats d’études antérieures (notamment de la variabilité observée) dans le laboratoire sur ces mêmes modèles. Pour les procédures 1 et 2, des étapes GO/NOGO ont été mises en place. En effet, elles ont pour objectifs d’évaluer l’implication de 2 récepteurs potentiels du candidat médicament testé dans les effets observés. Nous commencerons par tester l’effet du récepteur R1. Si tout l’effet du candidat médicament passe par ce récepteur R1, alors les expérimentations visant à étudier l’implications de R2 ne seront pas réalisées.
Raffinement
Les animaux mâles arriveront suffisamment tôt pour permettre une semaine d'acclimatation avant le début des procédures. Leur poids sera suivi hebdomadairement, et les animaux seront soumis à une surveillance attentive à l’aide d’une grille d’évaluation du bien-être, pour limiter au maximum stress et douleur, et apporter des soins adaptés, le cas échéant. Plus spécifiquement, pour la procédure n°1, qui dure au maximum 30 minutes, la mise à mort de l’animal sera réalisée dès qu’il a atteint la première crise convulsivante généralisée. Pour les procédures n°2 à 4, l’état de mal épileptique induit par la pilocarpine (Pilo-EME) entraîne une souffrance sévère sur les 3 à 5 premiers jours, avec perte de poids pouvant atteindre 25%. Afin de favoriser le recouvrement, nous maintenons les ratons avec la femelle nourricière jusqu’au terme de ces 5 jours (26 jours d’âge). En outre, nous massons quotidiennement l’abdomen des ratons pour stimuler à nouveau le transit intestinal, temporairement interrompu par l’administration de scopolamine (antagoniste des récepteurs muscariniques centraux et périphériques). Depuis que nous avons introduit ces deux améliorations, le taux de survie des ratons est passé de 75% à 95%.
Choix des espèces
L’ensemble des données antérieures de l’équipe a été obtenu sur des rats Sprague-Dawley. L’utilisation de la même souche de rat nous permettra de comparer les données de ce projet avec celles des études antérieures de l’équipe. Enfin, chaque fois que cela est possible, le rat est choisi à la souris du fait qu’il est physiologiquement, génétiquement et morphologiquement plus proche de l’humain. En outre, son répertoire comportemental, notamment au regard de certaines compétences cognitives, le rend plus pertinent que la souris. Nous travaillons sur des ratons jeunes (3 semaines), car la grande majorité des cas d’épilepsie acquise (non génétique) chez l’humain se déclare chez le jeune de moins de 20 ans.
Etude de la capacité d’un mimétique synthétique de l’héparane sulfate à promouvoir la réparation et la régénération du tissu pulmonaire dans un modèle murin de fibrose pulmonaire.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
797 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une fibrose pulmonaire leur est induite par instillation de bléomycine dans la trachée, puis elles reçoivent des injections répétées d'un mimétique de l'héparane sulfate ou un anti-fibrosant par gavage, avant une exploration respiratoire. Le porteur décrit la fibrose comme indolore mais reconnaît qu'elle peut provoquer une insuffisance respiratoire sévère et tuer 20 à 30 % des animaux avant l'euthanasie prévue pour prélever les organes. Il affirme qu'aucune méthode ne remplace l'induction d'une fibrose in vivo et juge la souris plus adaptée à l'approche mécanistique.
Objectifs
Ce projet vise à développer une thérapie régénérative pour le traitement des lésions pulmonaires tels que celles observées dans le syndrome de détresse respiratoire aiguë, les exacerbations aiguës de maladies pulmonaires interstitielles fibrotiques ou dans les pneumopathies sévères. Nous envisageons l'utilisation de mimétiques des héparanes sulfates (HSM) afin d’améliorer la réparation du tissu pulmonaire et de permettre une récupération fonctionnelle après une agression pulmonaire aiguë. Les effets bénéfiques des HSM seraient principalement liés à la régénération du tissu lésé en restructurant la matrice détruite, en protégeant les peptides cellulaires communicants (facteurs de croissance, cytokines, chimiokines), et en limitant la fibrose. Le projet explorera la capacité d'un agent mimétique de l'héparane sulfate à réduire l'inflammation, les altérations des mécanismes de l'angiogenèse et la fibrose. Cette thérapie a pour objectif d’améliorer les séquelles de lésions pulmonaires aiguës caractéristiques des dommages alvéolaires diffus. En cas de succès, ce projet proposerait une nouvelle approche pour la prévention et le traitement de la fibrose pulmonaire.
Bénéfices attendus
L’hypothèse de recherche de ce projet est que l'agent mimétique de l’héparane sulfate présenterait un potentiel thérapeutique pour lutter contre les lésions pulmonaires aiguës en fournissant une thérapie régénérative du tissu lésé. Ainsi cet agent (1) remplacera la matrice extracellulaire remodelée consécutive à l’induction des lésions en ciblant les héparanes sulfates (2) améliorera l'angiogenèse et la récupération alvéolaire, et (3) diminuera significativement le processus inflammatoire, et par conséquent la fibrose pulmonaire.
Procédures
La réalisation de ce projet nécessite l'induction d'une fibrose pulmonaire (durée 21jours). Dans un premier temps nous déterminerons la dose optimale d'agent mimétique de l'héparane sulfate. Pour cela les animaux recevront 6 injections intraveineuses (durée quelques secondes) de cet agent mimétique ou de serum physiologique. Le groupe contrôle recevra une molécule anti-fibrosante quotidiennement par gavage. Après une exploration fonctionnelle respiratoire (durée 1h) les animaux seront euthanasiés pour prélèvement d'organes. A partir de la dose optimale identifiée, nous déterminerons les mécanismes d'action de cet agent mimétique de l'héparane sulfate dans les stades précoce (jour 8) et tardif (jour 11) de l'inflammation. Pour cela les animaux recevront respectivement 2 (jour 5 et 7) et 3 (jour 5, 8 et 10) injections intraveineuses d'agent mimétique de l'héparane sulfate ou de serum physiologique. Le groupe contrôle positif recevra une molécule anti-fibrosante par gavage (durée quelques secondes) pendant 4 ou 7 jours respectivement. Suite à cela les animaux seront euthanasiés aux jours 8 ou 11 pour prélèvement des organes (durée 10 minutes). Enfin une étude de la pharmacocinétique et de la pharmacodistribution sera réalisée. Pour cela les organes seront prélevés à 5 min, 30 min, 3h, 6h, 12h 24h après injection intra veineuse d'agent mimétique de l'héparane sulfate.
Impact sur les animaux
Le modèle murin de fibrose pulmonaire induite par instillation intra-trachéale de bléomycine est validé et couramment utilisé dans la littérature internationale. Ce modèle est caractérisé par un pic inflammatoire (D8) précédent l'apparition de la fibrose pulmonaire (D14-D21). L'instillation intra-trachéale de BLM n'entraîne aucune lésion trachéale ni de douleur particulière au réveil de l'animal. Le développement d'une fibrose pulmonaire est également indolore du fait de l'absence d'innervation sensitive à la douleur dans le parenchyme pulmonaire. Elle peut néanmoins entraîner une insuffisance respiratoire sévère et une mortalité de 20 à 30%. La technique de plethysmographie corps entier est une technique largement utilisée pour l’étude de la respiration. Elle permet de mesurer les variables ventilatoires sur un animal non anesthésié et non contraint. Afin de diminuer le stress de l’animal, une séance d’acclimatation sera systématiquement réalisée. Concernant les prélèvements, tous les animaux seront anesthésiés au préalable.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasié pour prélèvement d'organes, du sang et du liquide de lavage broncho-alvéolaire.
Remplacement
La réalisation de ce projet nécessite l'induction d'une fibrose pulmonaire in vivo. De fait, il n'existe pas de méthode alternative à l'expérimentation animale in vivo à ce jour. D'autre part, l'étude des mécanismes d'action d'un mimétique de l'héparane sulfate dans le cadre d'une thérapie matricielle peut-être plus facilement entreprise chez la souris du fait de l'existence d'outils permettant une approche mécanistique plus poussée.
Réduction
Le nombre total d'animaux impliqué est de 797. Le nombre d’animaux par groupe a été choisi sur la base de données, publiées ou non, et des calculs statistiques afin de définir le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un effet statistiquement significatif. Cela permet également de déterminer les points d'arrêt d'expérimentation les plus précoces et compatibles avec les objectifs du projet. Pour cela nous nous sommes basé sur la littérature existante ainsi que des tests de puissance et des statistiques issues de séries expérimentales précédentes prenant en compte les effets du traitement à la bléomycine (BLM) et la potentielle variabilité de nos paramètres physiologiques entre les différents individus.
Raffinement
Toutes les procédures seront réalisées dans le respect total des règles du raffinement. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi par groupes sociaux de 4 animaux par cage. La température de l’animalerie et l’humidité́ relative sont contrôlés en permanence. La nourriture sera fournie ad libitum et la photopériode sera de 12h/12h. L'enrichissement du milieu sera composé de matériel de nidification (bandes de papier naturel compacté) et d'abri en cellulose. Concernant l'insitllation intra-trachéale de bléomycine, celle-ci sera réalisée sous anesthésie. Ce type d’anesthésie est de courte durée et l'instillation n'entraîne aucune lésion trachéale ni de douleur particulière au réveil de l'animal. Les souris seront ensuite surveillées jusqu'a leur réveil complet. Afin d’améliorer le confort de l’animal suite à l’instillation intra-trachéale de bléomycine et afin de prévenir une perte de poids trop importante, un gel hydraté enrichi pourra être proposé au animaux afin de faciliter l’alimentation et la récupération des animaux dans les premières heures suivant la procédure. En fin de procédure, lors de l'anesthésie précédent l’euthanasie, la profondeur d'anesthésie sera vérifiées via l’observation des signes suivants: le relâchement des muscles, la perte du réflexe de retrait sur les deux pattes et la queue, la perte du réflexe palpébral, une respiration calme. Durant toute la procédure, les conditions de soins et les méthodes utilisées ont été choisies pour réduire le plus possible toute souffrance qu’auraient pu ressentir les animaux. Les points limites seront basés sur l'examen visuel des signes suivant: immobilité́, difficultés respiratoires (râle, respiration rapide..), position anormale (dos vouté, couché sur le coté..), réduction de la mobilité́ (faiblesse musculaire, ataxie, tremblements, paralysie..), perte de poids rapide ou progressive, mauvais état du pelage (poil ébouriffé́, mal entretenu..), vocalisation, pâleur des yeux ou des extrémités, automutilation. Pour cela, une échelle d'évaluation avec score est utilisée.
Choix des espèces
Ce projet nécessite d'induire une fibrose pulmonaire, de réaliser des explorations fonctionnelles respiratoires et de prélever des tissus. Il n'existe donc pas d'alternative à l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques dans notre contexte. Notre choix c'est porté sur la souris car c'est un modèle qui s'héberge et se reproduit facilement. D'autre part, le modéle murin de fibrose pulmonaire induite par instilation intra-trachéale de bélomycine est un modéle validé dans la littérature et courament utilisé. Il est parfaitement décrit et Il a permis la description de multiples phénomènes moléculaires et cellulaires impliqués dans la fibrogénèse pulmonaire et a été utilisé pour tester de nombreuses stratégies thérapeutiques. Pour réaliser notre étude, nous avons besoin que le système ventilatoire soit mature et fonctionnel. Cependant, les souris jeunes semblent moins sensibles à la bléomycine comparées aux souris âgées. Cependant, Il est bien décrit dans la littérature que les souris C57Bl6/J plus âgées, développent une fibrose pulmonaire plus sévère, ce qui risquerait d’induire une surmortalité. Le compromis qui a été choisis est un âge de 8 semaines.
Utilisation d’embryons de lapin pour produire des cellules souches pluripotentes et contrôler leur capacité de colonisation embryonnaire.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
635 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la plupart tués (565), une partie réutilisée (60) et quelques individus transférés vers un élevage ou une association. Les femelles subissent une superovulation par sept injections d'hormones en quatre jours et des transferts d'embryons sous anesthésie avec interruption de gestation, les adultes des biopsies de peau et prises de sang. Le projet produit des embryons pour en cultiver les cellules souches et étudier leur capacité à coloniser un embryon hôte. Le porteur affirme impossible de remplacer la production d'embryons de lapin et présente la superovulation comme un moyen de réduire le nombre de femelles utilisées.
Objectifs
Les cellules de l’embryon très précoce ont une propriété unique, à savoir la capacité de produire tous les types de cellules d'un organisme adulte. Cette propriété peut être étudiée en injectant les cellules embryonnaires dans des embryons hôtes pour créer des chimères, c’est-à-dire des embryons constitués de cellules de deux origines différentes. Notre projet vise à comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires qui régissent la capacité des cellules embryonaires à produire des embryons chimères chez le lapin. Ce projet nécessite l’utilisation de nombreux embryons et par conséquent de nombreuses lapines superovulées. Le lapin est ainsi choisi comme espèce modèle, d’une part pour sa capacité à produire de grandes quantités d’embryons, et d’autre part pour les caractéristiques communes de son développement embryonnaire avec celui de l’Homme.
Bénéfices attendus
Les cellules de l’embryon précoce représentent un outil extraordinaire à la fois pour la recherche fondamentale et la recherche appliquée, aussi bien en médecine humaine que vétérinaire, grâce à leur capacité à produire tous les types de cellules d'un organisme adulte. Les connaissances fonctionnelles acquises sur les cellules de lapin permettront d’améliorer les conditions d’utilisation des cellules humaines dans le cadre de thérapies cellulaires de maladies dégénératives. Elles permettront également de créer des modèles de maladies humaines, de thérapies cellulaires ou de développement embryonnaire.
Procédures
Trois types d’interventions sont prévues : 1. Prélèvements de peaux et de sang sur animaux vigiles adultes avec anesthésie locale : une fois par animal, durée de l'expérimentation 10 minutes (40 minutes avec le temps d'action de la pommade anesthésiante), 5 mâles et 5 femelles. 2. Traitement de superovulation sur lapines : une fois par lapine, 7 injections d’hormones sur 4 jours, 411 femelle. 3.Transferts embryonnaires sur lapines anesthésiées : 1 fois par lapine, durée de l'opération 1h15 jusqu'au réveil, 214 lapines prévues.
Impact sur les animaux
Les lapines subiront de courts désagréments liés aux injections d’hormones ou de produits anesthésiants. Elles éprouveront un léger stress lors de la réalisation d’inséminations artificielles et de faibles douleurs lors des chirurgies de transfert embryonnaire. Les lapins sentiront aussi un léger stress et une faible douleur lors de la réalisation de biopsies au niveau des oreilles.
Devenir
La plupart des procédures nécessitera la mise à mort des animaux (lapines productrices d'embryons et lapines receveuses d’embryons avec interruption des gestations). Les animaux adultes utilisés pour des prélèvements de peau et de sang seront réutilisés : les mâles pour fournir du sperme pour les reproductions et les femelles pour produire des embryons. Les femelles ayant subi un transfert embryonnaire avec un développement à terme pourront être réutilisées pour des productions d'embryons. Les mâles inféconds seront proposés à l'association GRAAL.
Remplacement
Du fait de la nature intrinsèque du projet, à savoir la compréhension de la capacité des cellules embryonnaires à créer des embryons chimères, il est impossible de remplacer la production d’embryons de lapin. Ces embryons seront utilisés pour mettre leurs cellules en culture ou pour tester les propriétés de celles-ci. Cependant, une fois les cellules embryonnaires en culture, différents tests cellulaires et moléculaires permettront de définir la qualité de ces cellules, afin d’étudier in vivo, uniquement celles montrant un réel potentiel à produire des embryons chimères.
Réduction
Le recourt aux superovulations permettra de diminuer d’un tiers le nombre de lapines utilisées pour produire les embryons, avec 20 à 30 embryons obtenus en moyenne par femelle au lieu de 8 à 12. De plus, nous utiliserons pour produire et transplanter des embryons, des lapines ayant déjà donner naissance à des lapereaux, dont on connait ainsi le potentiel reproducteur, afin d’éviter d’employer des lapines stériles. Le nombre d’embryons nécessaire pour les tests de colonisation embryonnaire (50 embryons par lignée cellulaire) a été choisi pour pouvoir valider les résultats d’un point de vue statistique et assurer la pertinence de l’effet biologique, à savoir l’existence d’une réelle différence dans les taux de colonisation entre cellules testées et cellules contrôles. De plus, ces tests seront progressifs avec un arrêt du développement des embryons injectés à 4, 6 ou 10 jours et une évaluation du niveau de colonisation obtenu, afin de ne poursuivre les analyses que des lignées cellulaires présentant de forts potentiels de colonisation embryonnaire et donc limiter au maximum le nombre de lapines utilisées.
Raffinement
Les animaux seront nourris deux fois par jour, avec le matin une dose de croquette appropriée à leur état et leur âge et une grosse poignée de foin et avec l'après-midi des légumes frais (choux, salade, persil, carottes, radis...). Les lapins seront surveillés tous les jours par des animaliers qualifiés, et régulièrement placés pendant 24h à 48h dans une aire de récréation de 1,2 m2 comportant du foin, différents jouets (bâton à mâcher, balle, chaîne pendue) et objets pour se cacher (carton, banc, tunnel) et leur permettant de courir et de bouger plus facilement. Le choix des animaux à placer en récréation dépendra du temps qu’ils resteront à l’animalerie, les mâles étant prioritaires car ils seront gardés environ 2 ans, ainsi que les femelles receveuses et/ou gestantes qui seront sur places pendant un à deux mois.
Choix des espèces
Le but de notre projet étant de comprendre les mécanismes qui permettent aux cellules de l’embryon très précoce de coloniser un embryon hôte et de donner toutes les cellules composant un organisme adulte, le lapin est un animal modèle intéressant à plusieurs titres. Il présente de nombreux avantages en élevage, tels que sa taille moyenne, sa prolificité, son intervalle de génération court et sa forte production embryonnaire. De plus, le lapin est plus apparenté aux primates que ne l’est la souris, et présente un développement embryonnaire et un mode d’implantation dans la muqueuse utérine identiques à ceux des primates. Ainsi les cellules de l’embryon très précoce de lapin permettraient de développer différents modèles d’étude de maladies humaines, de thérapie cellulaire ou de développement embryonnaire. Tous les animaux seront utilisés en âge de reproduction, soit entre 5 et 30 mois pour les mâles et entre 9 et 36 mois pour les femelles ayant déjà eu une mise-bas.
Etude des bénéfices d’extraits de levures riches en nucléotides pour prévenir le risque d’inflammation de l’intestin chez la truite arc-en-ciel juvénile
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
180 truites arc-en-ciel juvéniles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries douze semaines avec cinq aliments différents, la moitié reçoit ensuite une injection simulant une infection bactérienne qui déclenche une réponse inflammatoire et un comportement de fièvre. Huit heures plus tard, toutes sont anesthésiées puis tuées pour prélever foie, intestin, rate et sang. Le projet cherche à valider des aliments aquacoles entièrement végétaux, le porteur indiquant avoir réduit les conditions par des tests in vitro préalables mais jugeant l'étape sur poisson vivant nécessaire pour la filière.
Objectifs
Les farines et les huiles de poisson sont des ingrédients traditionnels utilisés dans les aliments aquacoles pour nourrir les espèces de poissons carnivores comme les salmonidés. Issus principalement de la pêche, les volumes de production de ces matières premières marines sont stables depuis les années 80 et la mise en place des quotas de pêche. Aussi, la disponibilité en farine et l’huile de poissons devient de plus en plus limitante vis-à-vis de la demande croissante émanant de l’aquaculture. Pour assurer le développement durable de l’aquaculture, la farine et l’huile de poissons doivent faire l’objet d’un remplacement par des sources végétales abordables, adaptées aux besoins nutritionnels des poissons et respectueuses de l’environnement. Cependant, l’utilisation de régimes à base de plantes dépourvus de farine et d’huile de poisson ne favorise pas une croissance optimale de la truite arc-en-ciel. En nutrition animale, les extraits de levures sont souvent utilisés pour améliorer la santé des animaux et leur croissance. Après avoir démontré les effets anti-inflammatoires de certains extraits de levures en utilisant des cultures de cellules d’intestin de truite, nous souhaitons maintenant confirmer ces effets chez de jeunes truites arc-en-ciel en tant que complément alimentaire. Des jeunes truites arc-en-ciel seront donc nourries avec des aliments 100% végétaux contenant des levures. Après 12 semaines d’alimentation, nous évaluerons si l’utilisation des levures dans l’alimentation favorise la croissance et augmente la résistance du poisson en cas d’inflammation.
Bénéfices attendus
Cette expérience permettra d’améliorer l’efficience des aliments végétaux destinés aux jeunes truites arc-en-ciel. La filière pourra ainsi bénéficier d’aliments aquacoles 100% végétaux tout aussi performants que ceux contenant actuellement des huiles et farines de poissons et d’un moyen d’améliorer la robustesse des poissons.
Procédures
Dans cette expérimentation, 180 jeunes truites arc-en-ciel seront maintenues dans des conditions classiques d’élevage pendant 12 semaines et nourries avec 5 aliments différents répondant aux besoins alimentaires des poissons. A l’issue des 12 semaines, une moitié des poissons sera soumise à une injection de produit simulant une infection bactérienne (groupe traité) et l’autre moitié sera soumise à une injection de solution saline (groupe contrôle). La durée de l'injection dure en moyenne une dizaine de secondes. Huit heures après injection, les poissons seront anesthésiés puis euthanasiés et différents tissus (sang, foie, intestin et rate) seront prélevés sur ces animaux morts. Ce délai de huit heures a été démontré dans des études précédentes, comme nécessaire et suffisant pour observer une réponse inflammatoire. Les poissons seront également mesurés et pesés afin d’évaluer un potentiel effet des différents régimes alimentaires sur la croissance des poissons.
Impact sur les animaux
L'élevage ne créera aucune nuisance ou effet indésirable sur les animaux car c'est un protocole classique d'élevage avec des aliments qui répondent entièrement aux besoins nutritionnels des poissons. Les effets connus de l’injection que nous allons appliquer sont une augmentation de la réponse immunitaire ainsi qu’un comportement de fièvre chez la truite arc-en-ciel. Ces injections ne sont pas létales mais nous ne sous-estimons pas l’impact de cette inflammation déclenchée chez le poisson. Ainsi nous avons sélectionné la plus petite dose ainsi que le temps le plus court possible afin d’observer une réponse inflammatoire. Afin de réduire le stress potentiel engendré par la manipulation puis l’injection, chaque poisson sera capturé avec une épuisette puis placé sous anesthésie générale afin de procéder à l’injection. Les manipulations des truites arc-en-ciel seront effectuées par des personnes expérimentées et familiarisées avec l'espèce.
Devenir
Huit heures après l’injection, la totalité des poissons seront anesthésiés puis euthanasiés afin de prélever des échantillons de foie, d’intestin, de rate et de sang.
Remplacement
Cette étude se propose d’étudier la robustesse de la truite arc-en-ciel nourrie avec des régimes 100% végétaux supplémentés avec des extraits de levures. En amont de cette expérience, nous avons réalisé des études in vitro sur des cellules d’intestin de truite afin de définir les doses d’extrait de levures potentiellement les plus efficaces pour induire une résistance à une inflammation cellulaire. Cette première étape in vitro nous a permis de réduire le nombre de conditions expérimentales à tester in vivo. Cependant, afin de valider les observations faites in vitro et envisager l’utilisation de ces produits en aquaculture, nous ne pouvons pas exclure cette étape d’expérimentation animale.
Réduction
Le nombre de poissons à utiliser pour cette expérience a été minimisé, en considérant les différences de réactions que chaque poisson peut avoir face à ce type d’injection. Pour ces calculs, nous avons utilisé un logiciel qui permet de s’assurer que le nombre de poissons sera tout de même suffisant pour que les résultats soient fiables.
Raffinement
Afin de limiter les nuisances sur les animaux utilisés au cours de l’expérience les différents points seront assurés : le volume d'eau adapté avec renouvellement en continu, le rythme jour/nuit naturel, et le nombre de poissons par bassin pour exprimer un répertoire comportemental riche. Du début de l’élevage et jusqu’au grossissement des poissons la taille des bassins sera adaptée de façon à respecter une densité d’élevage appropriée à la truite arc-en-ciel. Tout au long de la croissance, le comportement et les mortalités seront contrôlés quotidiennement, lors de chaque repas. Ce suivi quotidien du bien-être animal sera évalué à l’aide d’une fiche d’évaluation quantitative du point limite. Cette évaluation est basée sur deux grands critères : comportemental et physique. Dans les critères comportementaux, il sera évalué (scores allant de 1 à 3 suivant la sévérité) : la prostration et l’isolement prolongé de l’animal, la nage anormale, la prise alimentaire perturbée et la position inhabituelle dans la colonne d’eau. Concernant les critères physiques, il sera évalué le changement du volume anormal (ex : maigreur observé par la tête plus grosse que le corps), les lésions comportementales dues aux blessures ou maladies, l’apparition de malformations (scoliose, exophtalmie, tumeur) ainsi que l’aspect général de la peau et des nageoires. Si une note de 3, qui correspond au point limite ultime, est scorée sur un des points à évaluer, l’animal sera euthanasié aussitôt via les procédures réglementaires. La manipulation des truites-arc-en-ciel sera effectuée par des personnes expérimentées et familiarisées avec cette espèce. Les injections seront réalisées sous anesthésie générale et ne dureront qu’une dizaine de secondes par poisson. Le stress au réveil sera évalué selon les comportements décrits ci-dessus.
Choix des espèces
La truite arc en ciel est choisie en raison de son importance agronomique et commerciale. L’expérimentation sera réalisée sur des truites arc-en-ciel de 10 à 15g. Cette taille de poissons permet la collecte d’échantillons tissulaires dont les tailles sont compatibles avec la réalisation de plusieurs analyses.
Rôle des interneurones corticaux de la couche 1 chez la souris (Mus musculus)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent du tamoxifène par voie intrapéritonéale cinq jours durant, des vecteurs viraux insérant des gènes, des chirurgies crâniennes sous anesthésie, puis sont fixées environ une heure, vigiles, pour des enregistrements électrophysiologiques pendant des stimulations. Le porteur mentionne des complications rares comme infections, douleurs chroniques ou baisse de température, et tue toutes les souris pour des prélèvements post-mortem. Cette recherche fondamentale sur les circuits du cortex vise à éclairer des maladies comme la schizophrénie ou l'autisme, le porteur affirmant qu'aucune lignée cellulaire ne reproduit la physiologie des neurones.
Objectifs
Les déficits cellulaires, les connexions et les circuits du cerveau sont responsables de nombreuses maladies graves telles que l'épilepsie, la schizophrénie, l'autisme et la dépression. Le cortex cérébral, qui est la partie du cerveau responsable des fonctions cognitives complexes, intègre les informations sensorielles. Cela se fait grâce à des interactions précises entre différents types de cellules du cerveau. Notre projet de recherche vise à comprendre comment ces cellules du cortex cérébral se connectent les unes aux autres et comment ces connexions contribuent aux changements dans le fonctionnement du cerveau, qui sont perturbés dans les maladies cérébrales. Nous nous concentrons en particulier sur une couche spécifique du cortex appelée couche superficielle 1 (L1), qui joue un rôle clé dans l'intégration des informations sensorielles et contextuelles. Les cellules spécifiques de cette couche, appelées interneurones L1, ont différentes caractéristiques structurelles et fonctionnelles. Cependant, nous ne savons pas encore comment ces différentes populations de cellules interneuronales contribuent à l'intégration des informations contextuelles avec les stimuli sensoriels. Nous avons découvert que de nombreux neurones de la couche L1 expriment un récepteur appelé récepteur cannabinoïde de type 1 (CB1), qui joue un rôle important dans les changements des connexions inhibitrices entre les cellules du cerveau. Ces changements pourraient avoir un rôle clé dans la transmission des informations contextuelles vers la couche L1 lors du traitement sensoriel. Nous supposons que les sous-groupes de neurones CB1-positifs et CB1-négatifs dans la couche L1 sont activés de manière différente par des informations contextuelles provenant de différentes voies du cerveau, ce qui influence la flexibilité du traitement sensoriel. Notre projet se concentre sur le cortex visuel des souris. Nous espérons que cette recherche nous aidera à mieux comprendre les mécanismes spécifiques des circuits neuronaux impliqués dans la perception sensorielle, ce qui pourrait conduire au développement de nouvelles thérapies pour le traitement des maladies cérébrales.
Bénéfices attendus
Les maladies du cerveau ont un impact important sur la santé, l'autonomie, l'éducation, l'emploi, la mobilité et les relations personnelles des individus, ce qui représente un fardeau considérable sur le plan social et économique. Il est crucial de comprendre les caractéristiques de base qui régissent les connexions entre les différents types de neurones dans le cerveau, tant dans des états normaux que pathologiques. En particulier, les problèmes liés au développement des circuits inhibiteurs du cortex cérébral sont impliqués dans des troubles neurologiques tels que la schizophrénie, la dépression et l'autisme. Cependant, nous avons encore beaucoup à apprendre sur l'organisation des microcircuits inhibiteurs, notamment dans la couche L1, aussi bien dans des conditions normales que dans des troubles. Nous espérons que ces études nous aideront à découvrir de nouvelles approches thérapeutiques pour ces maladies. En utilisant des souris génétiquement modifiées, nous pourrons cibler des types spécifiques de cellules et de réseaux, ce qui nous permettra de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques des maladies du cerveau.
Procédures
Toutes les souris seront injectées avec du tamofixen par voie intrapéritonéale (IP) au stade adulte (3 min/animal) pendant 5 jours. Une partie des souris transgéniques recevra une insertion de gènes au stade adulte en utilisant des vecteurs viraux. Toutes les souris seront recevront un traitement anti-douleur (3 min/animal). Les souris sont anesthésiées pour les chirurgies (30-40 min/animal). Une autre partie des souris recevra une insertion de gènes en utilisant des vecteurs viraux couplé à un système qui permettra soit l’imagerie soit les enregistrement électrophysiologiques (40 à 60 min /animal). Pour les enregistrements en électrophysiologie, les souris seront préparées sous anesthésie (pendant 15 min) puis réveillées pour être vigiles au moment des stimulations qui engendrent des activités neuronales, sujets de nos études. Les enregistrements nécessitent la fixation de l’animal pendant environ 1h, des séances d’habituation sont prévues pour préparer l’animal (1h). Toutes les souris seront injectées avec une injection d’un anti-inflammatoire par voie sous-cutanée (3 min/animal) et anti-douleur (3 min/animal), 30 min après seront anesthésiées pendant toute la durée de la chirurgie (30-40 min/animal). Une autre partie de souris transgéniques adultes subiront insertion de gènes par vecteurs viraux, et couplé à un système qui permettra soit l’imagerie soit les enregistrement électrophysiologiques. Toutes les souris seront injectées avec une injection d’un anti-inflammatoire par voie sous-cutanée (3 min/animal) et anti-douleur (3 min/animal), 30 min après seront anesthésiées pendant toute la durée de la chirurgie (30-40 min/animal). Pour les enregistrements électrophysiologiques, le jour de l'expérience, les souris seront brièvement anesthésiées (15 min/animal) et une électrode à haute densité sera descendu pour permettre l'enregistrement électrophysiologique. Le jour de l’euthanasie tous les souris seront injectées avec l’analgésique (3 min/animal) 10 min avant l’euthanasie (3 min/animal).
Impact sur les animaux
Le génotype des souris que nous utilisons n'a pas été associé à des effets indésirables connus sur les animaux. En général, nos interventions sont bien tolérées par les souris et n'affectent pas leur apparence ou leur comportement général. Cependant, il peut arriver très rarement que certaines complications se produisent, telles que des infections, des douleurs chroniques (visibles par une prostration, un mauvais ou un manque de toilette, une posture voutée), des saignements pendant les chirurgies ou une baisse de température pendant la procédure. Bien que beaucoup plus rares, il est également possible que les fils utilisés lors des chirurgies se détachent. L'injection intrapéritonéale de tamoxifène doit être réalisée sur une période de 5 jours. Ces injections sur 5 jours peuvent provoquer un certain stress lié à la manipulation de l'animal et des réactions locales possibles. Il est possible que l'administration d'injections pendant 5 jours consécutifs entraîne une légère perte de poids chez l'animal. Cependant, dans les heures qui suivent la chirurgie, il est possible que l'animal présente une réduction de l'activité spontanée. L'expérience de stimulation visuelle nécessite que l'animal soit éveillé et maintenu immobile, tandis que plusieurs essais de stimulations visuelles lui sont présentés. Cela nécessite une période d'adaptation à l'environnement d'enregistrement. Lors des deux premières séances, les animaux peuvent présenter des signes de stress tels que la présence de déjections sur le tapis roulant circulaire. Cependant, ces signes diminuent au fur et à mesure des séances à mesure que l'animal s'habitue à son environnement. Il est important de surveiller attentivement les souris tout au long de ces procédures et de signaler tout problème ou changement anormal à l'équipe de recherche.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasies en fin d’experience. Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Il n’y a pas d’autres alternatives à l’utilisation d’animaux pour ces expériences, car des modèles adéquats du circuit cortical contenant le nombre, les types et la localisation appropriés de récepteurs dans les réseaux excitateurs et inhibiteurs ne sont pas disponibles. L'objectif de nos expériences est de découvrir les actions des gènes, des neuromodulateurs et des médicaments sur les circuits neuronaux dans le cerveau intact. Il s'agit d'une question empirique qui nécessite l'examen de circuits intacts pour y répondre. Il n'existe aucune lignée cellulaire qui récapitule avec précision la physiologie des neurones des animaux, et comme nos expériences étudient les interconnexions entre les neurones qui se produisent dans le cerveau intact, De plus, il n'existe aucun modèle remplaçant l'utilisation d'animaux qui permettrait d'étudier les propriétés du reseau dans le cerveau entier d’un animal vigile.
Réduction
Le nombre total d'animaux impliqués dans ce projet (n = 1650) est calculé en tenant compte des mesures de réduction. Le nombre d'animaux utilisés dans les procédures sera réduit en effectuant différentes procédures sur un seul animal : les animaux recevront les injections virales seront implantés pour l'électrophysiologie ou l’imagerie simultanément afin de maximiser les mesures longitudinales multiples sur le même animal. Toutefois, les avantages de la réutilisation des animaux seront mis en balance avec les effets négatifs sur leur bien-être, en tenant compte du cumul sur toute une vie de l'animal. En outre, notre expertise dans l'entraînement des souris à être fixé par la tête dans l'installation d'imagerie ou d'électrophysiologie réduira également la variabilité et, dans une large mesure, les nombres globaux nécessaires pour obtenir une signification statistique dans les cohortes. Enfin, notre choix de la taille de l'échantillon est basé sur des études précédentes et est cohérent avec ceux généralement employés dans le domaine. La taille de chaque groupe sera déterminée par l'utilisation de tests statistiques appropriés, y compris le calcul de puissance. La taille réelle de l'échantillon, et donc la signification statistique, dépendra de la variabilité de la lecture biologique. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les méthodes utilisées et la manière de traiter les animaux pendant les expériences et dans l’animalerie assureront à ces derniers un minimum de contraintes et un maximum de bien-être. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les procédures expérimentales sont les plus appropriées pour minimiser toute douleur, souffrance, anxiété/détresse ou dommage que les animaux pourraient subir. Des mesures telles que la formation du personnel, l'habituation, l'acclimatation et le temps de récupération sont prises pour réduire tout impact physique et psychologique potentiel des procédures expérimentales. Les conditions d'élevage et d'hébergement (enrichissement de l'environnement avec des carrés de coton, kraft et maisonnettes) sont mises en œuvre afin d'accroître autant que possible le bien-être des animaux. La préférence pour les procédures non invasives par rapport aux procédures invasives est prise en considération et, lorsque des interventions invasives sont nécessaires, les directives appropriées en matière d'anesthésie/analgésie seront suivies, auprès du comité interne de l'institution, chargé de la prise en charge du Bien-être animal (strutucture chargée du bien-etre animal) . Les animaux auront à manger et à boire à volonté. Des croquettes adaptées à la gestation et à l’allaitement seront mise à disposition pour les animaux en accouplement. Des points limites sont mis en place et sont respectés pour limiter toute souffrance aux souris utilisées
Choix des espèces
Les propriétés de base des microcircuits neuronaux chez la souris sont similaires à celles d’autres mammifères. Actuellement seulement les modeles murins nous permettent de visualiser les types d’interneurones que nous voulons étudier. Les approches expérimentales multiples réalisées chez la souris permettent une analyse complète allant du comportement jusqu’à l’activité d’un seul neurone. Les souris peuvent être génétiquement modifiées révélant ainsi la fonction de gènes spécifiques. De plus, chez la souris, la période de gestation est courte et les portées sont importantes, permettant de produire suffisamment d’animaux pour plusieurs expériences à partir de peu de fondateurs. Le développement du cerveau est très bien caractérisé, ce qui facilite les études anatomiques et fonctionnelles. Nous maitrisons suffisamment les techniques proposées dans ce projet pour réduire le nombre d’animaux au strict nécessaire pour nos expériences. Les lignees que nous utiliserons ne présentent pas de phenotype dommageable. Des animaux adultes seront utilisés pour toutes les procédures (entre P35 et P150). Toutes les procédures nécessitent des interventions chirurgicales qui ne peuvent être pratiquées que sur des animaux adultes. Nos animaux sont identifiables par tatouage des phalanges et un petit prélèvement de l’extrémité de la queue est nécessaire à leur génotypage.
Evaluation de nouveaux traceurs d’imagerie dans un modèle murin de glioblastome sous-cutané chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Une tumeur de glioblastome est greffée sous leur peau, puis elles reçoivent un traceur d'imagerie par voie intraveineuse sous anesthésie avant une séance d'imagerie de trois heures. Le porteur signale que la tumeur peut entraîner une perte de poids et des signes de souffrance comme le poil hérissé ou la prostration, une perte de plus de 15 % du poids déclenchant la mise à mort. Toutes sont tuées pour des analyses d'immunohistochimie, le porteur affirmant qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer l'"animal entier" pour étudier la biodistribution.
Objectifs
Nous travaillons sur le développement de nouveaux traceurs d’imagerie qui permettront d’explorer in vivo les 2 enzymes clés intervenant dans le métabolisme du tryptophane. Chez l’humain des perturbations de ce métabolisme, présent dans un grand nombre de tissus et cellules, sont associées à une très large diversité de pathologies, du cancer aux affections du système nerveux central. Ces perturbations se traduisent le plus souvent par une augmentation de l’expression de ces enzymes. Leur détection in vivo a donc un fort potentiel d’applications cliniques telles que la détection de tumeurs ou le développement de stratégies thérapeutiques visant à moduler cette expression. Des radiotraceurs dérivés du tryptophane utilisables en imagerie ont déjà été proposés pour de telles applications, mais leur utilisation est limitée notamment pour des raisons de complexité du radiomarquage. Une alternative est de développer de nouveaux traceurs issus non pas du tryptophane mais de composés (petites molécules) se liant aux enzymes impliquées.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier de nouveaux traceurs d’imagerie capables de se lier spécifiquement à deux enzymes majeures du métabolisme du tryptophane. Après une caractérisation plus précise de leurs propriétés, ces traceurs pourraient être proposés pour le diagnostic, le suivi et le traitement de nombreuses affections cancéreuses ou neurologiques.
Procédures
injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse suivi d’une imagerie de 3h, 1 fois par animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables peuvent être des dommages liés au développement de la tumeur sous-cutanée, soit une perte de poids de 15% , soit une modification de la physiologie ou du comportement . Dommages pouvant être liés à l’imagerie : chute de la température corporelle (diminution de 2°C et inférieur à 35°C), la respiration, les battements cardiaques des animaux. Un hématome peut se former suite à la cathéterisation de la veine caudale de l'animal. Des signes de souffrance (poils hérissés, prostration, …).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser des études d'immunohistochimie complémentaires aux études d'imagerie.
Remplacement
L’objectif du projet étant de développer un traceur d’imagerie utilisable chez l’humain, aucun modèle in vitro n'est à même de remplacer l'animal entier étant donnée la complexité des processus mis en jeu, et ne permet d’étudier la biodistribution d'un composé dans tous les organes d'un individu. Le recours à l'animal entier, vivant, est indispensable pour l'étude de la biodistribution/ciblage de nouvelles sondes d'imagerie.
Réduction
L’utilisation de la méthode d’imagerie in vivo au cours de ce protocole va permettre de réduire le nombre d’animaux utilisé qui est néanmmoins dicté par les groupes expérimentaux réquis pour l’obtention de résultats permettant de répondre à la question scientifique posée. La première étude permet grâce à l’imagerie d’évaluer la cinétique du radiotraceur de manière continue. Les moyennes de captation du traceur dans la tumeur et les différents tissus seront comparés entre les 3 groupes d’animaux en utilisant des tests statistiques appropriés au projet . Nous prévoyons d’inclure un total de 14 animaux/groupe (3 groupes), afin de garantir un nombre minimum exploitable de 10/groupe en raison de la probable hétérogénéité de la taille des tumeurs entre les animaux au sein d’un même groupe, et les difficultés imprévues pouvant survenir au cours des sessions d’imagerie (par exemple injection i.v. du traceur, problème d’anesthésie). Nous envisageons donc d'inclure 8 animaux/ traceur pour définir la cinétique puis 50 animaux/ traceur pour mesurer l'accumulation dans les tumeurs. Nous estimons à 5 le nombre de traceurs testés au cours de ce projet soit un total de 250 animaux.
Raffinement
Dès leur arrivée, les souris seront hébergées en portoir ventilé afin d’empêcher le phénotype dommageable lié à l’immunodéficience. Elles seront hébergées en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique). Elles seront observées une à 2 fois par jour et des points limites prédictifs (perte de poids >15% du poids initial, nécrose de la tumeur, détérioration de l'aspect général, de la physiologie clinique ou de la locomotion) nous permettront de prendre les mesures nécessaires afin d’éviter toute souffrance avant la session d’imagerie. Toutes les stratégies d'analgésie, d'anesthésie et de soin seront mises en oeuvre pour réduire au maximum tout inconfort. Avant l'imagerie, les animaux auront une phase d'habituation à l'environnement de la pièce pour éviter le stress lors de l'imagerie. Pour l’imagerie, les animaux seront soumis à une anesthésie gazeuse: cuve d’induction puis maintien pendant toute la durée de l'imagerie . Une protection occulaire sera appliquée pendant toute la durée de l’imagerie (3 h). Nous appliqerons également une crème anesthésiante sur la queue de l’animal lors de l’installation du cathéter à la veine caudale. L’animal sera maintenu durant toute l’expérimentation sur un tapis chauffant. Nous assurerons une surveillance continue du rythme respiratoire et de la température corporelle de l’animal et le surveillerons jusqu’à son réveil complet.
Choix des espèces
Ce modèle animal nous donne la possibilité d’utiliser des techniques d’imagerie in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la biodistribution/le ciblage de nouvelles sondes d'imagerie. Modèle de cancer réalisable chez le jeune animal (6 à 10 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, il est possible qu’une légère immunocompétence apparaisse, augmentant ainsi le risque de rejet de greffe tumorale.
Effet de la Fluoroethylnormemantine (FENM) à long terme sur un modèle pharmacologique de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur induit une maladie d'Alzheimer par injection intracérébrale d'un peptide amyloïde, administre une molécule chaque jour par voie intrapéritonéale, puis évalue la mémoire par le labyrinthe en Y, le test d'évitement passif avec un stimulus aux pattes, la reconnaissance du nouvel objet et le test du Hamlet. Toutes les souris sont ensuite tuées pour des analyses biochimiques post-mortem. Le porteur affirme le modèle murin "indispensable" et "seul recours in vivo" pour observer l'effet de la molécule sur la mémoire.
Objectifs
Ce projet a pour but d'évaluer l'effet de la Fluoroethylnormemantine (FENM) à long terme sur des modèles de rongeurs de la maladie d'Alzheimer (MA). Une étude préliminaire a démontré l'efficacité supérieure de la FENM en comparaison de la Mémantine (médicament utilisé pour la prise en charge des patients atteints par la MA). Cependant l'effet de la Mémantine est connu pour son manque d'éfficacité dans le temps et ses nombreux effets secondaires. C'est pourquoi la FENM a été testée en comparaison de la Mémantine dans un modèle de souris de la maladie d'Alzheimer sur 2 mois de traitement. Contrairement à la Mémantine où après 1 mois de traitement son efficacité est nulle, la FENM maintient le processus de mémorisation des animaux traités et cela même après un arrêt de traitement. Afin de compléter ses résultats et dans l'objectif d'un développement clinique de la molécule, la FENM sera administrée sur deux modèles de rongeurs de la MA après un traitement à la mémantine pour juger de sa supériorité dans le temps par rapport au médicament de référence. De plus l'efficacité de la FENM sera évaluée après un traitement à long terme dans un milieu reproduisant les comportements naturels des animaux afin cette fois-ci d'évaluer la mémoire spatiale et topographique des animaux (mémoire faisant appel à notre orientation dans un environnement) des animaux, expérience jamais encore étudiée.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but de préciser les effets pharmacologiques "in vivo" à long terme d'une molécule neuroprotectrice très efficace sur les modèles précliniques de la maladie d'Alzheimer. Ces informations apporteront des précisions importante quant au futur développement clinique de cette molécule de nouvelle génération.
Procédures
3 procédures au sein de ce projet concerneront une administration d'un peptide, ou de l'eau distillée, dans le ventricule droit des animaux par injection intra-cerébro-ventriculaire (ICV). Cette procédure sous anesthésie générale ne dure pas plus d'une minute, et se réalise une seule fois sur les animaux en début de procédure. Pour les tests de comportement, le labyrinthe en Y (8 min) (procédures 1-4), le test d'évitement passif (2 fois 5 min), le test du nouvel objet (3 fois 10 min) (procédures 1 à 3) et le test du Hamlet (2 semaines d’entrainement à 4h/jour pendant 10 jours et 2 fois 10 min pour le probe test (test de mémoire topographique, procédure 4 seulement)) seront réalisés au cours des procédures. Lors de l'apprentissage dans le test d'évitement passif les animaux reçoivent un stimulus non douloureux au niveau des pattes. Toute variation importante de la sensibilité aux stimulus conduit à l'arrêt de la procédure. Afin de traiter ces animaux, une injection intrapéritonéale quotidienne (tous les jours, 24h d'intervalle) sera réalisée sur la durée de la procédure expérimentale (ne dépassant pas 2 mois). En fin d'expérience les animauxseront euthanasiés et les échantillons seront prélevés pour analyses biochimiques.
Impact sur les animaux
Concernant le modèle pharmacologique induit par l'injection intra-cérébro-ventriculaire de peptide amyloide, la procédure d'injection peut induire du stress chez l'animal. Les animaux utilisés subiront deux autres types de stress modéré : une injection intrapéritonéale quotidienne et, un test d'évitement passif permettant d'évaluer la mémoire à long terme. Pour cela, un léger stimulus non douloureux sera produit au niveau des pattes de la souris. Les effets attendus sont un retardement des effets néfastes de la MA notamment sur les différents types de mémoires (court terme, long terme, spatiale et orientation dans un environnement soit topographique) sans effet secondaire.
Devenir
A la fin de chaque procédures les animaux seront euthanasiés afin de recupérer le matériel biologique permettant des analyses biochimiques post-mortem.
Remplacement
Afin de déterminer l'efficacité de la FENM, les tests doivent se faire « in vivo » en vue d’un éventuel développement clinique. De plus, l’utilisation de modèles murins de la MA pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours « in vivo » autre que l’humain à présenter les symptômes pathologiques de la MA. Les approches in silico ou in vitro ou ex vivo ne permettent pas d’étudier l’effet de la molécule FENM sur le comportement des animaux notamment sur la mémoire spatiale de travail ou mémoire topographique ou de reconnaissance. Il est aussi impossible de voir les potentiels effets indésirables de la molécule. A ce jour, afin d’envisager un développement clinique aucune autre alternative que l’animal ne peut être envisagé.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux les doses administrées aux animaux se baseront sur les doses efficaces observées sur un modèle aigu de la MA précédemment obtenus au laboratoire. Les analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux par groupe (12 souris/groupe) sauf pour l'une des procédure où nous pensons reproduire les résultats obtenus précédemment sur un fond génétique différent . Pour cela 6 souris/groupe sont nécessaires à l'étude. Une veille bibliographique sera également prise en compte tout au long du projet. Plusieurs structures du cerveau seront prélevées dans cette étude afin de concentrer un maximum d’échantillons et éviter ainsi de relancer des expérimentations.
Raffinement
De la naissance jusqu’à la fin de vie des animaux les procédures d’injections seront peu douloureuses avec une administration par voie intra-péritonéale. Pour les injections intra-cérébro-ventriculaires, une injection d'analgésique sera administrée afin de palier la douleur. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Les animaux seront aussi manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. Afin de suivre les animaux une feuille de bien-être, avec des points limites sera accessible à l’animalerie et complété par l’expérimentateur lorsque tout comportement suspect (plaie, lésions cutanées, agressivité, stéréotypie, apathie, convulsions, …) sera remarqué par celui-ci. Nous procéderons à l’enrichissement du milieu avec un accès à des copeaux de coton et des bâtons en bois et des cabanes en carton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid.
Choix des espèces
Le modèle souris est adapté aux protocoles comportementaux et déja utilisé dans les expériences antérieures au laboratoire. Les doses et mode d'administration sont donc connus. Les animaux seront étudiés à l'âge de 5 semaines qui correspond à l'âge adulte pour le modèle pharmacologique et aussi à partir de l'âge de 4 mois, âge auxquels les symptômes de la MA apparaissent dans le modèle transgénique.
Mise au point d’un modèle de migraine par injection de PACAP-38 chez des animaux mâles et femelles
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur induit une migraine par injection d'un neuropeptide, le PACAP-38, puis mesure la sensibilité de la face au moyen de filaments de Von Frey et de jets d'air répétés pendant quatre heures après chaque injection. Il décrit une douleur modérée dont l'animal peut s'écarter faute de contention, et tue tous les rats pour prélever leur cerveau. Le projet vise à mettre au point un modèle de migraine chez mâles et femelles, le porteur affirmant qu'aucune méthode ne peut remplacer l'observation in vivo de l'intégration de la douleur.
Objectifs
L’objectif du projet est de développer un nouveau modèle de migraine en se basant sur les derniers résultats scientifiques. Nous étudierons un nouveau neuropeptide présent dans le système trigémino-vasculaire mais également dans l’hypothalamus et la vascularisation des méninges. Ce composé jouerait un rôle dans l’inflammation neurogène ainsi que la modulation et la sensibilisation des neurones nociceptifs trigémino-vasculaires. Des étude récentes chez l’homme ont montré que l’administration de ce produit induit des crises de migraine chez des patients souffrant de migraine sans aura. Ainsi pour mimer les conditions cliniques, nous souhaitons utiliser l’administration systémique du neuropeptide pour provoquer l’activation du système trigémino-vasculaire chez le rat. Nous évaluerons les effets de ce neuropeptide sur le comportement de l’animal, mais également sur l’excitabilité du complexe trigémino-vasculaire en utilisant des marqueurs d’activation neuronale chez le mâle et la femelle. Nous souhaitons comparer d’une part l’activation des régions du système nerveux central chez les mâles et les femelles pour voir s’il y a des différences entre les mâles et les femelles, mais aussi en fonction des variations hormonales qui ont lieu pendant le cycle sexuel chez la femelle.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet nous permettra de développer un modèle animal plus proche de la clinique et des dernières études scientifiques. Ceci devrait nous aider par la suite à mieux comprendre les mécanismes de la crise de migraine, caractériser ses spécificités chez le mâle et la femelle et identifier de nouvelles thérapeutiques. En effet, la migraine est plus fréquente chez les femmes que les hommes, mais les études ont été majoritairement réalisées chez les mâles. Pourtant, il est connu qu’il existe des différences d’intégration inhérentes au sexe et au cycle hormonal. Ainsi à moyen terme, identifier les différences ainsi que le rôle des différentes régions cérébrales dans ce nouveau modèle murin de migraine nous permettra de mieux comprendre cette pathologie. Par ailleurs, on sait que les triptans sont les médicaments spécifiques de la migraine, malheureusement ces molécules ne sont efficaces que chez environ 60% des personnes suggérant que d’autres mécanismes triptan-indépendants sous-tendent la crise de migraine. Ainsi les découvertes récentes chez l’homme montrant que les triptans et les antagonistes du CGRP sont moins efficaces sur les céphalées induites, suggèrent que l’inhibition de la voie du neuropeptide étudié constitue une cible de choix pour développer de nouveaux traitements antimigraineux.
Procédures
Mesure de la sensibilité cutanée : les jours d’injection pendant 4h ; cette mesure se fait par l'application de filaments fins sur la peau de l'animal et par l’envoi d’un jet d’air toutes les 30 min pendant 4 h après l'injection des molécules en sous cutané (chaque application dure 3 secondes). Les jours entre les injections, la mesure se fait une fois.
Impact sur les animaux
Nous utilisons un modèle de migraine qui provoque une douleur modérée de l’animal. Cette douleur est ressentie après les injections, mais n’empêche pas les mouvements de l’animal. Enfin, les stimulations mécaniques avec les filaments de Von Frey ou les jets d’air avec l’AirPuff induisent un retrait de la face signe d’une douleur modérée. L’animal peut échapper à cette stimulation puisqu’il n’est pas en contention. Cette stimulation dure au maximum 3 secondes.
Devenir
La procédure ne permet pas de réutiliser les animaux. En effet, elle se termine par des études immunohistochimiques qui nécessitent de prélever le cerveau : les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique. Il est donc nécessaire de réaliser les observations chez l’animal in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Huit animaux par groupe est le nombre d'animaux nécessaire pour permettre de mettre en évidence une différence statistique entre eux (logiciel statistique dédié). Par ailleurs pour rendre compte des mécanismes sans doute différents chez l'homme et la femme (hormones différentes), nous avons besoin de réaliser l'étude à la fois chez les mâles et les femelles.
Raffinement
La nuisance identifiée sur le bien-être des animaux est la douleur engendrée dans le cadre du modèle. Concernant la douleur générée par l’application des stimulations mécaniques (à l'aide de filaments en plastique ) , nous respectons les recommandations de l'International Association for the Study of Pain. Nous limitons les stimulations en durée et en intensité au minimum et l’animal a toujours la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements. Les stimulations mécaniques ne dépassent pas les point limite fixés. Pour améliorer le bien-être des animaux , les cages sont enrichies à l'aide de rouleaux permettant aux animaux de se cacher. La chirurgie et la mise à mort de l'animal sont realisées sous anesthésie generale.
Choix des espèces
La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires . C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Les animaux seront âgés de 6-8 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature : les rats sont considérés comme adultes.
Collecte de sang de brebis en oestrus pour la fécondation in vitro
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
40 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis replacées à l'issue. Chacune reçoit une éponge vaginale posée douze jours, une injection intramusculaire d'hormone puis une prise de sang à la jugulaire, le porteur signalant un stress de contention et un possible hématome. Leur sang sert à préparer du sérum de brebis en œstrus, un composant du milieu de fécondation in vitro d'ovocytes de brebis. Le porteur affirme qu'aucun protocole sans sérum n'est efficace et rattache l'ensemble à des perspectives lointaines de restauration de la fertilité chez la femme.
Objectifs
L’objectif est de préparer du sérum de brebis en œstrus, qui est un composant du milieu de fécondation in vitro (FIV) des ovocytes ovins. Cette technologie sera mise en œuvre au laboratoire dans le cadre d’un programme de recherche ne faisant pas appel à d’autres animaux expérimentaux (ovocytes obtenus à partir d’ovaires collectés post-mortem sur des animaux abattus dans des abattoirs commerciaux). Le programme de recherche vise à optimiser la qualité des ovocytes cultivés in vitro par l’addition de facteurs biologiques (notamment des facteurs de croissance ou des hormones) dans le milieu de culture des ovocytes. Après cette étape, la FIV permet de vérifier l’aptitude des ovocytes à être fécondés et à évoluer en embryons, deux indicateurs de leur qualité.
Bénéfices attendus
Le projet scientifique global contribuera à la mise au point de la culture in vitro des ovocytes de brebis, une espèce qui présente des similarités avec l’espèce humaine (en termes de taille des ovocytes, nombre d’ovulations, chronologie de la croissance des ovocytes dans l’ovaire et du développement des embryons). A court terme, il s’agit d’obtenir, à partir d’ovocytes présents dans l’ovaire mais bien en amont de l’ovulation, des ovocytes fécondables et capables d’évoluer en embryons. Le projet s’insère dans le développement à moyen terme de stratégies de restauration de la fertilité chez la femme : soit en produisant des embryons à partir des ovocytes contenus dans des biopsies ovariennes cryoconservées (conservation qui est proposée aux patientes avant un traitement potentiellement toxique pour les ovocytes), soit en stimulant in vitro la maturation d’ovocytes qui n’ont pas atteint in vivo le stade désiré en dépit d’un traitement de stimulation ovarienne (pour des patientes présentant des troubles de l’ovulation par exemple).
Procédures
Après une pose d’éponge vaginale pendant 12 jours suivie d’une injection intramusculaire de PMSG, chaque animal sera soumis à une prise de sang. Chaque opération a une durée inférieure à une minute.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront un stress lié à une contention brève (de l’ordre de la minute) et ressentiront la piqûre de l’aiguille lors de la prise de sang ou de l'injection intramusculaire. La prise de sang peut entraîner un hématome.
Devenir
Les animaux seront replacés à l’issue de la procédure.
Remplacement
La très grande majorité des protocoles rapportés dans la littérature mentionne l’addition de serum de brebis au moment de la fécondation in vitro ou lors d’une étape précédente dans l’espèce ovine (24/25 références). Une équipe espagnole a publié un protocole sans sérum, mais rapporte un taux de développement embryonnaire le plus faible de l’ensemble des 25 études (12% seulement des ovocytes génèrent des embryons atteignant le stade de blastocystes). A ce jour, il n’y a donc pas d’alternative efficace à l’utilisation de serum pour la production in vitro d’embryons ovins.
Réduction
Un prélèvement de de 4 à 5 mL de sang sera réalisée sur deux lots de 20 brebis, pour constituer deux pools de 40 mL de sérum. Il est prévu de pratiquer environ 80 fécondations in vitro sur quatre ans (soit une toutes les deux à trois semaines). Ceci requiert 80 mL de sérum, soit 160 mL de sang. Pour la reproductibilité expérimentale, il faut utiliser le même serum pour chaque série d’expériences, donc limiter le nombre de serums différents sur l’ensemble du projet. Nous prévoyons donc de préparer 2 fois 40 mL de serum, qui sera ensuite aliquoté et congelé. Une variabilité entre individus est observée dans l’efficacité du serum sur la production d’embryons par fécondation in vitro. Pour éviter le risque que le sérum constitué s’avère peu efficace et de ce fait inutilisable, nous faisons le choix - de réaliser les prélèvements sur des animaux du troupeau de l’établissement utilisateur au moment où ils vont être mis à la reproduction. Ils ont en effet reçu dans cette optique un traitement hormonal de synchronisation des chaleurs qui va réduire le nombre d’individus présentant un sérum pauvre en hormones sexuelles et potentiellement peu efficace en fécondation in vitro. - de constituer des pools de sérum à partir de 20 animaux chacun. Ce nombre d’individus représentés dans le pool va limiter la variabilité de la composition du sérum. Remarque 1 : Le prélèvement de 10 mL de sang sur 20 animaux pour constituer un pool unique a été envisagé, mais nécéssiterait une contention plus longue de chaque animal et le prélèvement risquerait d’être plus difficile. Remarque 2 : Le serum collecté peut se conserver plusieurs années au congélateur ; il pourra donc être utilisé même en cas de retard dans l’avancée du programme de recherche.
Raffinement
Les brebis seront dans leurs conditions d’élevage habituelles dans un bâtiment d’élevage conventionnel, en case collective à clairvoies sur litière paillée. La pose d’éponge, l’injection intramusculaire et le prélèvement de sang se feront en présence de congénères pour éviter le stress dû à l’isolement. La contention des brebis pour le prélèvement sanguin se fera dans un espace réduit entre des claies. Les opérations, et particulièrement le prélèvement de sang par ponction à la veine jugulaire, seront réalisées par du personnel qualifié et expérimenté. La présence récurrente des expérimentateurs en interaction positive en dehors de la procédure (alimentation, soins aux animaux) est associée à une diminution du stress face à la contention. L'animal sera récompensé par des granulés. Lors de la prise de sang, les animaux peuvent ressentir une douleur légère de courte durée n’entrainant pas de trouble de l’état général (pas de douleur chronique ou aigüe de forte intensité) ; il ne sera pas fait d’anesthésie locale qui s'avèrerait plus douloureuse que la prise de sang, et augmenterait le risque d’hématome. Un baume végétal aux propriétés décongestionnantes, antiseptiques et cicatrisantes sera appliqué en massage sur la veine pour prévenir la douleur post-procédure et une infection éventuelle. Une surveillance journalière de l’état général des animaux sera ensuite assurée dans le cadre du suivi de la mise à la reproduction. En cas de signes de maladie, un traitement adapté (antidouleurs, anti-inflammatoires, antibiotiques) sera mis en place par les animaliers selon le protocole de soins établi par le vétérinaire conseil de l’installation expérimentale.
Choix des espèces
Le sang est collecté sur des brebis en vue de préparer du sérum pour la mise en œuvre de la fécondation in vitro d’ovocytes dans cette espèce. Afin de collecter le sang de brebis en oestrus, le prélèvement sanguin sera réalisée sur des brebis adultes de l’élevage de l’établissement au moment de leur mise à la reproduction.
caractérisation de la prise alimentaire et du métabolisme chez un modèle de rongeur diurne arvicanthis: impact d’un régime déséquilibré
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
96 rongeurs Arvicanthis vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumis pendant 16 semaines à un régime gras et sucré, ils subissent trois séries de huit microprélèvements sanguins sur animal vigile, que le porteur reconnaît pouvoir provoquer une douleur aiguë et une inflammation, avant un prélèvement sanguin terminal. Tous sont tués pour des analyses moléculaires et biochimiques post-mortem. Le porteur retient ce rongeur diurne pour sa proximité avec le rythme humain et affirme qu'aucune méthode sans animal ne peut caractériser la prise alimentaire, la retombée en chrononutrition humaine restant hypothétique.
Objectifs
Non seulement la quantité et la nature des aliments ingérés impactent la santé, mais le moment auquel sont pris les repas influence également le bien-être des individus. C'est notamment le cas des personnes qui ont des dîners à haute teneur énergétique et des personnes qui ont des habitudes alimentaires erratiques ou nocturnes chez lesquelles on observe une incidence accrue de diabète de type 2, d'obésité et de maladies cardiovasculaires. Au sein du système nerveux central, une région du cerveau appelée l'hypothalamus est impliquée dans le contrôle de la prise alimentaire, de la satiété et dans l'équilibre énergétique. Cette région est également responsable de l'organisation temporelle de toutes les fonctions et comportements biologiques car elle héberge une horloge biologique, les noyaux suprachiasmatiques (NSC) , qui donne le tempo à l'ensemble de l'organisme. Lors d'un régime alimentaire déséquilibré, il devient donc pertinent de pouvoir discriminer si les perturbations métaboliques observées viennent d'un déséquilibre dans les quantités d'aliments ingérés ou si elles s'accompagnent également d'une désorganisation temporelle du rythme de prise alimentaire. Le projet vise donc à étudier la chrononutrition chez Arvicanthis ansorgei, un modèle de rongeur diurne qui présente une organisation temporelle de ses fonctions biologiques similaire à celle de l'homme, comme par exemple un éveil diurne, un sommeil nocturne et une rétine riche en cônes. L'objectif sera sur des animaux nourris avec un régime équilibré 1/ de caractériser le rythme journalier de la prise alimentaire (structure temporelle sur 24h des repas, leur nombre et leur durée) ainsi que de la sécrétion des principales hormones métaboliques (insuline, leptine et corticostérone) equi la contrôlent 2/ de réaliser un phénotypage métabolique complet des animaux (volumes d'oxygène consommé et de CO2 rejeté avec calcul du quotient respiratoire et dela dépense énergétique) afijn ensuite d'évaluer les conséquences chez arvicanthis d'une exposition à un régime déséquilibré (graisse ou glucide) sur tous ces paramètres et in fine d'évaluer si les conséquences métaboliques observées sont uniquement dues au régime alimentaire déséquilibré seul ou combiné à une modification spontanée du rythme circadien de la prise alimentaire.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus pourraient permettre d'envisager chez l'homme des traitements basés sur des protocoles de chrononutrition visant à proposer certains aliments à certains moments de la journée sans rompre l'équilibre énergétique. La mise en évidence qu'un régime déséquilibré riche en graisse ou sucre ne conduit pas au développement d'une obésité et d'un diabète de type 2 sur le modèle animal choici pourrait ouvrir de nouvelles pistes pour de futurs traitements chez l'humain.
Procédures
Lers animaux seront soumis à 3 séries de 8 microprélèvements sanguins (durée de chaque prélèvement = quelques secondes) réalisés sur animal vigile. Chaque série de prélèvements est séparée de la précédente par 8 semaines de récupération. Chaque animal sera soumis à un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie profonde et analgésie (durée quelques minutes). Les animaux seront soumis à 16 semaines de régime alimentaire déséquilibré (gras et sucré).
Impact sur les animaux
Les tests métaboliques réalisés par microprélèvement sanguin pourront induire une douleur aigue et pourraient créer de l'inflammation. L'exposition au régime déséquilibré pendant 16 semaines pourrait induire des perturbations métaboliques pouvant conduire à la mise en place d'une obésit et / ou d'un diabète de type 2.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements post-mortem et analyses moléculaires et biochimiques.
Remplacement
L'objectif du projet étant de caractériser la prise alimentaire (nombre de repas, durée des repas,intervalles entre les repas, quantité de nourriture ingérée), il n'est pas possible d'utiliser des méthodes alternatives. L'animal reste donc le modèle de choix pour mener à bien cette étude.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires au projet (96 animaux sur 5 ans de projet) a été calculé pour permettre d'obtenir des résultats fiables et exploitables statistiquement. Nous avons privilégié une étude longitudinale pour le métabolisme où chaque animal sera son propre contrôle. Les résultats seront analysés par des tests statistiques permettant d'établir l'impact d'un régime déséquilibré sur la prise alimentaire et le métabolisme sur arvicanthis, modèle de rongeur diurne à l'instar de l'humain et établir si arvicanthis pourrait être résistant au diabète et à l'obésité.
Raffinement
Les mâles arvicanthis sont agressifs entre eux et sont donc maintenus en cage individuelle enrichie (bâton et matériel de nidification). Les animaux sont hébergés dans le même pièce ce qui permet de maintenir les contacts olfactifs, visuels et auditifs entre les congénères. Afin de limiter le stress lié à la préhension, arvicanthis étant un animal diurne particulièrement actif, les animaux sont habitués à la manipulation qui est réalisée avec une serviette ce qui permet de prendre les animaux délicatement par le corps. Les procédures invasives sont réalisées sous anesthésie et analgésie. Des points limites ont été définis permettant d'interrompre la procédure et ainsi soustraire l'animal à la souffrance.
Choix des espèces
Le moment du repas tout comme la quantité d'aliments ingérés ou leur qualité nutritionnelle concourrent au maintien de l'équilibre énergétique et donc au bien-être des individus. Il est donc important pour notre étude d'utiliser un modèle animal dont la niche temporelle de prise des repas se rapproche de celle de l'homme. Arvicanthis Ansorgei est un rongeur diurne qui présente des caractéristiques similaires à l'homme : rythme veille/sommeil avec un éveil diurne et un sommeil nocturne et une rétine riche en cônes. Il s'avère donc être un modèle pertinent pour étudier les conséquences d'un régime déséquilibré sur les rythmes circadiens (hormones, métabolites et gènes horloges). Nous utiliserons des animaux adultes âgés de 2 à 4 mois afin de travailler sur des animaux mâtures. Pour limiter les variations entre individus il est important pour l'étude de travailler sur des groupes avec un cerveau intégrant les centres régulateurs du comportement alimenatires (hypothalamus notamment mâture).
Évaluation des vésicules sur la protection du cerveau du nouveau-né lors d’un accouchement avec complications
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
286 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. À 12 jours de vie, les ratons sont séparés de leur mère, subissent une incision au cou pour isoler la carotide puis 90 minutes d'hypoxie qui provoque une hyperactivité proche de crises d'épilepsie, avant une injection de vésicules extracellulaires, le porteur signalant 10 % de mortalité. Tous sont ensuite tués pour prélever leur cerveau. L'effet neuroprotecteur espéré chez le nouveau-né humain reste une hypothèse à démontrer, et le porteur affirme qu'un organoïde cérébral in vitro, mené en parallèle, ne peut pas remplacer l'animal in vivo.
Objectifs
Deux nouveau-nés pour mille présentent des lésions cérébrales d’origine vasculaires induites lors de leur naissance difficile. Ces affections sont à l’origine de troubles neurologiques moteurs et cognitifs complexes à traiter. Des prises en charge sont connues, comme l’abaissement de la température cérébrale du nouveau-né. Ce procédé n’est que partiellement efficace, 50% des nourrissons traités développent encore des troubles neurologiques. Il y a aussi l’utilisation de cellules souches fœtales. Mais cette prise en charge présente certains obstacles : variabilité des cellules lors de leur préparation au laboratoire, rejet de greffe possible, problèmes de sécurité et d’éthiques liés à l’injection de cellules souches fœtales vivantes provenant de prélèvement en fin de grossesse. Il existe des cellules souches générées au laboratoire, qui lèvent ces obstacles. Elles sont dotées de qualités similaires aux cellules souches embryonnaires, elles peuvent être produites en grande quantité et sont immortelles. En plus, il est possible de récolter les vésicules extracellulaires des cellules souches. Ces vésicules extracellulaires sont de très petits sacs contenant des molécules thérapeutiques intéressantes pour soigner les lésions cérébrales, elles servent à communiquer avec des cellules cibles présentes dans leur microenvironnement pour en moduler le fonctionnement, de plus, leur contenu peut être modifié en incorporant des protéines connues pour leur effet bénéfiques. Les vésicules extracellulaires sont connues pour favoriser la récupération fonctionnelle notamment dans un modèle d’hémorragie intra-cellulaire chez le rat, ou lors de la protection des fonctions cérébrales dans un modèle chez le mouton. L’objectif de ce projet est de tester la neuro-protection des vésicules extracellulaires grâce à un modèle de lésion cérébrale chez le raton à 12 jours de vie (correspondant à un nouveau-né humain). Le contenu des vésicules extracellulaires sera modifié par l’enrichissement ou l’appauvrissement de la protéine d’intérêt connue pour contrôler l’inflammation et atténuer les lésions cérébrales. Nous montrerons que la protéine d’intérêt est plus efficace lorsqu’elle est administrée avec les vésicules extracellulaires. Nous procéderons à un ensemble de technique permettant d’évaluer les lésions cérébrales ainsi que les différentes populations de cellules du cerveau.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons montrer dans ce projet que l’injection de vésicules extracellulaires naïves (c’est à dire naturelle, sans ajout de molécules) peuvent diminuer les lésions cérébrales, et donc avoir un effet neuro-protecteur. Les vésicules extracellulaires représentent une alternative sûre à l’injection de cellules souches vivantes et permettent d’éliminer les risques liés à la transplantation de cellules vivantes, tels que les rejets immunitaires, les problèmes éthiques, la transformation des cellules souches en diverses cellules non cérébrales. Par ailleurs, nous allons montrer, qu’en modifiant le contenu des vésicules extracellulaires en leur ajoutant la protéine d’intérêt, que l’effet neuro-protecteur des vésicules extracellulaires naïves peut être augmenté. Comme le suggèrent des données pilotes, il est peu probable que la protéine d’intérêt soit le seul facteur naturel responsable des effets bénéfiques des vésicules extracellulaires. Cependant, les effets de l'injection de la protéine d’intérêt seule détermineront si la protéine d’intérêt doit être dans des vésicules pour être active. Les résultats obtenus vont permettre de valider l’effet neuro-protecteur des vésicules extracellulaires enrichies en protéine d’intérêt dans un modèle de lésion cérébrale chez le rongeur avant d’être validé dans un modèle plus gros (cochon), en tant que données préliminaires pour une étude clinique chez l’humain.
Procédures
La chirurgie des ratons se fera à 12 jours de vie sous anesthésie générale. Cette intervention dure 10 minutes. Puis l’hypoxie se fera pendant 90min. Vingt-quatre heures après la chirurgie, les ratons recevront une injection de vésicules extracellulaires, cette administration dure quelques secondes. L’ensemble du projet se fera donc sur 4 jours.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : - Le jour de la chirurgie : du stress, de la faim et de l’hypothermie sont causés par l’isolement d’avec la mère. Une douleur au niveau de l’incision du cou pour isoler la carotide. Au moment de l’hypoxie on observe une hyperactivité ressemblant à des crises d’épilepsie. - Nous observons une stagnation de la prise de poids pendant 24h après la chirurgie - Les ratons peuvent avoir une douleur locale lors des injections intra-péritonéal ou sous-cutanées - La mortalité observée dans ce modèle est de 10% - Les ratons des groupes hypoxie ischémie prennent moins de poids que ceux des groupes contrôle (SHAM).
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort à la fin du projet pour prélever leurs cerveaux afin de réaliser des analyses histologiques, ce qui correspond à l’analyse du tissu cérébral.
Remplacement
En parallèle de ce projet, une méthode alternative sera menée avec un modèle validé de cevreau humain fabriqué in vitro (appelé organoïde cérébral). Le but est de réaliser les mêmes traitements que sur les ratons pour ainsi comparer les résultats et d’élucider avec précision les mécanismes d’action des vésicules dans un contexte cellulaire humain. Toutefois, ce modèle récent a ses limites et ne peut remplacer totalement le modèle animal. Il n’y a pas d’alternative parfaite à un modèle in vivo pour étudier les effets de la réduction du flux sanguin/oxygène cérébral sur le cerveau et les anomalies du développement qui en découlent. La relation poumon/cerveau/circulation sanguine ne peut être modélisable in vitro. L’effet potentiellement neuro-protecteur des vésicules ne peut se faire que sur un organisme entier car il est difficile de reproduire in vitro la diminution du flux sanguin et une diminution de l’oxygène circulant.
Réduction
Nous utiliserons des données publiées dans les revues scientifiques afin de ne pas reproduire des expériences non utiles. Nous savons que la mortalité du modèle est de 10% nous compenserons en conséquence. Par ailleurs, compte tenu de l’hétérogénéité du modèle (réaction différentes selon les ratons), les groupes seront de 20 individus (10 mâles et 10 femelles pour mettre en évidence un éventuel effet sexe) pour obtenir des données analysables pour chaque point d’analyse (à quatorze et quinze jours de vie). Vingt animaux sont prévus pour transmettre le modèle à 2 nouvelles personnes. Si l’apprentissage se fait bien, nous en utiliserons moins. Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d’animaux utilisés.Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d’animaux utilisés. En conséquence, le nombre d’animaux dans notre étude sera maintenu au minimum nécessaire (286 ratons) afin d’obtenir des résultats analysables par les tests statistiques.
Raffinement
Afin de limiter le stress d’un nouvel environnement, nous procéderons à l’apprivoisement de la rate avant la mise bas. Nous l’habituerons à nous et aux bruits de déplacement dans la salle de chirurgie. Nous procéderons à l’enrichissement de l’hébergement avec du papier doux absorbant pour la fabrication du nid. Au moment de la naissance, si le comportement de la rate est anormal, c’est à dire qu’elle n’a pas fabriqué de nid et qu’elle ne s’occupe pas des petits, nous procéderons à une adoption par une autre rate. L’adoption se fera avec une rate qui pourra recevoir un nombre de ratons de manière raisonnable. L’adoption se fera en frottant doucement le raton avec la sciure de la nouvelle cage. Trente minutes avant la chirurgie, les ratons recevront une dose d’antidouleur, puis les ratons seront séparés de leur mère par groupe de 5 afin d’éviter un isolement trop long de toute la portée. Cinq ratons seront hébergés dans un environnement enrichi (sciure de la cage d’hébergement, papier doux absorbant et température contrôlée) pendant 1h. La chirurgie se fera sous anesthésie générale ainsi qu’une anesthésie locale sur un coussin chauffant. Dès que les ratons seront réveillés ils seront remis à leur mère pour recevoir ses soins et se nourrir. Pour finir, les ratons seront mis dans la couveuse reliée à la bouteille de mélange gazeux à 8% d’oxygène. On surveillera l’état général des ratons dans le nid à l’aide d’un document appelé « arbre décisionnel ». Il permet d’observer les ratons dans la portée sans les déranger à nouveau car le jour de la chirurgie les soins apportés par la mère sont importants. Dès qu’un animal ne va pas bien il est vite repéré car il est blanchâtre et/ou immobile. Une surveillance sera effectuée à +24h après la chirurgie afin de s’assurer de la bonne cicatrisation de la plaie et de la prise de poids. On surveillera la mobilité, la présence de lait dans l’estomac du raton. Les injections intra-péritonéales et sous cutanées seront réalisées avec une aiguille adaptée au raton (courte et fine) et par du personnel formé. Elles seront réalisées en même temps que la surveillance des points limites à 13 jours de vie afin de ne pas déranger plusieurs fois la portée.
Choix des espèces
Les revues scientifiques indiquent que les rats fournissent des informations pertinentes et qu’ils se remettent bien de la chirurgie. Le raton de 12 jours correspond à un nouveau-né à terme, au développement du cerveau et la maturation des cellules du système nerveux.