Recherche fondamentale

588 animaux non-humains, 307 souris et 281 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart reçoivent une injection d'oligonucléotides antisens dans le liquide céphalo-rachidien ou le cerveau, suivie de séances d'imagerie TEP ou ultrasonore sous anesthésie et, pour certains, d'une chirurgie d'amincissement du crâne. Le porteur mentionne des tests comportementaux chez soixante rats sans en préciser la nature, et signale des risques de paralysie, d'œdème et d'ataxie. Il justifie l'usage de deux espèces par le besoin de disposer de données chez le rat comme chez la souris pour de futurs candidats-médicaments.

Objectifs

Il existe aujourd’hui plus de 5 000 maladies neurologiques rares qui touchent près de 350 millions de personnes dans le monde. 70% d’entre elles se manifestent pendant l’enfance et la majorité ne dispose d’aucun traitement. La plupart de ces maladies orphelines présentant une origine génétique, il est envisageable d’utiliser des traitements ciblant la cause génétique de ces maladies. Les oligonucléotides antisens (ASOs), qui sont capables d’interagir spécifiquement avec l’ARN messager, ont montré des résultats prometteurs pour certaines de ces maladies, mais atteignent très difficilement le système nerveux central. La voie intrathécale (consistant à injecter ces agents directement dans le liquide céphalo-rachidien) a montré de meilleurs résultats, mais cette voie reste encore méconnue. Il est nécessaire de réaliser des études dédiées afin de mieux comprendre comment obtenir une diffusion dans le cerveau et un effet thérapeutique optimal des ASOs après injection intrathécale. Afin de répondre à cette problématique, nous souhaitons développer et évaluer chez le rat et la souris des techniques d’imagerie qui permettront de mesurer la distribution et l’effet d’ASOs dans le cerveau par voie intrathécale. La mise en place de tels outils est cruciale pour guider le développement préclinique et clinique de futurs candidats-médicaments ciblant l’ARN dans les maladies neurologiques. Nous évaluerons la possibilité de marquer directement des ASOs à l’aide d’isotopes radioactifs ou de groupements chimiques fluorescents, permettant leur visualisation directe, respectivement en imagerie par tomographie par émission de positons (TEP) ou par microscopie. Nous utiliserons également des approches d’imagerie indirectes qui permettront d’étudier l’intensité et la durée des effets spécifiques des ASOs sur des cibles et mécanismes moléculaires.

Bénéfices attendus

Les besoins thérapeutiques liés aux maladies du système nerveux central ne sont que partiellement couverts par les médicaments actuels, en particulier les maladies orphelines génétiques. Les oligonucléotides antisens ont le potentiel de traiter efficacement ces maladies mais leurs propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques ne sont pas suffisamment connues, en particulier par voie intrathécale. Cette étude sera donc très importante à la fois pour le développement préclinique (et à plus long terme, clinique) des ASOs en apportant des informations inédites.

Procédures

La quasi-totalité des animaux (237 rats sur 281 et 249 sur 307 souris) recevra une injection intrathécale (au niveau des lombaires, entre les méninges dites de l’arachnoïde et de la dure-mère, afin d’atteindre le liquide céphalo-rachidien), sous anesthésie et analgésie locale (10 minutes). Les autres animaux (44 rats et 58 souris) recevront une injection intracérébrale, également sous anesthésie et analgésie générale et locale (1h). Ensuite, les animaux pourront : - soit n’être exposés à aucune autre nuisance à part une anesthésie terminale nécessaire au prélèvement du cerveau (total de 179 rats et 115 souris), - soit être utilisés pour une ou plusieurs sessions d’imagerie de TEP sous anesthésie d’une durée d’une heure (total de 72 rats, dont 60 recevront également des tests comportementaux pendant 70 minutes le lendemain de chaque imagerie, et 36 souris) ou de 2 à 6 heures (30 rats et 30 souris) - soit être utilisés pour une ou plusieurs sessions d’imagerie ultrasonore sous anesthésie (1h), la première session étant précédée la veille par une chirurgie d’amincissement du crâne (30 min) sous anesthésie et analgésie (96 souris) - soit être utilisés pour plusieurs sessions d’imagerie fUS éveillée (30 min) puis imagerie TEP sous anesthésie (20 min), avec une première chirurgie (30 min) sous anesthésie et analgésie de pose d’un chapeau nécessaire à l’imagerie éveillée (quelques jours avant la première session), suivie d’une période d’habituation progressive aux sessions d’imagerie en tête-fixée sur une à deux semaines (sessions d’habituation de 5 minutes les premiers jours à 1 heure le dernier jour), puis d’une seconde chirurgie d’amincissement du crâne (30 min) sous anesthésie et analgésie la veille de la première session (30 souris).

Impact sur les animaux

La procédure d’injection par voie intrathécale peut s’accompagner d’effets indésirables tels une paralysie ou une fuite de liquide céphalo-rachidien entraînant un œdème. Certains ASOs sont susceptibles d’entraîner des symptômes d’anxiété, ou des troubles moteurs de type ataxie, voire une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux à la fin de la procédure seront mis-à-mort afin de permettre diverses analyses histologiques ou moléculaires du tissu cérébral.

Remplacement

L’objectif de l’étude est de mieux comprendre la biodisponibilité et l’effet d’oligonucléotides antisens administrés par la voie intrathécale, et ne peut donc pas être atteint avec des modèles in vitro. La voie intrathécale étant assez invasive et peu d’ASOs étant à ce jour validés pour une utilisation clinique, il est nécessaire de réaliser cette étude chez l’animal.

Réduction

Selon notre expérience en termes de variabilité et de taille d’effet sur ces données d’imagerie, le nombre d’animaux par groupe pour les techniques d’imagerie in vivo a été estimé à 8 sur la base d’un calcul de puissance statistique. Nous prévoyons 2 animaux supplémentaires par groupe en prenant en compte la possibilité d’échec de l’injection dans le liquide céphalo-rachidien (le taux de succès de l’injection étant rapporté autour de 80% dans la littérature). Pour les groupes de validation préliminaire des ASOs par stéréotaxie ou les approches ex vivo telles que l’autoradiographie ou la microscopie, les groupes de 3 à 6 animaux seront constitués étant donné les besoins statistiques plus limités pour ces analyses et la meilleure résolution spatiale de ces techniques. Concrètement, les données expérimentales générées seront traitées à l’aide de tests de Student ou d’analyse de variance à deux dimensions (two-way ANOVAs), selon les paramètres évalués, ou de tests non paramétriques équivalents, en fonction de la distribution normale ou non de nos données. Dès lors que la question expérimentale le permet, les mêmes animaux seront étudiés pour plusieurs sessions d’imagerie, permettant une réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

Les injections seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie locale. Les animaux seront surveillés régulièrement grâce à une grille de score et des points limites adaptés prenant en compte les éventuels troubles liés à l’injection intrathécale, voire aux troubles liés à la baisse d’expression des protéines étudiées dans les procédures 2 et 3. En cas de signes de détresse, la procédure serait interrompue et la mise à mort de l’animal serait effectuée. L’environnement sera enrichi avec morceaux de bois, boites ou cylindres et nourriture en pâtée après la chirurgie.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont deux espèces utilisées très régulièrement dans le développement préclinique de médicaments en général, et pour modéliser des pathologies du système nerveux central. Nous souhaitons donc obtenir des informations pertinentes chez les deux espèces qui seront utiles par la suite lors de l’évaluation de candidats-médicaments ASOs dans des modèles rongeurs d’intérêt, qui pourront être le rat ou la souris en fonction des pathologies. Adulte, afin d’étudier les mécanismes de biodistribution des ASOs sur des cerveaux pleinement développés.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles développent des maladies du foie induites génétiquement ou par des régimes alimentaires imposés pendant huit à seize semaines, avec gavages, injections intrapéritonéales, mises à jeun et prélèvements sanguins répétés. Le projet vise à tester l'effet de l'inhibition de la mort cellulaire dans la cholangite sclérosante primitive et la stéatose hépatique non alcoolique. Le porteur affirme qu'il n'est "pas possible de recréer in vitro la complexité d'un organisme entier" et attend de l'étude une simple preuve de concept.

Objectifs

La cholangite sclérosante primitive et la stéatose hépatique non-alcoolique sont des maladies ne disposant d’aucun traitement pharmacologique formel validé. La stéatose hépatique non-alcoolique va devenir la première cause de transplantation hépatique et la cholangite sclérosante primitive est une maladie dont les mécanismes moléculaires sont très mal caractérisés, il est dit d’elle que c’est la dernière boîte noire de la médecine qui s’intéresse à l’étude du foie. Ce projet a donc pour objectif de mieux caractériser rôle de la mort des différentes populations cellulaires dans le développement de ces maladies. Il permettra d’identifier et de cibler des populations clés dans le développement de la maladie. L’utilisation d’inhibiteurs pharmacologiques dans ces pathologies pourra constituer la base d’un dépôt de brevet. La présente demande concerne un projet préalablement autorisé pour lequel nous devons réaliser une étape nécessitant une expertise spécifique non disponible en interne. Aucun animal supplémentaire n'est donc ajouté ici par rapport au projet principal déjà autorisé.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux caractériser des maladies du foie sans traitement pharmacologique disponible actuellement. D’un côté la cholangite sclérosante primitive, maladie rare mais grave exposant au risque de cirrhose et de cancer. Actuellement, le seul traitement efficace de cette maladie est la transplantation hépatique. Or ce traitement est réservé aux patients avec une maladie avancée et n’est pas toujours possible en cas de cancer. Il est donc primordial d’étudier d’autres pistes thérapeutiques. De l’autre côté, la stéatose hépatique non alcoolique est la maladie hépatique la plus commune car elle suit la courbe de progression de l’obésité. Bien que sa prévalence explose, aucun traitement n’est disponible à ce jour, et le nombre de patients au stade terminal de la maladie (c’est-à-dire cirrhose) nécessitant une transplantation hépatique est en croissance perpétuelle. Nous attendons de cette étude la preuve de concept de l’effet bénéfique de l’inhibition de la mort cellulaire sur le développement de ces maladies.

Procédures

Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de pathologies hépatiques et à leurs traitements. Les interventions sont majoritairement peu invasives. Les différentes séries de gestes réalisés sur les souris pourront être au choix selon les questions scientifiques : 1-Injections intrapéritonéale (1x/j/pendant 5 jours/5 sec animal vigile)+Utilisation de régimes spéciaux (8 à 16 semaines de régime)+Tests dynamiques d’exploration du métabolisme glucidique (mise à jeun de 5h, 1 injection intrapéritonéale ou 1 gavage unique, 6 prélèvements sanguins de très faible quantité (une goutte) (2h pour chaque tests - 2 tests par mois espacé d’une semaine minimum - 4 fois maximum)+Mesure de la composition corporelle (5-10 minutes animal vigile ) et cages calorimétrie (maintien 5j maximum)+ Prélèvement sang sous anesthésie suivi de l’euthanasie et des prélèvements post-mortem (5 minutes). 2-Utilisation de régimes spéciaux (8 à 16 semaines de régime) )+Tests dynamiques d’exploration du métabolisme glucidique (mise à jeun de 5h, 1 injection intrapéritonéale ou 1 gavage unique, 6 prélèvements sanguins de très faible quantité (une goutte) (2h pour chaque tests - 2 tests par mois espacé d’une semaine minimum - 4 fois maximum)+Mesure de la composition corporelle (5-10 minutes animal vigile ) et cages calorimétrie (maintien 5j maximum)+ Prélèvement sang sous anesthésie suivi de l’euthanasie et des prélèvements post-mortem (5 minutes). Chaque point représente une trajectoire de vie pour un groupe d’animaux et donc le maximum d’actes effectués sur ce même groupe.

Impact sur les animaux

La principale contrainte concerne le développement des pathologies du foie induites génétiquement ou par des régimes alimentaires qui restent néanmoins asymptomatiques d’un point de vue phénotypique. L’induction de ces pathologies est malheureusement strictement nécessaire pour mener à bien ce projet et trouver des thérapies innovantes. Les traitements devraient quant à eux réduire les effets liés au développement des pathologies du foie étudiées avec de possibles effets secondaires mais qui semblent très limités puisque les molécules sont bien tolérées par les souris. Les administrations par gavage, les injections intra-péritonéales, et les prélèvements sanguins nécessaires durant les tests métaboliques peuvent être source de stress et d’inconfort pour l’animal. De façon extrêmement rare, ils peuvent induire des microlésions ou des irritations. Les tests métaboliques effectués peuvent également induire un stress pour les animaux en raison de période courte de mise à jeun ou encore l’isolement en cas d’utilisation de cage métabolique. De même, le transport des animaux qui pourra être mis en œuvre sera également source de stress pour les animaux.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet (n=720) seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures. L'euthanasie sera pratiqué au sein de l'établissement d'origine des animaux. En effet, pour rappel, la présente demande concerne un projet préalablement autorisé pour lequel nous devons réaliser une étape nécessitant une expertise spécifique non disponible en interne. Aucun animal supplémentaire n'est donc ajouté ici par rapport au projet principal déjà autorisé.

Remplacement

L’animal dans son intégrité est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement de la cholangite sclérosante primitive ou la stéatose hépatique non-alcoolique, la complexité cellulaire ne pouvant être répliqué in vitro. Nous avons besoin étudier spécifiquement l’influence de l’inactivation de nos gènes d’intérêts dans un type cellulaire donnée, sur les autres types cellulaires dans le développement de la maladie. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu.

Réduction

Un total de 720 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Un nombre de 12 souris par groupe est prévu afin de pouvoir réaliser des statistiques. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). La principale contrainte concerne le développement des pathologies du foie induites génétiquement ou par des régimes alimentaires qui sont malheureusement nécessaires pour mener à bien ce projet. Les traitements devraient quant à eux réduire les effets liés au développement des pathologies étudiées avec de possibles effets secondaires mais qui semblent très limités puisque les inhibiteurs sont bien tolérés par les souris. Toutefois, afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter toute anomalie. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (analgésique, soins, etc.) et le vétérinaire pourra être sollicité, le cas échéant.

Choix des espèces

Justification de l’espèce/modèle : Le projet a pour objectif d’étudier le rôle de la nécroptose dans les processus physiopathologiques aboutissant à la cholangite sclérosante primitive et la stéatose hépatique non-alcoolique. Afin de répondre à cet objectif, l’expression de certains gènes d’intérêts dans les modèles animaux utilisés doit être altérée génétiquement dans des types cellulaires choisis, ce qui justifie le choix de cette espèce (souris). Justification des stades : Les animaux seront utilisés à l’âge de 6 et 8 semaines pour chaque procédure. Cela correspond à l’âge adulte, deux semaines après le temps du sevrage. De plus, les variations entre les souris sont minimales ce qui permet de diminuer la variabilité (aspects métaboliques) entre animaux avant le début des traitements. Cet âge de départ permettra de réduire le nombre d’animaux à utiliser. Justification du sexe : Nous favoriserons l’utilisation des deux sexes (idéalement 50/50) afin de ne pas introduire un biais dans nos études notamment lors des tests d’inhibiteurs pharmacologiques dans le développement des maladies étudiées. En effet, il est maintenant établi que lors des expérimentations et autres tests médicamenteux, les souris mâles sont plus exploitées que les souris femelles. Cela introduit donc un énorme gap puisque les femelles peuvent réagir différemment sur le plan de toxicité, du métabolisme ou encore de la biodisponibilité. Étant donné que notre but est de proposer de nouveaux traitements, il nous apparait essentiel d’analyser les deux sexes afin que les résultats puissent être transposés à l’homme.

288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intra-nasales d'un dérivé de plastique, le DEHP, jusqu'à quarante-quatre injections par animal sur cinq mois, puis passent des tests de locomotion, de mémoire de reconnaissance et de localisation d'objets et de mémoire spatiale. Le projet cherche à établir si ce phtalate aggrave une maladie du cerveau modélisée chez la souris. Le porteur qualifie l'inconfort de léger et affirme qu'aucune alternative cellulaire ne peut remplacer le recours à l'"animal entier".

Objectifs

Les molécules comme le DEHP (phtalate) sont des produits chimiques synthétiques largement utilisés dans de nombreux produits plastiques de consommation courante. Ils ne sont pas chimiquement liés aux polymères plastiques et sont facilement libérés dans l'environnement. Des études récentes rapportent pour la première fois une contribution potentielle du DEHP à une maladie du cerveau chez l’Homme (la maladie à corps de Lewy). L’objectif de ce projet est de déterminer si les dérivés de plastiques (comme le DEHP) représentent un facteur de risque d’une maladie du cerveau, en tant que polluants environnementaux. Cette maladie est modélisée chez le rongeur (souris), et ce projet vise à tester l’effet du DEHP sur le comportement des animaux et d’étudier les mécanismes mis en jeu. Nous avons choisi le mode d'administration intra-nasal car nous pensons que l'entrée par la voie respiratoire imitera mieux l'influence environnementale de la toxicité du DEHP chez les humains. De plus, il a été démontré que ce mode d'administration permet d'obtenir une délivrance rapide et concentrée au cerveau. Une étude pilote visera tout d’abord à définir la dose de phtalate qui sera administrée aux souris saines ou modèles de la maladie, permettant la détection cérébrale de ces produits (et dérivés) dans le cerveau après injection. Un phénotypage comportemental et un phénotypage moléculaire et cellulaire seront ensuite réalisés suite à l’administration chronique de DEHP. Les objectifs sont de comprendre si le DEHP aggrave la maladie en touchant des paramètres impliqués dans la progression de la pathologie, ainsi que les fonctions de mémoire.

Bénéfices attendus

En utilisant des modèles animaux de pathologies humaines, cette étude permettra de mettre en évidence si l’administration d’une molécule dérivée de plastique présent dans de nombreux produits usuels, le DEHP, représente un facteur de risque dans une maladie du cerveau (maladie à Corps de Lewy). De plus, nos études montreront également si cette molécule affecte le cerveau de l’animal sain. La mise en évidence d’un lien de cause à effet permettra de comprendre certains aspects cliniques chez l’Homme. Ainsi, ces études apporteront des bénéfices en santé humaine car elles permettront d’adapter de nouvelles thérapeutiques chez l’Homme. En apportant des bases mécanistiques à leur mode d’action, ces études permettront d’étayer les connaissances plus fondamentales de l’effet toxique de ces molécules sur le cerveau. Ainsi, ces études apporteront des bénéfices en santé humaine car elles dévoileront des pistes pour la mise en garde contre certaines toxicités environnementales. Elles permettront de mettre en place des politiques de prévention. Enfin, ce projet comprend les analyses sur les souris mâles et femelles. Le DEHP est un perturbateur endocrinien et a des effets différents sur les deux sexes, avec notamment une baisse de la testostérone chez le mâle. En apportant une analyse complète des différences entre mâles et femelles, ce projet apportera donc un bénéfice sur la compréhension de mécanismes spécifiquement liés au sexe, dans la toxicité cérébrale de DEHP, mais aussi dans les facteurs de risque de la maladie.

Procédures

72 souris vigiles adultes (6 mois) recevront des injections (5 secondes) à raison de 1X/jour pendant 6 jours. 216 animaux vigiles recevront des injections (5 secondes) à raison de 2X/semaine pendant 5 mois (22 semaines), soient 44 injections par animal. Comportement réalisé sur 72 animaux vigiles sur une période de 41 jours/animal, période durant laquelle les animaux sont hébergés en cage individuelle pour tester leur locomotion (2 nuits et 3 jours), leur mémoire de reconnaissance et de localisation d’objets (15 minutes par essais, 2 essais/jours, 5 jours) et enfin test de mémoire spatiale à long terme (1 minute/essai, 4 essais/jours, 6 jours) suivis d’1 test après 24h (1 minute/animal) et 21 jours (1 minute/animal). Les souris transgéniques modèle de maladie développent des déficits mnésiques à l’âge de 12 mois.

Impact sur les animaux

Les procédures exécutées ne provoqueront qu'un inconfort léger liées au stress de la contention des souris au moment de l’administration de molécule. L’inconfort ne durera que très peu de temps, juste pendant et après l’injection. Selon notre hypothèse que le DEHP représente un facteur de risque de la MCL, nous attendons une aggravation de la pathologie. Les animaux pourraient présenter des signes de détresse si une forte toxicité du DEHP devait se répercuter au niveau systémique. Cependant, la littérature ne documente pas ce type d’effet aux doses testées dans ce projet chez des souris adultes. Les études de comportement pourront induire du stess aux animaux.

Devenir

Tous les animaux (288) seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvements et analyses post-mortem.

Remplacement

Dans la mesure où nos travaux portent sur les caractérisations comportementales et moléculaires suite à un traitement pharmacologique, il n’est pas possible de recourir à un autre type de modèle d’étude qu’à celui de l’animal entier. Nous ne pouvons pas utiliser d’alternative cellulaire. Notons que les modèles murins (souris) récapitulent les symptômes majeurs de la maladie (déficit de mémoire) et restent ainsi des outils uniques pour l'étude des mécanismes physiopathologiques, la validation de cibles thérapeutiques et la réalisation de tests précliniques.

Réduction

Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux pour permettre des analyses statistiques sur des groupes incluant mâles et femelles, soit 18 souris/groupe (9 mâles et 9 femelles) pour le comportement et 12 souris/groupe (soit 6 mâles et 6 femelles) pour les approches moléculaires et 24 souris/groupe (soit 12 mâles et 12 femelles) pour l’imagerie cérébrale. L’efficacité de chaque traitement sera effectuée à l’aide de tests statistiques adaptés. Les calculs fait tiennent compte de la variabilité interindividuelle. Ainsi, pour toutes nos analyses, nous utiliserons à la fois des animaux mâles et femelles dans nos expériences de manière à ne pas biaiser nos résultats, et les sexe ratios seront conservés entre les différents groupes.

Raffinement

Afin de raffiner les conditions de vie des animaux, ceux-ci bénéficieront de soins appropriés pour optimiser le bien-être des souris, tels que des éléments d’enrichissement (matériel de construction du nid, barre à ronger) et d’un suivi quotidien. De plus, ils seront maintenus en groupe sociaux, sauf pour la durée des tests de comportement où ils seront isolés (1/cage). Dans ce cas, plusieurs cages (3 au minimum) seront maintenues côte à côte sur les rayonnages des racks de stabulation. Les souris seront manipulées à l’aide de tubes spécifiques pour réduire le stress lors des changes (permet de nettoyer les cages sans toucher la souris). Des points limites prédictifs sont mis en place pour limiter la souffrance si un problème devait survenir après l’administration de molécule DEHP: la surveillance des souris se fait à chaque instillation, soit 2X par semaine (observation visuelle, suivi de l’aspect général et de la posture) et elles sont pesées avant chaque administration de molécule, permettant de s’assurer du bien-être des souris. Les souris sont habituées à la manipulation par l’expérimentateur pour réduire le stress lié à la manipulation lors de l’administration des molécules. Les animaux sont testés dès le début de l’apparition des déficiences mnésiques afin de réduire le temps d’hébergement des animaux en animalerie.

Choix des espèces

Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des maladies du cerveau ayant une origine génétique. En effet, les maladies du cerveau que nous étudions dans ce projet apparaissent à l’âge adulte (40-50 ans) lorsque ce sont des formes génétiques. Elles apparaissent plus tardivement, quand leur origine n’est pas connue, le vieillissement étant un facteur de risque majeur de ces pathologies. Ainsi, les animaux étudiés seront utilisés à l'âge de 7 mois au début du projet et seront analysés à l'âge adulte de 12 mois, ce qui correspond environ à la moitié de la vie d’une souris en laboratoire. Nos études antérieures ont montré que cela correspond au moment où les premiers signes de déficits mnésiques apparaissent dans ces modèles. De plus, ces modèles permettent de répondre à la question posée car les souris possèdent des structures neuro-anatomiques comparables à celles du cerveau humain.

1 440 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques humaines par voie intraveineuse ou intra-tibiale, puis subissent des prélèvements sanguins répétés, jusqu'à trente-six ponctions étalées sur dix-huit mois. Le projet vise à anticiper la rechute de patients atteints de leucémie aiguë en amplifiant leurs cellules chez la souris pour tester des médicaments. Le porteur affirme que ni les cellules de patients en culture ni les lignées cellulaires ne conviennent et conclut que la xénogreffe reste le modèle "indispensable".

Objectifs

Les leucémies aiguës sont des cancers agressifs et rares du sang. Les rechutes surviennent dans ~40% des cas et sont presque systématiquement mortelles à défaut de traitement codifié efficace. Pourtant de nouveaux traitements émergent, en particulier les thérapies ciblées. Mais nous ne savons pas quels patients peuvent en bénéficier en situation de rechute. Il est impossible de de réaliser des tests de nouveaux médicaments directement sur la leucémie du patient. La seule méthode actuellement validée dans la littérature est d’injecter les cellules leucémiques du patient au diagnostic dans un modèle de souris immunodéprimée pour amplifier les cellules leucémiques et modéliser la rechute. Aussitôt la greffe obtenue et la leucémie amplifiée, l’expérimentation est arrêtée pour récupérer les cellules leucémiques et réaliser les tests de drogues en laboratoire dont il est établi qu’ils sont parfaitement corrélés avec la réponse thérapeutique du patient en rechute. Il s’agit par conséquent d’anticiper la rechute avec ce modèle afin de proposer au patient un traitement efficace aussitôt qu’il rechute. Nous n’injecterons chez les souris que des leucémies pour lesquelles nous avons identifié qu’elles étaient à haut risque de rechute (~40% des patients).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus se situent à deux niveaux. Le premier niveau est individuel : nous pourrons identifier avant même la survenue de la rechute du patient un traitement prédit efficace par le modèle qui pourra alors être proposé dès la rechute du patient. Le deuxième niveau est collectif : nous pourrons corréler les données de ce modèle avec d’autres informations biologiques collectées dans le laboratoire afin d’identifier des biomarqueurs prédictifs de la sensibilité à chacune des thérapies ciblées. C’est un atout majeur, car les patients qui rechuteraient sans avoir bénéficié d’un tel modèle pourront disposer d’un traitement ciblé sur la base de ces biomarqueurs ; et nous pourrons ne plus utiliser le modèle murin lorsque nous aurons identifié des biomarqueurs capables de se substituer à l’utilisation du modèle animal.

Procédures

Injection de cellules leucémiques dans la veine caudale (90% des cas soit 1296 souris) sur souris vigile contentionnée, sous anesthésie locale : 1 injection unqiue/souris (durée : 30sec). Injection de cellules leucémiques par voie intra-tibiale (10% des cas soit 144 souris) sur souris endormie (anesthésie par voie gazeuse) et sous couverture antalgique locale : 1 injection unique/souris (durée 2 min). Prise de sang au niveau de la veine sub-mandibulaire (90% des cas soit 1296 souris) sur souris vigile : 2 fois par mois, puis 1 fois par semaine (durée : 30 sec) jusqu'à atteinte d'un point limite (maximum : 36 prélèvements de 30 sec étalés sur 18 mois). Prise de sang au niveau intra-tibial (10% des cas soit 144 souris) sur souris endormie (anesthésie par voie gazeuse) et sous couverture antalgique locale : 1 fois/mois à partir de 3 mois après injection des cellules leucémiques (durée : 2 min, maximum : 15 prélèvements de 2 min étalés sur 18 mois).

Impact sur les animaux

Les éventuels nuisances/effets indésirables peuvent se produire à 3 niveaux : -1/injection (éventuelle douleur post-injection, rapidement résolutive). -2/prise de greffe (éventuelles douleurs, perte de poids, changement de comportement). -3/monitorage biologique (éventuel stress momentané). -4/Le cas échéant, survenue de pathologies liées à l'âge.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Les cellules leucémiques de patients (dites cellules primaires) ne peuvent pas être obtenues en quantité suffisante pour tester in vitro l’efficacité des médicaments innovants. Ces cellules sont fragiles et ne peuvent être maintenues en culture suffisamment longtemps pour les besoins des expériences. L’utilisation de lignées cellulaires de leucémies aigues ne constitue pas une alternative, car elles ne représentent pas les spécificités individuelles des patients. Le modèle murin est le seul pertinent dans cette étude pour modéliser la rechute des patients individuels dans le cadre de la médecine personnalisée. Pour toutes ces raisons, l’utilisation de xénogreffes dérivées de patients reste le modèle préclinique indispensable pour l’étude des leucémies aiguës, et pour tester l’efficacité de nouveaux traitements, comme rapporté dans la littérature scientifique.

Réduction

6 prélèvements de patients à haut risque de rechute seront reçus par mois. La prise de greffe se produit pour environ 50% des souris injectées. Pour chaque patient, il est nécessaire de récupérer les cellules leucémiques provenant de 2 souris pour espérer avoir suffisamment de cellules leucémiques pour tester notre panel de médicaments innovants en duplicats et ainsi avoir des résultats statistiquement significatifs. Ainsi, afin de maximiser les chances de greffe et pour espérer obtenir suffisamment de cellules pour tester leur sensibilité aux traitements innovants, les cellules leucémiques de chaque patient seront injectées dans 4 souris âgées de 8 à 12 semaines (âge auquel le taux de prise de greffe est le plus haut).

Raffinement

Tout au long de ce projet, nous serons attentifs au bien-être des animaux : Les cages sont ventilées et enrichies à l’aide de cotons, petits bouts de bois et tunnels rouges, afin de répondre aux besoins des souris (nidification, entretien des dents, jeux). Celles-ci seront également maintenues en communauté (2 à 5 souris par cage), en accord avec leurs besoins sociaux. Nous avons défini des points limites précoces, évaluables à l’aide d’une grille de score que nous avons établie, dans le but de ne pas causer de souffrance animale. Un suivi visuel quotidien des animaux sera assuré par un zootechnicien Les responsables du projet tiendront une fiche d'observation des points limites 1 fois/semaine ou plus, si un animal présente des signes de mal-être ou de souffrance. La manifestation de tout signe évoquant une douleur définie par les points limites préalablement évoqués sera particulièrement surveillée. Le volume des injections et des prélèvements sera réduit au minimum possible. Afin de limiter la douleur, l'injection des cellules leucémiques au niveau de la veine caudale se fera sous anesthésie local. Les injections et prélèvements au niveau intra-tibial seront effectués sous anesthésie gazeuse (durée totale d'environ 2 minutes) avec couverture antalgique générale (30 min avant l'injection/prélèvement) et locale (immédiatement avant et après l'injection/prélèèvement) au point d'injection. Les prélèvements au niveau de la veine sub-mandibulaire et au niveau tibial pour le suivi de la prise de greffe seront réalisés en alternant successsivement les côtés gauche et droit pour chaque souris.

Choix des espèces

Voici les facteurs qui justifient le choix de la souris : 1) Les souris immunodéprimées ont été abondamment décrites dans la littérature scientifique depuis plusieurs années comme le meilleur modèle pour greffer les cellules hématopoïétiques humaines, étudier le développement des leucémies humaines et servir de modèles précliniques pour l’évaluation de nouveau traitements. 2) L'hématopoïèse (=la fabrication des cellules du sang) et la leucémogénèse (=l'apparition de la leucémie) ont été largement étudiés chez la souris. Nous pourrons donc analyser nos résultats à la lumière de toute cette connaissance accumulée chez la souris. 3) Leur durée de vie est particulièrement adaptée par rapport à la cinétique de prise de greffe et pour un programme de recherche sur 5 ans. 4) Les 2 sexes seront utilisés sans distinction car il n'y a pas d'influence des hormones sexuelles sur la survenue des leucémies. Afin de maximiser les chances de greffe et d'obtenir suffisamment de cellules, chaque prélèvement de patient sera injecté dans 4 souris, âgées de 8 à 12 semaines (car présentent le plus haut taux de succès de prise de greffe).

252 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation gamma du corps entier, que le porteur décrit comme indolore, puis des échographies cardiaques sous anesthésie, des passages sur tapis de course, des mesures de pression à la queue sous contention et une stimulation transœsophagienne. Une perte de plus de 20 % du poids déclenche la mise à mort, et toutes sont tuées en fin d'étude pour prélever cœur et poumons. Le projet cherche à mimer l'exposition de populations vivant en zone contaminée après un accident nucléaire, afin d'alimenter les normes de radioprotection.

Objectifs

Actuellement, des résultats préliminaires de notre précédentes étude ont mis en évidence un effet des doses faibles à modérées (inférieur ou égal à 500mGy) sur le développement d’arythmies atypiques à long terme et également l’observation d’un remodelage des vaisseaux pulmonaires. Il parait alors intéressant de vérifier le rôle du système nerveux sympathique et de l’hypertension artérielle pulmonaire sur la physiologie et le maintien de la fonction cardiaque. Notre l'hypothèse est qu’il existe un seuil pour lequel nous avons le développement de maladies cardiovasculaires et également des troubles du rythme dans le contexte de l’exposition faible à modérée et que cette pathologie cardiaque à long terme est due à un dysfonctionnement du système nerveux sympathique ou un remodelage vasculaire pulmonaire. L’objectif de ce projet sera d’évaluer cette hypothèse par un modèle expérimental d’exposition externe unique aux rayonnements gamma corps entier. Les effets des doses faibles à modérées de rayonnements ionisants gamma à long terme sur le cœur et les vaisseaux du poumon seront évalués afin d’apporter des réponses très attendues quant aux questions des effets biologiques pouvant induire des pathologies non-cancéreuses comme les pathologies cardiovasculaires pour permettre d’alimenter le système de radioprotection. En mimant une exposition à des doses faibles à modérées, ce projet sera complémentaire aux études épidémiologiques et permettra d’apporter des réponses notamment dans les gammes de doses où les études épidémiologiques manquent de puissance statistique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’obtenir de nouvelles connaissances d’un point de vue mécanistique sur les effets à long terme d’une exposition de doses faibles à modérées sur le système vasculaire (pulmonaire et cardiaque), le système nerveux sympathique cardiaque et sur le développement de troubles du rythme radio-induite afin d’améliorer et d’actualiser les connaissances et participer à la détermination des normes en radioprotection pour des institutions du domaine de la radioprotection. Il s’agit d’un projet multi-site se déroulant sur 3 EU différents.

Procédures

Les animaux subiront une irradiation corps entier à des doses faibles n’entrainant ni douleur, ni brulure que ce soit pendant l’irradiation ou après celle-ci. Des échographies seront réalisées sur les animaux sous anesthésie (1 fois par mois). Cette mesure sera prise 1 fois par mois à une semaine d’intervalle avec les échocardiographies pour limiter le stress et biaiser la mesure de pression artérielle. L'hypertension induite dans les modèles utilisés n'est pas très forte et sera indolore pour les animaux. Certaines échographies seront précédées d’un temps limité sur un tapis de course (10 min sur le tapis roulant). La mesure de pression artérielle sera réalisée à la queue sur souris vigiles. Le ballonnet est gonflé puis dégonflé pour prendre la mesure, le tout pendant 2-3 min. Les mesures sont répétées 10 fois. Les souris sont d’abord habituées avec une série de 10 mesures par jour pendant 5 jours, avant la première prise de mesure qui sera prise en compte. Et enfin une seule mesure de stimulation transoesophagienne sous anesthésie sera également réalisée une semaine avant la fin de la procédure pour se rendre compte d’un potentiel trouble du rythme.

Impact sur les animaux

L’irradiation à de faibles doses n’entraine pas de douleur ni de brulure aux animaux, seules des modulations d’expression protéique et une légère diminution de la fonction cardiaque a été observée à long terme. L'hypertension induite dans les modèles utilisés n'est pas très forte et sera indolore pour les animaux. Néanmoins un stress des animaux est possible lors de la mise en boite d’irradiation et lors des mesures de pression artérielle même s’il y a habituation au tube à contention. Les procédures d’injection peuvent potentiellement conduire à des infections. Les animaux subiront certains actes chirurgicaux qui seront réalisés sous anesthésie générale, n’entrainant pas de douleur pour les animaux.

Devenir

A la fin de la procédure toutes les souris seront euthanasiées pour prélever des organes (cœur et poumons) qui permettront une analyse histologique complétant les analyses fonctionnelles réalisées sur tous les animaux de ce projet.

Remplacement

Pour mimer l’exposition corps entier de résidents vivants en zone contaminée après un accident nucléaire par exemple celui de Tchernobyl, il est nécessaire d’avoir recours à une exposition externe à des doses faibles de rayonnements ionisants gamma (imitant les rayonnements ionisants du CS137) sur un modèle intégré (cardiomyocytes et fibres nerveuses). De plus, les études in vitro présentent des limites pour l’évaluation des mécanismes au niveau cellulaire après une exposition à des doses faibles à modérées et ne permettent pas d’identifier des processus physiologique et/ou physiopathologique comme la régulation de la pression artérielle ne peuvent être évalués qu'in vivo, tout comme l’évaluation de la fonction cardiaque, c'est pourquoi ce projet nécessite des modèles murins. Néanmoins pour une partie du projet, dès que possible, les voies et les molécules impliquées seront étudiées in vitro sur des cellules en culture. Néanmoins, il est très difficile de maintenir des cultures cellulaires au-delà de 3 semaines dû au vieillissement cellulaire et aux cycles limités des cellules.

Réduction

Au total, 252 animaux seront utilisés dans ce projet. Le nombre de 15 animaux par groupe a été établi avec l’utilisation d’outils statistiques permettant d’optimiser la puissance de l’étude et avec notre expérience concernant ce type d'analyses et ces modèles murins pour être au minimum. Néanmoins si on considère une mortalité possible due à la longévité des souris pour nos groupes qui seront gardés pendant 3 mois et 9 mois post-irradiation, on constituera des groupes de 18 animaux pour conserver un nombre d’animaux suffisant pour nos analyses statistiques. Il n’y aura pas 20% de mortalité mais la puissance statistique sera supérieure à celle attendue avec 15 souris. Si nous n’observons pas de mortalité tous les animaux seront pris en compte pour nos résultats.

Raffinement

Les animaux sont pesés régulièrement. Tout signe de prostration de l’animal, de blessures importantes dues aux bagarres entrainera l’euthanasie anticipée. Pendant l’ensemble des procédures, une surveillance quotidienne sera effectuée par les zootechniciens et hebdomadaire par le porteur de projet. Si le comportement d'un animal est altéré, il sera pesé avec un point limite à 20% de perte de poids constituent un point limite, ainsi que l’observation des certains signes d’atteinte de l’état général.

Choix des espèces

Ce projet vise à déterminer un seuil dose pour lequel on observe le développement de pathologies cardiovasculaires (hypertension artérielles pulmonaire, cardiomyopathies) et également des troubles du rythme cardiaque chez des souris irradiées en corps entier avec des rayonnements gamma à faible dose et ce afin de mimer des effets secondaires à long terme de l’exposition des personnes en territoire contaminé post accident nucléaire. Les souris seront âgées de 2 mois (8 semaines) au moment de l’irradiation car à cet âge leur système nerveux sympathique cardiaque est mature. Des souris C57BL/6 males seront utilisées pour notre projet afin de pallier les effets cardioprotecteurs des hormones comme les œstrogènes. Néanmoins lorsque nous aurons des résultats sur les mâles et si ceux-ci sont significatifs, nous pourront prévoir la réalisation de ces mêmes expériences sur des souris femelles.