Oncologie

116 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc, des injections intraveineuses et des séances d'imagerie répétées sous anesthésie, pour suivre la biodistribution de six molécules anticancéreuses modifiées. Les souris dont la tumeur dépasse 400 mm3 ou se nécrose sont mises à mort par dislocation cervicale. Le porteur présente l'étude comme préliminaire, destinée à sélectionner les meilleurs candidats, et revendique une réduction du nombre d'animaux grâce à l'imagerie de fluorescence.

Objectifs

Le TLR3 est un récepteur de l'immunité permettant au corps de se protéger des infections. Il est exprimé par les cellules immunitaires et épithéliales normales ainsi que de très nombreux cancers solides. Le concept du TLR3 comme cible anticancéreuse existe depuis près de 30 ans, même si son mécanisme exact n’est connu que depuis peu. L’activation de ce récepteur entraine une mort programmée spécifique des cellules cancéreuses (pas des cellules normales), ainsi qu’une inflammation locale ayant un effet antitumoral. La conjugaison de ces deux mécanismes d’action induit une autovaccination empêchant les récidives. Malgré cela, aucun activateur de ce récepteur n'a jusqu’ici obtenu l'autorisation de mise sur le marché en raison d'effets toxiques, de manque d'efficacité ou d’homogénéité. Un nouvel activateur de ce récepteur a récemment été découvert, homogène, actif, spécifique et surtout très bien toléré. De nombreuses études sur souris ont permis d’objectiver l’efficacité de ce nouveau candidat médicament (non protégées, ni vectorisé), administré par voie locale (intratumorale). Afin de favoriser l'administration par voie veineuse, ce candidat médicament sera protégé (pour résister aux enzymes présentes dans le sang qui peuvent dégrader ces molécules), et vectorisé (afin de cibler spécifiquement les cellules tumorales et immunitaires d’intérêt). L’objectif de cette étude est donc d’observer les effets de ces protections et vectorisations sur la stabilisation et la localisation des candidat médicament au cours du temps. Il s’agit d’une expérience préliminaire destinée à raffiner le choix des meilleurs candidats (qui devront être confirmé par la suite par des études de biodistribution plus complètes et à visées statistiques). Pour cette étude préliminaire, six différentes molécules (portant différentes combinaisons de protection et de vectorisation), seront analysées. Ces molécules seront toutes marquées avec une molécule fluorescente. C’est cette fluorescence qui permettra de les localiser et de les quantifier au cours du temps, grâce à des méthodes innovantes d’imagerie en trois dimensions. Cela permettra d’obtenir une biodistribution corporelle de ces composés. Pour chacune des six molécules, cinq souris seront injectées par voie intraveineuse. Les souris seront analysées quand leurs tumeurs atteindront 100 à 200mm3. A cette taille-là, les tumeurs sont suffisamment bien vascularisées pour permettre une délivrance à la tumeur par voie sanguine.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de de définir les bases pour une nouvelle voie d’administration d'un candidat médicament, en ciblant plus spécifiquement certains types de tumeurs ainsi que des cellules immunitaires d’intérêt, ce qui diminue les doses nécessaires à son activité ainsi que les effets indésirables. Il s’agit d’une étude de recherche à la fois fondamentale et translationnelle, permettant de poser les bases d’une nouvelle voie d’administration d’un candidat médicament anticancéreux, en vue d’une étude clinique chez l’homme. La première procédure permettra de sélectionner et caractériser le meilleur model tumoral à utiliser pour les études de biodistribution. La seconde procédure permettra de cribler les molécules modifiées sur la base de leur cinétique et quantité de distribution à la tumeur et ainsi d'évaluer le/les meilleurs candidats pour une étude clinique en injection par voie intraveineuse.

Procédures

# Greffe tumorale: injections sous-cutannées de cellules tumorales dans le flanc sous anesthésie gazeuse (3-5 minutes). # Injections par voie intraveineuses (produit de contraste dans la procédure-1 et molécules fluorescentes dans la procédure-2), sous anesthésie gazeuse (3-5 minutes). # Analyses par imagerie échographiques (échodoppler et echographie de contraste) sous anesthesie gazeuse (temps d'analyses cumulés de 30-40 minutes environ). # Analyses par imagerie de fluorescence 3D (non invasive) sous anesthesie gazeuse (5 minutes environ - répétées aux temps 5min, 15min, 30min, 1h , 2h, 4h, 6h et 24h ).

Impact sur les animaux

Douleurs engendrées par l’injection de cellules tumorales, la pousse tumorale, les anesthésies répétées, stress engendré lors des analyses de volume tumoral et de poids de la souris. De façon plus détaillée: #Procédure-1: (1) les animaux seront greffées avec des cellules cancéreuses par injection sous-cutanée dans le flanc sous anésthésie gazeuse. (2) Suivi de croissance tumorale trois fois par semaine avec manipulation des animaux pour mesurer la tumeur et peser les animaux. (3) Lorsque les tumeurs atteignent environ 100 à 200mm3, les souris sont anesthésiées pour deux analyses en imagerie échographique consécutives (non invasive). La seconde analyse nécessitera l'injection intraveineuse (dans la veine caudale) d'un agent de contraste (toujours sous anésthésie). Le temps cumulé de ces deux analyses est d'environ 30 à 40 minutes. (4) Les souris ayant des tumeurs au-delà de 400mm3 ou nécrosée seront mises à mort par dislocation cervicale. #Procédure-2: Les animaux seront greffés avec des cellules cancéreuses par injection sous-cutanée dans le flanc (du modèle déterminé en procédure-1). Les souris seront anesthésiées et injectées avec les molécules fluorescentes par voie intraveineuse (dans la veine caudale). Les souris seront alors analysées en imagerie de fluorescence (non invasive) sous anesthésie aux temps 5min, 15min, 30min, 1h , 2h, 4h, 6h et 24h (chaque analyse prenant environ 5 minutes). Après la dernière analyse à 24h, les animaux seront mis à mort et leurs organes récupérés post-mortem pour analyses.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux seront mis à mort. Leurs organes et tumeurs seront prélevés post mortem pour analyse.

Remplacement

Les preuves de concept in-vitro et ex-vivo des molecules modifiées (efficacité, stabilité, internalisation), ont déjà été effectuées avec succès. A présent, un modèle préclinique physiologique complexe est nécessaire dans les donditions d'injection par voie intraveineuse afin d’analyser la biodistribution dans les organes/tissus/tumeurs au cours du temps et de définir une approche qualitative et cinétique pour poser les bases d’une étude clinique.

Réduction

La procédure-1 permet de mettre au point le modèle et de le caractériser au mieux sur un nombre limité d’animaux (5 souris par modèle tumoral – 4 modèles). Ce nombre limité d’animaux est permis grâce à des méthodes non invasives d’imagerie échographiques de pointe permettant de répondre avec précision aux questions posées sur vascularisation des tumeurs et de perméabilité de celles-ci aux traitements injectés par voie intraveineuse. Seul le meilleur modèle sera utilisé par la suite. La procédure-2 s’effectue également sur un nombre limité d’animaux (8 animaux greffées pour 5 animaux analysés par molécule – jusqu’à 12 molécules). Pour éviter la dispersion des résultats, seuls les animaux les plus homogènes en termes de taille de tumeur mais aussi en termes de vascularisation seront analysés. La cinétique de biodistribution par imagerie de fluorescence constitue en soit une réduction par rapport aux biodistribution classiques en point final à chaque temps. Cette méthode évite ainsi d’avoir à procéder à de très nombreuses mises à mort d’animaux aux différents temps d’intérêt pour obtenir les mêmes résultats. Le fait que nous ne cherchions pas de résultats statistiques mais tout en étant sur un pool de tumeurs homogène et bien caractérisé, nous permet d’avoir les résultats suffisamment robustes pour répondre à la question du criblage de ces molécules in-vivo sur ce nombre limité d’animaux.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupe sociaux de 3 à 5 animaux, en environnement enrichi avec eau et nourriture (classique et non fluorescente) à volonté, dans des conditions sanitaires permettant que leur phénotype ne soit pas dommageable. Le changement d’alimentation pour une nourriture non fluorescente est généralement très bien toléré par les animaux et n’engendre pas de diarrhées ou autres troubles digestifs. Il est à noter que les enrichissements de type nid ou rouleaux en cartons seront proscris à partir de la greffe tumorale afin d'éviter toute plaie sur les tumeurs (significatifs d'exclusion de l'expérience et de Mise à Mort), et seront compensés par une augmentation des quantités de balles de coton et de batons à ronger. Les souris seront greffées avec tumeurs en injection sous-cutanée dans le flanc sous anesthésie gazeuse, selon les conditions publiées dans la littérature. La surveillance des animaux sera effectuée trois fois par semaine avec une analyse scorée du comportement animal, du poids corporel et du volume tumoral. La taille des tumeurs (de 100 à 200mm3 pour les études d’imagerie), permet une bonne analyse de la fluorescence ainsi qu’une souffrance et une gêne physique minimale pour l’animal, avec moins de risque de nécrose. L’imagerie par fluorescence et par échographie sont des processus non invasif et non douloureux mais nécessitant l’immobilité de la souris pendant l’acquisition des données. L'animal est anesthésié sous isoflurane et est placé dans une cassette de contention. Pour l’imagerie échographique, la souris est fixée sur un plateau chauffant réglable afin de maintenir sa température interne, contrôlable par une sonde anale. De plus les pattes sont fixées à des électrodes permettant de contrôler en direct l’ECG. Pour l’imagerie de fluorescence, de l’air chauffé circule dans l’appareil et permet de maintenir constante la température de l’animal. Les animaux sont réveillés sous une lumière chauffante et sous surveillance. Tous les animaux de l’expériences seront mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère bien caractérisé pour les études pharmacologiques permettant de démontrer dans un modèle physiologique complexe que les organes et/ou tissus normaux ne sont pas touchés par ces mécanismes d’action pouvant induire une toxicité du candidat médicament. En plus d’être un modèle pertinent, la souris est un modèle de petite taille, facile à manipuler et génétiquement bien caractérisé. Qui plus est, il existe aussi de nombreux outils (souris immunodéprimées, appareillage adapté comme le FMT...), qui permettent d'étudier précisément les différents mécanismes d’action de thérapies ciblées chez cette espèce. Des souris de 7 semaines seront utilisées. A cet âge, les souris sont physiologiquement matures, ce qui est nécessaire dans notre étude de biodistribution (assimilation, barrière hématoencéphalique...) etc. Les quatre types de tumeurs greffées provenant de patients humains ou d'une souche murine différente, donc toutes non immuno-compatibles, l'utilsiation des souris immunodéficientes BALB/c Nude permettra l'absence de rejet de ces tumeurs. De plus, s'agissant d'une souche de souris sans poils, l'acquisition de fluorescence s'en trouvera facilitée.

152 souris athymiques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des cellules cancéreuses prostatiques par implantation sous-cutanée ou par chirurgie intraprostatique, pour évaluer le rôle d'une isoforme protéique dans la croissance tumorale et les métastases. Le porteur mentionne une possible perte de poids et une mobilité réduite en cas de cachexie liée aux métastases. Il affirme qu'aucune alternative in vitro ou in silico ne permet d'étudier la progression tumorale dans un "organisme entier".

Objectifs

Malgré les nombreux progrès réalisés au cours des dernières années dans les domaines de la prévention, de la détection précoce et du traitement du cancer, cette maladie reste un problème majeur de santé publique. Lors de la croissance tumorale, certaines cellules cancéreuses acquièrent la capacité d’envahir les tissus environnants avant de disséminer dans des organes éloignés de la tumeur d’origine. Contrairement aux tumeurs primaires, cette capacité de dissémination n’est ciblée par aucune thérapie spécifique alors qu’elle est la cause majeure des décès par cancer. L’acquisition de la capacité d’invasion et le développement de métastases représentent donc un défi thérapeutique majeur qui nécessite d’en élucider les mécanismes moléculaires. Or, les mécanismes activés pendant la migration et l’invasion tissulaire sont complexes. Des travaux antérieurs ont pu préciser qu'une protéine structurale des jonctions communicantes intercellulaires, lorsqu’elle est localisée à la membrane plasmique, jouait un rôle important dans ces mécanismes moléculaires favorisant les capacités invasives des cellules de cancer de la prostate et dans la sensibilité au microenvironnement osseux dans le contexte des métastases. Il a également été rapporté qu’une isoforme courte particulière de cette protéine, située en intracellulaire, favorise, lorsqu’elle est surexprimée, le transit de la forme structurale longue vers la membrane des cellules cancéreuses prostatiques, les rendant alors plus agressives in vitro. Le présent projet a pour objectif d’évaluer in vivo le rôle protumoral de cette isoforme courte en étudiant l’effet de sa surexpression sur la croissance tumorale et sa capacité à induire et former des métastases.

Bénéfices attendus

Dans le domaine de recherche très peu exploré de cette isoforme courte, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires liés à la présence membranaire de la forme longue de la protéine structurale et son rôle dans la sensibilité au microenvironnement dans le cadre des métastases osseuses. La validation in vivo de l'isoforme courte en tant facteur pro-tumorigénique permettra d’une part de la reconnaitre comme un marqueur prédictif de progression du cancer de la prostate et d’autre d’en faire une cible thérapeutique anti-cancéreuse. Ce dernier aspect nous semble particulièrement important car à l’heure actuelle aucun traitement ne cible particulièrement cette capacité métastatique.

Procédures

Pour cette validation in vivo, 3 procédures expérimentales différentes vont être mises en place mais utilisant toujours les 4 mêmes clones de cellules tumorales à des fins de comparaison. Chacune des procédures correspondra à un site d’implantation/injection différent. La procédure 1 correspondra à une implantation sous-cutanée des différents clones de cellules prostatiques à des souris anesthésiées par voie gazeuse (durée de l'intervention entre 5 et 10 min). La procédure 2 correspondra à une implantation chirurgicale intraprostatique des différents clones de cellules prostatiques à des souris anesthésiées par voie gazeuse (durée de l'intervention entre 20 et 30 min). Enfin, la procédure 3 correspondra à une injection intravasculaire des différents clones de cellules prostatiques à des souris vigiles afin d'étudier l'impact de l'isoforme courte sur leur capacité à développer des métastases dans différents sites secondaires (durée de l'intervention environ 10 min). Le suivi du développement tumoral primaire ou métastatique se fera par imagerie in vivo sur animaux anesthésiés par voie gazeuse au maximum deux fois par semaine pendant 4 semaines pour la procédure 1 et pendant 5 semaines pour les procédures 2 et 3 (durée totale de chaque mesure entre 5 et 10 min).

Impact sur les animaux

Il existe une possibilité de perte de poids et une mobilité réduite en cas de développement de métastases liées à une potentielle cachexie pour les procédures 2 et 3.

Devenir

Tous les animaux des trois procédures seront mis à mort en fin d'expérience par anesthésie gazeuse (isoflurane) puis dislocation cervicale. Les tumeurs primaires seront ensuite systématiquement récupérées lors des procédures 1 et 2. En cas de signal in vivo révélant la présence de métastases, les tissus correspondants seront prélevés. Ces animaux, ayant subi une induction tumorale et développant potentiellement des métastases, ne pourront pas être réutilisés pour un autre projet.

Remplacement

Il n'est pas possible de remplacer l'expérimentation animale sur souris par d'autres alternatives in vitro en l'absence de modèles virtuels ou in silico disponibles pour etudier la progression tumorale et la dissémination métastatique dans un organisme entier.

Réduction

Par une approche statistique (Snedecor et Cochran), la réduction au maximum du nombre d'animaux nécessaires en expérimentation a été prise en compte, tout en s'assurant d'en avoir le nombre suffisant pour conduire une étude statistiquement interprétable. Le suivi de la croissance tumorale par bioluminescence par un imageur dedié au petit animal permet non seulement de suivre la croissance tumorale au cours du temps mais également de réduire le nombre d'animaux utilisés en permettant de collecter un nombre important de données par individu.

Raffinement

Ce projet fait suite à des projets antérieurs qui nous ont permis d'affiner au mieux les procédures expérimentales, notamment pour la définition de points de contrôle et limites (comportementaux et physiques). Ainsi, les modalités d'injection des cellules tumorales sont réalisées sous anesthésie générale, avec contrôle de la température corporelle, en présence d'antalgiques et d'anti-inflammatoires en péri et post phase opératoire afin de limiter au maximum la douleur. Des grilles de suivi ont été élaborées pour suivre au plus près le bien être animal. En cas d'apparition de signes de mal-être, un traitement à base de dérivés morphiniques est mis en place immédiatement. De plus, les conditions d'élevage sont optimisées au mieux (hébergement en groupe social de 4 à 5 souris, environnement enrichi avec des conditions de température et d'hygrométrie controlées) afin de s'assurer du bien-être des animaux tout au long des procédures expérimentales et de l'absence d'interférences sur les résultats. Ce projet utilise des animaux immnodéprimés. Les conditions d'hébergement sont adaptées et compatibles pour le maintien du statut sanitaire requis pour ces animaux génétiquement altérés.

Choix des espèces

Afin de pouvoir comparer les résultats que nous obtiendrons à ceux de la littérature, l’utilisation de souris est complètement justifiée. C’est également un modèle animal où l’induction des tumeurs dans les souches Nude est rapide et le suivi de leur croissance facilité par un imageur du petit animal. Les souris athymiques Nude sont très largement usitées dans les études oncologiques qui utilisent des cellules cancéreuses humaines rendant impossible le recours à des souris non immuno-déprimées. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 semaines au début de l'expérience pour les 3 procédures expérimentales. Cet âge correspond à des animaux matures sexuellement et dont la prostate est suffisamment développée pour permettre une injection standardisée.

148 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie développe des tumeurs mammaires, d'autres reçoivent une greffe de cellules tumorales, y compris des femelles pré-pubères de trois semaines, pour étudier le rôle d'intégrines dans le cancer du sein lié à BRCA1. Le porteur renvoie les retombées thérapeutiques au long terme et au conditionnel, l'étude visant d'abord à comprendre des mécanismes. Il revendique la souris comme un "modèle incontournable" et juge "indispensable" le recours à l'expérimentation in vivo.

Objectifs

Le cancer du sein représente la première cause de décès par cancer chez la femme, principalement dû à une connaissance encore incomplète des mécanismes moléculaires et cellulaires qui induisent le développement tumoral. La glande mammaire est une structure épithéliale constituée d’un système de canaux ramifiés et d’alvéoles. L’épithélium mammaire adulte est composé de cellules luminales sécrétrices du lait et de cellules basales myoépithéliales qui, en se contractant, aident à l’expulsion du lait vers les canaux. Ces deux types de cellules dérivent de la prolifération et de la différenciation de cellules souches mammaires. Or, des études récentes ont montré que l’amplification aberrante des cellules souches est à l’origine de cancers du sein agressifs associés à des mutations du gène BRCA1 (Breast Cancer 1), un gène connu pour être un suppresseur tumoral. Ces cancers appartiennent à un groupe des tumeurs pour lesquelles les thérapies ciblées utilisées dans le traitement d’autres types de cancers du sein (par exemple, les thérapies hormonales) se sont avérées inefficaces. Les intégrines sont des protéines présentes dans la surface des cellules qui permettent leur adhésion et régulent de nombreuses fonctions. Certaines intégrines sont indispensables à la multiplication et la différenciation des cellules souches nécessaires à une gestation et lactation normales. Nous souhaitons étudier le rôle de ces intégrines dans un modèle murin connu pour développer des tumeurs mammaires dont l’origine et les caractéristiques sont très similaires aux cancers du sein avec mutation en BRCA1 chez la femme. Nos premiers résultats indiquant que la perte des intégrines dans ce modèle diminue l’apparition des tumeurs mammaires, nous projetons d’analyser les mécanismes qui expliquent cette inhibition. On déterminera en particulier l’impact de la perte des intégrines dans la glande avant l’apparition des tumeurs (statut pre-néoplasique) et sur son contenu en cellules souches tumorales, connues pour leur implication dans les récidives et la dissémination métastatique.

Bénéfices attendus

L’interaction des intégrines avec la matrice extracellulaire qui entoure les cellules joue un rôle important au cours des différentes étapes de la progression tumorale mammaire, du carcinome in situ (tumeur en stage initiale, souvent bénin) à l’invasion tissulaire (tumeur invasif mais encore localisé à la glande mammaire) et la métastase (invasion d’autres tissues). De façon notable, certaines intégrines sont surexprimées dans les tumeurs du sein et leur expression est associée à un mauvais pronostic et à des taux de survie réduits. Notre étude permettra de déterminer la contribution des intégrines dans le développement tumoral de la glande mammaire et la régulation des cellules souches tumorales, responsables des récidives et de la dissémination métastatique. Notre approche permettra d’évaluer la contribution de ces intégrines dans les anomalies de croissance cellulaire, différenciation et invasion observées dans les carcinomes mammaires humains. A long terme, ces informations permettront de mieux appréhender les mécanismes impliqués dans la communication entre cellules épithéliales et matrice extracellulaire et notamment d’évaluer si des signaux anormalement émis par les intégrines dans le contexte tumoral peuvent constituer des cibles thérapeutiques efficaces pour le traitement de certains cancers du sein.

Procédures

Un suivi des animaux développant spontanément des tumeurs mammaires (observation et palpation) sera réalisé pendant toute la durée de l’expérience (au maximum 4 semaines après la détection des tumeurs). Des expériences de transplantation (greffe) de cellules tumorales dans le tissu adipeux mammaire de souris receveuses seront réalisées. Cette intervention chirurgicale est peu invasive, le péritoine (membrane entourant la cavité abdominale), restant intact. Elle est de courte durée (15-20 min par animal) et s’effectue sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Nos souris transgéniques sont viables et ne présentent aucun problème sévère de santé à l’âge adulte. Le modèle de tumorigenèse que nous étudions n’entraînent pas de souffrance notable. Les nuisances liées au développement tumoral sont faibles et les souris portant des tumeurs seront analysées en moyenne 2 semaines après leur détection, avec un maximum de 4 semaines pour les tumeurs à croissance lente. Les tumeurs restent localisées à la glande mammaire et ne sont pas métastatiques dans notre fenêtre expérimentale. L’apparition de tumeurs sur d’autres organes reste extrêmement rare dans ce modèle. De possibles mais rares ulcérations peuvent se produire dans les tumeurs mammaires chez certains animaux. Les animaux opérés pourront éventuellement développer des tumeurs mammaires qui, d’après la littérature, reproduiront le phénotype de la tumeur originale avec, notamment, une absence de développement métastatique.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour analyses post-mortem

Remplacement

Notre projet repose sur l’utilisation de souris génétiquement modifiées (souris transgéniques) pour définir les mécanismes qui régulent les cellules souches et leur contribution dans les cancers du sein. La glande mammaire est un tissu spécifique aux mammifères dont le fonctionnement normal est contrôlé par un ensemble complexe de régulateurs hormonaux et locaux. La souris reste à ce jour le modèle le plus pertinent pour étudier la biologie des cancers du sein. Les souris transgéniques sont reconnues comme des modèles incontournables pour explorer les mécanismes de tumorigénèse et développer des thérapies. Bien que nous utilisions des méthodes alternatives réduisant l’utilisation des animaux, en particulier des cultures pour modéliser le comportement des cellules tumorales in vitro, il est indispensable d’effectuer des expériences in vivo pour comprendre la formation et la progression des tumeurs dans leur environnement physiologique.

Réduction

Le nombre de souris utilisées pour chaque expérience sera réduit au minimum possible pour maintenir une signification statistique. Pour réduire au maximum le nombre d’animaux et exploiter au mieux les prélèvements de glande mammaire, on utilise chaque glande mammaire d’une même souris donneuse, celle-ci étant pourvue de 5 paires de glandes. Des schémas de reproduction des souris transgéniques sont réalisés afin d’obtenir efficacement les cohortes de souris appropriées.

Raffinement

Les animaux seront manipulés le moins possible. Les souris seront surveillées soigneusement pour détecter tout signe de détérioration des conditions cliniques. L’apparition de tumeurs sera surveillée à partir de l’âge de 4 mois (l’âge moyen d’apparition de tumeurs dans ces souris est de 7,5 mois). Des palpations seront effectuées trois fois par semaine. Un examen complet au moins hebdomadaire (fréquence adaptée à l’évolution) des souris développant des tumeurs permettra de détecter des signes précoces de détresse et de maladie. Les points limites sont soigneusement définis avec une surveillance attentive des signes cliniques. Des fiches d'évaluation clinique sont mises en place pour ce projet spécifique. Les expériences de transplantation se font sous anesthésie générale. Pour minimiser les risques d’infection, les instruments de chirurgie sont stérilisés et les surfaces et la loupe utilisées, soigneusement lavées et rincées à l’éthanol. Pendant l’opération un gel de protection oculaire est appliqué aux animaux pour éviter le desséchement. Des analgésiques, sont administrés 20 min avant l’anesthésie (buprenorphine, carprofen), puis relais 24h après l’opération (ibuprofène). Après l’intervention, nous utilisons du fil de suture stérile résorbable pour refermer la plaie. En post-opératoire, les souris encore anesthésiées sont réhydratées et placées sur une platine chauffante pour éviter l’hypothermie. Les souris greffées sont surveillées tous les jours afin de déceler tout signe de mal-être et pour détecter l’apparition de tumeurs (palpation trois fois par semaine). Si elles présentent des signes de mal-être (amaigrissement, prostration), elles sont mises à mort avant la fin programmée de l’expérience.

Choix des espèces

Notre programme de recherche nécessite l’utilisation de mammifères. L'organisation générale, le développement et le fonctionnement de la glande mammaire sont très similaires chez la souris et chez la femme. Par ailleurs, la connaissance du génome murin, sa forte homologie avec le génome humain et l’existence de divers modèles génétiques murins rendent ce modèle puissant. Enfin, c'est un animal facile à anesthésier, ce qui permet de réduire au maximum le stress qui pourrait être provoqué chez l'animal. Ainsi, ce modèle animal est le meilleur compromis entre l’étude d'un modèle animal mammifère et l’obtention de réponses pertinentes aux questions posées. Pour l’analyse des tumeurs, les souris avec un phénotype potentiellement dommageable sont euthanasiées à l’âge adulte (à partir de 5-6 mois d’âge lors de l’apparition des tumeurs ou avant, pour analyse de la glande pre-néoplasique). Les tumeurs sont analysées avant qu’elles ne génèrent de signes de souffrance chez les souris. Les souris receveuses utilisées dans les expériences de transplantation sont des femelles pré-pubertaires âgées de 3 semaines. A ce stade, l’épithélium mammaire est très peu développé, on peut donc l’éliminer par microchirurgie et transplanter les cellules du donneur dans la partie du tissue adipeux resté intact.

5 070 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur leur greffe sous la peau des cellules de cancer du sein, puis leur administre chaque jour une à trois molécules inhibitrices, les souris étant mises à mort dès que la tumeur dépasse 2 000 mm³ ou en cas de perte de poids supérieure à 20 %. Les prélèvements sont réalisés post-mortem. Il affirme que les essais in vitro déjà menés ne suffisent pas et que l'étape chez l'animal reste "indispensable" au développement des médicaments.

Objectifs

Nous avons identifié un onco-métabolite qui stimule la prolifération des cellules mammaires expriment le récepteur des estrogènes (RE+) ou ne l’exprimant pas (triple négatif ou TN) in vitro et in vivo. In vitro, nous avons récemment caractérisé les voies de signalisation qui participent au développement tumoral induit par cet onco-métabolite et les voies métaboliques qui induisent la production de cet onco-métabolite. Nous avons caractérisé différents acteurs impliqués dans les voies de signalisation et de production cet onco-métabolite dont le ciblage par des inhibiteurs bloque la prolifération tumorale des cellules tumorales mammaires RE+ ou TN. Nous avons caractérisé un analogue phytostérol cet onco-métabolite qui cible les mêmes voies de signalisation mais qui a une activité anti-mitogène in vitro. Nous avons caractérisé une nouvelle cible thérapeutique (C1) qui médie les effets pro- et anti-prolifératifs de ces deux molécules in vitro. Les objectifs du projet consisteront i) à valider in vivo l’implication de la cible C1 dans les effets mitogènes de cet onco-métabolite et anti-mitogène de l'analogue phytostérol de cet onco-métabolite en utilisant des modèles de cellules KO pour la cible C1 (KOC1) en comparaison avec des cellules non KO (WT et mock), ii) à étudier l’effet des différents inhibiteurs ciblant différents acteurs des voies de signalisation ou production de cet onco-métabolite, seul ou en association, sur le développement de différents modèles de cancers mammaires RE+ et TN, implantées chez la souris, traités ou non par cet onco-métabolite. Nous utiliserons différentes lignées tumorales commerciales exprimant les cibles d’intérêts (WT et mock) ou déficientes pour le gène d’intérêt (KOC1).

Bénéfices attendus

Le bénéfice de ce projet est de valider, in vivo, le ciblage thérapeutique de deux nouvelles voies impliquées dans la signalisation et la production d’un onco-métabolite induisant la prolifération des cancers du sein RE+ et TN ainsi que l’efficacité de différents inhibiteurs ciblant différents acteurs de ces deux voies, seul ou en association, sur le développement de différents modèles de cancers mammaires RE+ et TN. Les bénéfices seront de pouvoir publier dans un article scientifique les résultats de ce projet et d’en faire bénéficier la communauté scientifique. A terme, ce projet permettra de proposer des traitements ou combinaison de traitements pour ces cancers qui représentent la première cause de mortalité chez la femme.

Procédures

Les interventions sur les animaux seront : l'injection en sous cutanée des cellules tumorales pour établir une tumeur : 1 injection / expérience (Exp 1 à Exp 3), avec une durée de 1 min/ souris; Traitement avec une molécule: 1 fois par jour, 5 jours/7, avec une durée de 1 min/souris. Traitement avec deux molécules : 1 fois par jour, 5 jours/7, avec une durée de 2 min/souris. Traitement avec trois molécules : 1 fois par jour, 5 jours/7, avec une durée de 3 min/souris. Les prélèvements se feront post-mortem.

Impact sur les animaux

L'onco-métabolite, à la dose qui sera utilisée, a été testé in vivo sur plusieurs modèles de cancers mammaires RE+ et TN et aucun effet indésirable n'a été observé. Les inhibiteurs inhS1 à inhS5 et inhP1 ont déjà été utilisés in vivo sans effet indésirable observé sur les animaux aux doses qui seront testées. Les autres inhibiteurs n’ont pas encore été testés in vivo. Dans tous les cas, pour chaque traitement ou combinaison de traitements, nous serons vigilants et nous surveillerons de façon quotidienne les animaux afin de s’assurer que les inhibiteurs n’auront pas d’effets indésirables et ne provoquerons pas de souffrance.

Devenir

Procédure 1: garder en vie 5070 souris. Procédure 2: mise à mort à la fin des expériences

Remplacement

Des expériences in vitro sur les cellules utilisées dans ce projet ont été préalablement réalisées avec l'ONCO seul ou en association avec les inhibiteurs, qui seront testés in vivo, pour s'assurer de la pertinence d'étudier ces inhibiteurs sur la croissance tumorale chez la souris. Cependant ces expériences ne sont pas suffisantes et nous devons avoir recours à l’utilisation de souris afin de montrer l’efficacité des molécules testées dans un modèle animal. Les études précliniques chez l’animal sont des étapes indispensables dans le développement des médicaments pour démontrer leur efficacité.

Réduction

Le nombre de souris utilisées sera le nombre d’animaux qui permettra de mener à bien ce projet et d’avoir des résultats significativement exploitables pour permettre d'avoir un suivi de la réponse anti-tumorale au cours du temps et de pouvoir être publié dans un article scientifique.

Raffinement

Les animaux utilisés au cours de cette expérience seront maintenus dans des conditions optimales avec une surveillance régulière de leur bien-être et un enrichissement du milieu. Les animaux auront un suivi clinique quotidien (observations, manipulation/palpation, état général, pesée) afin d’intervenir rapidement si les animaux manifestent des signes de douleur. Si une souffrance est observée, un traitement mis dans l’eau de boisson pour éliminer la douleur sera mis en place sous prescription du vétérinaire de l’animalerie. Si des symptômes correspondants à des critères d’arrêt de l’expérience (voir ci-dessous) sont observés, Les souris seront anesthésiées en injectant un mélange de kétamine plus xylazine (50 mg + 5 mg /kg, i.p.) puis mises à mort en injectant une solution de pentobarbital (150 mg/kg, i.p.). De même, les animaux seront mis à mort si la tumeur atteint un volume supérieur à 2000 mm3. Critères d'arrêt par rapport à la souffrance et procédure d’urgence en cas de dégradation rapide de l’état d’un animal : Les critères d’arrêt de l’expérimentation établis afin de minimiser la souffrance et/ou la détresse des animaux sont les suivants : Perte de poids > 20 % du poids initial ; en particulier, une maigreur extrême des animaux sera définie comme critère d’arrêt.

Choix des espèces

La souris est le modèle utilisé majoritairement par la communauté scientifique internationale pour tester in vivo les effets de molécules anticancéreuses ou pro-tumorales et permet de comparer les effets obtenus à d’autres molécules développées dans d’autres laboratoires. Les modèles utilisés se reproduisent bien. De nombreux outils sont disponibles pour l’étude de cette espèce comme les anticorps ou les microarrays. Les souris sont achetées à l’âge de 5-6 semaines et greffées après la période d’acclimatation. Les souris sont adultes lorsqu’elles sont traitées.

192 jeunes rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès la naissance, le porteur leur fait ingérer par la bouche des bactéries, puis mesure leur comportement alimentaire lors d'isolements répétés et d'un test à deux bouteilles opposant eau et solution sucrée, avant de les décapiter sous anesthésie pour prélever cerveau et sang. Il décrit un protocole sans douleur mais reconnaît le stress lié à l'isolement des ratons. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico assez complexe n'existe et que le rat Fischer est "nécessaire" à la continuité du projet.

Objectifs

Ce projet repose sur la constatation qu’un enfant présente plus de risque de développer une obésité si sa mère était en surpoids ou présentait une obésité avant ou pendant la période périnatale. Etant donné que l’obésité modifie la composition du microbiote en faisant augmenter la présence de bactéries néfastes pour le métabolisme, la question est de savoir si le comportement alimentaire de l’enfant né par voie basse et allaité peut être influencé par le transfert du microbiote maternel. Selon cette hypothèse, le microbiote maternel modifierait, par l’intermédiaire de métabolites bactériens, le neurodéveloppement du petit dans les structures cérébrales liées au comportement alimentaire. Les deux premières parties du projet ont abouti aux résultats suivants : 1. Les ratons à qui l’on a fait ingurgiter par têtage dès la naissance un mélange de microbiotes vaginaux, laitier et fécaux provenant de rates obèses s’alimentent plus que des ratons ayant ingurgité un microbiote de mères non obèses (ingéré laitier doublé, par exemple) et développent une préférence pour les aliments gras et/ou sucrés jusqu’au stade jeune adulte. 2. L’analyse des microbiotes des mères et des ratons a mis en évidence la présence d’espèces bactériennes dont les abondances/absences étaient corrélées avec des caractéristiques du comportement alimentaire des petits. L’expérimentation décrite dans cette demande vise à déterminer si les supplémentations en 2 des espèces bactériennes identifiées, et supposées favorables (car abondantes chez les rates non obèses), peuvent effectivement modifier le comportement alimentaire des ratons en le modérant. Celui-ci sera examiné à 3 temps de leur croissance : pendant la lactation, à l’adolescence et au stade jeune adulte.

Bénéfices attendus

Si l’obésité est un des grands problèmes de santé des pays industrialisés, l’obésité des enfants est doublement préoccupante, car un enfant en surpoids a toutes les chances de souffrir de ce problème et/ou de diabète de type 2 dans sa vie d’adulte. Les traitements classiques –régimes, restriction alimentaire, activité physique etc- restent généralement en échec, car trop difficiles à poursuivre dans la durée. De nouvelles sources thérapeutiques doivent donc être envisagées. L’influence du microbiote dans les problèmes métaboliques est désormais bien reconnue. La question du projet validé par l’ANR était de savoir si le microbiote maternel, transmis lors de la naissance et de la lactation, pouvait influer sur le comportement alimentaire des petits. L’objectif était d’identifier des espèces bactériennes favorables ou néfastes, dans la perspective plus lointaine de modifier et corriger le microbiote défavorable. Nous avons mis en évidence, dans une première partie, des espèces bactériennes plus abondantes dans le microbiote des ratons résistant à l’obésité et nous allons ici déterminer leur impact sur le comportement alimentaire de jeunes rats. Si les bactéries étudiées dans cette expérimentation se révélaient bénéfiques en induisant une baisse de la prise alimentaire, cela pourrait contribuer à la mise en place de nouveaux traitements par supplémentation bactérienne

Procédures

Hormis la récupération de féces dans les pots de pesée des ratons, il n’y a pas de prélèvement sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Ce protocole n’engendrera aucune douleur, mais des isolements seront nécessaires, en raison de la mesure de l’ingéré alimentaire en différents points. Dès la naissance, les ratons nouveaux nés recevront par têtage de petits volumes (25µl) de liquide (eau salée) contenant ou non les bactéries étudiées. Cet acte est réalisé avec le plus grand soin possible par des intervenants expérimentés. La goutte de liquide est déposée sur la cavité orale des ratons, sans forcer l’introduction. A J15, les ratons seront isolés de leur mère pendant 2 heures, puis remis à têter pendant 1 heure. A J34, 8 ratons dans chaque isolateur seront placés dans des cages individuelles pendant 1 heure, le temps de consommer un aliment appétent (céréales chocolatées) puis remis dans leurs cages d’origine, et ce pendant 10 jours, puis ils seront euthanasiés le 11ème jour. A J62 les ratons restants seront placés dans des cages individuelles pour l’habituation à un test 2 bouteilles, l’une contenant de l’eau et l’autre une solution sucrée. La consommation de ces boissons sera mesurée pendant 3 jours et les ratons seront euthanasiés. Le stress dû à l’isolement sera donc limité autant que possible.

Devenir

Les animaux seront décapités après anesthésie profonde à l’isoflurane afin de récupérer le sang du tronc et le cerveau. Des analyses de peptides liés à l’alimentation seront effectuées.

Remplacement

Ce projet vise à déterminer l’effet de la supplémentation de 2 bactéries sur le comportement alimentaire du jeune. Ces bactéries ingérées sont susceptibles de générer des métabolites pouvant agir sur les structures cérébrales liées à l’alimentation, par voie nerveuse ou circulatoire. L’utilisation d’animaux est donc obligatoire, car il n’y a aucun modèle in vitro ou in silico suffisamment complexe qui existe et puisse être utilisé dans cet objectif.

Réduction

Le nombre d’animaux a été fixé au strict nécessaire, par un calcul statistique de puissance (n=8 par temps, traitement et sexe) .

Raffinement

Il n’y a pas douleur particulière liée à la réalisation de ce protocole. Les ratons seront conservés avec leur mère pendant la durée de la lactation. Lors de l’isolement pour la mesure de l’ingéré laitier, ils seront isolés par portée entière, dans une cage contenant de la litière de la cage d’origine, et du sopalin déchiqueté par la mère. L’ingéré alimentaire est mesuré de plusieurs façons, mais chaque fois sur des ratons différents qui sont euthanasiés après ces mesures. Par conséquent, l’isolement nécessaire pour la mesure sera le plus bref possible et n’interviendra qu’une seule fois dans la vie de l’animal. Les animaux sont surveillés quotidiennement et pesés deux fois par semaine. Tout signe indiquant un mal-être est surveillé (prostration, perte de 10% de poids par rapport à la mesure précédente, dos vouté, pelage dégradé, blessure). Bien que peu probable, un incident d’expérimentation peut survenir. Dans le cas d’un animal en détresse, une surveillance de 24 h sera effectuée, et si l’état de l’animal reste non satisfaisant, il sera exclu de l’expérience et euthanasié.

Choix des espèces

C’est le comportement alimentaire du jeune qui nous intéresse, et nous utliserons donc des ratons âgés de 15 à 70 jours, des deux sexes. Le rat Fischer est un bon modèle pour les études nutrionnelles et métaboliques ; ce modèle a été utlisé dans la première partie de l’expérimentation, et il est nécessaire pour la continuité et la cohérence du projet.

135 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plus lourde est l'implantation chirurgicale de capteurs télémétriques dans l'abdomen, dont le porteur reconnaît qu'elle peut provoquer décès sous anesthésie, infection ou arrêt cardiaque, l'hébergement en cage individuelle affectant en outre le bien-être social des souris. Elles sont ensuite exposées de façon répétée à des champs radiofréquences puis mises à mort pour analyser les organes de la thermorégulation. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro n'est possible tant que la cible moléculaire n'est pas identifiée.

Objectifs

Les champs radiofréquences (RF) deviennent de plus en plus ubiquitaires. Au-delà des interrogations soulevées par le public, cela justifie de rechercher s’il existe un risque même faible, de telles expositions à faible niveau, répétées ou continues. A faible intensité, il a été montré par plusieurs équipes qu’une exposition chronique ou répétitive à des RF de faible niveau à 900MHz - 1 à 30 V/m - peut produire des réponses chez la souris semblables à celles provoquées par le froid. L’objectif de notre projet est de préciser l’effet des champs RF dans ces réponses en étudiant les mécanismes biologiques impliqués chez les souris exposées de façon répétée aux champs radiofréquences (RF) et en identifiant les cibles moléculaires responsables des changements observés. Ce projet vise à vérifier quels récepteurs thermiques sont à l'origine des comportements manifestés par les animaux exposés. Plus spécifiquement les questions abordées dans ce projet sont: 1) Est-ce que le phénomène de vasoconstriction observé chez les animaux exposés se produit dans la même plage de température lorsque la température ambiante augmente et lorsqu'elle diminue ? 2) Est-ce que cet effet se produit aussi chez des souris privées d’un gène pour un récepteur thermique (souris mutantes) ? 3) Dans quelle gamme de fréquences cet effet est-il observable ? Dans ce projet, 135 souris adultes seront utilisées, 108 mâles et 27 femelles.

Bénéfices attendus

L’identification de la cible moléculaire d’interaction du champ RF permettra d’envisager d’une part les possibles conséquences sanitaires des effets des RF sur la régulation thermique chez les animaux, d’une part l’éventuelle extrapolabilité ou non à l’homme des effets observés.

Procédures

Une implantation intra-péritonéale de capteurs télémétriques sera effectuée sur 119 souris, 92 mâles dont 14 mutées sur le gène TRPM8 et 27 femelles dont 14 mutées sur le gène TRPM8. La durée d'intervention est d'environ une demi-heure. Les souris doivent être hébergées isolément en cage individuelle en post-opératoire (4 jours, 119 souris), ou sur 2 jours pour les mesures de température par caméra infra-rouge (16 souris).

Impact sur les animaux

L’acte le plus sévère sur une partie des animaux est la chirurgie d’implantation de capteurs télémétriques. Les effets indésirables attendus sont une mauvaise réaction à l’anesthésie (décès), et dans les 3 à 4 jours post-opératoires une agressivité des congénères, une infection de la plaie, sous-cutanée ou du péritoine, un possible lâchage de suture nécessitant une reprise chirurgicale. Un arrêt cardiaque post-chirurgical ou une rupture de suture dans les 24h ont quelquefois été observés dans nos expérimentations antérieures. L’exposition au champ RF ne produit a priori pas d’effet indésirable attendu. La fragilité post-opératoire nécessite 3 à 4 jours d'hébergement en cage individuelle et les mesures de température par caméra infra-rouge sur 48h nécessitent également un hébergement en cage individuelle. Cet isolement en cage individuelle supérieur à 24h a un retentissement sur le bien-être social des souris.

Devenir

A la fin de la période d’exposition, les animaux seront mis à mort pour étudier les modifications tissulaires et moléculaires des organes impliqués dans la régulation thermique.

Remplacement

Les premiers objectifs de cette étude visent à préciser les cibles moléculaires ou tissulaires des effets observés sur la régulation thermique lors d’expositions répétées à des champs RF. Ceci permettra lorsqu’elles auront été identifiées d’envisager des études in vitro pour explorer les paramètres efficaces de ces effets. D’ici là, la réaction de régulation thermique étant un effet systémique global, cet effet ne peut pas être observé par des méthodes in vitro tant que la cible d’interaction moléculaire ou cellulaire n’est pas clairement identifiée, et il n’existe pas de modèle tissulaire partiel qui éviterait de rechercher cet effet in vivo.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires à une bonne compréhension des mécanismes mis en jeu, des études in vitro et une modélisation en dynamique moléculaire sont envisagées dans ce projet. Ces travaux devraient permettre de cibler plus rapidement les paramètres efficaces de l’effet étudié et ainsi limiter le nombre d’expérimentations in vivo effectuées à cette fin. De plus, plusieurs expérimentations sont conditionnées aux résultats antérieurs, et ne seront donc pas effectuées lorsqu’elles n’ont pas d’utilité. A la fin de la période d’exposition, les animaux seront mis à mort. Pour optimiser l’utilisation des animaux et limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, de nombreux échantillons de tissus seront prélevés pour réaliser des analyses biochimiques et immunohistochimiques.

Raffinement

Ce projet sera réalisé dans des chambres réverbérantes, où les animaux seront hébergés pendant l’exposition. Un fond sonore sera diffusé la journée pour leur permettre de s’habituer au bruit généré par les manipulations et ainsi limiter le stress pouvant être ressenti durant les expérimentations. Du matériau leur permettant de nidifier, des tubes colorés et des bâtons en bois à ronger seront également disposés dans leurs cages d’hébergement pour favoriser leur développement cognitif. Les protocoles expérimentaux limiteront fortement l’intensité et la durée de l’inconfort ou de l’angoisse des souris qui seront utilisées par l’utilisation d’antalgiques pré et post-opératoires, et permettront de réduire au minimum le nombre d’animaux nécessaires, pour obtenir des résultats concluants. Des procédures d’anesthésie et de mise à mort éviteront toute douleur ou angoisse prolongées. Une surveillance régulière permet également de détecter toute souffrance aigue et d’anticiper l’aggravation de l’état des animaux.

Choix des espèces

La souris est une espèce très utilisée dans la recherche fondamentale et bien documentée dans la bibliographie. Ce qui permet des comparaisons de nos résultats avec ceux obtenus précédemment concernant les effets thermiques des champs RF dans la litérature scientifique. L’équipe possède une expertise en toxicologie expérimentale, ainsi que dans le domaine des effets des champs RF et de la régulation thermique. L’équipe dispose ainsi des compétences et de l’équipement nécessaires à l’exposition des souris aux RF et à l’évaluation des effets précités.

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié suit un régime riche en fibres, toutes reçoivent une injection de substance cancérigène sous la peau, et une partie est enfermée sous cloche sans eau ni nourriture pendant une à quatre heures pour mesurer le dihydrogène produit. Le porteur indique que les animaux peuvent développer des nécroses au point d'injection et une tumeur, et sont tués aux points limites pour prélèvement. Il affirme que le rôle du microbiote et l'immunosurveillance des cancers ne peuvent s'étudier qu'in vivo, sans alternative à ce jour.

Objectifs

Il a été montré qu’un régime riche en fibre (High Fiber Diet - HFD) permet de moduler positivement la composition de la flore intestinale, ainsi que ses fonctions, impactant sur le métabolisme et l'immunité de l’hôte. Ceci conduit à l’activation de certains lymphocytes au niveau intestinal. Dans un modèle murin de mélanome, un pré-conditionnement à l’aide d’un régime HFD permet de prévenir la pousse tumorale. Au sein des tumeurs résiduelles, nous retrouvons ces lymphocytes avec des fonctions augmentées.Ceci suggèrent qu’un régime riche en fibre, en modulant le microbiote intestinal et ses métabolites, active l’immunité locale et systémique de l’hôte, permettant une immunosurveillance accrue des cancers. Afin de pleinement démontrer le rôle de la nutrition dans la prévention des cancers, nous proposons ici d’évaluer les capacités préventives des cancers d’un régime HFD, dans un modèle de cancer chimio-induit, qui se développe « naturellement » suite à l'exposition à un carcinogène. Cette démonstration au plus proche de la situation clinique des patients renforcera nos observations et sera rapidement transférable en clinique humaine, ainsi que dans la population générale.

Bénéfices attendus

Le modèle de mélanome utilisé jusqu'à présent est très artificiel, car il consiste en l'injection directe de cellules cancéreuses. En conditions physiologiques, un cancer apparait progressivement, suite à une exposition à un carcinogène. Ce projet permettra de mettre en évidence l'effet préventif du régime riche en fibres (High Fiber Diet – HFD) sur l'apparition de cancer, dans des conditions physiologiques normales, suite à une exposition à un carcinogène. L'ajout d'un anticorps bloquant les lymhocytes chez les animaux n'ayant pas développé de tumeur sera une preuve de concept de l'implication de l'immunosurveillance dans la prévention de l'apparition de tumeurs. La mesure de dihydrogène sera un argument supplémentaire pour expliquer cette immunosurveillance accrue suite au régime HFD.

Procédures

La moitié des animaux (92) suivra un régime High Fiber Diet (HFD) durant la totalité de la procédure, pendant que l'autre moitié aura un régime standard. Après 3 semaines de pré-conditionnement, chacune des 192 souris recevra une injection sous-cutanée de carcinogène, et leurs fécès seront prélevés une fois par mois. Durant les neufs mois suivant l'injection du cancérigène, maximum 20% des animaux (40) développeront une tumeur, puis de nouveau 20% (40) après l'injection de l'anticorps bloquant les lymphcytes. 24 animaux, n'ayant pas développé de tumeur, seront mis sous cloche pour mesurer le dihydrogène qu'ils produisent (2 séquences de 3 mesures d'1 à 4h par semaine).

Impact sur les animaux

Les nuisances au bien-être animal apportées par ces expérimentations seront visibles par des caractères physiques (manque de toilettage, poil ébouriffé, écoulement nasal/oculaire posture prostrée), comportementaux, (mobilité réduite, vocalisations), ainsi que par la perte de poids. Les animaux pourront aussi déveloper des nécroses au site d'injection du carcinogène et seront manipulés pour les collectes de fécès. Dans la cloche pour la mesure de dihydrogène, les animaux n'auront pas d'accès à l'abreuvement et à l'alimentation pour la durée de la mesure.

Devenir

Les animaux en fin d'expérimentation seront euthanasiés après avoir atteint les points limites, pour des prélèvements.

Remplacement

Le rôle du microbiote intestinal ne peut être étudié qu’in vivo. En effet les interactions hôte/microbes et notamment système immunitaire de l’hôte/microbes et les réponses anti-tumorales induites nécessitent une étude dans un organisme vivant. Il n’existe donc pas d’alternative à ce jour.

Réduction

Afin de tenir compte de la variabilité inter individuelle dans la réponse à l'agent carcinogène d'une part (20% des animaux exposés développent une tumeur) et au régime HFD d'autre part, ainsi que des aléas dus au maintien des animaux durant toute la durée de la croissance tumorale, deux groupes de 96 souris seront constitués, afin de s'assurer 18 à 20 animauxdéveloppant une tumeur dans le groupe contrôle in fine. Ainsi malgré la variabilité, ce nombre d’animaux par groupe apportera une fiabilité au niveau statistique.

Raffinement

Afin d'assurer le bien être des animaux, les souris seront hébergées par cage de 6, avec environnement enrichi. Le régime alimentaire n'est associé à aucune contrainte. L'injection de l'agent carcinogène n'induit qu'une légère souffrance des animaux. Toutefois, les animaux seront quotidiennement surveillés la première semaine suivant l'injection du carcinogène, puis 1 fois par semaine au minimum jusqu'à J70. Au delà, et ce jusuqu'au jour 250, les animaux seront cliniquement suivi au minimum 3 fois par semaine. Les animaux seront sacrifiés dès lors que la tumeur nécrose ou atteind la taille définie comme point limite. En plus des points limites liés à la tumeur, les animaux seront suivis pour évaluer l’apparition de stress/douleur liés à l’expérience selon les critères de base (poil hérissé, faible activité, perte de poids).

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus pertinent pour mener ce genre d’étude. La manipulation de leur flore est acquis. De plus, les modèles tumoraux et d’immunothérapie, ainsi que les outils pour étudier les réponses immunes induites sont parfaitement développer pour ce modèle animal. Tous nos résultats précédents obtenus dans le cadre de cette thématique scientifique l'ont été avec ces mêmes souris. Les souris seront utilisées à partir de 6 semaines d’âge (livrées à 5 semaines + 1 semaine d'acclimatation). A ce stade, les souris sont sevrées, et le système immunitaire est pleinement mature et permet donc son étude.