Oncologie
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Analyse et traitement des tumeurs du sein
- Recherche fondamentale
- Oncologie
828 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses humaines dans les canaux mammaires ou sous la peau, des séances d'imagerie sous anesthésie et, pour certaines, une ablation des ovaires et des traitements hormonaux, sur une durée pouvant atteindre un an. Le porteur affirme que les tumeurs resteront le plus souvent petites et peu douloureuses, les animaux étant tués pour récolter ces tumeurs. Il indique recourir à des cultures en trois dimensions mais juge la vérification in vivo obligatoire, la réponse de ces cultures aux hormones étant "contestée".
Objectifs
Établir des lignées cellulaires de cancer du sein à partir de tumeurs de patientes. Créer des lignées cellulaires de cancer du sein à partir de tissu mammaire normal. Caractériser l'effet d'oncogènes sur la différenciation de lignées de cancer du sein. Tester la réponse de ces lignées aux traitements pour le cancer du sein. Abréviations: PDX: xénogreffe dérivée de tumeur de patiente ("Patient Derived Xenograft"). GDX: xénogreffe dérivée de cellules normales converties en cellules tumorales ("Genetically Defined Xenograft"). SARM: androgène sans effet virilisant ("Selective Androgen Receptor Modulator").
Bénéfices attendus
Les lignées créées permettront de comprendre la réponse aux traitements hormonaux du cancer du sein. Nous avons montré qui les androgènes sans effet virilisant, dites SARMs, inhibent la croissance des tumeurs résistantes aux traitements avec les anti-estrogènes habituels. Les SARMs ont le double avantage d'être très bien acceptés par les femmes, contrairement aux traitements classiques qui sont abandonnés par la moitié des femmes. Le problème est que nous ne comprenons pas pourquoi certaines tumeurs du sein sont inhibées et d'autres sont stimulées par les androgènes. Le bénéfice attendu donc est de pouvoir mieux choisir quelles patientes devraient recevoir les SARMs. Jusqu'à présent il était presqu'impossible d'établir des lignées cellulaires de tumeurs du sein hormonosensibles. Nous avons montré que la culture 3D, dite organoïde, combinée avec l'injection intracanalaire permet de créer des lignées hormonosensibles à partir de tumeurs de patientes, et nous avons montré que la même approche permet de créer des tumeurs hormonosensibles à partir de cellules mammaires normales en ajoutant des oncogènes mammaires. Ces derniers permettent de disséquer les mécanismes de régulation de la croissance par les stéroïdes parce que on peut modifier les gènes qu'on utilise pour créer les tumeurs. Un deuxième avantage de l'injection intracanalaire est que ça met les cellules au site d'origine des tumeurs du sein. Elle permet donc de suivre la progression des tumeurs dès la première étape de formation de la tumeur.
Procédures
Nous injecterons des cellules tumorales dans les mamelons ou sous la peau. La procédure durera environ 10 min par animal. Si nous injectons les cellules dans le mamelon, une crème analgésique sera mise sur la peau autour du mamelon pour prévenir la douleur immédiatement après l’injection. Les cellules tumorales émettront une lumière dite bioluminescence qui permettra de quantifier la croissance de la tumeur. Les souris seront anesthésiées pour scanner la bioluminescence. La durée d’un scan sera d'environ 15 min. Les souris seront scannées une semaine après l'injection des cellules, puis une fois par mois pour suivre la croissance des tumeurs si nous voulons simplement établir une lignée tumorale. Dans ce cas l’expérience pourrait durer 1 an si la tumeur poussait très lentement. Si les cellules tumorales ont besoin de l’estrogène pour survivre, la souris pourrait recevoir de l’estrogène dans le biberon pendant tout ce temps. Pour évaluer la réponse aux traitements les souris seront scannées tous les 7-14 jours. Si un traitement antitumorale est mis dans le biberon, la durée sera
Impact sur les animaux
Dans la majorité des cas les tumeurs seront tellement petites qu'elles ne seront détectables que par bioluminescence, ou par des analyses au laboratoire après la mort de l’animal (microscopie fluorescente et histologie). L'impact sur le bien-être des souris sera limité essentiellement aux procédures et donc aux injections et à la chirurgie pour enlever les ovaires. Les injections dans les canaux galactophores seront faites avec une aiguille tellement fine que la blessure sera à peine visible à l'oeil nu. Pour éviter la douleur après la chirurgie pour enlever les ovaires les souris recevront un traitement analgésique (la buprénorphine) 20 minutes avant l'intervention et pendant les jours suivant l'intervention si nécessaire. Même quand les tumeurs seront palpables, elles auront peu d'effet sur le bien-être des animaux (les tumeurs équivalentes chez les femmes ne sont pas douloureuses). Les tumeurs ne feront presque jamais d'ulcères cutanées. Les traitements prévus sont des traitements hormonaux (androgènes, anti-androgènes, estrogènes, anti-estrogènes et produits similaires). Comparés à la chimiothérapie il s'agit de traitements doux qui ont certes des effets physiologiques, par exemple sur la croissance des canaux galactophores, mais n'induisent pas les effets secondaires qu'on craint avec la chimio (diarrhées, anémies, pertes de poids). Les pellets d'estrogène peuvent provoquer la rétention urinaire s'ils sont utilisés pendant plus de 3 mois donc nous limiterons la durée du traitement à 3 mois dans ces cas. L'estrogène dans les biberons n'a pas cet effet donc les biberons seront utilisés s'il faut donner de l'estrogène pendant des périodes prolongées.
Devenir
Mise à mort pour récolter les tumeurs.
Remplacement
Plusieurs nouvelles approches de cultures cellulaires dites "organoïdes" viennent d'être inventées. Les milieux utilisés pour la culture organoïde maintiennent le caractère des cellules tumorales mieux que les milieux de culture classique. Au lieu de pousser sur une boîte en plastique, les cellules flottent dans un gel où elles forment des petits amas sans toucher le plastique. A l’échelle d’une cellule, le plastique est plus rigide que l’os, ce qui change complètement le comportement des cellules. Pour les tumeurs du sein l’avantage de la culture organoïde est que les cellules tumorales continuent à produire les protéines pour détecter les stéroïdes. On s’attend donc à ce que les réponses aux médicaments en culture organoïde prédisent mieux les réponses dans les patientes. Autant que possible nous utilisons ces approches pour tester l'efficacité des médicaments mais la réponse des organoïdes aux stéroïdes est actuellement contestée et nous sommes obligés de vérifier au moins les résultats importants in vivo. Par ailleurs, les cultures organoïdes sont rarement pérennes et il faut donc maintenir un stock des cellules dans les souris pour éviter de les perdre.
Réduction
L'injection dans les canaux galactophores est beaucoup plus efficace que l'injection sous la peau pour les tumeurs du sein hormonosensibles. Nous avons donc besoin de moins d'animaux pour obtenir le même nombre de tumeurs. Nous avons déterminé via des tests statistiques (test t de Student avec une puissance de 80% et une valeur p de 0.05) qu'un lot de 10 souris par groupe était nécessaire pour avoir des données statistiquement exploitables à la fin de l'étude.
Raffinement
Afin d'être moins invasif, nous marquerons les cellules tumorales avec des protéines qui émettent la lumière. Ceci permettra de suivre la croissance des tumeurs quand leur taille sera nettement inférieure aux tailles habituelles. Par conséquent il sera souvent possible d’arrêter l'expérience avant que les tumeurs ne soient palpables ou visibles à l'oeil nu. Afin d'éviter la douleur, les souris seront anesthésiées pendant les interventions potentiellement douloureuses. Afin de protéger les animaux contre les infections, nous utiliserons des cages stériles. Plus globalement en matière de raffinement, le bien-être des animaux sera pris en compte dès leur naissance jusqu’à leur mort. Pour réduire la souffrance et l’angoisse, les animaux seront hébergés collectivement, cinq souris par cage, avec accès en permanence à l'eau et à la nourriture. Chaque cage sera pourvue d’un enrichissement du milieu (nids de « woodwool »). Les souris seront manipulées par du personnel formé et qualifié. L'estimation de la souffrance sera réalisée par le personnel de l’animalerie. Les critères utilisés seront basés directement sur les conseils des autorités françaises et européennes.
Choix des espèces
Il faut utiliser des animaux immunodéficients pour éviter le rejet des cellules humaines. De nombreuses études ont montré que les souris immunodéficientes dites "NSG" permettent de greffer les cellules humaines. Les canaux galactophores de souris maintiennent le caractère hormonosensible des tumeurs du sein humaines. Souris adultes (il n’y a pas assez de canaux galactophores pour faire les injections avant 6 semaines).
Etude comparative de la diversité génétique de lots de juvéniles de denti, Dentex dentex, et de corb, Sciaena umbra, produits en écloserie avec celle retrouvée dans les populations naturelles
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
250 poissons, dentis et corbs, vont être utilisés dans des procédures déclarées de gravité légère, gardés vivants et remis dans leurs bassins d'élevage à l'issue. Sous anesthésie et hors de l'eau pendant une trentaine de secondes, chacun subit un prélèvement d'un morceau de nageoire caudale pour comparer la diversité génétique des poissons d'écloserie à celle des populations sauvages. Le porteur reconnaît qu'une mauvaise réaction à l'anesthésiant peut conduire à euthanasier un individu. Il présente ces géniteurs et juvéniles comme "nécessaires" à la production de la station aquacole, à laquelle ils sont réintégrés.
Objectifs
Ce projet, vise à étudier la diversité génétique d’un lot de juvéniles de Dentex dentex et d’un lot de juvéniles de Sciaena umbra (deux poissons marins côtiers) produits en captivité et de comparer cette diversité génétique à la diversité génétique actuelle des populations sauvages de la zone. L'objectif est de s'assurer que les juvéniles produits en écloserie ont une diversité génétique peu ou pas différente statistiquement de celle retrouvée dans le milieu naturel. En effet, ce projet a pour objectif d'être un contrôle génétique afin d'envisager des relâchés de lots d'élevage dans un but de restauration de la biodiversité naturelle. Et un des points essentiels à vérifier au préalable de potentiels relâchés en vue de restauration, est de ne pas impacter la diversité génétique naturelle afin de conserver le potentiel évolutif des populations sauvages. L'étude de la diversité génétique des deux lots de géniteurs (issus du milieu naturel ; de corb et de denti) sera également effectuée afin de s’assurer que la diversité génétique de ces géniteurs reflète bien la diversité génétique retrouvée dans les populations du milieu naturel. Ces résultats pourraient permettre la meilleure gestion des lots d’élevage étudiés pour un potentiel objectif futur de restauration de population. Ce projet s’inscrit au sein d’un programme à plus grande échelle, comprenant également en parallèle deux autres projets ayant pour but de tester l’efficacité de relâché d’individus produits en écloserie via leur capacité d’adaptation au milieu naturel et l’estimation de leur taux de survie mesurés in situ ainsi que via l’estimation de leurs performances comportementales mesurées en bassin afin de soutenir les populations naturelles de corb et de denti. En résumé, ce projet-ci (décrit ici), correspond au contrôle génétique nécessaire à prendre en compte afin de pouvoir envisager des relâchés de lots d’élevage dans un but de restauration. Il est bien évident que ces résultats seront mis en parallèle avec de futurs contrôles sanitaires (c'est-à-dire une vérification de l’absence de pathogènes et virus des lots relâchés dans ces relâchés expérimentaux sera également effectuée par un vétérinaire spécialisé).
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait de conclure quant à la faisabilité de l’utilisation des lots de juvéniles issus de nos géniteurs dans un but de restauration de population. Ainsi, ces résultats pourraient permettre la meilleure gestion de nos lots d’élevage afin de ne pas impacter la diversité génétique naturelle pour un potentiel objectif futur de restauration de population.
Procédures
Les 25 géniteurs de Sciaena umbra et les 25 géniteurs de Dentex dentex seront soumis à une anesthésie dans le but d’effectuer un prélèvement individuel d’un petit morceau de nageoire caudale. De plus, 200 juvéniles au total (100 juvéniles de Sciaena umbra et 100 juvéniles de Dentex dentex) seront également utilisés dans ce projet en étant également soumis à une anesthésie dans le but d’effectuer un prélèvement individuel d’un petit morceau de nageoire caudale. Chaque prélèvement génétique s’effectuera individuellement et ne durera pas plus de 30 secondes où l’animal sera hors de l’eau. Puis il sera immédiatement transféré dans un bac de réveil fortement oxygéné.
Impact sur les animaux
Aucune nuisance n’est attendue sur les animaux. Cependant, une mauvaise réaction à l’anesthésiant lors de la session de prélèvement de tissu (respiration très lente et discontinue) n’est jamais à exclure ni à négliger. Ce type de réaction entraînera l’arrêt complet de l’intervention et une aide à la ventilation (mouvements lents favorisant la circulation de l’eau sur les branchies) sera pratiquée dans une eau claire sans anesthésiant. Les réponses post-traumatiques étant maximales de 60 à 90 minutes après le traumatisme, un non-retour à un état considéré comme normal entraînera une euthanasie par balnéation (anesthésie puis transfert pour euthanasie dans une solution de Benzocaïne à 1000 ppm). La mort de l’animal sera confirmée en lien avec l’absence de mouvements operculaires.
Devenir
A l’issue de la procédure unique, les individus seront gardés en vie et retrouveront leurs bassins d’élevage au cœur de la station de production aquacole. Les géniteurs sont en effet nécessaires à la production de la station aquacole et les juvéniles seront réintégrés dans le circuit d’élevage de la plateforme à des fins de production aquacole (qui est le cœur de la station aquacole, permettant un partage de technologies à des aquaculteurs locaux). Tous les individus repartiront ainsi dans leurs bassins d’élevage dans les mêmes conditions que précédemment (température, photopériode, salinité, densité, volume d’eau, etc.)
Remplacement
Il est impossible dans le cadre de ce protocole de remplacer ces espèces par un autre modèle, l’intérêt du projet étant justement d’étudier la génétique de ces deux espèces.
Réduction
L’effectif d’individus prélevés pour la mesure de la diversité génétique sur les juvéniles (soit n=100 juvéniles par espèce) a été calculé à partir de données d’expérimentations précédentes et de la littérature pour assurer une puissance statistique de détections suffisante avec des tests statistiques adaptés. Les deux lots de géniteurs (pour rappel, issus du milieu naturel) sont tous prélevés pour comparer la diversité génétique des lots de géniteurs avec celle des populations sauvages et ainsi voir si leur diversité génétique reflète bien la diversité génétique naturelle. Ainsi pour ces analyses-ci, 100 juvéniles par espèce ainsi que les 25 géniteurs denti et les 25 géniteurs de corbs (soit 250 individus au total) semble être un effectif nécessaire et suffisant pour l’exploitation de données concernant la diversité génétique des lots d’élevage.
Raffinement
Plusieurs procédures d'anesthésie générale, d’asepsie et de prélèvements optimales ont été mises en place dans le cadre des procédures pour limiter la souffrance et le stress des animaux. Avec, notamment, un dosage anesthésique fin permettant la minimisation du stress chez tous les individus et un réveil rapide, des prélèvements dans la partie la plus fine de la nageoire caudale et une désinfection systématique entre chaque individu. La totalité des prélèvements de tissu seront effectués sous anesthésie générale. Ce prélèvement s’effectuera hors de l’eau mais ne sera pas plus long que 30 secondes. Entre chaque prélèvement, le matériel de prélèvement (ciseaux chirurgicaux) sera désinfecté (Ethanol 96% NORMAPUR) afin d’éviter toute contamination (par exemple, bactérienne) de la zone incisée de l’animal (bientraitance) et afin d’éviter toute contamination biologique (ADN) entre les différents échantillons (concernant les résultats expérimentaux).
Choix des espèces
Ces deux espèces sont des espèces emblématiques de Méditerranée et sont également considérées comme des espèces trophées, induisant une diminution de leurs stocks naturels à cause d’une surexploitation par la pêche et d’une dégradation de leurs habitats. De meilleures connaissances concernant leur génétique liée à l’élevage pourraient être utilisées dans une optique de restauration dans un but de sauvegarde de ces espèces pour la biodiversité. Les individus produits en écloserie de Dentex dentex et de Sciaena umbra sur lesquels nous ferons les prélèvements (de nageoire caudale) sont des individus au stade juvénile. Il faut savoir que les génotypes individuels ne sont en aucun cas influencés par la taille ou le stade de développement des individus. Il sera donc préférable de prélever les échantillons biologiques sur des individus au stade juvénile plutôt que sur des larves. En effet, l’anesthésie de larves est trop complexe et incertaine : cela risquerait d’engendrer un fort taux de mortalité. Le stage juvénile est, lui, un stade pour lequel les individus sont bien plus robustes à l’anesthésie. De plus, grâce à une connaissance de plus en plus conséquente de ces deux espèces par l’équipe en charge de ce futur projet, les dosages anesthésiques pour ces deux espèces et pour des petites tailles de juvéniles sont maîtrisées et n’induisent aucune mortalité. Egalement, l’analyse de la diversité génétique du lot de géniteurs de Dentex dentex et de Sciaena umbra (individus issus du milieu naturel) permettra de vérifier que ces lots de géniteurs ont une diversité génétique représentative de la diversité génétique retrouvé dans le milieu naturel pour les deux espèces. Ainsi des prélèvements génétiques seront effectués sur les 2 lots de géniteurs : des individus adultes et matures sexuellement.
Les néo-sarcomes secondaires post-radiothérapie : évaluer l’accumulation de cassures simple-brin de l’ADN dans les tissus situés en marge du territoire irradié.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue dont une partie sous anesthésie sans réveil, dans des procédures déclarées de gravité légère. Placées sous anesthésie au contact d'un objet irradié cinq jours sur sept pendant sept semaines, tondues et privées de supplément en niacine, elles servent à mesurer l'accumulation de cassures de l'ADN dans les tissus voisins d'une zone irradiée. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable, les souris ne recevant que de très faibles doses. Il indique avoir d'abord travaillé sur cultures cellulaires et juge désormais l'étape animale nécessaire pour vérifier ces résultats dans un organisme entier.
Objectifs
Plus de la moitié des cancers sont traités par radiothérapie, seule ou en combinaison avec de la chimiothérapie ou de la chirurgie. Les radiations utilisées pour le traitement créent des cassures sur les deux brins de la double hélice d’ADN, qui sont létales pour les cellules cancéreuses. Bien que les techniques de radiothérapie soient de plus en plus précises, les rayonnements touchent toujours des cellules saines à proximité de la zone traitée, ce qui induit des effets secondaires. Certains sont immédiats, comme une réaction inflammatoire, d’autres sont beaucoup plus tardifs, avec un risque de développement d’un second cancer. Les seconds cancers sont extrêmement rares, mais souvent sévères, avec un taux de survie à 5 ans compris entre 10 et 40%. Comme ils se développent de nombreuses années après la radiothérapie initiale, ils concernent principalement des personnes ayant souffert d’un cancer durant leur enfance. Il est donc important et urgent de comprendre les mécanismes responsables du développement de ces cancers afin de pouvoir mieux prévenir leur formation. Lors d’études précédentes réalisées sur des cultures de cellules, nous avons montré que les cellules saines en bordure de zone traitée, recevant uniquement de très faibles doses de rayonnements, subissent aussi des cassures de l’ADN, mais seulement sur un brin, ce qui n’est pas létal pour les cellules, mais induit leur sénescence prématurément, ce qui se traduit entre autres par un arrêt de prolifération. Puis, quelques rares de ces cellules sénescentes évoluent vers un état pré-tumoral. L’objectif de ce projet est de vérifier une partie de ces résultats chez l’animal, notamment l’accumulation de cassures simple-brin de l’ADN, qui est l’étape cruciale pour l’induction de la sénescence puis l’acquisition de mutations nécessaires à l’évolution tumorale.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera à une meilleure compréhension des mécanismes responsables du développement des seconds cancers post-radiothérapie. Les résultats seront publiés dans une revue scientifique internationale à comité de lecture. La compréhension de ces mécanismes pourrait doter la clinique de marqueurs prédictifs de risque d’apparition des seconds cancers, que pourraient être les marqueurs de sénescence et de cassures simple-brin l’ADN. Des traitements préventifs ciblant les cellules sénescentes pourraient ensuite faire l’objet d’essais cliniques.
Procédures
Afin de n’étudier que l’effet des radiations sur les cellules saines en bordure d’une tumeur, nous n’irradierons pas les souris directement, mais nous les placerons en contact étroit avec un objet mimant la tumeur, appelé fantôme qui, lui, sera irradié. Les irradiations suivront un protocole similaire à celui appliqué aux patients, soit 2 Gy par séance quotidienne, sauf les week-ends, pendant maximum 7 semaines. De façon à bien assurer le contact entre la souris et le fantôme, les souris seront tondues et du gel d’échographie sera appliqué sur leur peau. Pendant la tonte et l’irradiation, les souris seront anesthésiées (anesthésie gazeuse). Les souris seront euthanasiées après une irradiation et à la fin de chaque semaine et des fragments de tissus seront prélevés. Ils feront ensuite l’objet d’analyse microscopique pour quantifier l’accumulation des cassures simple-brin de l’ADN au fur et à mesure des irradiations. Nous comparerons les résultats à des contrôles négatifs d’âge égal et manipulées comme les souris irradiées (anesthésie, tonte et application de gel d’échographie). Nous réaliserons également des contrôles positifs, c’est-à-dire des souris qui seront irradiées directement une fois et qui auront donc des cassures simple-brin de l’ADN. Deux jours avant le début du protocole d’irradiation, puis pendant tout le protocole jusqu’à l’euthanasie finale, l’alimentation des souris qui est très enrichie en vitamines passera à une alimentation sans supplémentation en niacine (= vitamine B3). En effet, la niacine est nécessaire à la réparation des cassures simple-brin de l’ADN. Un excès, bien supérieur à la quantité naturellement présente dans les céréales composant les granulés de l’alimentation des souris en animalerie et bien supérieur à la quantité moyenne présente dans l’alimentation humaine, pourrait minimiser les effets de la radiothérapie. Nombre de souris et nombre d’irradiations : - 5 souris placées en contact d’un fantôme irradié 1 fois - 5 souris contrôle négatif - 5 souris contrôle positif irradiées directement 1 fois - 5 souris placées en contact d’un fantôme irradié 1 fois par jour pendant 5 jours consécutifs (= 1 semaine) - 5 souris contrôle négatif - Même procédure que précédemment à 2, 3, 4, 5, 6, 7 semaines. Au total, nous aurons besoin de 85 souris. Nous prévoyons le double, pour pouvoir refaire tout ou en partie la procédure en cas de problème, soit 170 souris au maximum.
Impact sur les animaux
Pour les souris contrôle positif, aucun effet indésirable n’est prévu, car elles seront euthanasiées tout de suite après irradiation. Pour les souris contrôle négatif, elles ne subiront qu’un rasage une fois tous les 8 ou 15 jours, une anesthésie gazeuse et une application de gel d’échographie quotidiennes, ce qui ne devrait pas avoir d’effet indésirable. Pour les autres souris, aucun effet indésirable n’est prévu non plus car, en n’étant pas irradiées directement, elles ne recevront que des doses très faibles, ce qui ne devrait pas induire de réaction inflammatoire. Par ailleurs, elles ne devraient pas avoir le temps de développer de seconds cancers, car les cancers induits par irradiation chez la souris sont connus pour se développer après une période d’au moins 18 mois. Deux jours avant, puis pendant tout le protocole d’irradiation, le régime alimentaire des souris comprendra uniquement la niacine apportée par les céréales (soit 50mg/kg, à comparer aux 70mg/kg des régimes supplémentés), alors que le minimum recommandé est de 30mg/kg. Cette absence de supplémentation en niacine ne devrait donc pas changer la physiologie globale des souris, d’autant qu’elle ne sera pas réalisée pendant la croissance des souris.
Devenir
A l’issue de chaque procédure les souris seront sacrifiées et des prélèvements de tissus seront réalisés pour des analyses microscopiques. Les analyses consisteront à quantifier les cassures simple-brin de l’ADN dans les cellules devenues sénescentes suite aux irradiations successives.
Remplacement
Nous avons déjà répondu à l’injonction de remplacement en réalisant des études préalables utilisant des cellules en culture. Nous avons ainsi pu montrer que les radiations touchant les cellules saines situées en bordure d’une zone irradiée induisent des dommages à l’ADN (des cassures simple-brin) qui s’accumulent et de la sénescence cellulaire. Ces résultats ont été publiés dans une revue scientifique internationale à comité de lecture. Mais nous ne pouvons affirmer que ces évènements (cassures simple-brin de l’ADN et sénescence) auront lieu dans des cellules incluses dans un organisme, avec notamment un système immunitaire qui pourrait éliminer les cellules sénescentes. C’est pourquoi, même si nous avons commencé par remplacer l’expérimentation animale par des études in vitro, nous devons maintenant procéder à des études chez l’animal.
Réduction
Notre stratégie expérimentale est composée de deux étapes. La 1ère étape déterminera l’avenir du projet qui ne sera poursuivi que si nous détectons bien une formation de cassures simple-brin de l’ADN dans les tissus à distance de la zone irradiée. Plusieurs échantillons de tissu à même distance de la zone d’irradiation seront pris par souris ce qui permet d’augmenter le nombre d’échantillons. Un calcul de puissance statistique en se basant sur nos résultats in vitro nous indique que 2 souris par lot seraient suffisantes. Néanmoins, étant donné que les résultats pourraient être plus variables in vivo qu’in vitro, nous monterons à 5 souris par lot. Trente souris seront donc nécessaires (5 par lot, 3 lots, multiplié par deux pour pouvoir refaire l’expérience en cas de problème). La 2ème étape permettra de déterminer si les cassures simple-brin de l’ADN s’accumulent au fur et à mesure des irradiations d’un protocole mimant un traitement de radiothérapie anti-cancéreuse standard et induisent la sénescence. Nous limiterons à 7 semaines d’irradiation, ce qui correspond au traitement maximal appliqué chez l’homme. Nous fixons a priori la taille des lots à 5 comme pour l’étape 1, mais si en fonction des résultats de l’étape 1, il est possible de diminuer le nombre de souris, nous le ferons. Nous prévoyons donc cent quarante souris (5 par lot, 14 lots, multiplié par deux en cas de problème).
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des cages d’une animalerie thermiquement et hygrométriquement régulée, avec un éclairage alternant jour/nuit. Elles auront accès à de l’eau stérilisée et à une alimentation à volonté. Leurs cages seront équipées d’une litière enrichie de 2-3 nestlés. Pour chaque manipulation (rasage, irradiation), les animaux seront anesthésiés (anesthésie gazeuse). Les manipulations des animaux (mise en cage, anesthésie, irradiation, mise à mort) seront réalisées par un personnel qualifié. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé de manière à s’assurer qu’ils ne présentent pas de signes de souffrance nécessitant l’arrêt des procédures et leur euthanasie. La souffrance sera évaluée par l’observation de paramètres de poids, de comportement et d’apparence reportés dans une grille standard permettant d’établir un score à ne pas dépasser. Tout animal dépassant ce score sera exclu du protocole d’irradiation et mis à mort. Des échantillons de tissus seront alors prélevés et analysés comme prévu, pour ne pas perdre de données.
Choix des espèces
La souris est une espèce classiquement utilisée en radiobiologie et cancérologie, dont la génétique et la manipulation sont bien maitrisées en laboratoire. De plus, nous utiliserons une souche de souris transgénique (p16-tdTomato : insertion de tdTomato fluorescent dans le gène p16) qui permet d’analyser facilement les cellules sénescentes. Enfin, en lien avec notre problématique, la souris est connue pour développer des cancers lorsqu’elle est soumise à des irradiations. Nous utiliserons des souris adultes jeunes ayant atteint leur taille maximale, soit âgées de 10 semaines. L’acquisition de la taille adulte permettra de placer toujours la souris de la même manière en contact avec le fantôme irradié. La sénescence cellulaire survient avec l’âge. C’est la raison pour laquelle nous utiliserons des souris jeunes pour être le moins possible parasité par la sénescence survenant spontanément avec l’âge.
Effet préventif primaire d’un régime supplémenté par un extrait végétal standardisé dans l’apparition des dérèglements métaboliques et inflammatoires associés au surpoids chez le chien
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
30 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, gardés vivants et replacés dans leur environnement d'étude à l'issue. Soumis à un régime gras, ils subissent cinq prélèvements de sang à la jugulaire et des prélèvements de selles, dont certains par écouvillon rectal ou isolement de vingt-quatre heures, pour tester un extrait végétal censé prévenir les troubles métaboliques du surpoids. Le porteur indique provoquer volontairement chez eux un surpoids et des désordres métaboliques, objet de l'étude. Il présente le chien comme l'espèce cible et affirme qu'il n'y a "absolument pas d'alternative" à son remplacement.
Objectifs
De nombreuses études ont révélé le rôle central de la dysbiose intestinale dans l’initiation et l’entretien des désordres associés aux maladies métaboliques (i.e. syndrome métabolique). Le premier objectif de ce projet sera d’explorer l’action prébiotique potentielle d'un extrait végétal standardisé (versus un composant majoritaire de l'extrait) et son impact sur le profil métabolique chez des chiens exposés à un régime hyperlipidique, par leur suivi clinique et biologique (analyse du microbiote intestinal, paramètres biochimiques, métaboliques). L’activité prébiotique potentielle de l’extrait végétal standardisé sera également évaluée en présence d’un probiotique spécifique, déjà développé et commercialisé chez le chien. Parmi les facteurs susceptibles de participer aux dérèglements métaboliques et inflammatoires, les protéines sirtuines, notamment les sirtuines 1 et 3, émergent comme des cibles potentielles pour des interventions nutritionnelles ou pharmacologiques. Les sirtuines, des désacétylases NAD- dépendante, sont des régulateurs importants de l’activité des protéines impliquées dans le métabolisme cellulaire et le contrôle de l’inflammation. Différents travaux ont démontré les effets positifs de la modulation des sirtuines 1 et 3 dans les maladies métaboliques et inflammatoires. Par exemple, la modulation des sirtuines 1 et 3 induit des effets bénéfiques sur les métabolismes (notamment glucidique) via partiellement le contrôle de l’inflammation (voie PPARs et le facteur NF-KB) et du stress oxydatif. Par conséquent, tout traitement visant à augmenter l’activité désacétylase des sirtuines 1 et 3 pourrait constituer une approche thérapeutique qui pourrait s’avérer très prometteuse. Le deuxième volet de ce projet sera consacré à explorer les effets de l’extrait végétal standardisé (versus un composant majoritaire de l'extrait) sur l’expression et l’activité des facteurs susceptibles de participer aux dérèglements métaboliques, oxydants et inflammatoires comme les sirtuines 1 et 3, les PPARs et le facteur NF-KB. Notre hypothèse est que la richesse de cet extrait végétal en flavonoïdes, en anthocyanines et en acides phénols, et surtout leur potentielle action synergique et/ou additive pourrait lui conférer une action anti-inflammatoire et régulatrice des métabolismes lipidique et glucidique plus efficace en impliquant notamment un rôle des sirtuines 1 et 3.
Bénéfices attendus
Notre hypothèse principale est que l’action synergique des composants majeurs (acides phénoliques, flavonoïdes, anthocyanes) de l’extrait végétal standardisé augmente la diversité microbienne, renforce la barrière épithéliale intestinale et améliore le profil métabolique en prévenant l’accumulation des graisses. Par ailleurs, une des stratégies visant à limiter ou réduire le processus inflammatoire associé au surpoids est également l’utilisation de probiotiques ayant la capacité de supprimer la production de facteurs pro-inflammatoires ou favoriser la synthèse de métabolites anti-inflammatoires comme les acides gras à chaîne courte (AGCC). Les protocoles mis en œuvre dans le cadre de ce projet devraient permettre de déterminer si l’extrait végétal standardisé étudié (comparativement à son principal principe actif) est apte à prévenir l’inflammation et les perturbations métaboliques associées au surpoids. Les composants de l'extrait végétal testé pourraient avoir une action synergique et/ou additive conférant une action anti-inflammatoire et régulatrice des métabolismes lipidiques et glucidiques plus efficace en impliquant notamment un rôle des sirtuines 1 et 3. Ce projet pourrait apporter la preuve de concept que l’intérêt thérapeutique de plante étudiée chez le chien ne dépend pas d’un principe actif mais d’une action synergique de ses principaux constituants. Ce projet pourrait également permettre de faire émerger chez le chien une nouvelle classe de produits thérapeutiques qui combine l’extrait bactérien et l’extrait standardisé végétal dans la prévention de l'inflammation et des dérèglements métaboliques associés au surpoids.
Procédures
3 interventions : 30 chiens suivront un régime hyperlipidique avec administration ou non d'une supplémentation en extrait végétal standardisé ou d'un composant majoritaire de l'extrait étudié avec ou sans un probiotique déjà développé chez le chien, 30 chiens auront des prélèvements sanguins, 5 fois sur une période de 3 mois avec un intervale de 2 semaines minimum ; 30 chiens auront des prélèvements de selles (4 fois). 1- Les prélèvements sanguins se feront au niveau de la veine jugulaire par une personne expérimentée. L'acte de prélèvement dure 2 minutes environ (contention par un tiers, rasage et désinfection du site de prélèvement). 2- Concernant les selles, deux approches de prélèvement seront envisagées : - Dans la première approche, les chiens doivent être individualisés. Ils seront maintenus en box individuel de 4m² durant 24h pour le recueil des selles destinées aux analyses du microbiote (équilibre des différents groupes et espèces d’intérêt). Cela sera répété 4 fois lors de l'étude efficacité. - Dans la deuximème approche, les selles seront recueillies sur animaux vigiles à partir d'un écouvillon (stérile) rectal. le chien est légèrement contenu, un écouvillon est délicatement introduit de 2 à 3 cm dans l'anus et tourné sur la paroi une dizaine de fois, puis retiré. L'animal est alors remis dans son box. Les deux mode de recueil des selles sont de nature légère. Dans le cas d'individualisation, les animaux seront isolés en box individuel mais avec un contact visuel avec leurs congénères. La méthode par écouvillonnage rectal permet de recueillir une petite quantité de selles qui devrait être suffisante pour l'analyse. L'objectif secondaire de ce mode de prélèvement est d’établir si les selles récoltées par ce biais sont représentatives du microbiote intestinal. Si c’était le cas, nous pourrions envisager de ne plus individusaliser pendant 24 h nos chiens pour le recueil des selles dans le cadre de l'étude du microbiote intestinal (dans le cadre de la règle des 3R, nous raffinerons ainsi notre procédure de recueil des selles).
Impact sur les animaux
Les animaux soumis au régime hyperlipidique vont développer des désordres métaboliques liés au surpoids, ce qui est l'objet de l'étude. Les traitements mis en oeuvre ont comme objectif d'atténuer les complications générées par le surpoids. Aucune nuisance n'est attendue de l'extrait standardisé étant reconnu pour ses vertus par la pharmacopée et déjà utilisé chez le chien, de même pour le probiotique utilisé. En cas de souffrance, l’animal sera mis en observation pour d’éventuels soins. Si la souffrance, pour des raisons inconnues, persiste, il sera exclu de l'étude.
Devenir
Les animaux sont replacés dans leur environnement d'étude après chaque procédure. Le comportement des animaux est surveillé après chaque procédure pour s'assurer de leur bonne santé.
Remplacement
Il s'agit de l'espèce cible des résultats du projet. Eu égard à la nature de ce projet (démonstration scientifique de l'efficacité et de la tolérance sur espèce cible), il n’y a absolument (et à l’évidence) pas d’alternative qui permettrait le remplacement le chien.
Réduction
Nous utilisons 6 chiens par groupes afin d'avoir un nombre suffisant pour pouvoir réaliser des tests statistiques pertinents et anticiper les différences interindividuelles pour répondre aux objectifs de l'étude. Le nombre de prélèvement étant répété sur chaque chien, cela permet de réduire leur nombre au minimum et d'avoir des données suffisantes pour répondre aux questions posées par une utilisation optimisée de ces dernières sur chaque animal.
Raffinement
L'hébergement respecte les recommandations en vigueurs chez les animaux de l'étude. L'enrichissement du milieu de vie est régulièrement amélioré (balade et moments en liberté, jeux...). Un suivi régulier des animaux est assurés par le personnel animalier (observation quotidienne de l’état général et du comportement, pesées hebdomadaires). La définition de points limites et une grille de scoring de la souffrance et/ou de la douleur sont mis en place chez tous les animaux soumis aux différents traitements prévus dans le projet. Les protocoles expérimentaux sont optimisés pour chaque procédure afin d’obtenir le maximum d’informations et ainsi une meilleure analyse des résultats obtenus.
Choix des espèces
Il s'agit de l'espèce cible des résultats du projet. Il n'y a donc pas d'alternative qui permettrait leur remplacement. Les chiens sont des adultes de 2 ans, en bonne santé et n'ayant pas reçu de traitement antibiotique ou tout autre traitement pouvant modifier le microbiote, depuis au moins 3 mois.
THYROCRISP: Création et caractérisation de lignées génétiquement modifiées pour étudier les effets d’une hypothyroïdie ou d’une hyperthyroïdie médiées par invalidation de gènes clés de l’axe thyroïdien lors du développement embryonnaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
883 xénopes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la plupart tués et une partie réutilisée pour d'autres projets. Les femelles sont injectées pour pondre, les têtards génotypés par écouvillon puis soumis à un test de nage, et les embryons surnuméraires comme les têtards non porteurs de la mutation sont tués avant terme. Le porteur crée cinq lignées génétiquement modifiées pour étudier l'axe thyroïdien, et anticipe le développement possible d'un goitre chez les têtards rendus hypothyroïdiens. Il affirme que la complexité de cet axe ne peut être reproduite in vitro et présente le choix d'un amphibien à un stade larvaire comme un respect des 3R.
Objectifs
Les hormones thyroïdiennes (HTs) contrôlent de nombreux processus biologiques en régulant l’expression de nombreux gènes. Des perturbations de la signalisation de ces hormones sont à l’origine de diverses pathologies qui peuvent se manifester tout au long de la vie des êtres vivants et constituent des problèmes majeurs de santé publique et santé environnementale. Ainsi, l’étude des gènes contrôlés par les HTs est essentiel pour comprendre les mécanismes liés à cette signalisation. La complexité du système hormonal lié à la thyroïde ne peut être reproduite in vitro à cause de nombreux mécanismes de contrôles de la régulation de cet axe et nécessite de recourir à des organismes modèles animaux. A l’heure actuelle, aucune batterie de tests in vitro ne peut prendre en compte la circulation sanguine, la métabolisation par le foie et le rétrocontrôle exercé par le cerveau sur la production d’hormones par la thyroïde. Le xénope dont la métamorphose est dépendante d’un pic en hormones thyroïdiennes identique à celles des autres vertébrés dont l’Homme, est un amphibien couramment utilisé comme modèle pour étudier l’axe thyroïdien et les perturbations de cet axe. Pour étudier le rôle de ces HTs, nous avons donc choisi le xénope comme modèle et des stades d'études (embryo/larvaire) qui permettent de satisfaire au mieux la règle des 3R. Notre projet a pour objectif la création de 5 lignées génétiquement modifiées chez le xénope, où l’inactivation d’un gène clé de la signalisation HTs dans chaque lignée, entraine soit une hyperthyroïdie soit une hypothyroïdie chez les animaux portant la mutation. La caractérisation de ces 5 lignées nous permettra de mieux comprendre les conséquences d’une déficience ou d’un excès en HTs sur le développement des animaux, en s’interressant plus particulièrement au développement du cerveau.
Bénéfices attendus
Le but du projet est de pouvoir développer des modèles hypothyroïdiens et hyperthyroïdiens avec l’invalidation de 5 gènes sélectionnés pour leur rôle essentiel dans la signalisation thyroïdienne. Les hormones thyroidiennes (HTs) sont conservées parmi tous les vertébrés. Les HTs jouent un rôle clé dans les transitions des cycles de vie de ces vertébrés et notamment la métamorphose des amphibiens. Les retombées de ce projet seront, au niveau scientifique, de mieux comprendre les mécanismes d’action des HTs en étudiant les fonctions des protéines invalidées (stratégie de perte de fonction). Ce projet permettra en outre, d’établir des points de comparaison entre les modifications de l’expression des gènes observées suite à l’invalidation des 5 gènes clés de l’axe thyroïdien avec celles qui ont pu être observées suite à une exposition à des produits chimiques susceptibles de perturber la signalisation par les HTs. D’un point de vue applicatif, nous pourrons tester des stratégies profilaxiques afin de traiter les patients atteints de telles mutations, mais aussi analyser les comportements associés à la perte de fonction de ces gènes et faire des comparaisons avec ce qui est observé en écotoxicologie sur certaines espèces.
Procédures
Afin d'obtenir des œufs, les femelles adultes sont induites à pondre par injections en sous-cutané dans les sacs lymphatiques dorsaux avec de l'hormone chorionogonadotropine humaine. Elles sont capturées avec une épuisette (propre et désinfectée) dans laquelle ils sont maintenus manuellement sans pression, pour éviter qu’elles ne s’échappent pendant l’injection. Une pression légère sur le point d’injection est faite pendant quelques secondes au moment de retirer l’aiguille. Dans le but d’identifier les animaux portant la mutation du gène ciblé pour chaque lignée, un prélèvement de mucus sur les têtards anesthésiés est fait de façon non invasive, à l’aide d’un écouvillon frotté délicatement sur la peau de chaque animal. La durée du prélèvement est d’environ 15 secondes par animal et ne sera effectué qu’une seule fois sur les animaux à génotyper. Un test de mobilité consistant à suivre le mouvement de chaque têtard pendant 10 minutes avec une alternance de périodes lumière/obscurité sera fait pour les animaux de chacune des 5 lignées afin de contrôler si la mutation affecte ou non cette mobilité.
Impact sur les animaux
Pour les 5 gènes choisis, l’invalidation des différents gènes ciblés devrait conduire soit à une baisse des HTs circulantes entrainant une hypothyroïdie générale de l’animal, soit au contraire à une augmentation des HTs circulantes entrainant une hyperthroïdie de l’animal. Pour les invalidations de gènes qui sont succeptibles d’induire des hypothyroïdies, nous anticipons la possibilité pour les têtards de développer une hypertrophie de la glande thyroïde (goitre).
Devenir
Procédure 1 : Induction de la ponte des femelles xénope (18 femelles de type sauvage dites Wild Type) et récolte des œufs. Toutes les femelles sont gardées et pourront être impliquées dans d’autres projets à la suite de cette procédure. Procédure 2 : Création et élevage des animaux de chaque lignée où chacun des 5 gènes ciblés a été inactivé. Dans un 1er temps les 325 animaux impliqués dans cette procédure (soit 50 par lignée donc 250, et 75 animaux contrôles) seront élevés jusqu’au stade têtard pour être génotypés afin d’identifier et de conserver les animaux où le gène ciblé est bien inactivé, lesanimaux partiellement ou non invalidés ne seront pas conservés. Ensuite seuls les animaux pleinement invalidés sont élevés jusqu’au stade adulte où 2 couples d’animaux par lignée (soit 2x5 femelles et 2x5 mâles) seront conservés pour établir les 5 lignées qui serviront à produire les animaux portant chacune des mutations voulues. Tous les adultes des 5 lignées sont gardés et pourront être impliqués dans d’autres projets à la suite de cette procédure. Procédure 3 : Analyse moléculaire et comportementale des 5 lignées. La mobilité des animaux mutants pour chacune des 5 lignées sera étudiée. Cela comprendra l’analyse de 540 têtards pour le comportement de nage (90 animaux x 5 lignées + 1 lignée contrôle) au stade NF48 (15 jours post fécondation). Puis sur les 540 têtards, seuls 90 têtards (15 têtards par groupe) seront conservés afin de réduire le nombre d'animaux en expérimentation et ils seront élevés jusqu'au stade NF55 (33 jours post fécondation) pour prélever différents tissus destinés à être analysés.
Remplacement
L’objectif de notre projet est de comprendre les effets d’une déficience ou d'un excès en hormones thyroïdiennes au cours du développement. La complexité de l’axe hypothalamo-hypophyso-thyroïdien ne peut être reproduite in vitro à cause de nombreux mécanismes de régulation de cet axe et nécessite de recourir à des animaux modèles. Aucune batterie de tests in vitro ne peut prendre en compte la circulation sanguine, la métabolisation par le foie et le rétrocontrôle exercé par le cerveau sur la production d’hormones par la thyroïde. Nous avons choisi un modèle (amphibien) et des stades d'études (embryon/larve) qui permettent de satisfaire au mieux de la règle des 3R.
Réduction
La production d’animaux est réduite au maximum de façon à atteindre les objectifs. Pour les procédures 1 à 2, correspondant à la production de lignées, le nombre d’animaux utilisés correspond au meilleur compromis pour parvenir à établir le nombre de mutants, avec une reproductibilité sur au moins trois expériences indépendantes. Lorsqu’une ponte fournira plus d’embryons que nécessaire pour une expérience prévue, les embryons surnuméraires seront euthanasiés avant la fin des stades éleuthero-embryons.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions optimisées pour leur croissance et leur reproduction. Les embryons et larves sont maintenus dans un milieu d’élevage adapté à leur croissance et les adultes dans de l’eau dont les paramètres sont surveillés quotidiennement (température) ou de façon hebdomadaire (salinité, concentration en nitrate-nitrite et pH). Les têtards sont nourris avec de la poudre d’ortie avec un apport en proteines, puis après métamorphose les animaux sont nourris avec de la nourriture sèche ainsi que de la nourriture riche en protéines (vers de vase), afin d’assurer aux animaux une croissance optimale. Ils sont maintenus à une densité recommandée par la directive européenne afin d’éviter tout stress dû à une surpopulation ou un isolement. Enfin, les animaux sont l’objet d’un suivi quotidien et tout animal présentant des signes de maladies est isolé et soigné pour éviter toute propagation.
Choix des espèces
Le xénope (Xenopus laevis) est un modèle reconnu pour l’étude du système hormonal lié à la thyroïde. En effet la métamorphose est entièrement dépendante d'un pic en Hormone thyroïdienne. Ce pic a lieu à la naissance chez les humains (et la plupart des vertébrés) et permet la maturation du système nerveux. Cette espèce, comme tous les vertébrés, possède les mêmes hormones que les Hommes. Elle offre l'avantage 1) de ne pas être un mammifère et d'avoir un développement externe qui permet un traitement avec des différentes molécules par balnéation et non par gavage ou par injection, 2) d'être un vertébré tétrapode (à la différence des poissons) et d'être évolutivement relativement proche de l'Homme. De plus, son développement rapide, le grand nombre d’embryons synchronisés obtenus par fécondation in vitro, la transparence des embryons, les possibilités de transgénèse et de mutagenèse, en font un modèle de choix pour la recherche. Les femelles adultes de type sauvage permettront d’assurer la production des œufs qui serviront à créer les 5 lignées génétiquement modifiées présentant chacune l’inactivation d’un gène clé de la signalisation thyroïdienne. Pour établir les 5 lignées, les têtards seront élevés jusqu’au stade adulte pour sélectionner 20 adultes, soit 10 mâles et 10 femelles matures sexuellement correspondant à 2 couples par lignée créée. Pour caractériser les 5 lignées, les couples permettront d’assurer les reproductions, puis les tests de mobilité (comportement de nage) seront pratiqués sur les têtards issus de ces reproductions au stade NF48 (15 jours post fécondation) et les tissus seront prélevés pour analyse au stade NF55 (33 jours post fécondation).
Identification de nouvelles cibles thérapeutiques dans les leucémies aiguës myéloïdes dans l’espèce Mus musculus
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
910 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent une irradiation, des injections, des prélèvements de sang hebdomadaires, des prélèvements de moelle osseuse et, pour certaines, une plaie provoquée par brûlure, afin de tester des cibles contre une leucémie agressive, dont des sécrétions de la grenouille utilisée dans le rituel du kambo. Le porteur prévoit la mise à mort quand les cellules leucémiques atteignent 80 % du sang ou dès l'apparition de signes de souffrance. Il affirme que le développement de la leucémie exige un "micro-environnement médullaire" impossible à reproduire in vitro.
Objectifs
Le projet vise à identifier des nouvelles thérapies pour le traitement de la leucémie aiguë myéloïde (LAM), un cancer agressif des cellules du sang. Ce projet se base sur deux hypothèses. Selon la première hypothèse, la protéine ACLY, impliquée dans le cycle de synthèse des acides gras, jouerait en rôle clef dans le développement de la leucémie. Elle constituerait donc une importante cible thérapeutique. Cette hypothèse sera adressée en vérifiant si la leucémie disparaît après avoir invalidé la protéine ACLY. Selon la deuxième hypothèse, les protéines contenues dans les sécrétions de la grenouille tropicale Phyllomedusa bicolor (utilisées dans le rituel du kambo) pourraient être utilisées comme approche thérapeutique dans les LAM. Cette hypothèse se base sur observations cliniques, car un patient atteint de LAM a été guéri après avoir fait le rituel du kambo. Ces hypothèses seront abordées grâce à trois lignées différentes de souris: - Des souris qui développent une leucémie similaire à celle développée par les patients atteints de LAM - Des souris qui permettent d’invalider la protéine ACLY dans les leucémies - Des souris qui permettent la survie et l’expansion des cellules leucémiques de patients, cellules qui sont trop fragiles pour être maintenues in vitro, pour y mener des tests thérapeutiques
Bénéfices attendus
1. Bénéfices à court terme: ce projet fera progresser le connaissance scientifique car il permet d’identifier de nouveaux mécanismes qui expliquent pourquoi et comment la leucémie aiguë myéloïde survient et se développe. La connaissance de ces mécanismes sera utile non seulement pour comprendre les mécanismes de leucémogenèse mais aussi potentiellement pour d’autres cancers du sang et/ou des cancers solides. 2. Bénéfices à long terme: grâce à ce projet nous espérons identifier de nouvelles cibles thérapeutiques afin d’améliorer le pronostic de leucémie aiguë myéloïdes, de prévenir la résistance aux médicaments et les rechutes et donc prolonger donc la vie des patients atteints de LAM.
Procédures
P1 - analyse de la leucémie après invalidation de la protéine ACLY: exposition à l’antibiotique doxycycline (eau de boisson, tous les jours de jour 1 à jour 168) Injection intra-péritonéale de tamoxifen, 5 jours consécutifs, de jour 1 à jour 5, prélèvements sanguins hebdomadaires (ponction veineuse submandibulaire sur souris vigile avec une lancette), effectués pour 24 semaines à partir de 15 jours après l’exposition à la doxycycline. P2 - analyse de la progression de la leucémie après invalidation d’ACLY dans des cohortes des souris receveuses: une injection intra-péritonéale d’anesthétique une irradiation sub-létale (durée d’une minute) tout de suite après l’anesthésie 6 heures après l’irradiation, une injection intraveineuse des cellules leucémiques murines Prélèvements sanguins hebdomadaires, effectués pour 36 semaines à partir de 7 jours après l’injection des cellules leucémiques. P3 - analyse de l’invalidation d’ACLY sur la survie des cellules saines de la moelle osseuse: injection intra-péritonéale de tamoxifen, 5 jours consécutifs, de jour 1 à jour 5. P4 -effet de l’application des sécrétions de grenouille sur le dévelopement de la leucémie. exposition à l’antibiotique doxycycline (eau de boisson, tous les jours de jour 1 à jour 198) prélèvements sanguin hebdomadaires, effectués pour 28 semaines à partir de 15 jours après l’exposition à la doxycycline une injection intra-péritonéale de l’anesthétique quand la leucémie apparaît dans le sang (à patrir de la semaine 8) Injection intra-péritonéale de l’analgésique, tout de suite après l’anesthésie 30 minutes après analgésie, induction d’une plaie par brûlure par application pendant 1 seconde d'une tige de laiton de 2mm de diamètre chauffée à 100°C sur la peau du dos de la souris. une application cutanée des peptides bioactifs sur plaies cutanées, faite tout de suite après l’induction de la plaie par brûlure. 8h et 16h après la brulure, injection intra-péritonéale de l’analgésique. P5 - greffe des cellules leucémiques des patients, injection intra-péritonéale de busulfan 24 h après, injection intraveineuse des cellules leucémique humaines, prélèvements sanguin hebdomadaires sur souris vigiles, effectués pour 52 semaines à partir de 15 jours après les injections des cellules leucémiques, prélèvement de la moelle osseuse sur souris anesthésiée (4 prélèvements totaux qui se font en alternant les pattes avec une fréquence de 3 semaines entre les prélèvements
Impact sur les animaux
1. Effets indésirables directement liées aux actes expérimentaux: 1. Nuisances modérées liées aux injections intra-péritonéales et intraveineuse. Ces nuisances sont attendues durer quelques secondes, ce qui est le temps requis pour effectuer les injections. 2. Nuissances sévères à la réalisation d’une plaie par brulure. L’administration de l’analgésique avant la réalisation de la paie diminuera fortement la douleur. On attend donc seulement une nuisance modérée liée à cette intervention. 3. Nuissances modérées aux prélèvements de la moelle osseuse en intra-tibiale. L’administration de l’anesthésie avant la réalisation des prélèvements limitera au maximum ces nuances. Elles vont également être limitées par leur nombre (4 maximum) et l’alternance des deux pattes. 4. Modérées nuisances liées aux prélèvements sanguins hebdomadaires. Ces nuisances sont attendues pour durer quelques secondes, ce qui est le temps requis pour effectuer le prélèvement, car le saignement s’arrête par compression dès que le prélèvement est terminé. Nuissances modérées liées à l’irradiation sub-létale (2.5 Gy). Ces nuisances sont attendues pour durer 1 minute, ce qui correspond au temps nécessaire pour effectuer l’irradiation. 2. Effets indésirables issues des produits injectés: effets indésirables modérées liés à l’injection des cellules leucémiques (réduction de l’activité, position anormale du nez et des oreilles, poil hérissé, yeux plissés ou bridés). Ils vont être prévenus au maximum grâce à une analyse du taux d’infiltration leucémique à travers le prélèvement sanguin, qui doit conduire à la mise à mort anticipée de la souris en cas d'infiltration forte
Devenir
A l’issue de chaque procédure les animaux seront mises à mort avec dislocation cervicale car la moelle osseuse et la rate doivent être prélevées et analysées pour déterminer le taux d’infiltration leucémique.
Remplacement
Les objectives du projet ne peuvent pas être réalisés en faisant des expériences alternatives in vitro car le développement de la leucémie nécessite la présence d’un micro-environnement médullaire qui joue un rôle clef dans le développement de la leucémie et le maintien des cellules souches leucémiques. L’évaluation de l’activité thérapeutique du Kambo nécessite également d’être faite in vivo car l’activité pharmaco-dynamique et la pharmaco-cinétique des peptides contenus dans les sécrétions de la grenouille jouent certainement un rôle clefs dans leur effet thérapeutique et elles ne peuvent pas être reproduites in vitro.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à l’expérimentation nous allons: - mutualiser au sein de l’équipe les ressources cellulaires post-mortem afin qu’un même échantillon puisse être exploité pour différents projets et ainsi éviter l'utilisation itérative de souris - effectuer une étude statistique qui permettra de determiner le nombre des souris à utiliser pour obtenir l’information scientifique en évitant la répétition de l’expérience. Cela permettra de réduire au minimum l’utilisation des animaux optimiser le matériel issu des greffes pour production multiple (congélation des cellules, conservation du materiel génétique etc..) pour analyses rétrospectives et éviter la répétition de l’expérience). quantifier la viabilité cellulaire des échantillons humains avant toute injection pour limiter les échecs de greffe
Raffinement
Pour réduire au maximum la douleur associée à la leucémie, la mise à mort sera pratiquée lorsque les cellules leucémique dans le sang représenteront 80% des cellules circulantes, c’est à dire quand la leucémie peut commencer à générer une légère souffrance aux animaux. Si des signes cliniques de souffrance se déclarent avant ce point limite, l’animal sera mis à mort. La manifestation de signe évoquant une douleur chez l’animal sera surveillée grâce à un suivi de 5 jours par semaine (de lundi au vendredi). Nous veillerons à optimiser, enrichir l’hébergement (nous mettrons de la nourriture dans la cage si nous constatons une difficulté de déplacement et accès à la nourriture et/ou à l'eau). Pour réduire la souffrance liée à la réalisation d’une plaie par brulure, l’analgésie sera administrée 3 fois (30 minutes avant de la réalisation de la plaie, 8 heures et 16 heures après). La plaie sera suivie 5 jours par semaine afin de surveiller tout risque d’infection (jusqu’à cicatrisation de la plaie). Si mise en évidence d’une infection cutanée, la plaie sera désinfectée 2 fois par jour avec une solution de Vétadine à 10% jusqu’à disparition des signes d’infection. Pour réduire au maximum les nuissance liées aux injections et au prélèvement de sang, nous ferons une surveillance 5 jours par semaine. Si des signes cliniques de souffrance animal apparaissent la souris sera mise à mort. Pour réduire les nuisances liées au prélèvement intra-tibial de la moelle osseuse les souris seront anesthésiées avant le prélèvement. D’autre part, nous limiterons ces prélèvements à un total de 4 (c’est à dire 4 prélèvements totaux qui se font en alternant le site de prélèvement entre le tibia gauche et le tibia droit avec une fréquence de 3 semaines entre prélèvements). Nous allons aussi réaliser un suivi du comportement des souris 5 jours par semaine après réalisation de ces prélèvements afin de vérifier que ces prélèvements n’auront pas d’impact sur le déplacement des souris. Si nous constatons des souris incapables de se déplacer, elles seront immédiatement mises à mort par dislocation cervicale
Choix des espèces
L’objective de ce projet est d’identifier de nouveaux traitement pour la LAM, une maladie qui rechute très fréquemment. Au cours des dernières années, la communauté scientifique a générée des lignées génétiquement modifiées en utilisant l’espèce Mus musculus. Ces lignées miment la maladie humaine et permettent donc d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et de tester leur efficacité thérapeutique afin d’aboutir à des nouveaux traitements pour les patients atteints de cette maladie. Les souris génétiquement modifiées que nous allons utiliser proviendront de notre élevage. Elles seront utilisées entre 8 semaines et 36 semaines (âge auquel les souris auront toutes développées la leucémie). Les souris que nous allons utiliser comme receveuses de cellules leucémiques murines seront fournies par un fournisseur agrée à l’âge de 7 semaines. Elles seront utilisées à 8 semaines, âge auquel ces souris tolèrent bien la greffe). Elles seront utilisées jusqu’au l’âge de 17-25 semaines, car 8-16 semaines seront nécessaires afin que les souris développent la leucémie après avoir été greffées. Les souris immunodéficientes que nous allons utiliser comme receveuses de cellules leucémiques humaines proviendront de notre élevage. Ces souris seront utilisées entre 8 et 15 semaines car cette fenêtre d’âge permet d’avoir un taux idéal de greffe, en permettant de réaliser la procédure d’injection dans de bonnes conditions. Ces souris seront utilisées jusqu’à 52 semaines après la greffe car, comme décrit dans la littérature scientifique, certaines cellules humaines peuvent greffer après un longue période de temps, qui peux atteindre 52 semaines.
Evaluation d’un agent de contraste dans l’amélioration de la fertilité féminine
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les mâles sont vasectomisés par une chirurgie de trente minutes puis gardés huit mois, les femelles reçoivent des stimulations hormonales, un agent de contraste par voie vaginale et une insémination, pour comprendre comment ce produit améliore la fertilité. Le porteur indique que l'agent de contraste iodé peut provoquer chez les femelles une réaction allergique avec difficulté respiratoire. Il affirme qu'aucun système de culture ne permet d'obtenir des gamètes fécondables et que l'étude de la fertilité ne peut se passer d'animaux reproduisant les atteintes humaines.
Objectifs
L'infertilité touche près de 15% des couples en age de concevoir. Les causes de cette infertilité peuvent être multiples et touchent aussi bien les hommes que les femmes. L'une des causes féminines est l'imperméabilité des trompes de Fallope, ce qui aura pour conséquence d'empecher le passage des spermatozoides vers l'oviducte et donc la fécondation ovocytaire. Afin de tester cette hypothèse, les femmes subissent une hystérosalpyngographie qui consiste en l'injection d'un agent de contraste monitoré sous rayons X et qui permet de visualiser l'utérus et les oviductes. Cet examen médical peut se faire à l'aide d'agents de contraste soit huileux (oil-soluble contrast media dénommé ci-après OSCM), soit soluble dans l'eau (water-soluble contrast media, ci-après WSCM). Une amélioration du taux de grossesse a été montrée lorsque les patientes sont traitées avec le OSCM (39.7%) vs le WSCM (29,1%). Cette amélioration est visible jusqu'à 6 mois après l'hystérosalpyngographie. Le but de notre projet est donc de comprendre dans un modèle murin à quel niveau un OSCM agit : épithélium utérin/oviductal, implantation embryonnaire, physiologie spermatique et améliore ainsi la fertilité. La souris étant un mammifère hyperfertile, il faudra donc dans un premier temps générer un modèle sous-fertile puis analyser si un traitement avec un OSCM rétablit une fertilité normale.
Bénéfices attendus
A court terme, cela permettra de comprendre comment un OSCM améliore la fertilité et sur quel type cellulaire il agit. A plus long terme, une fois la cible déterminée, de nouvelles molécules pro-fertilisantes pourront être developpées et proposées aux patients.
Procédures
Chirurgie sur les males pour la vasectomisation (30 minutes par souris, une chirurgie par souris). Injection intra-péritoneale pour les stimulations hormonales, les anesthésies et les analgésies (2 à 4 par souris femelle). Injection avec l'agent de contraste par voie vaginale (1 par souris femelle). Insémination intra-utérine ou tranfert d'embryon (1 par souris femelle)
Impact sur les animaux
La stimulation hormonale et l'insémination des souris femelles nécessitera leur préhension, de même que l'anesthésie et l'analgésie des souris males et femelles. Les males ayant une vasectomie pourront perdre du poids. Les souris femelles traitées au lipiodol pourraient faire une réaction allergique (difficulté respiratoire, rougeur) due à la présence d'iode dans le produit de contraste.
Devenir
Les males vasectomisés sont maintenus en vie pendant 8 mois puis euthanasiés. Nous ne pouvons réutilier les femelles traitées au lipiodol car nous ne connaissons pas la durée d'action du composé.
Remplacement
L'étude de la fertilité nécessite l'utilisation d'animaux reproduisant les phénotypes observés chez l'homme. Il est donc compliqué de les remplacer. Il n'existe aucun système de culture in vitro permettant d'obtenir des gamètes matures et fécondables (femelle) ou fécondantes (male).
Réduction
Le nombre minimal d'animaux sera utilisé dans chaque procédure tout en garantissant une étude statistique correcte (ANOVA, test de Tukey's). Lorsque les gamètes sont utilisées en fécondation in vitro, la stimulation hormonale des souris permet de récupérer un grand nombre d'ovocytes, cela permet de réduire le nombre de souris femelles. Plusieurs fécondation in vitro ou insémimation intra-utérine seront réalisées avec les spermatozoides d'un seul male, ce qui permet de réduire le nombre de males utilisés dans l'étude. Les males vasectomisés serviront tout au long du projet.
Raffinement
Les souris seront placées en conditions de température régulée, ad libitum. Afin de limiter l'angoisse et le stress, les souris sont hébergées à plusieurs par cage. Pour qu'elles puissent interargir avec leur environnement, faire leur nid et se cacher, des rouleaux et du papier sont ajoutés lors du change. Les animaux seront maintenus le moins de temps possible afin d'injecter les hormones nécessaires à la stimulation ovarienne, le traitement au lipiodol ou les anesthésiants/analgésiants. Le sacrifice des animaux sera effectué dans une pièce différente de celle de l'hébergement. Suite aux inséminations, les femelles seront placées individuellement avec un male vasectomisé pendant 24h puis rassemblées à raison de 2 souris par cage. Les males ne pouvant être rassemblés entre eux, ils seront replacés avec une femelle afin qu'ils ne restent pas isolés.
Choix des espèces
L'étude des mécanismes de la spermatogenèse et de l'ovogenèse, ainsi que de l'infertilité nécessite l'utilisation d'animaux car 1/ ces processus ne sont pas reproductibles in vitro. Il n'existe pas de système de culture cellulaire permettant d'obtenir des gamètes viables. 2/ La fécondation nécessite l'obtention de gamètes matures, qui ne peuvent être obtenus que sur des animaux 3/ l'étude des phénotypes d'infertilité humaine nécessite des animaux présentant les mêmes défauts que ceux observés chez les patients Il nous est donc impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. En effet, aucun modèle alternatif ne permet encore de reproduire en globalité, la complexité de la gamétogenèse et les impacts sur la fertilité en général et la fécondation en particulier. Il n'existe pas de modèle utérin in vitro assurant toute la complexité d'interaction entre la muqueuse utérine et l'embryon. Les souris males seront utilisés à maturité sexuelle soit 8-9 semaines. Les souris femelles seront utilisées à maturité sexuelle soit à partir de 6 semaines et pas au delà de 12 semaines car elles répondent alors moins bien à la stimulation hormonale.
Implication thérapeutique du blocage des CB1R et de l’inhibition des récepteurs SGLT2 sur la prise en charge de la néphropathie diabétique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues diabétiques, elles reçoivent pendant vingt-huit jours deux médicaments par gavage, avec incision de la veine de la queue pour mesurer la glycémie et échocardiographie sous anesthésie, pour tester une association contre la néphropathie diabétique. Le porteur indique que le diabète expose les animaux à un risque de déshydratation et d'hypothermie, pris en charge par du sérum et un tapis chauffant. Il juge "indispensable" de travailler sur un "organisme vivant en entier" et présente l'effet bénéfique de l'association au conditionnel.
Objectifs
L'insuffisance rénale chronique (IRC) touche des millions de patients dans le monde et malgré les efforts de recherches, peu d'options thérapeutiques sont disponibles. Actuellement, la prise en charge des patients souffrant de néphropathie diabétique (ND) consiste essentiellement en l’amélioration du contrôle glycémique, la réduction du risque cardiovasculaire, un meilleur contrôle de la pression artérielle, l'inhibition du système rénine-angiotensine (SRA) et plus récemment, l’inhibition du cotransporteur sodium-glucose de type 2 (SGLT2). Les patients présentant une ND sont de plus en plus fréquemment soumis à un double traitement composé d’un bloqueur du SRA associé à un inhibiteur SGLT2. Toutefois, bien que cette approche soit efficace, la progression de la ND n’est freinée que dans 39% des cas. Cela démontre que les traitements actuels ne sont pas optimums et que les efforts de recherche doivent s’intensifier afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans ce contexte, le récepteur aux cannabinoïde-1 (CB1R) est actuellement une cible potentielle très prometteuse pour la prise en charge de la ND mais là encore, les données pré-cliniques montrent une protection partielle uniquement. Ainsi, l'idée d'utiliser une approche pharmacologique permettant de combiner le blocage de CB1R et l’inhibition de SGLT2 au cours de la ND pourrait être une stratégie thérapeutique prometteuse. L’objectif principal de ce projet sera donc de déterminer si cette approche poly-pharmacologique est viable. Ainsi, nous étudierons les effets combinés du bloqueur CB1R INV202 et l’inhibiteur SGLT2 Empaglifozine dans deux modèles de souris diabétique de type 2 présentant les principaux symptômes retrouvés au cours de la pathologie humaine dont la perte de fonction glomérulaire, le développement de fibrose ou encore la présence d'une forte inflammation. L’objectif secondaire sera de déterminer si cette approche pharmacologique entraîne une amélioration de la fonction cardiaque particulièrement impactée par la présence d’un diabète non ou mal contrôlé. Cet aspect se fera de manière non-invasive via la technique d’échocardiographie.
Bénéfices attendus
Le diabète représente un véritable enjeu de santé publique ; cette pathologie étant classée parmi les urgences sanitaires du XXIème siècle du fait de l’évolution rapide du nombre de patients. En effet, selon les derniers chiffres de l’atlas de la Fédération Internationale du Diabète, le nombre d’adultes souffrant de diabète dans le monde est passé de 151 millions en 2000 à 463 millions en 2019. Sur le long terme, le diabète est la cause de nombreuses complications dont la néphropathie conduisant à l’insuffisance rénale chronique. À ce jour, malgré des efforts et des recherches considérables, peu d'options thérapeutiques restent disponibles pour les cliniciens pour traiter ou ralentir l’apparition de la néphropathie. Actuellement les traitements disponibles freinent le développement de la pathologie dans 39% des cas et une approche poly-pharmacologique semble appropriée en ce qui concerne le blocage des récepteurs CB1 et les inhibiteurs SGLT2. Ces derniers semblent exercés des effets bénéfiques différents mais complémentaires sur la néphropathie diabétique et leur combinaison devrait permettre d’obtenir une protection plus importante vis-à-vis de cette pathologie.
Procédures
Pour chaque test de glycémie, une petite incision à la veine caudale sera réalisée après avoir appliqué un anesthésique local et la quantité de sang total prélevée à un moment donné sera d’environ de 2 à 2,5 μL afin de pouvoir réaliser une mesure à l’aide du glucomètre. Ce type de prélèvement n’aura lieu qu’une fois, après 9 semaines de régime afin de sélectionner les souris diabétiques. Les souris seront anesthésiées puis rasées sur le ventre afin de procéder à une échocardiographie avant et après traitement pharmacologique. L’ensemble de la mesure se fait en 45 minutes maximum. Pendant les 28 jours de traitements, les drogues seront administrées par voie orale via gavage.
Impact sur les animaux
Tout au long de ce projet, l’état général des animaux diabétiques sera surveillé de façon régulière car bien que le diabète ne soit pas un point limite, les pathologies qu’il génère peuvent être une source de dérèglements internes. Ainsi les risques de déshydratations sont importants et les animaux présentant ces signes recevront une injection sous-cutanée de sérum physiologique ainsi que de l’eau gélifiée supplémentée en nutriments. Pour prévenir les risques d’hypothermie suite au développement d’hyperglycémie, les cages seront maintenues sur un tapis chauffant à circulation d’eau chaude. Le personnel maitrise très bien les gestes techniques nécessaire au bon déroulement du prélèvement de sang caudal servant à la mesure de la glycémie ainsi que la mise en œuvre des gavages orogastriques, et les animaux seront observés plusieurs fois dans la journée (en cas de fausse route l'animal montre des signes de souffrance assez rapidement). Tous les animaux de l’étude seront suivis par un personnel compétent selon les modalités mise en place par la structure chargée du Bien-être Animal du Centre de zootechnie.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’actions mis en jeux.
Remplacement
Le diabète de type 2 est une pathologie multifactorielle entraînant une élévation incontrôlée du glucose sanguin ayant des conséquences dramatiques sur de nombreux tissus et organes. Afin d’étudier les conséquences métaboliques et les pathologies associées, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier ce qui justifie ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux. En revanche, l’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous permettra de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques.
Réduction
Dans ce projet, nous allons utiliser des souris diabétiques. Les procédures prévues dans ce projet ne provoqueront pas de contraintes indues. Toutefois, le diabète pouvant conduire à un risque accru de déshydratation et d’hypothermie, nous opérerons un suivi quotidien des animaux afin de détecter tout dommage imprévu et ainsi intervenir pour soulager/abréger toute souffrance. Ainsi, les cages seront posées sur des tapis chauffant afin de prévenir l’hypothermie et en cas de déshydratation, les souris recevront une injection sous-cutanée de sérum physiologique ainsi que de l’eau gélifiée supplémentée en nutriments. Enfin, les souris diabétiques sont susceptibles de développer une polyurie marquée, nécessitant un changement de litière plus fréquent. Les analyses étant basées sur le degré d’hyperglycémie et d’albuminurie développé par les animaux, ces derniers seront répartis dans les groupes placebo, INV202, Empaglifozine ou INV202+Empaglifozinee de manière à ce que ces 2 paramètres soit similaire dans les 4 groupes. Dans le cas où un test non paramétrique serait nécessaire, nous utiliserons le test non paramétrique de Mann-Withney. Le minimum d’animaux par groupe pour atteindre la significativité de différence de traitement est de 15-20. Toutefois, ce nombre pourra être réduit dès que la significativité sera atteinte.
Raffinement
Depuis leur arrivée du fournisseur jusqu’à 5 semaines de régime hyper-protéiné, les souris seront hébergées en groupe afin d’éviter l'isolement. De plus, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Lors des 4 dernières semaines, les souris seront hébergées individuellement afin de permettre l’évaluation quotidienne de la prise alimentaire. A nouveau, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher.
Choix des espèces
L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’Homme. C’est pourquoi, le choix des modèles est important. Ainsi, il apparait logique de choisir un modèle de vertébré dont la physiologie et la physiopathologie sont le plus proche possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris. Leur métabolisme au sens large présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. A 9 semaines, les animaux seront soumis à un régime riche en protéines pour une durée de 9 semaines dont les 4 dernières correspondront aux interventions pharmacologiques. Cette intervention commencera donc lorsque les animaux auront 14 semaines et se terminera à l’âge 18 semaines. Cet âge est privilégié dans le but d’étudier des pathologies d’ordre métabolique telles que le diabète de type 2 et ses conséquences sur la fonction rénale normalement diagnostiqué chez l’Homme à l’âge adulte. Pour une raison de coût financier, les animaux seront commandés à l’âge de 4-5 semaines et seront hébergés dans notre animalerie en attendant d’avoir 9 semaines d’âge.
Modèles murins pour comprendre les fonctions de p53 dans la moëlle osseuse.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
174 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent des prélèvements sanguins tous les deux mois pendant un an après inactivation d'un gène dans leur moelle osseuse, pour étudier le rôle de la protéine p53 dans la production des cellules du sang. Le porteur indique que cette inactivation peut provoquer une insuffisance médullaire ou une leucémie, avec un point limite déclenchant la mise à mort des animaux qui se dégradent. Il qualifie la souris de "modèle incontournable" et juge son usage "indispensable", les retombées thérapeutiques n'étant évoquées qu'au conditionnel.
Objectifs
La moëlle osseuse est un tissu situé au centre des os où tous les différents types de cellules du sang sont produites : Les globules rouges (qui transportent l’oxygène), les globules blancs (qui protègent des infections) et les plaquettes (qui s’accumulent lors d’une blessure pour arrêter une hémorragie). Ces cellules sanguines ont une durée de vie allant de quelques jours à quelques mois et doivent être continuellement renouvelées tout au long de la vie. Le processus de renouvellement des cellules sanguines est appelé hématopoïèse. Ce processus est finement régulé. Un défaut d’hématopoïèse peut être à l’origine d’une anémie causée par un défaut de production des globules rouges et de transport d’oxygène ou d’une thrombopénie causée par un défaut de production des plaquettes responsable de défauts de cicatrisation et d’hémorragies. A l’inverse une trop grande production de plaquettes peut créer des caillots de sang qui vont obstruer la circulation sanguine.
Bénéfices attendus
Les données du projet permettront peut-être aussi d’identifier une nouvelle stratégie thérapeutique dans les syndromes d’insuffisance médullaire associés à une hyperactivation de p53.
Procédures
Pour assurer le suivi des animaux, des prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile tous les deux mois sur une durée maximale d’un an
Impact sur les animaux
Les effets indésirables potentiellement associés à l’inactivation de notre gène d’intérêt dans l’ensemble de l’organisme sont inconnus. Les effets indésirables possibles de son inactivation ciblée dans la moëlle osseuse sont le développement soit d’une insuffisance médullaire soit d’une leucémie.
Devenir
A l’issue de toutes les procédures, les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Des analyses in vitro réalisées au préalable sur des lignées cellulaires murines et humaines ont révélé que la protéine p53 inhibe l’expression de plusieurs gènes fréquemment inactivés dans les syndromes d’insuffisance médullaire. Ce mécanisme est indirect et dépend du recrutement sur l’ADN d’un complexe protéique ayant un rôle répresseur sur l’expression des gènes. Ces résultats suggèrent la possibilité de prévenir l’insuffisance médullaire en atténuant l’activité du complexe répresseur induit par la suractivation de p53. Le projet a pour but maintenant d’étudier chez la souris, organisme vivant intégré et autonome, les conséquences physiologiques d’une perte de fonction de ce complexe répresseur. L’utilisation du modèle Souris reste indispensable pour le présent projet.
Réduction
Les stratégies d’accouplement sont optimisées afin d’obtenir le maximum de souris de génotype adéquat et ainsi réduire l’élevage. Pour chaque souris euthanasiée, un maximum d’organes est prélevé et les tissus sont congelés et/ ou fixés pour analyses ARN, protéines et histologiques. Dans les différentes procédures, le nombre d’animaux est suffisant pour mesurer des différences significatives.
Raffinement
Les souris utilisées dans ce projet peuvent avoir un phénotype dommageable. Afin d’éviter toute souffrance et/ou détresse, une grille d’évaluation de l’état de l’animal sera appliquée pour définir le point limite à partir duquel l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Grâce à sa parenté biologique avec l’Humain (génome murin/humain, physiologie) et à la possibilité de modifier son génome, la souris est un modèle incontournable pour la compréhension des mécanismes qui contribuent au développement des syndromes d’insuffisance médullaire prédisposant aux cancers. Les conséquences de l’inactivation de notre gène d’intérêt in vivo sont totalement inconnues, c’est pourquoi une analyse phénotypique chez l’embryon et l’adulte sera réalisée. Les conséquences de l’inactivation de notre gène d’intérêt dans le lignage hématopoïétique sont également inconnues. Le suivi d’une éventuelle anémie ou hémopathie maligne sera réalisé chez des animaux adultes.
Rôle des hormones thyroïdiennes sur croissance de tumeurs intestinales en xénogreffes sous-cutanées et analyse de l’effet sur la chimiothérapie FOLFIRI
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues hyperthyroïdiennes par leur eau de boisson pendant dix-huit semaines, elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses sous la peau puis neuf injections de chimiothérapie, pour mesurer l'effet des hormones thyroïdiennes sur l'efficacité du traitement. Le porteur indique que la chimiothérapie peut provoquer des diarrhées et du sang dans les selles, les manipulations se faisant sur animal vigile. Il affirme que ces mécanismes ne peuvent s'étudier que dans un "organisme complet" et juge l'animal "absolument nécessaire", les retombées pour les patients restant hypothétiques.
Objectifs
Le but du projet est de réaliser des expériences permettant d’analyser les effets des Hormones Thyroïdiennes (HT) sur la croissance de tumeurs chez la souris lorsqu’un traitement par chimiothérapie est mis en place. La chimiothérapie est l’un des traitements majeurs mis en place pour combattre le cancer. Elle vise à éliminer les cellules cancéreuses quel que soit l’endroit où elles se trouvent dans le corps. Nous savons par nos travaux antérieurs que les HT influent le développement de certains cancers, dont le cancer colorectal. Nous souhaitons étudier maintenant si ce taux d’HT influe également sur l’efficacité de la chimiothérapie. Pour cela, nous utiliserons des souris hyperthyroïdiennes (avec un niveau d’HT plus élevé que la normale) auxquelles nous grefferont des cellules cancéreuses. Une fois que les tumeurs se seront développées, ces souris recevront une chimiothérapie. Nous pourrons alors étudier l’impact des HT sur le développement des tumeurs et estimer si les HT ont un impact sur l’efficacité de la chimiothérapie.
Bénéfices attendus
Des patients atteints de cancers colorectaux se retrouvent dans une situation d’hyperthyroïdie. Nous savons qu’il existe un lien entre les HT et le développent tumoral. SI cet effet est caractérisé et mieux compris, les traitements pourront être mieux adaptés pour les patients.
Procédures
Nous utiliserons des souris immunodéprimées qui seront hébergées dans une pièce dédiée à ce type d'animaux afin de les protéger au maximum. Les animaux recevront d’abord un traitement pour induire une hyperthyroïdie sub-clinique dans l’eau de boisson pendant toute la durée de la procédure, soit 18 semaines. Les souris subiront ensuite une greffe de cellules cancéreuses sous la peau. Cela dure quelques secondes. Cette injection engendrera un développement de tumeurs. Enfin, les souris seront traitées par chimiothérapie. L’administration de ce traitement se fait par cycle de 3 injection par semaine. Il y aura 3 cycles de traitement au total, soit 9 injections par souris. Entre chaque cycle de traitement, il y aura une semaine de repos. Chaque injection dure quelques secondes.
Impact sur les animaux
Nous utiliserons des souris immunodéprimées qui seront hébergées dans une pièce dédiée à ce type d'animaux afin de les protéger au maximum. Les animaux recevront d’abord un traitement pour induire une hyperthyroïdie sub-clinique dans l’eau de boisson pendant toute la durée de la procédure. Cette hyperthyroïdie induit des modifications physiologiques légères, en particulier une tendance à une légère hyperthermie. Les souris subiront ensuite une greffe de cellules cancéreuses sous la peau. Cela dure quelques secondes. Cette injection engendrera un développement de tumeurs. Enfin, les souris seront traitées par chimiothérapie. L’administration de ce traitement se fait par cycle de 3 injection par semaine. Il y aura 3 cycles de traitement au total, soit 9 injections par souris. Entre chaque cycle de traitement, il y aura une semaine de repos. Chaque injection dure quelques secondes. La chimiothérapie peut provoquer des effets secondaires comme des diarrhées et du sang dans les selles. Les manipulations se feront sur animal vigile.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure. En effet, le but est de mener des analyses sur plusieurs de leurs tissus (tumeurs et organes) afin d'évaluer l'impact des hormones thyroïdiennes lors d'une chimiothérapie.
Remplacement
Un travail en amont a été réalisé in vitro sur les cellules cancéreuses utilisées dans ce projet. A présent, il s'agit d'étudier l'impact des hormones thyroïdiennes et leur effet sur un traitement de chimiothérapie. Pour cela, ces cellules cancéreuses doivent être implantées dans un organisme afin de reproduire au mieux les conditions physiologiques dans lesquelles les tumeurs se développent habituellement. Il nous faut donc avoir recours à un système intégré et mature, dans notre cas le modèle souris.
Réduction
Ce nombre a été réduit au maximum tout en restant suffisant et statistiquement robuste pour apporter des réponses claires à notre projet.
Raffinement
Les souris, de par leur statut immunodéficient, seront hébergées en groupes sociaux dans des conditions sanitaires contrôlées en disposant d’un enrichissement adapté (carrés de coton pour la fabrication des nids ainsi que des tunnels ou maisonnette et des bâtons de bois à ronger). Les animaux seront commandés chez un fournisseur et à leur arrivée au laboratoire, ils bénéficieront d’une période d’acclimatation pour leur permettre de s’habituer à leur nouvel environnement. Une habituation à la manipulation sera également réalisée après cette période d’acclimatation. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Un suivi régulier comprenant l’observation de critères définis (poids, taille des tumeurs, état général) sera effectué. Des points limites (poids et état de maigreur, taille des tumeurs) ont été établis permettant de soustraire l’animal au protocole, limitant ainsi dans le temps une souffrance et un stress potentiels.
Choix des espèces
Nous utilisons la souris comme modèle. L'animal est absolument nécessaire par son côté physiologique intégratif. Dans notre projet, l'étude de l'effet des hormones thyroïdiennes (HT) sur le développement de tumeurs cancéreuses et l’étude de l'impact de ces hormones lors d'un traitement de chimiothérapie ne peuvent se faire que dans des organismes complets. La culture sur cellules ne permet pas d'étudier la totalité des mécanismes ni d'évaluer l'efficacité d'un traitement et ses effets. Les animaux seront âgés d'au moins 8 semaines afin de mener notre projet sur un stade adulte.
Cancer Colorectal : développement de nouveaux bio-marqueurs
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Génétiquement modifiées pour être dépourvues de trois protéines, elles reçoivent quatre injections intrapéritonéales et deux prélèvements sanguins pour produire des anticorps, avant le prélèvement de la rate. Le porteur destine ces anticorps au diagnostic du cancer colorectal. Il affirme que la production d'anticorps ne peut se faire que dans un animal vivant au système immunitaire opérationnel.
Objectifs
Le cancer colorectal (CCR) est la troisième malignité en nombre de nouveaux cas par an en Europe. Dans ce projet, nous allons clarifier le rôle de 3 protéines encore peu étudiées et dont l’expression peut être un biomarqueur pronostique pour le CCR et/ou un indicateur pour les options de traitements spécifiques. Nous avons mis en évidence une altération de l’expression de ces protéines dans des tumeurs de patients atteints de CCR en comparaison avec la muqueuse intestinale normale du même patient. Hors actuellement, il n'existe pas d’anticorps fiables reconnaissant spécifiquement ces molécules. C’est pourquoi nous souhaitons générer des anticorps monoclonaux dirigés contre ces protéines de modification de la structure cellulaire, qui pourront être utilisés comme des nouveaux outils indispensables dans la caractérisation en routine de biopsie du colon et ainsi permettront d’affiner le diagnostic et le traitement des patients atteint de CCR.
Bénéfices attendus
La production d’anticorps spécifiques pour des enzymes de modification de la structure cellulaire permettra, à court terme, de pouvoir confirmer nos résultats de recherche obtenus aux niveaux de l’expression des gènes. Ils nous permettront également de visualiser la distribution de ces enzymes dans les différents compartiments du colon et ainsi de mieux comprendre le rôle de ces protéines dans le développement du cancer colorectal. A plus long terme, nous pourrons également proposer ces anticorps en clinique humaine, pour déterminer le niveau d’expression des protéines aux différents stades du cancer colorectal et dans les différents sous-types de cancer. La cartographie plus précise de cette expression permettra de proposer ces enzymes comme biomarqueurs de façon à diriger plus efficacement les stratégies de traitement.
Procédures
Chaque animal entrant dans ce projet sera soumis, vigile, aux interventions suivantes : - 4 injections intrapéritonéales d’un liquide inerte de 100µl, espacées de 2-3 semaines. Cet acte représente moins d’une minute ; - 2 prélèvements de 70-100µl de sang au niveau mandibulaire (réalisé pas un personnel de l’animalerie parfaitement formé à cette technique), 7 jours après la 2° et la 3° injection, soit deux prélèvements à 2-3 semaine d’intervalle. Cet acte représente moins d’une minute.
Impact sur les animaux
L’injection intrapéritonéale de l’antigène représente une souffrance de classe légère. Notre pratique régulière de cette procédure montre que la gêne la plus importante pour les animaux est le stress lié à la contention et à la piqure de l’aiguille. Pour le réduire au maximum, l’aiguille utilisée est une 26G que nous utilisons seulement pour injecter 2 souris, car ensuite le bout est trop émoussé. A son retour dans sa cage, la souris va y trouver une récompense sous forme de pâtée alimentaire différente des croquettes habituelles.
Devenir
Chaque animal entrant dans ce projet sera mis à mort afin de prélever sa rate, organe à partir duquel nous isolerons les lymphocytes B producteurs d’anticorps
Remplacement
La réaction immunitaire contre un antigène/protéine conduisant à la production de lymphocytes B producteurs d’anticorps n’est possible que dans un animale vivant avec un système immunitaire opérationnel, soit chez la souris pour la génération d’anticorps monoclonaux, soit chez le lapin pour celle d’anticorps polyclonaux et/ou monoclonaux. Donc cette première phase de la production d’anticorps ne peut pas utiliser de méthode alternative. Le choix de la souris comme espèce de travail se justifie par le faite que l’anticorps va être généré par immunisation d’une souris déficiente pour l’antigène/protéine d’intérêt pour avoir une réponse immunitaire élevée et spécifique. De plus les clones auront l’avantage d’avoir une spécificité stricte et leur mode de production assurera une production infinie et reproductible d’anticorps de lot-à-lot.
Réduction
Le nombre de souris nécessaires pour la génération d'un anticorps monoclonal spécifique dépend de l'antigène/protéine et notamment de son immunogénicité, habituellement il est de l’ordre de 4 à 8 souris. Aucune analyse empirique ne documente cela, mais ces chiffres sont basés sur l'expérience du chercheur principal, qui a généré divers anticorps monoclonaux au cours de sa carrière scientifique.
Raffinement
Les animaux sont hébergés selon les standards prévus pour la règlementation, en groupes sociaux, dans un environnement adapté et enrichi (cabane, coton à dépiauter pour faire un nid). Les 4 femelles, injectées pour une même protéine, seront regroupées dans une même cage. Lors des injections de l’antigène, les souris vont trouver, à leur retour dans la cage, une récompense sous forme de pâtée alimentaire différente des croquettes habituelles. Pour que les animaux se partagent la récompense, et ne se battent pas, nous déposons autant de portions de pâtée alimentaire (de la taille d’une noisette) que d’animaux présents dans la cage et ceci de manière espacée. Une attention particulière est portée à la formation de l’expérimentateur afin de limiter la durée de la procédure expérimentale et ainsi réduire la douleur et le stress de l’animal.
Choix des espèces
Pour optimiser la réaction immunitaire contre un antigène/protéine conduisant à la production d’anticorps les souris totalement déficientes pour TTLL3, TTLL4 ou TTLL6 (des enzymes de modification de la tubuline) seront utilisées pour générer des anticorps contre ces protéines. L’utilisation d’animaux transgéniques totalement “naifs” vis-à-vis de la protéine contre laquelle nous voulons faire des anticorps augmentera l’efficacité de la réponse immunitaire puisque le système immunitaire n’aura jamais rencontré cet antigène/protéine. Les animaux seront utilisés à partir de 2 mois d'âge selon le protocole établi dans la littérature.
Etude du rôle des NETs dans la progression tumorale du cancer de la peau
- Recherche fondamentale
- Oncologie
2 064 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales dans le derme qui provoque un cancer de la peau, avec troubles de la locomotion et signes de douleur suivis pendant 40 jours au moyen d'une grille de points limites détaillée incluant nécrose, ulcération et perte de poids, avant le prélèvement des tumeurs. Le porteur étudie le rôle des NETs, des structures libérées par certains globules blancs, dans la progression tumorale. Il indique avoir d'abord travaillé sur des cultures in vitro.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’évaluer l’impact des voies de signalisation responsables du recrutement des neutrophiles et de la formation des Neutrophil Extracellular Traps (NETs) dans la progression tumorale des carcinomes squameux (CS) de la peau in vivo. En effet, nos résultats obtenus in vitro montrent que les neutrophiles et NETs entrainent la progression des CS via i) un effet direct sur la prolifération des cellules tumorales ; i) l’activation des fibroblastes et ainsi la mise en place d’un environnement riche en matrice extracellulaire ; ii) l’inhibition des lymphocytes T cytotoxiques. En effet, cet environnement est indispensable au développement tumoral et à l’invasion des CS. Nous voulons maintenant confirmer nos résultats chez la souris en utilisant un modèle d’injection de cellules tumorales de souris (cellules SCC38) dans le derme des souris. En effet nous nous attendons à une diminution de la progression tumorale après inhibition du recrutement des neutrophiles et NETs et de leurs sous-effecteurs.
Bénéfices attendus
Notre étude nécessite l’utilisation d’animaux mais pourrait déboucher sur la mise au point de nouveaux médicaments permettant d’améliorer les traitements pour les patients atteints de CS. Cette étude permettra notamment de mettre en évidence les neutrophiles et les NETs comme cibles thérapeutiques permettant de contrecarrer la progression des CS.
Procédures
Nous implanterons 500 000 cellules de la lignée SCC38 dans le derme de souris FVB/n femelles rasées placées sur un tapis chauffant, sans incision sous anesthésie générale (induction à 5% isoflurane pendant une minute, et maintient au masque à 2.5% isoflurane d’environ 5 minutes, temps nécessaire au rasage des souris et l’injection des cellules dans les souris). Pour cela une seringue à insuline (29 G) sera utilisée pour injecter les cellules tumorales dans le derme des souris, au niveau du dos, dans un volume de 50 uL de PBS (communément utilisé pour l’injection intradermique). L’administration des inhibiteurs/anticorps et de leur véhicule commencera 7 jours après implantation des cellules tumorales et jusqu’à la fin de l’expérience. L’administration des inhibiteurs/anticorps se fera IP dans un volume de 200uL (via une seringue à insuline, 29G). Une rotation des points d’injection IP sera effectuée.
Impact sur les animaux
Les signes cliniques attendus des animaux développant des tumeurs sont des problèmes de déplacements et des signes de douleurs. Le bien-être animal sera évalué de manière objective grâce à des fiches d’évaluation adaptées à cette procédure (cf. annexe 1). Le suivi des animaux sera effectué 2 fois par semaine jusqu’a la mise a mort des animaux, au maximum 40 jours après implantation des cellules tumorales SCC38 ou lorsqu’un point limite sera atteint. Ce projet a été construit en respectant la règle des 3R.
Devenir
Les animaux seront a mis a mort par dislocation cervicale puis les tumeurs primaires seront prélevés pour analyse ex vivo. Les critères d’analyses des échantillons utilisés seront l’évaluation i) de la taille des papillomes/carcinomes ; ii) de la présence de neutrophiles/NETs/lymphocytes/fibrose dans les papillomes/carcinomes ; iii) de la fibrose tumorale. De plus, nous ne considérons pas comme un échec qu’un traitement n’aboutissent pas à un changement du nombre/taille des papillomes/carcinomes puisque la compréhension de ce critère nécessite l’analyse histologique/biochimique des échantillons à la fin de l’expérience.
Remplacement
Remplacer : Nos recherches ont décrit les cultures in vitro comme une méthode de remplacement pour l’étude du développement tumoral métastatique. Nous avons déjà développé des modèles in vitro permettant de vérifier le rôle des NETs sur les capacités tumorales des SCC38. Ces cultures ne récapitulent pas la complexité de l’organe (notamment les relations entre les cellules tumorales, les neutrophiles, les fibroblastes et les lymphocytes CD8), nous avons donc recours aux animaux.
Réduction
Réduire : Le nombre d’animaux est choisi pour détecter toute différence significative sur le volume tumoral avec un nombre de souris minimum. Les tests statistiques nous permettant de calculer le nombre de sujets nécessaires pour comparer les valeurs moyennes des groupes expérimentaux ont été réalisés via le logiciel BiostaTGV (recommandé par l’INSERM) avec les estimations suivantes : Moyenne du premier lot : 1000 (1cm3) Moyenne du deuxième lot : 700 (0.7 cm3) Ecart type commun omega : 310 Risque de première espèce alpha : 0.05 Puissance 1 – beta = 0.95 Les résultats obtenus au laboratoire in vitro permettent de réduire le nombre d’animaux. De plus, les résultats déjà publiés avec ce modèle nous permettent de connaitre la cinétique de développement de la maladie. Toutes ces données nous ont permis de générer une analyse statistique prévisionnelle permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les signes cliniques attendus des animaux développant des tumeurs sont des problèmes de déplacements et des signes de douleurs. L’implantation des cellules tumorales, les souris se fera sur un tapis chauffant, sans incision sous anesthésie générale (induction à 5% isoflurane pendant une minute, et maintien au masque à 2.5% isoflurane d’environ 5 minutes, temps nécessaire au rasage des souris et l’injection des cellules dans les souris). Afin d’évaluer le bien-être animal au mieux et de manière objective, nous avons établi des fiches d’évaluation du bien-être animal adaptées à cette procédure (cf. annexe 1). Ces fiches contiennent des points limites qui correspondent à un score maximum qui prend en compte plusieurs paramètres. L’état des animaux sera évalué 2 fois par semaine et un score sera donné aux paramètres suivants. Prostration=point limite Manque de toilettage=1 Mauvais état de la peau=1 Plaie=3 Dos vouté=3 Ventre creux=point limite Plaie majeure=point limite Difficulté respiratoire=point limite Tremblement=1 Piloérection=point limite Convulsion=point limite decubitus=point limite Ataxie=point limite Paralysie=point limite Vocalisations=1 Agressivité=3 Saignement muqueuse=1 Prolapsus mineur=1 Prolapsus majeur=3 Maigreur=3 Perte de poids inferieur 5%=1, Perte de poids inferieur 10%=2 (un sirop de framboise 1% sera donne) Perte de poids inferieur 15%=3 (de la nourriture gélifiée sera donne) Perte de poids de 15%=point limite Nécrose=point limite Ulcération=point limite Tumeur de 0.75cm3 =2, tumeur de plus de 1cm3=point limite Rougeur site IP=1 (antiseptique quotidien jusqu’à disparition) Gonflement site IP=1 (antiseptique quotidien jusqu’à disparition) Peau tanne site IP=1 (antiseptique quotidien jusqu’à disparition) Suintement site IP=2 (antiseptique quotidien + antibiothérapie per os quotidien jusqu’à disparition) Un score de 9, évalué selon les différents critères de la grille de score, correspond à un point limite et entrainera la mise a mort immédiate de l’animal. De plus, les résultats obtenus avec ce même modèle nous permettent de connaitre la cinétique de développement de la maladie et justifient les procédures proposées.
Choix des espèces
Nous souhaitons étudier le rôle des NETs dans le développement des CS. Le modèle murin est un excellent modèle pour élucider ces mécanismes car il présente de grandes similitudes génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. En outre, les modèles de tumeur primaire chez la souris sont couramment utilisés par la communauté scientifique, et nous ont déjà permis de dévoiler ; 1) le rôle des fibroblastes dans l’invasion tumorale 2) le rôle des NETs dans le réveil des cellules tumorales ; 3) le rôle des NETs dans la résistance aux chimiothérapies. De plus, le modèle d’implantation des SCC38 dans le derme de la souris a déjà été utilisé pour étudier le développement des CS. Les injections de cellules tumorales SCC38 seront réalisées sur des souris âgées d’au moins 8 semaines ce qui représenten l’âge adulte chez la souris. En effet, nous nous intéressons au développement des cancers de la peau chez l’adulte et non chez l’enfant. Les prélèvements des tumeurs sur les souris se feront au maximum 40 jours après injection des cellules tumorales (ou lorsque le point limite sera atteint).