Système endocrinien

1 664 souris génétiquement modifiées, privées d'un à trois facteurs dans le foie, vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie est nourrie quinze semaines avec un régime hypercalorique jusqu'à développer diabète et accumulation de graisse dans le foie, l'autre suivie un an avec des tests de glycémie répétés. Toutes sont tuées pour prélever sang et organes. Le projet étudie la coopération entre facteurs de transcription du métabolisme, présentés comme des cibles thérapeutiques contre les maladies liées à l'obésité.

Objectifs

L’obésité est en constante augmentation et représente un facteur de risque majeur pour le diabète de type 2 et d’autres maladies telles que la stéatose hépatique métabolique. Le foie est un organe majeur pour la régulation de l’homéostasie énergétique et contrôle de nombreuses fonctions métaboliques et des réponses inflammatoires. De nombreuses fonctions hépatiques sont assurées par des facteurs de transcription qui coopèrent pour réguler l’expression de gènes. La dérégulation de ces processus est l’un des mécanismes observés lors du diabète de type 2 et de la stéatose. Dans ce projet, nous souhaitons étudier les rôles respectifs et les coopérations potentielles entre plusieurs facteurs de transcription dans la régulation du métabolisme en condition physiologique et dans l’obésité induite par l’alimentation. Nous disposons au laboratoire de souris spécifiquement délétées pour un ou plusieurs facteurs de transcription dans les hépatocytes. Ces animaux, hébergés pour certains d'entre eux à thermoneutralité, seront soit nourris avec un régime standard et suivis au cours du temps, soit nourris avec un régime hypercalorique pendant 15 semaines. Les effets seront évalués grâce à des bilans sanguins et des analyses du foie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer les rôles spécifiques ainsi que les potentielles interactions ou redondances entre différents facteurs de transcription impliqués dans la régulation du métabolisme hépatique, en condition physiologique et physiopathologique.Les facteurs de transcription étudiés sont des cibles thérapeutiques de choix pour le traitement des maladies métaboliques associées à l’obésité et il existe actuellement un intérêt croissant pour le développement de molécules ciblant simultanément plusieurs de ces facteurs. Les résultats obtenus lors de ces expériences apporteront ainsi une contribution à la recherche biomédicale.

Procédures

Des groupes d’animaux seront nourris à volonté avec un régime standard et suivis pendant 1 an (512 animaux). D’autres groupes, hébergés à thermoneutralité, seront nourris à volonté avec un régime standard ou hypercalorique pendant 15 semaines (1152 animaux). -pesées hebdomadaires - 6 mesures de la glycémie (tous les 2 mois sur 1 année) pour 512 animaux à partir d’une goutte de sang . La mesure ne nécessite pas de contention et prend moins de 5 secondes. - 2 mesures de la glycémie pour 1152 animaux - 3 tests de tolérance au glucose et 3 tests de tolérance à l’insuline sur une année pour 512 animaux, consistant en 6h de jeûne, suivi d'une mesure de la glycémie (temps 0) puis administration orale de glucose ou injection d'insuline prenant moins de 30 secondes, puis de mesures de la glycémie toutes les 15 min pendant 2 h (6 prélèvements de moins de 5 secondes). - 1 test de tolérance au glucose et 1 test de tolérance à l’insuline sur 1152 animaux - un dernier prélèvement sanguin avant la fin de l’étude pour tous les animaux

Impact sur les animaux

Les animaux nourris avec le régime hypercalorique vont progressivement prendre du poids associé à des perturbations métaboliques progressives telles que le développement d’un diabète (hyperglycémie, intolérance au glucose, résistance à l’insuline) et d’une stéatose (accumulation de lipides dans le foie). Ces altérations s’installent de manière progressive sur plusieurs semaines et correspondent à une nuisance d’intensité modérée, sans altération brutale de l’état général des animaux. La piqûre pour obtenir la goutte de sang peut entraîner une douleur ponctuelle de faible intensité (quelques secondes), sans effet persistant. Le dernier prélèvement de sang peut entraîner un stress des animaux lié à la contention et une brève douleur d’intensité très modérée. L'administration de glucose ou d'insuline peut également entraîner un stress de quelques minutes lié essentiellement à la contention. Lorsqu'il est réalisé par du personnel expérimenté, ce geste n'entraîne pas de douleur significative ni de complication.

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique.

Remplacement

Des méthodes alternatives utilisant des cellules de foie par exemple pourraientt être envisagées. Néanmoins, le métabolisme énergétique est un processus complexe qui met en jeu des interactions entre plusieurs organes (foie, tissu adipeux, intestin, muscle, cerveau) qui sont difficiles à reproduire avec des cellules en culture. L’utilisation d'un organisme vivant, dans lequel tous les organes fonctionnent ensemble, est donc nécessaire. De plus, l’utilisation de souris transgéniques rend possible la délétion d’une protéine d’intérêt dans un organe spécifique pour étudier son rôle et il est possible d’induire une obésité chez la souris grâce à un régime hypercalorique.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.

Raffinement

Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement (hébergement collectif, environnement contrôlé, enrichissements du milieu de vie). L’hébergement à thermo-neutralité permet de limiter le stress dû au froid. Les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux, et nous mesurerons les consommations alimentaire et hydrique. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres. Si un critère d'arrêt est atteint, l'animal sera retiré de la procédure et replacé en conditions d’hébergement standard après examen par la vétérinaire référente.

Choix des espèces

L’utilisation de souris de laboratoire permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Les modèles utilisés dans ce projet (délétés pour 1, 2 ou 3 protéines dans le foie) existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 semaines d’âge minimum) car le développement du foie est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.

Exposées au froid à 5 degrés, soumises à des mesures répétées de température rectale et à un régime gras pendant seize semaines, 736 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Certaines passent 48 heures isolées en cage métabolique, d'autres reçoivent des injections quotidiennes puis un prélèvement de sang juste avant la mise à mort. Toutes sont tuées pour prélever organes et sang. L'objectif est de savoir si une protéine des cellules graisseuses contrôle la combustion des graisses, piste avancée contre l'obésité.

Objectifs

Il existe dans notre organisme deux grands types de cellules graisseuses appelées adipocytes : les adipocytes blancs qui stockent les graisses que nous mangeons et les adipocytes bruns et beiges qui brulent ces graisses. L'activation de ces adipocytes bruleurs de graisse contribue au maintien de la température corporelle lors d'une exposition au froid et permet de dissiper l'excédent calorique après un repas. Ainsi favoriser la fonction de ces adipocytes bruleurs de graisse diminuerait la prise de poids. Nous avons récemment découvert que ces adipocytes bruns et beiges bruleurs de graisse expriment en grande quantité d'un canal ionique donc l’activation est contrôlée par des forces mécaniques qui s'excersent sur les cellules. Elle fait partie de la famille des protéines dites mécano-sensible. L'objectif de ce projet est de déterminer si cette protéine mécano-sensible contrôle la capacité des adipocytes bruns et beiges à bruler des graisses lors de l'exposition au froid et après la prise d'un repas et si elle joue un rôle dans ces adipocytes pour moduler le développement de l’obésité induite par un régime riche en graisse.

Bénéfices attendus

L'ensemble des expériences décrites dans ce projet permettront de mieux comprendre le rôle de cette protéine mécano-sensible dans les mécanismes d'activation des adipocytes bruns et beiges bruleurs de graisse et ainsi pourrait permettre de proposer cette protéine comme une future cible pour des médicaments visant à augmenter la fonction et/ou le nombre de ces adipocytes bruleurs de graisse. Cela permettra de favoriser la dépense énergétique et de réduire la masse grasse et ainsi lutter contre l’obésité et ses complications métaboliques comme le diabète de type 2 ou les maladies cardiovasculaires.

Procédures

Les souris (48) seront soumises à un régime riche en lipides pendant 16 semaines. La masse maigre et la masse grasse sera mesurée sur des souris vigiles (96) par un appareil à raisonnance magnetique nucléaire (RMN) qui est une procédure non invasive un peu comme un scanner, la mesure dure 2 min/souris. Pour les mesures en cage métabolique, les souris (96) seront en hébergement individuel pendant 48 h. Des souris vigiles (96) seront soumises à 3 tests d’explorations métaboliques nécessitant une injection intrapéritonéale par test. Pour ces 3 tests, ces souris seront soumises à 7 prélèvements d’une goutte sang d'environ 1µl (soit environ 7µL de sang prélevé par test) pour mesurer la glycémie. Le prélevement nécessitera de faire une petite incision sur la queue de la souris au début du test. Les tests seront espacés de 2 semaines. Des souris vigiles recevront une injection intrapéritonéale pendant 7 jours d'un composé activant le tissu adipeux brun (144 souris) ou de NaCl en contrôle (144 souris). A la fin de certaines procédures, des souris (448) seront immédiatement mise à mort après un prélevement d'un volume de sang d'environ 200 µl à la veine temporale. Pour les experiences à thermoneutralité, des souris (144 souris) seront hébergées à 30 °C pendant 5 semaines maximimum. Des souris seront hébérgées à 5°C pendant 6h (192 souris) ou 10 jours (80 souris) et seront pour ces durées soit en hébergement individuel (5°C 6h) soit 2 dans la cage (5 °C 10 jours) afin d’éviter ou de limiter le comportement de thermorégulation sociale qui consiste au regroupement d’animaux les uns contre les autres afin de se réchauffer, comportement qui pourrait fausser les résultats de la mesure de la variation de température corporelle par mesure de la température rectale. Une mesure de la température rectale sera faite sur des souris vigiles (352 souris) comme dans l'espèce humaine à l'aide d'un thermomètre dont la sonde à un diamètre adapté à la souris pour une insertion sans trop d'inconfort dans son anus. 7 mesures espacées d'1h seront faites sur les souris hébérgées à 5°C pendant 6h et 1 mesure par jour sera faite sur les souris hébérgées à 5°C pendant 10 jours. 2 mesures espacées de 10 j seront faites sur des souris hébergées à 21 C °(80 souris).

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales sur animaux vigile entrainent une douleur légère et de courte durée. Le prélevement d'une goutte de sang lors des tests d'exploration métabolique necessite de faire une petite incision à la queue au debut du test qui peut engendrer une légère douleur de courte durée. Le prélevement de sang à la veine temporale immédiatement avant la mise à mort entraine une douleur de courte durée car une piqure avec une aiguille de 20-23G est réalisée pour provoquer le saignement. La mesure de la masse grasse/maigre nécessite une contention de l’animal d’environ 2 minutes, pouvant induire un stress modéré et transitoire. La mesure de la dépense energétique en cage métabolique nécessite que les souris soient en hébergement individuel pouvant induire un stress modéré qui sera atténué par une periode d'adaptation. Lors de l'exposition au froid la mesure de la température rectale s’effectue à l’aide d’une sonde de petit diamètre mais son insertion dans l'anus de la souris vigile peut être inconfortable pour l’animal et donc susceptible de générer un stress supplémentaire en plus de celui lié à la contention. L'exposition au froid dans les conditions que nous utiliserons induit un stress modéré et une baisse d'environ 2 °C de la température corporelle mais sans entrainer d'hypothermie sevère car les souris comme tous les animaux à sang chaud (homéothermes) sont capables de mettre en jeux différents processus pour maitenir leur température corporelle interne stable, dans certaines limites, indépendamment de la température extérieure. Nous surveillerons cependant ces souris pour détecter tous signes d'hypothermie sévère comme une perte du réflexe de redressement, une prostration ou une léthargie et une température réctale inférieure à 32°C.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour récuperer des organes et du sang pour différentes analyses moléculaires

Remplacement

Pour satisfaire au remplacement nous avons fait des études sur des cellules d'adipocytaires brunes et nous avons ainsi montré que Piezo1 est fortement exprimé dans ces adipocytes et nos expériences cellulaires suggèrent que Piezo1 contrôle la capacité des adipocytes thermogéniques à bruler des calories et pourrait donc impacter la prise de poids. Les mécanismes du developpement d'une prise de poids excessive lors de l’obésité sont complexes faisant intervenir un dialogue entre plusieurs organes. Il n’est pas possible pour l’instant d’utiliser des systèmes cellulaires reproduisant cette complexité biologique. Il nous est donc nécessaire maintenant d’étudier le rôle de cette proteine mécano-sensible Piezo1 dans les adipocytes bruns et beiges au sein d’un organisme entier car aucune méthode alternative n’existe.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction, une gestion éthique de l’élevage nous permettra de ne pas générer des animaux en excès. Les protocoles utilisés sont bien maitrisés par les participants au projet . Cette expertise permet de définir pour chaque procédure un nombre d’animaux minimum pour obtenir des résultats reproductibles et fiables. Nous avons utilisé un logiciel dédié pour calculer le nombre d'animaux minimum nécessaire permettant d'avoir un effet statistiquement signficatif en utilisant des données préliminaires qui permettent de prendre en compte la variabilité de l'effet étudié.

Raffinement

Nous avons généré des souris avec une invalidation de la protéine étudiée restreinte au adipocytes bruns et beiges pour limiter le risque d'apparition d'un phénotype dommageable. L'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un maximum de 4-5 souris/cage sur des portoirs ventilés. L’isolement de souris sera évité hormis pour un temps limité pour les études en cage métabolique et pour l'exposition au froid. L'environnement est amélioré pour minimiser le stress (igloo, tige de coton, L'observation quotidienne des animaux permettra d'identifier rapidement des souris souffrantes et de prendre les mesures correctives nécessaires en fonction des points limites définis adaptés à chaque procédure. Une grille d'observation avec conduite à tenir a été mise en place afin de prendre les mesures appropriées. Nous ne prévoyons pas de complications pour les animaux pour les différentes procédures mais dans l’éventualité d’apparitions de points limites définis, les mesures retenues seront mises en oeuvre (isolement de l'animale pour soins si blessure pas trop grave avec application de solutions antiseptiques, mise à mort si blessure importante ou signes de souffrance ou hypothermie ou perte de poids sévère).

Choix des espèces

L'utilisation de souris se justifie par le fait que cette espèce a beaucoup d'adipocytes bruns et beiges bruleurs de graisse qui contribuent à la dépense énergétique et à la capacité d'adaptation au froid. Les souris sont donc un modèle de choix pour identifier de nouvelles protéines régulant la fonction de ces adipocytes et la dépense énergétique. Cette espèce est aussi très utilisée dans les études sur le développement de l'obésité et de ses complications métaboliques car lorsque des souris adultes mais relativement jeunes (age 7-8 semaines) sont nourries avec un régime riche en lipide, elles deviennent rapidement obèses. Ce temps relativement court par rapport à d'autres espèces permet d'étudier facilement l'impact de modifications génétiques ou de composés pharmacologiques sur l'obésité. L'obésité des souris est assez proche de celle de l'homme permettant de tirer des informations pertinentes pour l'obésité humaine. Enfin, la souris est l'espèce de mammifère de choix pour réaliser des modifications génétiques (surexpression ou invalidation d'une protéine, globale ou ciblée dans un tissu). Les animaux seront étudiés au stade adulte (âge 12-23 semaines selon les procédures).

52 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Dès le sevrage, elles reçoivent un régime pauvre en protéines pendant cinq semaines pour modéliser la malnutrition infantile, avec contentions quotidiennes, frottis vaginaux et un test au glucose comprenant six heures de jeûne, une incision de la queue et plusieurs prélèvements de sang. Le projet cherche à savoir si l'énergie dépensée pour maintenir la température du corps module la réponse au manque de protéines. Les retombées annoncées pour les 150 millions d'enfants malnutris restent lointaines, la mise à mort servant à prélever muscle et graisses.

Objectifs

La malnutrition chez l’enfant est un problème majeur de santé publique dans le monde. Elle peut avoir des conséquences durables sur la croissance, le métabolisme (la manière dont le corps utilise l’énergie) et la puberté. Des études suggèrent que les garçons pourraient être plus touchés que les filles. Dans nos travaux précédents chez la souris, nous avons observé qu’un régime pauvre en protéines affecte davantage la croissance et le métabolisme des jeunes mâles, tandis qu’il retarde surtout la puberté chez les femelles. Ces résultats indiquent que, lorsqu’il manque de nutriments, l’organisme doit répartir son énergie entre plusieurs fonctions essentielles : grandir, maintenir son métabolisme et assurer la reproduction. Cette répartition semble différer selon le sexe. Nous avons montré que, chez les jeunes mâles, l’énergie consacrée à la reproduction joue un rôle limité dans ces effets. En revanche, une part importante de l’énergie pourrait être utilisée pour maintenir la température corporelle. L’objectif de ce projet est de comprendre si l’énergie associée au maintien de la température corporelle influence la façon dont l’organisme gère un manque de protéines, en particulier pendant la période juvénile, lorsque la croissance et la puberté demandent aussi beaucoup d’énergie. Nous mesurerons les effets d’un régime pauvre en protéines sur la croissance et sur certains paramètres du métabolisme, dans des conditions adaptées aux besoins physiologiques des souris. Ce projet permettra de mieux comprendre comment la nutrition au début de la vie peut influencer le risque ultérieur de troubles métaboliques et reproductifs, en tenant compte des différences entre sexes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment l’organisme répartit son énergie en cas de manque de protéines pendant l’enfance, notamment l’énergie utilisée pour maintenir la température du corps, et comment ces mécanismes peuvent différer entre les sexes. La malnutrition infantile touche malheureusement encore 150 millions d’enfants de moins de 5 ans à travers le monde. Ces connaissances aideront à mieux comprendre le fonctionnement du corps des jeunes en situation de malnutrition et pourraient, à plus long terme, contribuer à identifier de nouvelles pistes de prévention ou d’amélioration de la prise en charge en santé humaine.

Procédures

52 souris seront utilisées dans le projet. Tous les animaux seront nourris soit avec un régime contrôle, soit avec un régime pauvre en protéines (modèle de malnutrition infantile) pendant 5 semaines. Toutes les souris seront mesurées avec une règle chaque semaine sous anesthésie générale (3 minutes) puis pesées (< 1 min) entre 21 et 56 jours. Certaines souris subiront des contentions manuelles, tous les jours à partir de 21 jours (< 1 min par contention) pour détecter la puberté. Chez certaines femelles, un frottis vaginal sera réalisé quotidiennement à partir de cette détection et jusqu’à 56 jours (15 sec de contention). A 56 jours, les souris seront anesthésiées (3 minutes), et subiront un prélèvement sanguin (20 sec). Toutes les souris subiront un test permettant d’évaluer la réponse de chaque individu à un sucre (glucose), et seront donc soumises à : 6 heures de jeûne, introduction orale de glucose (10 sec), incision à la queue (1 sec), 7 prélèvements d’une petite goutte de sang et 3 prélèvements supplémentaires de quelques gouttes (durée totale de prélèvement < 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les pesées, mesures et frottis vaginaux hebdomadaires induisent un stress modéré lié à la contention, ainsi qu’un inconfort transitoire. Ces manipulations sont associées à un stress transitoire lié à la contention. Les prélèvements de petites gouttes de sang à la queue impliquent une incision d’environ 1 mm et un recueil répété des gouttes, provoquant une douleur légère à chaque point temporel. Le jeûne de 6 heures induit un stress modéré. L’introduction orale est source d’inconfort et peut entraîner un risque de fausse route ou d’irritation œsophagienne.

Devenir

L'ensemble des animaux mis en procédure seront mis à mort en vue du prélèvement des organes d'intérêt.

Remplacement

Cette recherche vise à comprendre comment l’organisme dans son ensemble réagit à différents régimes alimentaires, en particulier en cas de manque de protéines. À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode alternative (comme des cultures de cellules en laboratoire) capable de reproduire la complexité d’un organisme entier, où plusieurs organes interagissent en permanence pour réguler l’état nutritionnel. L’utilisation d’animaux est donc nécessaire pour répondre à ces questions. La souris a été choisie car elle constitue un modèle bien établi en recherche en nutrition et permet d’étudier de façon fiable les effets d’une carence en protéines dans des conditions proches de la physiologie. L’objectif étant d’analyser des mécanismes à l’échelle de plusieurs organes, ainsi qu’au niveau moléculaire, ce type d’étude ne peut pas être réalisé chez l’être humain.

Réduction

Le nombre d’animaux a été limité au strict nécessaire tout en garantissant des résultats fiables. Le nombre d’animaux par groupe (14 mâles et 12 femelles) a été déterminé grâce à un calcul statistique précis, afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant la validité scientifique des conclusions. Ce calcul s’appuie sur les paramètres les plus variables entre les individus. Les analyses permettront de comparer les effets de l’alimentation, du sexe et d’autres paramètres biologiques. Enfin, pour éviter d’avoir recours à de nouveaux animaux dans de futurs projets, différents organes pouvant être utiles à d’autres recherches (comme le muscle ou les graisses) seront prélevés à la fin de l’étude et conservés pour d’éventuelles analyses ultérieures.

Raffinement

L’étude ne débutera que chez des animaux suffisamment développés, pesant plus de 7 g au moment du sevrage. Leur croissance (taille et poids) sera suivie chaque semaine de manière individuelle. Pour faciliter l’alimentation des plus jeunes, la nourriture sera placée directement dans la litière afin qu’elle soit facilement accessible. La quantité de nourriture consommée sera également surveillée pour s’assurer de leur bon état général. Des seuils d’alerte seront définis à l’avance : si un animal les atteint, il sera retiré immédiatement de l’étude pour éviter toute souffrance. Le régime pauvre en protéines et les méthodes utilisées sont déjà bien maîtrisés au laboratoire et ne provoquent pas de signes de souffrance. Les mesures finales, ainsi que le prélèvement nécessaire, seront effectuées sous anesthésie pour garantir le bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris, un animal omnivore comme l’humain, est couramment utilisée pour les recherches en nutrition. Son microbiote est bien connu et de nombreux outils scientifiques existent déjà, ce qui en fait un modèle préclinique idéal pour comprendre le fonctionnement de l’organisme lors de changements alimentaires. Les animaux seront suivis pendant 5 semaines après le sevrage, c’est-à-dire de 3 à 8 semaines d’âge. Le but du projet est de comprendre comment la production de chaleur par l’organisme oriente la réponse à un manque de protéines dans l’alimentation. Il est important de commencer l’étude dès le sevrage, car c’est le stade où la croissance et la reproduction se mettent en place chez la souris.

40 souris juvéniles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès le sevrage, elles reçoivent un régime pauvre en protéines pendant cinq semaines, avec des jeûnes de six heures, des introductions orales de colorant et de glucose et des prélèvements sanguins, pour mesurer le transit intestinal. L'étude cherche à décrire l'effet de la malnutrition infantile sur l'intestin, en comparant mâles et femelles. Le porteur affirme que ce travail est "indispensable" et ne peut être mené chez l'humain.

Objectifs

La malnutrition chez l’enfant est un problème majeur dans le monde. Elle peut provoquer des troubles durables de la croissance, de la gestion de l’énergie et du développement. Des études récentes montrent que les garçons semblent plus touchés que les filles. L’intestin, qui absorbe les nutriments et joue un rôle central dans de nombreux processus du corps, est au cœur de cette problématique. Pourtant, on connaît encore mal la façon dont il réagit à une alimentation pauvre en protéines. Nos premiers résultats suggèrent que ce type de régime pourrait ralentir le passage des aliments dans l’intestin. Le but de ce projet est de mieux comprendre comment un régime pauvre en protéines influence le fonctionnement de l’intestin, essentiel à la digestion et à la communication entre les organes. Nous utiliserons une seule procédure expérimentale pour mesurer la vitesse de transit intestinal, qui est un indicateur important de la santé du système digestif. Ce projet aidera à mieux comprendre l’effet de l’alimentation sur l’intestin, en tenant compte des différences entre sexes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment le fonctionnement intestinal est affecté par la malnutrition protéique juvénile, en tenant compte du sexe. Cette description extensive de la motilité intestinale permettra à terme d’éclairer de nouvelles pistes de prévention ou d’intervention en santé humaine, où les enfants en malnutrition sont généralement sujets à des symptômes intestinaux associé à un mauvais fonctionnement intestinal (comme le transit).

Procédures

40 souris seront utilisées dans le projet. Tous les animaux seront nourris soit avec un régime contrôle, soit avec un régime pauvre en protéines (modèle de malnutrition infantile) pendant 5 semaines. Toutes les souris seront mesurées avec une règle chaque semaine sous anesthésie générale (3 minutes) puis pesées (< 1 min) entre 21 et 56 jours. A 56 jours, les souris seront anesthésiées (3 minutes), et subiront un prélèvement sanguin (20 sec). Pour étudier différents paramètres du transit intestinal : toutes les souris subiront à 48 jours une mise à jeun de 6h, suivie d’une introduction orale de colorant rouge (10 sec), à 52 jours une mise à jeun de 6h suivie d’une introduction orale de glucose (10 sec), puis 15 min plus tard d’une introduction orale de colorant rouge (10 sec), et à 56 jours une mise à jeun de 6h suivie d’une introduction orale de colorant rouge (10 sec).

Impact sur les animaux

Les pesées et mesures hebdomadaires induisent un stress modéré, ainsi qu’un inconfort transitoire. Le prélèvement sanguin est invasif et peut induire une légère douleur. Ces manipulations sont associées à un stress transitoire lié à la contention. Les trois introductions orales nécessitent un jeûne de 6 heures induisant un stress modéré. L’introduction orale est source d’inconfort et peut entraîner un risque de fausse route ou d’irritation œsophagienne. La récolte des féces est réalisée en cage individuelle, les animaux sont donc isolés pendant maximum 6h après l’introduction orale, induisant un stress modéré.

Devenir

L'ensemble des animaux mis en procédure seront mis à mort en vue de la mesure terminale des paramètres de transit, et du prélèvement des organes d’intérêt.

Remplacement

Pour comprendre comment le corps réagit à différents types d’alimentation, en particulier en cas de manque de protéines, il est nécessaire d’étudier l’organisme dans son ensemble. Aucun modèle en laboratoire (sans animal) ne permet aujourd’hui de reproduire la complexité du corps humain, où plusieurs organes communiquent entre eux et influencent ensemble l’état nutritionnel. C’est pour cette raison que l’utilisation d’animaux est indispensable dans ce projet. La souris a été choisie car elle représente un bon modèle pour étudier les effets d’une alimentation pauvre en protéines dans des conditions proches de la physiologie humaine. L’objectif est de mieux comprendre ce qui se passe dans l’intestin, à la fois à l’échelle de l’organe et au niveau moléculaire. Ce type d’étude ne peut pas être réalisé chez l’humain.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été limité autant que possible tout en permettant d’obtenir des résultats fiables. Nous avons choisi d’inclure 10 animaux par groupe, sur la base d’un calcul statistique garantissant la solidité des conclusions. Ce calcul s’appuie sur la mesure la plus variable que nous connaissons déjà : la longueur de l’intestin, qui réagit de manière comparable chez les mâles et les femelles lorsqu’ils reçoivent un régime pauvre en protéines. Les analyses prévues permettront de comparer les effets du régime alimentaire et du sexe. Pour éviter d’utiliser davantage d’animaux dans de futurs projets, tous les organes qui pourraient être utiles à d’autres recherches (comme certains tissus liés au métabolisme ou au système nerveux) seront prélevés à la fin de l’étude et conservés pour d’éventuelles analyses ultérieures.

Raffinement

L’étude commencera uniquement avec des animaux suffisamment développés, pesant plus de 7 g au moment du sevrage. Leur croissance (taille et poids) sera suivie chaque semaine, et la nourriture sera mise à portée des plus jeunes pour qu’ils puissent y accéder facilement. Nous surveillerons aussi leur prise alimentaire afin de vérifier qu’ils s’alimentent correctement. Des seuils d’alerte seront définis à l’avance : si un animal les atteint, il sera retiré immédiatement de l’étude pour éviter toute souffrance. Le régime pauvre en protéines et les méthodes utilisées sont déjà bien maîtrisés au laboratoire et ne provoquent pas de signes de souffrance. Les mesures finales, ainsi que le prélèvement nécessaire, seront effectués sous anesthésie pour garantir le bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris, un animal omnivore comme l’humain, est couramment utilisée pour les recherches en nutrition. Son microbiote est bien connu et de nombreux outils scientifiques existent déjà, ce qui en fait un modèle préclinique idéal pour étudier le fonctionnement de l’intestin lors de changements alimentaires. Les animaux seront suivis pendant 5 semaines après le sevrage, c’est-à-dire de 3 à 8 semaines d’âge. Le but du projet est de comprendre comment un manque de protéines dans l’alimentation influence l’intestin durant la période juvénile. Il est important de commencer l’étude dès le sevrage, car l’intestin joue un rôle essentiel dans l’absorption des nutriments dès les premiers stades de la vie et peut ainsi influencer de nombreux aspects du développement, comme la croissance.

2 232 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, réparties en groupes d'âge de deux à dix-neuf mois. Chacune subit gavages, injections dans le muscle de la cuisse, tests d'effort et prélèvements sanguins, certaines étant transportées entre deux établissements, pour étudier le lien entre la graisse intramusculaire et le métabolisme du muscle. Les retombées pour la santé humaine, fragilité musculaire liée à l'âge ou à l'obésité, sont annoncées "à plus long terme". Le porteur reconnaît qu'aucun calcul de puissance n'a été possible et que l'effectif repose sur ses habitudes expérimentales.

Objectifs

L'augmentation du nombre de personnes âgées et/ou obèses constitue un enjeu majeur de santé publique. Ces 2 situations ont des conséquences (i) individuelles, favorisant la fragilité et la dépendance et (ii) sociétales, entrainant une augmentation des dépenses de santé. De plus, ce sont des facteurs de risque de pathologies telles que le diabète de type 2 (DT2), lié à des désordres du métabolisme glucidique, et la sarcopénie, liée à une diminution de la masse et de la force musculaire. Le vieillissement et l’obésité représentent deux contextes dans lesquels il y a émergence, au sein du muscle squelettique, d’un tissu adipeux intramusculaire (IMAT) dont les cellules matures sont les adipocytes intramusculaires. Ce tissu a été bien documenté dans les muscles squelettiques des animaux de rente, puisqu’il donne son goût à la viande, mais il n’existe que peu de données chez l’Homme. Toutefois, des données corrélatives semblent indiquer que la présence chronique d’IMAT pourrait participer à la perte de sensibilité à l’insuline musculaire participant à l’étiologie du DT2. Nos données préliminaires chez la souris sont encourageantes et vont dans le même sens. D’un autre côté des données observationnelles dans différents modèles murins de lésions musculaires, révèlent une émergence transitoire d’IMAT qui pourrait participer à la régénération musculaire nécessaire au maintien de la masse et de la force de ce tissu. C’est l’hypothèse que nous avançons. Il semble donc que l’IMAT via son abondance, sa cinétique d’apparition/disparition et/ou son phénotype soit un acteur important des fonctions métabolique et régénérative du muscle squelettique. Ce projet a comme objectif principal de montrer le lien causal entre (i) IMAT et désordres métaboliques glucidiques, principalement musculaires et (ii) IMAT et régénération musculaire ; ceci à l’aide d’un modèle murin transgénique dans lequel l’ablation spécifique et contrôlée des adipocytes intramusculaires, constituant l’IMAT, est possible. Afin d’avoir une étude la plus complète possible et étant donné le dymorphisme sexuel existant à la fois dans la composition corporelle (i.e. masses grasse et maigre), la régulation des métabolismes ou les capacités régénératives, des animaux femelles et mâles seront inclus dans cette étude. Ils seront étudiés à des âges physiologiques différents, afin de reproduire les effets de l’avancée en âge chez l’Homme. CE PROJET EST MULTISITE, IL SERA REALISE DANS 2 ETABLISSEMENTS UTILISATEURS.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra, pour la première fois, de mettre en évidence les effets d’un dépôt adipeux ectopique méconnu, l’IMAT sur l’homéostasie du muscle squelettique en fonction du sexe et de l’âge. Le muscle squelettique représente, en masse, le tissu le plus abondant de l’organisme et joue un rôle majeur dans certaines fonctions clés telles que la locomotion mais aussi dans la gestion de l’énergie, i.e. le métabolisme. Il devrait permettre, d’une part, d’obtenir des données nouvelles sur le contenu lipidique et le phénotype de l’IMAT (i.e. hypertrophie/ hyperplasie adipocytaire, inflammation, sécrétions, etc…), son évolution avec l’âge et/ou l’obésité mais également avec le sexe des individus. D’autre part, grâce à l’originalité du modèle de souris double transgénique permettant une diminution partielle ou totale de l’IMAT, il devrait permettre d’établir un lien causal (délétère ou bénéfique) entre ce tissu et les fonctions musculaires étudiées (i.e. métabolisme glucidique et régénération) selon le sexe, l’âge, le régime alimentaire et/ou le statut régénératif. Ce projet pourrait en particulier faire émerger des molécules actives (lipides, cytokines, etc…) explicatives des effets observés lors de l’obésité, du vieillissement ou bien de la régénération. A plus long terme, les connaissances générées par cette étude pourraient être exploitées en santé humaine puisque de nombreuses conditions pathologiques musculaires aiguës ou dégénératives sont caractérisées par un dépôt important d’IMAT. Nous anticipons que ces travaux pourraient donc avoir des répercussions sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques du patient en situation de fragilité musculaire résultant de l’avancée en âge, d’obésité ou même de myopathies.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur la partie 1 du projet s’attellera à caractériser les désordres métaboliques glucidiques et l’IMAT en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique comprenant chacun 1 injection intrapéritonéale et des prélèvements sanguins caudaux (20 sec à 2 min/prélèvement, 130 μL de volume cumulé maximal). La partie 2 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin de lésion musculaire induite par l’injection intramusculaire de glycérol ou de cardiotoxine, facilitant le développement d’IMAT. Les animaux seront soumis à 1 injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Suivi, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 3 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, d’une injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Puis, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 4 du projet concernera le lien causal entre la présence d’IMAT et la régénération musculaire dans un modèle de souris double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, de 2 injections consécutives séparées de 4 jours dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). La fonction musculaire d’une partie des animaux sera ensuite évaluée par différents tests non invasifs : agrippement, cadre inversé et endurance sur tapis roulant. Dans le second établissement utilisateur, des tests terminaux d’évaluation du métabolisme utilisant des radioélements seront réalisés à la place des tests classiques afin d’affiner la caractérisation des désordres métaboliques en lien avec l’IMAT et utilisant des radioélements seront réalisés. Ces tests comprennent 1 injection intrapéritonéale et deux prélèvements sanguins à la queue (20 sec à 2 min/prélèvement, 10 μL de volume cumulé maximal).

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables pourraient être observés dans cette étude : 1- Stress lié à la contention lors des gavages et lors des injections. La durée de cet effet indésirable sera réduit au minimum de part l’expérience de l’expérimentateur ; 2- Stress lié à l'isolement, lors des expériences de mesure de la composition corporelle, de la force musculaire ou lors du test d'endurance ; 3- Inconfort voire douleur lors du réveil des animaux anesthésiés pour la réalisation des injections intramusculaires ou pour leur identification par tatouage. Dans premières heures suivant la réalisation de l'injection intramusculaire, une mobilité réduite pourra être observée. Le geste chirurgical étant réalisé le matin et cet état de mobilité réduite n’étant que passager, il n’entrave pas la prise alimentaire la nuit suivante ; 4-Inconfort engendré par l’obésité résultant de la mise en régime enrichi en lipides. Cet inconfort pourrait durer plusieurs semaines ; 5- Stress lié au transport entre les deux établissements utilisateurs (5 à 10 min max).

Devenir

Comme indiqué dans les pagraphes concernant chacune des procédures expérimentales, les animaux seront nécropsiés en fin de procédure pour récolter des tissus d'intérêt. Ils seront mis à mort en fonction des groupes d'âge inclus dans les procédures: à 2-3 mois, à 6-7 mois, 12-13 mois ou à 18-19 mois.

Remplacement

A l’aide d’expériences réalisées in vitro avec des cellules humaines nous avons précédemment publié que les sécrétions des adipocytes musculaires obtenus en culture étaient capables de diminuer la réponse à l’insuline des cellules musculaires également obtenues en culture, appuyant l’hypothèse que l’IMAT pourrait être un régulateur du métabolisme glucidique musculaire et plus particulièremet des perturbations de ce métabolisme. Par ailleurs, nous avons également mis en évidence plus recemment des modifications du phénotype des adipocytes musculaires obtenues in vitro en fonction de l’age des volontaires dont étaient issues les biopsies musculaires. Ce sont ces données qui nous ont conduits à nous tourner vers l’animal. En effet, il est bien connu que la culture à a ses limites qui sont clairement ici (1) que les cellules (adipocytes et myocytes) n’arrivent jamais au stade terminal de différenciation donc sont des formes immatures des cellules observées in vivo et (2) qu’il est impossible dans un tel modèle d’imaginer l’impact sur le muscle en entier et sur l’organisme. Il est cependant évident qu’en fonction des résultats obtenus dans ce projet des expériences complémentaires sur des points mécanistiques précis seront réalisées sur des cultures primaires humaines et/ou murines qui permettent de par la capacité de prolifération des cellules de réaliser un certain nombre d’analyses.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales, des expériences préliminaires et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en oeuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en oeuvre seront des tests pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, un test différent pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, un autre test à une ou deux voies pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans la Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés dans les cages. Un suivi quotidien sera réalisé soit par le personnel de la zootechnie soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permettra une habituation à l'Homme et, le stress ainsi diminué, devrait diminuer la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées. Le réveil de l'animal, après injection musculaire, se fera dans une cage posée sur un tapis chauffant ; du collyre sera appliqué sur l'oeil de l'animal qui aura été injecté. L'observation et la surveillance des animaux permettent d’appliquer des points limites précis et des critères d’arrêt des souffrances. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages d'origine des animaux sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettent un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est pré-déterminé et évite la rencontre avec le public.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux de différents âges seront inclus dans les procédures : 2-3 mois, 6-7 mois, 12-13 mois ou 18-19 mois. L'utilisation de ces différents groupes d'âge permettra, dans certaines procédures, d'étudier la cinétique d’évolution « naturelle » de certains paramètres (i.e. régulation du métabolisme, composition corporelle, développement du tissu adipeux intramusculaire, etc....) au cours d’une diète normale ou riche en graisses. Dans d'autres procédures, l'utilisation des animaux de différents groupes d'âge permettra de mettre en évidence l'impact du vieillissement sur certains processus (i.e. processus d'installation du diabète et rôle du tissu adipeux intramusculaire, processus régénératifs musculaires, etc ...). Les âges des souris de chaque procédure ont été choisis en fonction de résultats d’expériences préliminaires du laboratoire et de données rapportées dans la littérature.

Scarifiées à la queue pour des prélèvements répétés de gouttes de sang, 1 344 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent des mutations reproduisant un diabète ou des tumeurs du pancréas et reçoivent des injections activant la mutation, des gavages, un régime gras et des tests de glycémie répétés. Certains fœtus sont traités à travers la mère gestante. Le porteur qualifie ces souris de "modèles uniques au monde" et affirme que la mesure de la glycémie ne peut se faire qu'in vivo.

Objectifs

Récemment, une nouvelle mutation d’une protéine pancréatique a été décrite dans plusieurs familles de patients. Cette mutation cause un diabète chez les hommes, et des tumeurs du pancréas chez les femmes. Pour le moment, son mode d’action n’est pas connu. Les hommes touchés développent un diabète particulier différent du diabète de type 1 auto-immun et du diabète de type 2 lié à l’obésité. Les femmes présentent quant à elles des tumeurs particulières du pancréas issues des cellules productrices d’insuline, entrainant une sécrétion excessive et incontrôlée d’insuline qui provoque des hypoglycémies répétées (baisse anormale du sucre dans le sang). L’objectif de ce projet est donc de rechercher les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de ces troubles du pancréas. A plus long terme, ces recherches devraient permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et ainsi de proposer de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

Cette étude présente un grand intérêt pour le traitement à la fois du diabète et du cancer du pancréas puisque les mutations de notre protéine d’intérêt ont été décrites dans ces deux pathologies. Sur le plan clinique, nous prévoyons des retombées potentielles à moyen et à plus long terme. En effet, le diabète est une maladie métabolique complexe qui implique souvent plusieurs gènes. Cette hétérogénéité rend difficile son étude. Il existe aussi certaines autres formes de diabète qui n’impliquent qu’un seul gène. Elles sont présentes soit chez des nouveau-nés, soit chez de jeunes adultes. Dans ce contexte, il est plus facile de comprendre les mécanismes à l’origine de la maladie et ainsi de progresser vers des voies thérapeutiques. C’est le cas du facteur que nous étudions au laboratoire, qui est produit dans le pancréas. Une seule mutation du gène codant pour ce facteur suffit à déclencher un diabète. Nous pensons donc que notre étude chez la souris pourra permettre non seulement de décrire une nouvelle forme de diabète monogénique, mais aussi d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant d’élaborer de nouveaux traitements. Le facteur que nous étudions est également associé à l’apparition de tumeurs pancréatiques chez des patients. Son rôle biologique reste toutefois encore mal compris à ce jour. Notre projet permettra d’élucider son implication dans le cancer pancréatique qui représente une cause de mortalité importante.

Procédures

Dans ce projet, nous utiliserons des souris qui portent des mutations représentatives de celles portées par des patients qui présentent soit un diabète, soit des tumeurs du pancréas. Ces souris seront examinées à différents stades de la vie, allant de la vie fœtale à des stades âgés. Certains des animaux utilisés nécessitent l’injection d’un composé pour activer la mutation étudiée. Les animaux adultes vigiles (éveillés) porteurs de cette mutation inductible, recevront une ou cinq administrations de la substance par injection soit une (ou trois) administrations par voie orale, soit une administration par application d’une solution sur la peau (1 ou 3 fois) (durée de chaque geste inf à 30sec). Des fœtus seront également traités en administrant le composé chez la mère gestante : soit par gavage (1 à 2 doses), soit par injection (1 ou 2 fois) soit dans l’alimentation pendant une semaine (durée de chaque geste inf à 30 sec). Ces mêmes animaux seront ensuite étudiés grâce à des expériences de mesure de la régulation de la glycémie. Pour cela, ils auront un prélèvement, puis ils seront placés à jeun pendant 16 heures, et auront un second prélèvement (durée de chaque prélèvement inf à 10sec). Ils recevront une injection (10 sec) suivie de 5 prélèvements d’une goutte de sang durant les 2h suivantes. Trois jours plus tard, ces gestes seront répétés sur ces mêmes souris. Dans le cadre d’une étude longtudinale, ce lot de souris pourra être soumis à ce type d’injection puis prélèvement au maximum 3 fois lors de ces 2 tests (durée de chaque prélèvement inf à 10sec). Enfin, certaines souris seront exposées à un régime riche en graisse pendant des durées allant de 14 jours à 3 mois. Ces mêmes animaux seront ensuite étudiés grâce à des expériences de mesure de la glycémie, impliquants une injection et 7 prélèvements d’une goutte de sang, Trois jours plus tard, ces gestes seront répétés sur ces mêmes souris (durée de chaque prélèvement inf à 10sec).

Impact sur les animaux

Les modèles générés pour l’étude n’ont pas de phénotype dommageable. Les nuisances attendues sont celles liées aux différentes injections. Ces nuisances correspondent à l’introduction d’une aiguille et donc à des douleurs associées à une injection classique. Celles-ci sont de courte durée, et ces différentes injections ne provoquent aucun autre effet secondaire à l’exception de la nuisance de l’injection. Les souris exposées à régime particulier (riche en graisse) peuvent présenter une prise de poids sans conséquence sur le bien-être des animaux. Après injection, nous nous attendons à observer une légère hyperglycémie (élévation de la glycémie) à la fois chez les mâles et les femelles lorsque des tests métaboliques seront effectués. Sur la base de nos premiers résultats, l’hyperglycémie devrait être moindre chez les femelles. Néanmoins, cette hyperglycémie modérée ne sera probablement que passagère, et une glycémie normale sera rétablie après quelques heures. Pour les mesures de glycémie, le premier prélèvement étant réalisé après une légère scarification de la queue et les suivants après le retrait de la croûte, ce geste entraînera une douleur légère et de courte durée. Cela prend 10 à 20 secondes maximum répétées 5 fois sur 120 minutes, les temps de l’expérience.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Les souris que nous utilisons sont des modèles uniques au monde. Les paramètres physiologiques, c’est à dire les mesures de glycémie et d’insulinémie ne peuvent être effectuées que in vivo. De plus, il existe un dialogue entre les différents organes de la souris. Cette interaction entre les différents organes impliqués dans le métabolisme glucidique de la souris -le foie, le muscle et le tissu adipeux- ne peut être analysée que dans un organisme entier vivant. Néanmoins, pour limiter les investigations in vivo, un maximum d’informations proviendra d’analyses sur des tissus fixés et d’analyses bio-informatiques in silico à partir de prélèvement post-mortem. Nous effectuerons également des expériences in vitro quand cela est possible pour limiter les expériences in vivo. Par exemple, la culture d’îlots de Langerhans prélevés sur des souris post-mortem, un animal pouvant générer environ 100 îlots qui sont ensuite stimulés in vitro..

Réduction

Nos modèles représentent des modèles uniques au monde pour étudier les pathologies trouvées chez l’homme. En effet, ce sont le seul moyen d’étudier les effets d’une mutation, qui chez l’homme, déclenche un diabète ou un insulinome. Les stratégies d’accouplement ont été optimisées afin de réduire le nombre d’animaux.. D’après la littérature, nous avons défini la taille de nos groupes pour permettre des résultats concluants et faire des analyses statistiques. Pour réduire le nombre de souris utilisées, une étude pilote sera réalisée pour certains modèles de souris avant de définir les conditions optimales. Une approche Go/No Go sera ensuite appliquée afin de déterminer si les inductions pour activer la mutation étudiée se feront au stade fœtal ou adulte. Cela signifie que nous ferons un choix de la méthodologie utilisée selon les résultats préliminaires obtenus. Si nous constatons que l’activation de la mutation est satisfaisante pendant le développement foetal, nous choisirons plutôt cette méthode et nous n’activerons pas la mutation au stade adulte.

Raffinement

En accord avec les recommandations internationales dans le domaine du diabète et de la cancérologie, les animaux seront suivis régulièrement afin d'assurer leur bien-être et les expérimentations seront arrêtées avant la souffrance des animaux. Une grille de score sera également mise en place. Dans le cadre des procédures, toutes les manipulations seront réalisés pour garantir le meilleur confort à l’animal. En particulier, lors des expériences impliquant des injections, les animaux seront observés de façon quotidienne, de manière à surveiller l'état général de la souris. Pour rappel, nous n’attendons pas de nuisance particulière, hormis une légère hyperglycémie chez les mâles après injection. De plus, les animaux aux stades fœtal et nouveau-né seront utilisés uniquement pour des prélèvements d’organes après injection. Aux stades plus tardifs, les tests réalisés ne nécessitent pas d’utiliser des analgésiques pour ces tests.

Choix des espèces

Nos modèles murins sont uniques et la souris est le seul organisme existant qui puisse permettre d’étudier l’effet de mutations de notre protéine d’intérêt. Etant donné son cycle de reproduction et sa parenté biologique avec l’homme, la souris constitue un modèle de choix pour mener nos expériences. De plus, il est accepté et validé par la communauté internationale que la souris est pleinement appropriée pour les études du métabolisme que nous proposons. Les stades de développement étudiés sont les suivants : fœtus (E18,5), 1 mois, adultes de 3 mois, 6 mois, 12 mois, 18 mois, et 24 mois. En effet, on sait que notre protéine d’intérêt peut jouer un rôle dans la différenciation des cellules pancréatiques pendant la vie fœtale, mais aussi sur leur prolifération pendant la période postnatale jusqu’à un mois.. Nous souhaitons donc déterminer si la mutation étudiée affecte ces cellules à ces stades. Plus tard, cette mutation pourrait déclencher un diabète ou une tumeur pancréatique, selon le stade de la vie de la souris. En effet, on sait que ce type de phénotype est très dépendant du métabolisme et de l’âge de la souris). C’est pour cette raison qu’il est impératif d’étudier le phénotype des souris à ces différents stades de la vie adulte.