Système endocrinien

Pour mesurer si une consommation régulière d'édulcorants altère la perception du glucose, 208 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Pendant quinze semaines, elles sont exposées à des édulcorants, soumises à des jeûnes répétés, à des tests au gustomètre, à des prélèvements de sang à la queue et à l'application linguale d'un lentivirus sous anesthésie jusqu'à six fois. Les animaux subissent un stress chronique lié à l'isolement et à chaque mise à jeun pouvant durer quinze heures, tout écart clinique entraînant leur retrait puis leur mise à mort. Le projet revendique une portée pour les politiques publiques sur l'usage des édulcorants, un bénéfice large au regard d'une question posée sur la seule perception gustative du sucre.

Objectifs

Dans notre société moderne, la nourriture riche en sucres ajoutés est présente partout et facilement accessible. L’attrait pour cette nourriture fait qu’elle est souvent consommée en absence de besoin énergétique, contribuant à l’émergence dans le monde de l’obésité et du diabète. Pour contrer ce phénomène, les sucres ajoutés sont remplacés par des édulcorants, qui produisent une perception sucrée sans apporter de calories. Cependant, les effets de la consommation régulière des édulcorants sur la santé humaine ne sont pas bien compris. Notamment, déterminer si les édulcorants produisent un goût sucré sans induire de complication métabolique, même sans apporter de calories, est l’une des problématiques les plus controversées dans la littérature. Chez les mammifères, la perception du goût sucré est médiée par un récepteur qui lie entre autres les sucres et les édulcorants. Cependant, il a été montré au niveau du système gustatif que pour le sucre simple glucose spécifiquement, ce récepteur n’est pas la seule voie de détection. Dans le corps, différents senseurs du glucose ont été caractérisés et leur rôle dans la détection et la régulation du métabolisme de ce nutriment a été défini. Récemment, la présence de ces mêmes senseurs spécifiques du glucose a été décrite dans le système gustatif, où ils sembleraient jouer un rôle dans l’intégration du signal sucré avec la prise alimentaire et/ou les réponses métaboliques. Cependant, l’impact de la consommation régulière des édulcorants sur les voies gustatives impliquant ces senseurs spécifiques au glucose n’est pas connu. Les objectifs du projet sont donc de vérifier si les voies gustatives mettant en jeu ces senseurs du glucose sont impactées par une consommation régulière d’édulcorants à l’âge adulte, amenant à une altération de la perception du glucose et du métabolisme glucidique.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mieux comprendre les effets de la consommation régulière d’édulcorants sur la perception gustative et la santé métabolique. Cette étude sera l'une des premières à analyser le rôle que jouent les senseurs du glucose présents dans le système du goût dans les troubles comportementaux induits par une exposition chronique aux édulcorants à l'âge adulte. Dans l'ensemble, ce projet contribuera à établir une base scientifique qui informe sur l'utilisation des édulcorants, afin d'alimenter les décisions en matière de politiques publiques.

Procédures

Exposition aux édulcorants ou saccharose en plus de la nourriture habituelle et de l’eau : dose journalière admissible fixée par l’Union Européenne pendant 15 semaines ; Mise à jeun alimentaire de 12h à 15h en phase nocturne : 7 fois par souris ; Entrainements et tests dans le gustomètre : 20 minutes – 7 fois par souris ; Mise à jeun alimentaire de 5h en phase diurne : 7 fois par souris ; Prélèvements de sang à la queue sur animal vigile : 1 minute – 2 x 5 par souris (car deux tests) ; Administration linguale de lentivirus sous anesthésie générale gazeuse : 10 minutes maximum – 6 fois par animal concerné ; Injections intrapéritonéales : 30 secondes – 3 par animal

Impact sur les animaux

Les effets sur les animaux seront : - Une perturbation de la tolérance au glucose lors de l’exposition aux édulcorants/sucres. - Un stress chronique pour les animaux individualisés (procédures 1 et 3), qui sera atténué par un enrichissement supplémentaire dans la cage d’hébergement. - Un stress (maximum une demi-journée) au réveil de l’anesthésie générale effectuée pour l’application sur la langue du lentivirus induisant une diminution d’expression de la protéine d’intérêt. - Une douleur locale et passagère (maximum 5 minutes) lors des injections systémiques ainsi que lors de prélèvements sanguins. - Un stress chronique et une perte de poids à chaque mise à jeun alimentaire des animaux lors des tests comportementaux (maximum 15 heures chacune).

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort par injection d’un euthanasiant, puis les tissus seront prélevés rapidement après arrêt cardiaque pour analyse.

Remplacement

L’étude du rôle précis des senseurs linguaux du glucose dans les modifications comportementales induites par la consommation d’édulcorants ne peut être réalisée que sur des animaux vivants. La motivation à consommer des aliments ainsi que la régulation du métabolisme impliquent une communication entre différents organes. Il n’existe pas actuellement de modèle de substitution permettant d’étudier les dialogues inter-organes. Ce projet sera donc réalisé chez la souris, modèle de référence pour les études métaboliques et de physiologie alimentaire.

Réduction

Le nombre optimal d’animaux, c’est-à-dire nécessaire à l’obtention de résultats significatifs sans être trop élevé, est calculé grâce à des analyses de puissance statistique. Les tests statistiques de type t-test ou ANOVA et tests de comparaison à posteriori seront utilisés pour analyser les différences significatives entre les groupes expérimentaux. Lorsque cela est possible, les mêmes animaux sont utilisés pour plusieurs tests comportementaux, après une période de repos et de récupération.

Raffinement

Dès la réception des animaux à l’animalerie, tout est mis en place pour réduire leur stress et inconfort. A leur arrivée, une semaine d’acclimatation au nouvel environnement et personnel, sans expérimentation, sera observée. Les animaux individualisés (procédures 1 et 3) seront élevés en environnement enrichi grâce à un dôme de nidation, un bâton et un carré de coton par cage. Un suivi quotidien par le personnel compétent sera effectué. Les animaux seront manipulés régulièrement par les expérimentateurs dans le but de réduire le stress. Le poids corporel et la prise alimentaire seront également contrôlés trois fois par semaine pour s’assurer de l’état de santé des animaux. Les différentes manipulations seront réalisées par du personnel compétent, conformément à la législation. Lors des prélèvements de sang, la douleur des animaux sera diminuée grâce à l’application locale d’un analgésique. A la fin des expériences, les animaux seront mis à mort. Tout au long des expérimentations, si un animal présente un comportement anormal (perte de poids, prostration, piloérection, activité ralentie, …), il sera surveillé avec attention et retiré de l’étude. Si son état clinique ne s’améliore pas, il sera mis à mort selon le tableau des points limites mis en place avec la SBEA de l’établissement.

Choix des espèces

Les résultats préliminaires obtenus ainsi que les données bibliographiques dans ce domaine d’étude sont pour la grande majorité réalisés avec le modèle souris. Afin d’éviter la duplication inutile de travaux déjà publiés, et de pouvoir effectuer des comparaisons avec les travaux précédents, il est important de continuer sur des modèles similaires. Des souris seront donc utilisées dans ce projet de recherche. Des souris âgées de 9 semaines seront utilisées. Cela correspond au stade de l’état jeune adulte, la maturité sexuelle est atteinte par les deux sexes. Il n’y aura pas d’effet confondant sur les résultats dû au développement du système du goût ou du système nerveux central lors de la phase juvénile et adolescente de la souris.

Soumises à une pression mécanique et à une source de chaleur provoquant des réactions réflexes, à des tests d'anxiété et à un isolement de 72 heures, 528 souris vont toutes être tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est génétiquement modifié pour ne pas exprimer une enzyme dont le rôle dans le cerveau reste inconnu. Les prélèvements finaux se font sous anesthésie générale, après une injection d'analgésique. Le bénéfice avancé se limite à ouvrir de nouvelles voies de recherche.

Objectifs

Nos molécules d'intérêt coupent certains lipides présents dans les membranes des cellules. Chez l’humain, il existe plusieurs gènes codant pour différentes formes des molécules auxquelles nous nous intéressons. Elles participent à de nombreux processus biologiques, même si leurs rôles précis ne sont pas encore entièrement compris. Elles sont aussi intéressantes pour la recherche médicale, car elles jouent un rôle important dans la production de molécules qui régulent l’inflammation. Notre protéine d'intêret, une forme particulière de ces enzymes, est surtout présente dans le cœur, les muscles et certaines cellules du système immunitaire. Elle contribue notamment à réguler l’inflammation en favorisant la production de molécules pro-inflammatoires. Elle intervient également dans le fonctionnement du système cardiovasculaire, en influençant le tonus des vaisseaux et en participant à des processus comme l’athérosclérose ou l’infarctus. Elle a aussi été impliquée dans certains aspects du métabolisme, comme la régulation du glucose et la résistance à l’insuline. Cependant, toutes ces fonctions ont été étudiées en périphérie, c’est-à-dire en dehors du cerveau, et on ne sait pas encore ce que fait notre molécule d'intêret dans le cerveau. Des études récentes ont montré que chez la souris, son expression est limitée à deux zones cérébrales particulières à l'interface sang-cerveau. Le projet que nous souhaitons mener vise à étudier les conséquences comportementales d’une déficience en la molécule d'intêret dans le cerveau.

Bénéfices attendus

Nos résultats permettront de révéler des rôles cérébraux jusqu'ici inconnus pour la molécule d'intêret et permettraient d'ouvrir de nouvelles voies de recherche.

Procédures

176 souris maximum seront exposées à un stress transitoire lié à: l’isolement temporaire (1 fois chacune, 30 min max), l'anxiété (2 fois chacune, 30 min la 1ere fois, 8 min la seconde). 176 souris maximum seront hébergées individuellement (avec stimuli auditifs et olfactifs) transitoirement (72h chacune, 1x). 176 souris maximum seront soumises à une douleur mécanique et thermique qui provoqueront un inconfort momentané et des réactions réflexes (2x20 min par souris) . D’autres facteurs de stress incluent les transferts, les manipulations répétées et le changement d’environnement. A la fin des procédures, toutes les souris recevront une première injection (1x par souris, 10 sec) 15 mn avant une seconde (1 fois par souris, 10 sec). Elles subiront ensuite des prélèvements sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

176 souris max seront exposées à: - l’isolement temporaire (1 fois chacune, 30 min max) qui entrainera un stress léger et transitoire - l'anxiété pour l'open-field (1 fois chacune, 30 min) qui entrainera un stress léger et transitoire - l'Y-maze (1 fois chacune, 8 min) qui entrainera un stress léger et transitoire 176 souris max seront exposées à: - l'isolement temporaire (72h chacune, 1x) qui entrainera un stress léger et transitoire. 176 souris max les souris subiront: - une pression mécanique (20 min par souris) entrainant une douleur mécanique évitable - une chaleur provoquant un inconfort momentané et des réactions réflexes (20 min par souris). D’autres facteurs de stress incluent les transferts, les manipulations répétées et le changement d’environnement. A la fin des procédures, les souris recevront une injection d'analgésique (1x par souris, 10 sec) 15 mn avant l'induction de l'anesthésie par une injection (1 fois par souris, 10 sec). Les contentions nécessaires entraîneront un léger stress et les injections une faible douleur de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder à des prélèvements biologiques ou des analyses histologiques.

Remplacement

Les phénomènes étudiés dans ce projet, tels que la sociabilité, la cognition, le métabolisme et la douleur, nécessitent l’observation de comportements complexes intégrant le système nerveux central et périphérique, ce qui ne peut être reproduit de manière fiable par des modèles in vitro ou informatiques. Par conséquent, l’utilisation de souris est indispensable pour obtenir des données physiologiquement pertinentes et transposables.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé à l’aide d'un logiciel de calcul de puissance statistique. Les critères représentent un compromis raisonné entre robustesse statistique, faisabilité expérimentale et respect du principe de Réduction, conformément aux recommandations méthodologiques en expérimentation animale.

Raffinement

Des mesures de raffinement seront mises en place pour minimiser la souffrance et le stress des souris : - Habituation préalable à la salle, au matériel et aux manipulations avant les tests. - Manipulations douces et standardisées par du personnel expérimenté. - Durée d’isolement minimale dans les cages métaboliques et les tests individuels. - Surveillance attentive des animaux pendant tous les tests, avec critères d’arrêt définis pour toute détresse. - Espacement suffisant entre les tests stressants ou nociceptifs pour permettre la récupération. Une grille de score a été établie afin de définir des points limites adaptés, des mesures correctives à mettre en place et des critères d'arrêt de souffrance en cas de besoin.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies car elles permettent d’étudier des fonctions complexes intégrant le système nerveux central et périphérique, comme la cognition, la sociabilité, le métabolisme et la douleur, dans un organisme intact. Leur physiologie et leur génétique sont bien caractérisées, ce qui rend les résultats transposables et comparables à d’autres études. Les alternatives in vitro ou informatiques ne permettent pas de reproduire ces interactions complexes entre tissus et organes, ni d’évaluer de manière fiable les comportements ou la nociception. Les expériences seront réalisées sur des souris âgées de 8 à 10 semaines, correspondant à l’âge adulte jeune où les systèmes nerveux, métabolique et sensoriel sont pleinement développés. Cet âge permet d’obtenir des données stables et comparables tout en évitant les variations liées à la croissance ou au vieillissement.

8 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le protocole impose des régimes alimentaires particuliers ou des traitements pendant quatorze semaines, avec injections, gavages et prélèvements de sang répétés, pour étudier le lien entre métabolisme et inflammation. Une partie porte une inflammation chronique qui réduit leur survie à environ six mois, avec troubles cardiaques et respiratoires. Le porteur affirme que les cultures de cellules ne permettent pas d'étudier la communication entre organes, ce qui justifie selon lui le modèle animal.

Objectifs

Ce projet cherche à comprendre le lien entre les problèmes de métabolisme et l’inflammation dans certaines maladies comme les maladies auto-immunes. Pour cela, nous utiliserons des souris qui ont des troubles similaires à ceux observés chez certaines personnes malades. Nous avons déjà pu observer que ces souris produisent des lipides qui accentuent l’inflammation provoquée par la maladie . Nous voulons maintenant savoir si agir sur l’inflammation et le métabolisme en même temps pourrait aider à mieux traiter ces maladies.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait aider à mieux comprendre certaines maladies inflammatoires de type maladie auto-immunes et à trouver de nouvelles façons de les traiter en agissant à la fois sur les défenses naturelles du corps et sur son métabolisme.

Procédures

Certains animaux recevront des régimes alimentaires spécifiques supplémentés en certains acides gras ou des traitements pharmacologiques pendant 14 semaines, puis seront testés pour voir comment leur corps réagit au sucre (glucose) ou à l’insuline, et comment leur foie régule le taux de sucre dans le sang. Ces tests seront espacés d’au moins 14 jours. Pour cela, il faudra prélever environ 7 petites gouttes de sang sur une période de 2 heures. Ces tests seront réalisés sur des animaux vigiles mais manipulés avec précaution. -Injection 1 fois/2 semaines (x3) ; Prélèvement goutte sang 6 fois/2 semaines (x3) D’autres animaux recevront ces mêmes régimes alimentaires spécifiques ou des traitements pharmacologiques pendant 14 semaines, puis seront prélevés au niveau sanguin toutes les 4 semaines pour suivre des marqueurs sanguins inflammatoires. -Administration traitement 2 fois/semaine (x14) ; Prélèvement sang 1 fois/4 semaines (x4) ; Prise de température environ 1min/2 semaines (x7) Des animaux modèles de maladies inflammatoires chroniques recevront des traitements pharmacologiques pendant 3 semaines via une administration par voie aériennes. Des animaux, dont on aura induit l’inflammation seront traités par voie aérienne ou par injection. -Injection 1 fois ; Administration traitement voie aérienne 40 secondes/jour (x21) Ou 30 secondes/jour (x21)

Impact sur les animaux

Dans ce projet, certains animaux utilisés présentent une inflammation chronique importante, ce qui réduit fortement leur espérance de vie, avec une survie moyenne d’environ 6 mois. Ces animaux peuvent développer des problèmes cardiaques, respirer difficilement ou avoir une peau pâle au niveau des oreilles et des pattes, signes d’un cœur fatigué. D’autres animaux peuvent aussi montrer une faiblesse du système immunitaire, des inflammations des poumons et un poids plus faible que les animaux sains. À noter que certains animaux porteurs d’une seule copie du gène concerné ne développent aucun signe de maladie et vivent normalement.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans le projet seront mis à mort pour prélèvement des organes d’intérêt (foie, cœur, poumons...)

Remplacement

Ce projet a besoin d'utiliser des modèles animaux, car les méthodes alternatives comme les tests en laboratoire sur des cellules ne permettent pas d’étudier comment les organes communiquent entre eux, ni comment un changement d’alimentation peut influencer tout le corps, notamment le métabolisme et les réactions inflammatoires.

Réduction

Nous adapterons le nombre d’animaux utilisés en fonction des besoins réels de l’étude. Tous les animaux nés seront inclus dans les expériences. Des groupes de référence seront utilisés pour chaque groupe étudié. Par ailleurs, nos expériences précédentes et une analyse préalable nous indiquent qu’un groupe de 10 animaux est suffisant pour obtenir des résultats fiables d’un point de vue statistique.

Raffinement

Des signes d’alerte spécifiques ont été définis pour repérer rapidement tout problème lié à leur état de santé. Si un animal montre l’un de ces signes, il sera immédiatement pris en charge et euthanasié si nécessaire. Leurs besoins sociaux et biologiques sont bien connus, ce qui permet de réduire au maximum toute douleur ou souffrance. Les animaux vivront par petits groupes de cinq, dans des cages enrichies avec une maisonnette et du coton pour leur confort. Lors des expériences, un anti-douleur sera appliqué sur leur queue pour limiter toute gêne.

Choix des espèces

Les souris adultes ( à partir de 6 semaines) sont les animaux les plus utilisés pour étudier le fonctionnement du système immunitaire et du métabolisme, notamment pour comprendre comment certains régimes alimentaires influencent ces mécanismes. Grâce à de nombreux modèles génétiquement modifiés disponibles, nous pouvons obtenir des résultats fiables et les comparer facilement avec ceux d'autres études.

Autour d'un projet de production de foie gras, 140 oies et canes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en abattoir. La seule intervention déclarée est un unique prélèvement de sang au sinus occipital, le protocole reposant surtout sur l'exposition à la lumière et la maturité sexuelle pour induire un engraissement spontané du foie. L'étude cherche une alternative au gavage conventionnel, qu'elle relie à une demande sociétale croissante. À l'abattage, le sang, le foie, les magrets et l'appareil reproducteur sont prélevés.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer si une exposition à une photopériode de type jours courts et/ou le niveau de maturité sexuelle des palmipèdes, peuvent induire une hyperphagie chez les canards Barbarie et les oies grises des Landes, conduisant à un engraissement spontané du foie. Cette démarche pourrait permettre d’établir un protocole alternatif et physiologique au gavage conventionnel. Ce projet explore plus particulièrement la capacité des femelles à l'engraissement spontané, ce qui n'a jamais été étudié auparavant.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre d’établir si, chez les oies la maturité sexuelle et, chez les canes Barbarie souche à père Mulard, la maturité sexuelle ainsi que la durée du jour, peuvent constituer des leviers pour induire une hyperphagie conduisant à un engraissement spontané du foie. Si les expériences sont concluantes, elles pourraient amener à identifier des marqueurs centraux de la capacité à l’hyperphagie, qui pourraient en outre être utilisés dans le cadre de la sélection génétique. Par ailleurs, ces premières expériences pourraient servir de base à l'étude de nouvelles pratiques en élevage et répondre ainsi aux attentes sociétales actuelles. En effet, une part croissante de la société remet en question la pratique du gavage destinée à la production de foie gras et de canards gras, en raison des contraintes qu'elle impose aux animaux et de la perception de souffrance qui lui est associée. Les citoyens et les consommateurs expriment ainsi des attentes accrues concernant les conditions d'élevage, notamment en matière de réduction du stress, d'amélioration des conditions de logement et de renforcement du contrôle des pratiques. Par ailleurs, un nombre grandissant de citoyens encourage le développement d'alternatives au gavage ou de méthodes permettant d'obtenir du foie gras sans recours à l'alimentation forcée.

Procédures

Un seul prélèvement de sang sera réalisé par animal au niveau du sinus occipital. Il se fera avant la période d’engraissement sur animal vigile par des soigneurs très expérimentés et possédant la maitrise des gestes techniques sur les espèces aviaires (canes et oies). Le geste maitrisé ne dure qu’une minute environ.

Impact sur les animaux

Tout stress majeur sera évité, en particulier lors de la prise de sang qui sera réalisée avant la période d’engraissement. Celle-ci sera réalisée au niveau du sinus occipital par des soigneurs experts, avec une connaisance approfondie de ces espèces aviaires et maitrisant parfaitement les gestes de prélèvement. De plus, ce prélèvement de sang au sinus occipital évite l'apparition d'hématome.

Devenir

A la fin du protocole, les animaux seront mis à mort en respectant la règlementation en vigueur (abattage dans un abattoir agréé). Le sang sera prélevé suite à l’exsanguination, des tissus et des organes seront collectés : le foie, les magrets, l’appareil reproducteur, le tissu adipeux sous-cutané et abdominal et le cerveau pour étudier les marqueurs liés au contrôle central de la prise alimentaire.

Remplacement

L’objectif de ce projet étant de définir des leviers capables d’induire une hyperphagie conduisant à une stéatose spontanée chez les palmipèdes à foie gras, aucune alternative in vitro ou in silico n’est envisageable.

Réduction

En tenant compte de la variabilité individuelle et de la perte possible de quelques individus, le minimum d'animaux recommandé pour que l'étude soit interprétable et exploitable est de 35 individus par groupe.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans un environnement adapté et propice à leur croissance (sur litière de copeaux de bois puis sur caillebotis). Toute situation stressante sera réduite au minimum (un seul prélèvement de sang pour chaque animal). Les animaux seront élevés en groupes sociaux stables, ce qui est permis par l’utilisation des seules femelles. Ils seront regroupés par lot de 35 individus dans des loges de 32.44m² (soit 1.08 m² par animal). L’environnement sera enrichi par la présence de chainettes métalliques de jeu, de tas de copeaux de bois, afin de stimuler leur curiosité et le jeu. Au fur et à mesure de l'élevage, d'autres enrichissements seront rajoutés, tels que plusieurs points d'eau, un bac à grit et différents objets suspendus : jouets en plastiques durs et résistants. Par ailleurs, une surveillance quotidienne sera assurée pour détecter toute détérioration éventuelle et retirer immédiatement les éléments concernés, afin d'éviter tout risque d'ingestion. Le comportement des animaux sera suivi quotidiennement afin de détecter tout risque de souffrance ou de mal-être. Une grille d'évaluation du bien-être (indicateurs physiologiques, comportementaux et d'état corporel) sera mise en place afin d'assurer un suivi quotidien et de détecter précocement toute altération du bien-être des animaux.

Choix des espèces

L’oie grise des Landes possède une forte capacité d’ingestion et une prédisposition marquée à la stéatose. C’est l’une des espèces domestiques la mieux adaptée à la stéatose spontanée en raison de sa proximité génétique avec son ancêtre, l’oie cendrée sauvage migratrice. Pour cette espèce, un protocole d’induction d’une hyperphagie a déjà été validé. Ce protocole consiste à appliquer un régime alimentaire contrôlé à la fin de la période de croissance suivi d’une distribution à volonté de maïs pendant plusieurs semaines de façon concomitante avec une réduction de la durée du jour en bâtiment obscur (de 10 à 7 h/j d’éclairement). Le canard de Barbarie souche père à Mulard, est l’un des deux fonds génétiques de canards adaptés à la production du foie gras. De plus, ce fond génétique est resté photosensible puisqu’une exposition à des jours longs est capable d’accélérer sa maturation sexuelle. Tous les animaux seront accueillis sur le site d’hébergement dès l’âge de 1 jour.

Chacune des 96 souris enchaîne, à 6, 12 puis 18 mois, une batterie de tests répartie sur trois semaines : prélèvements sanguins, suspension à un câble à 45 cm du sol, labyrinthe, mesure de force, arène lumineuse, course forcée sur tapis roulant et 48 heures en cage individuelle. Ces procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à l'issue pour nécropsie. La course sur tapis roulant est entretenue par des chocs électriques que le porteur qualifie de légers et destinés à motiver le mouvement. L'étude vise à mesurer l'effet d'un anticorps anti-GDF15 sur le vieillissement, le protocole imposant à chaque animal trois cycles de tests sur dix-huit mois.

Objectifs

Le vieillissement est un processus complexe et hétérogène, se manifestant par différentes trajectoires de déclin fonctionnel et métabolique. GDF15 est l’une des protéines les plus corrélées à l’âge avec des niveaux qui augmentent progressivement tout au long de la vie. Elle a un effet protecteur à court terme, mais son élévation chronique est associée au déclin lié à l’âge. Dans ce contexte, ce projet a pour objectif d'évaluer de manière approfondie l'impact d'un traitement par anticorps anti-GDF15 sur ces trajectoires. L'étude vise à mettre en évidence comment ce traitement influence la préservation d'un ensemble de capacités intrinsèques (aptitudes physiques et cognitives non liées à un apprentissage ou un entrainement) et l'amélioration des marqueurs clés du métabolisme comme le taux de cholestérol et de glucose dans le sang, et la dépense énergétique par exemple. En identifiant les effets précis du traitement, ce projet contribuera à une meilleure compréhension des mécanismes physiologiques impliqués dans le vieillissement, ouvrant ainsi la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour favoriser la vitalité et la qualité de vie à un âge avancé. Le projet pourra se dérouler dans deux Établissements Utilisateurs si nécessaire.

Bénéfices attendus

Grâce à cette étude, nous serons en mesure de mieux comprendre le rôle de la GDF-15 dans les processus de vieillissement ainsi que son lien avec le déclin fonctionnel, et d'envisager de nouvelles approches thérapeutique pour favoriser la vitalité et la qualité de vie à un âge avancé.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à une série d'évaluations comportementales, motrices, et métaboliques, réparties sur 3 semaines, le tout à 3 reprises, soit à l’âge de 6, 12 et 18 mois : - Les prélèvements de sang : faible volume et sous anesthésie gazeuse pour la Biochimie du sang et l'hématologie. - L’analyse de la composition corporelle : les animaux seront placés dans une cellule de contention, type tube, lui-même placé dans une chambre RMN durant moins de 3 minutes au total. - Evaluation de la coordination motrice : Les animaux seront suspendus à un câble métallique à une hauteur de 45 cm pendant maximum 4 minutes et le temps de chute (sur une surface épaisse et molle pour amortir le choc) sera mesuré à trois reprises, chaque mesure étant espacée d’une heure. - Évaluation de la mémoire spatiale à court terme : Les animaux seront soumis à un test d'exploration dans un labyrinthe, d'une durée d'environ 8 minutes par souris. - Évaluation de la force de préhension : La force motrice des membres sera mesurée par trois prises espacées d'une heure pour une durée totale d'environ 5 minutes par mesure. - Évaluation de l'activité motrice et de l'anxiété : Les animaux seront observés pendant 10 minutes dans une arène lumineuse. - Évaluation de l'endurance physique : Les animaux seront soumis à un exercice forcé sur tapis roulant. La durée de cette intervention est variable en fonction des performances individuelles. Des stimulations électriques de faible intensité encouragent le mouvement. - La mesure des échanges gazeux : les animaux sont temporairement individualisés (48h) pour permettre la mesure des gaz consommés et produits de chaque individu. Afin de limiter la fatigue et l'interférence entre les mesures, les tests seront répartis sur 3 semaines (Prélèvements de sang et Analyse de la composition corporelle en semaine 1, tests comportementaux en semaine 2, mesure des échanges gazeux en semaine 3). L’ensemble du projet jusqu’à ce stade sera réalisé dans le premier Etablissement Utilisateur. En fin de procédure, les animaux seront mis à jeûn durant 2 heures, anesthésiés pour un prélèvement de sang terminal puis mis à mort pour nécropsie dans le premier ou le second Etablissement Utilisateur.

Impact sur les animaux

Les tests expérimentaux utilisés pour cette étude génèrent un faible niveau de stress : - Les prélèvements de sang génèrent un stress et une douleurs légers. Ces prélèvements n'auront lieu que tous les 6 mois, soit 3 fois au cours du protocole. - L’analyse de la composition corporelle implique le placement des animaux dans une cellule de confinement exigüe, ce qui génère un stress léger et court (moins de 3 minutes au total). - La préhension de une à cinq minutes lors de la mise en place des animaux dans les dispositifs de comportement génère un stress léger. - L'évaluation de la coordination motrice génère un stress physique léger. Les animaux seront suspendus à un câble métallique à une hauteur de 45 cm pendant maximum 4 minutes. - L'évaluation de la mémoire spatiale à court terme génère un stress léger et court (environ 8 minutes) lié à un environnement nouveau et non familier. - L'évaluation de la force de préhension genère un stress lors de la préhension mais également un stress physique court lors de l’expérience (5 minutes par mesure). - L'évaluation de l'activité motrice et de l'anxiété génère un stress léger et court (10 minutes) car l’environnement est nouveau, lumineux et non sécurisant (absence d’enrichissement). - L'évaluation de l'endurance physique génère un stress modéré et un inconfort physique dus à l'exercice forcé (la durée de cette intervention est variable en fonction des performances individuelles). Les stimulations électriques sur la grille arrière sont utilisées uniquement pour inciter l'animal à courir et sont calibrées au niveau minimal efficace (choc aversif léger) pour motiver le mouvement par inconfort et non par douleur. - La mesure des échanges gazeux génère un stress modéré lié à l’individualisation temporaire (48h) des animaux. Les fonds de cage de calorimétrie sont les mêmes que les fonds de cages d’hébergement habituel, ils sont transparents et les animaux peuvent se voir d’une cage à l’autre durant l’enregistrement. - Le transport éventuel en fin de protocole pour la mise à mort dans le second Etablissement Utilisateur, entrainera un stress léger lié au mouvement des cages durant quelques minutes (300m à parcourir).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de procéder à des nécropsies (analyses en biochimie et en expression génique sur différents organes d'intérêt).

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, nous souhaitons analyser comment un traitement anti-GDF15 influence l'évolution des capacités intrinsèques et des fonctions métaboliques d'individus d'âge avancé. L'évaluation de ces processus exige l'utilisation d'organismes vivants (humains ou modèles animaux), car les tests comportementaux essentiels ne peuvent être reproduits par des approches in vitro ou ex vivo. Compte tenu de son espérance de vie plus courte et de ses processus physiologiques similaires à ceux de l'Homme, la souris apparaît comme le modèle de choix le plus pertinent pour cette étude.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum en se basant sur les données de la littérature et ce nombre a été corrigé par un calcul de puissance statistique. L'utilisation d'un analyseur de composition corporelle pour évaluer les masses grasses et maigre constitue également un élément de réduction du nombre d'animaux utilisé, en ceci que 60 secondes dans une cellule de contention remplacent l'utilisation d'animaux supplémentaires : avant l'utilisation de cet automate, il était nécessaire de prévoir un groupe d'animaux dédié à la composition corporelle, évaluée par prélèvement et pesée des tissus lors d'une nécropsie.

Raffinement

Les tests expérimentaux utilisés pour cette étude génèrent peu de stress (préhension lors de la mise en place des animaux dans les dispositifs de comportement). Une habituation aux gestes de manipulation sera effectuée avant chaque lot de tests pendant 5 minutes par souris pendant 3 jours avant le début des tests pour limiter le stress généré par l’expérimentateur. Les animaux seront également acclimatés à la salle d’expérimentation pendant la phase d’habituation. Les prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie gazeuse afin de limiter le stress et la douleur, ce geste sera effectué par une personne ayant une longue exérience de ce geste technique. Des éléments d’enrichissement seront mis en place dans la cage d’hébergement afin d’assurer leur bien-être et réduire le stress : animaux placés en groupe dans les cages, mise en place de tunnels en cartons, du papier pour faire un nid. A partir de l’âge de 12 mois, les souris seront placées dans des portoirs connectés DVC (Cage Digitales Ventilées) permettant d’identifier précocément toute perte d’activité et de prostration. Enfin, si la mise à mort a lieu dans le second Etablissement Utilisateur, les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément du second Etablissement Utilisateur (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les animaux sont transportés dans leur cage d'origine et les cages seront protégées du froid ou de la chaleur dans un container souple occultant et isotherme afin de minimiser le stress, pour un transport d'une durée de moins de 10 minutes. Le choix de la mise à mort dans le premier Etablissement Utilisateur sera privilégié si l’organisation des laboratoires et des équipements au moment de la mise à mort le permet.

Choix des espèces

Lors de ce projet, nous cherchons à étudier l’évolution des capacités intrinsèques (aptitudes physiques et cognitives non liées à un apprentissage ou un entrainement) d’un individu d’âge avancé et ses fonctions métaboliques en fonction d’un traitement anti-GDF15. Cela nécessite de l’étudier sur des organismes vivants, humains ou modèles animaux. La souris semble un choix plus approprié pour cette étude grâce à l’espérance de vie plus courte et des processus physiologiques similaires à l’Homme. Pour étudier les différentes trajectoires de vieillissement, une évaluation des capacités et des fonctions métaboliques sera réalisée à trois âges différents : 6, 12 et 18 mois. L’objectif est d’identifier le rôle précoce de GDF-15 et de l’action du traitement testé à long terme.

3 456 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, dont 1 728 recevront une injection directement dans le cerveau et 192 une double chirurgie. Elles sont soumises à un régime gras, à un gavage de tamoxifène et à un suivi en cage individuelle, puis tuées pour extraction du cerveau. L'étude porte sur les filets qui entourent certains neurones de la satiété et sur leur rôle dans l'obésité. Les retombées annoncées, de nouvelles stratégies contre l'obésité, sont renvoyées au long terme.

Objectifs

L’obésité touche aujourd’hui plus de 13 % de la population mondiale et augmente le risque de maladies graves comme le diabète ou les troubles cardiovasculaires. Pour mieux prévenir ou traiter cette maladie, il est essentiel de comprendre comment notre corps régule la faim et la sensation de satiété. Dans le cerveau, une zone appelée l’hypothalamus joue un rôle central. Elle contient des neurones spécifiques, appelés neurones POMC, qui envoient le signal de satiété (on n’a plus faim), et d'autres neurones qui provoquent l’envie de manger. Des recherches récentes montrent que les neurones POMC ne sont pas tous identiques. Certains réagissent moins bien aux signaux hormonaux et seraient plus sensibles à une alimentation trop riche en graisses, ce qui pourrait contribuer à l’installation de l’obésité. Par ailleurs, environ 30 % de ces neurones sont entourés d’une sorte de « filet » protecteur, appelé matrice extracellulaire ou filets périneuronaux (PNN). Ces structures influencent le fonctionnement des neurones et leur capacité à s’adapter. Chez les souris obèses, ces filets semblent profondément modifiés. Nous cherchons à comprendre comment les neurones POMC réagissent aux changements alimentaires (jeûne, réalimentation) et quel rôle joue leur environnement extracellulaire dans cette réponse. Nous allons : Observer ces neurones chez des souris en jeûne, après réalimentation, ou nourries avec un régime gras. Analyser l'activité des neurones et la composition de leur environnement avec des outils d’imagerie et d’électrophysiologie. Modifier directement la matrice autour des neurones pour voir si cela influence leur fonctionnement. Activer ou inhiber artificiellement ces neurones pour étudier l’effet combiné avec les changements de leur environnement. Nous pensons que les modifications de l’environnement des neurones POMC jouent un rôle important dans la dérégulation de la sensation de satiété en cas d’obésité. Mieux comprendre cette interaction entre neurones et matrice extracellulaire pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour lutter contre l’obésité.

Bénéfices attendus

À l’heure actuelle, l’Organisation Mondiale de la Santé estime à plus d’un milliard le nombre de personnes obèses dans le monde, faisant de l’obésité un enjeu majeur de santé publique. Malgré les efforts thérapeutiques, les traitements disponibles restent globalement peu efficaces à long terme, à l’exception de techniques invasives telles que la chirurgie bariatrique, dont les résultats ne sont pas systématiquement garantis. Il est donc essentiel de mieux comprendre les mécanismes biologiques sous-jacents à l’apparition et à la persistance de cette pathologie, afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans ce projet, nous étudions un élément encore peu connu du contrôle de la faim : la matrice extracellulaire, et en particulier les filets périneuronaux (PNN). Ces structures entourent certains neurones du cerveau, notamment les neurones POMC, qui nous aident à ressentir la satiété. Nous pensons que ces filets pourraient réduire la souplesse des neurones, en limitant leur capacité à s’adapter aux changements liés à l’alimentation, surtout en cas d’obésité. Cela pourrait empêcher le cerveau de bien réguler l’appétit lorsque l’environnement nutritionnel change. À court terme, nous voulons comprendre comment ces filets réagissent à une alimentation trop riche ou à des changements rapides de régime, et comment cela influence les neurones qui contrôlent la faim. À plus long terme, ce projet pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour aider le cerveau à retrouver sa flexibilité, et ainsi améliorer la régulation de l’appétit chez les personnes obèses.

Procédures

4 prélèvements sera effectués au total pour le suivi de la glycémie. Lors de l'habituation au "fasting" : 24 heures après le jeûne puis 1h30 après la réintroduction à la nourriture. Lors de la phase expérimentale : 24 heures après le jeûne puis 1h30 après la réintroduction à la nourriture. A chaque prélèvement, une goutte de sang sera récoltée, soit 50 µL environ. Cela concerne toutes les souris de toutes les procédures, soit 3456 souris. Des procédures chirurgicales sont prévues. 1728 souris auront une injection intra-cérébrale dans le noyau arqué de l'hypothalamus. 192 souris subiront une double chirurgie, soit une injection de virus permettant de contrôler une sous population de neurones, puis une injection d'enzyme permettant de dégrader la matrice extracellulaire.

Impact sur les animaux

Certaines souris de l’étude recevront une administration orale de tamoxifène, connu pour induire une perte temporaire de tissu adipeux, entraînant une perte de poids transitoire. Le gavage, bien qu’indolore, implique une contention totale, source probable de stress. Des douleurs post-opératoires modérées peuvent survenir à la suite des injections stéréotaxiques bilatérales de vecteurs viraux. Ces douleurs seront prises en charge par un traitement analgésique systématique. Lorsque deux interventions seront nécessaires, un délai suffisant sera respecté entre chaque chirurgie afin de maximiser la récupération. Certaines procédures expérimentales peuvent générer un stress transitoire ou des effets physiologiques réversibles (régime hypercalorique). Ces effets ont été anticipés, et des mesures seront mises en place pour en limiter l’impact (enrichissement augmenté). Le passage en cage individuelle, requis pour un suivi précis de la prise alimentaire, pourra induire un stress lié à l’isolement. Toutefois, les cages resteront proches afin de maintenir un contact visuel, auditif et olfactif entre congénères, réduisant les effets d’isolement social. L’analyse de la composition corporelle par EchoMRI nécessite une brève contention (moins de cinq minutes) dans un tube transparent. Ce stress aigu sera donc de faible intensité et de courte durée. L’administration prolongée d’un régime hypercalorique (HFD) entraînera une prise de poids progressive, ne dépassant pas 200 % du poids initial selon nos données antérieures. Un suivi rigoureux sera mis en place afin de prévenir toute dérive pathologique. Les protocoles de jeûne induiront une perte de poids modérée (inférieure à 10 % du poids initial), totalement réversible à la reprise de l’alimentation. Les chirurgies stéréotaxiques nécessaires aux injections intracérébrales provoqueront une douleur modérée liée à l’incision du scalp et du périoste. Un traitement analgésique sera systématiquement administré, avec une reprise attendue de l’activité normale et du poids en 2 à 3 jours. Enfin, certains tests comportementaux seront réalisés pour évaluer les effets fonctionnels des manipulations. Ils dureront moins d’une heure et nécessiteront une petite goutte de sang pour mesurer la glycémie avec précision.

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort, les cerveaux seront alors extraits et des analyses d'imagerie, d'électrophysiologie, ou de "Single Particle Tracking" pourront être effectués ex vivo (le cas échéant).

Remplacement

Le but de ce projet est d’étudier la relation entre l’activité des sous-populations de neurones à POMC et les modifications de leur environnement extracellulaire, en particulier les filets péri-neuronaux (PNN), en réponse à la consommation d’un régime obésogène. Dans ce contexte, les neurones étudiés ne fonctionnent pas de manière isolée : ils interagissent avec d’autres structures cérébrales mais également avec des signaux périphériques d’origine hormonale ou nutritionnelle. La matrice extracellulaire pourrait jouer un rôle clé dans cette interface en modulant la plasticité et la réactivité neuronale. Les effets que nous cherchons à comprendre sont donc le fruit d’interactions complexes entre réseaux neuronaux et signaux métaboliques périphériques. Une telle dynamique ne peut être reproduite in vitro, car elle nécessite un système intégratif capable de refléter fidèlement les adaptations comportementales, telles que la prise alimentaire. De même, aucun modèle informatique ne permettrait aujourd’hui de simuler avec une précision suffisante les interactions entre la matrice extracellulaire, l’activité neuronale, et les réponses métaboliques de l’organisme. Seul un modèle in vivo permet de capturer l’ensemble de ces processus.

Réduction

Pour l’analyse des résultats, nous comparerons les différents groupes expérimentaux utilisant des tests statistiques. Le nombre d’animaux que nous demandons est le nombre maximal dont nous estimons avoir besoin. Si nous nous rendons compte en cours de projet que ce nombre peut encore être réduit, il le sera bien évidemment.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront à l’âge de 6 semaines et seront habitués pendant au moins 2 semaines. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’enrichissement des cages sera ainsi : carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnets en bois pour ronger et de tunnels en carton, qui permettront aux souris de se cacher. Nous utiliserons ces tunnels pour transporter les souris, méthode de manipulation la moins stressante pour ces animaux. 3) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 4) Notre étude nécessite une chirurgie stéréotaxique, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole associant morphinique, anesthésique local et traitement anti-inflammatoire. Durant la chirurgie, dès l’induction, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Le risque de déshydratation post-opératoire est prévenu par injection sous-cutanée de solution saline stérile. Enfin, le traitement anti-inflammatoire se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 5) Certains animaux de cette DAP auront un suivi chronique de leur poids, leur prise alimentaire et leur composition corporelle ainsi que le suivi de la prise alimentaire suite à certaines procédures chirurgicales (enzyme dégradant la matrice ou virus permettant le désassemblage de la matrice) nécessitera que les animaux soient placés en cage individuelle. ¬6) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été́ définis : l'apparence, l'évolution du poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échéant). Lorsqu’un point limite précoce est atteint, nous demanderons un avis vétérinaire afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude. En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort, pour lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel, et du comportement alimentaire sont depuis longtemps étudiés chez la souris. La souris représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De plus, les lignées transgéniques dont nous avons besoin pour mener à bien ce projet ont été créées chez la souris. Enfin, la forte proximité́ biologique entre l’Homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de cette espèce un bon modèle prédictif. Toutes les souris de ce projet arriveront à l’âge de 6 semaines dans notre animalerie, mais nous ne débuterons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 semaines, sur des souris adultes. Il est admis qu’à 8 semaines, la croissance des os est achevée, ce qui facilite les procédures impliquant une chirurgie stéréotaxique (car les points de repère anatomiques se situent sur le crâne). Les souris seront logées dans des cages collectives pour favoriser les interactions sociales. Afin de permettre le suivi individuel du poids et de la prise alimentaire, uniquement quand cela sera nécessaire, les souris seront placées en cage individuelle. Ces cages vont être rapprocher le plus possible pour permettre au mieux à l’animal d’avoir une interaction visuelle, auditive et olfactive.

96 souris vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune soumise à trois campagnes de tests à 6, 12 et 18 mois. Les animaux subissent des prises de sang, une suspension à un câble à 45 cm de hauteur, un test de force, un labyrinthe et une course forcée sur tapis avec chocs électriques légers. Le projet évalue un anticorps anti-GDF15 censé freiner le déclin fonctionnel du vieillissement. Les bénéfices annoncés pour la "vitalité" et la "qualité de vie" à un âge avancé restent hypothétiques, les souris étant mises à mort pour nécropsie.

Objectifs

Le vieillissement est un processus complexe et h?t?rog?ne, se manifestant par diff?rentes trajectoires de d?clin fonctionnel et m?tabolique. GDF15 est l?une des prot?ines les plus corr?l?es ? l??ge avec des niveaux qui augmentent progressivement tout au long de la vie. Elle a un effet protecteur ? court terme, mais son ?l?vation chronique est associ?e au d?clin li? ? l??ge. Dans ce contexte, ce projet a pour objectif d'?valuer de mani?re approfondie l'impact d'un traitement par anticorps anti-GDF15 sur ces trajectoires. L'?tude vise ? mettre en ?vidence comment ce traitement influence la pr?servation d'un ensemble de capacit?s intrins?ques (aptitudes physiques et cognitives non li?es ? un apprentissage ou un entrainement) et l'am?lioration des marqueurs cl?s du m?tabolisme comme le taux de cholest?rol et de glucose dans le sang, et la d?pense ?nerg?tique par exemple. En identifiant les effets pr?cis du traitement, ce projet contribuera ? une meilleure compr?hension des m?canismes physiologiques impliqu?s dans le vieillissement, ouvrant ainsi la voie ? de nouvelles strat?gies th?rapeutiques pour favoriser la vitalit? et la qualit? de vie ? un ?ge avanc?. Le projet pourra se d?rouler dans deux ?tablissements Utilisateurs si n?cessaire.

Bénéfices attendus

Gr?ce ? cette ?tude, nous serons en mesure de mieux comprendre le r?le de la GDF-15 dans les processus de vieillissement ainsi que son lien avec le d?clin fonctionnel, et d'envisager de nouvelles approches th?rapeutique pour favoriser la vitalit? et la qualit? de vie ? un ?ge avanc?.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis ? une s?rie d'?valuations comportementales, motrices, et m?taboliques, r?parties sur 3 semaines, le tout ? 3 reprises, soit ? l??ge de 6, 12 et 18 mois : - Les pr?l?vements de sang : faible volume et sous anesth?sie gazeuse pour la Biochimie du sang et l'h?matologie. - L?analyse de la composition corporelle : les animaux seront plac?s dans une cellule de contention, type tube, lui-m?me plac? dans une chambre RMN durant moins de 3 minutes au total. - Evaluation de la coordination motrice : Les animaux seront suspendus ? un c?ble m?tallique ? une hauteur de 45 cm pendant maximum 4 minutes et le temps de chute (sur une surface ?paisse et molle pour amortir le choc) sera mesur? ? trois reprises, chaque mesure ?tant espac?e d?une heure. - ?valuation de la m?moire spatiale ? court terme : Les animaux seront soumis ? un test d'exploration dans un labyrinthe, d'une dur?e d'environ 8 minutes par souris. - ?valuation de la force de pr?hension : La force motrice des membres sera mesur?e par trois prises espac?es d'une heure pour une dur?e totale d'environ 5 minutes par mesure. - ?valuation de l'activit? motrice et de l'anxi?t? : Les animaux seront observ?s pendant 10 minutes dans une ar?ne lumineuse. - ?valuation de l'endurance physique : Les animaux seront soumis ? un exercice forc? sur tapis roulant. La dur?e de cette intervention est variable en fonction des performances individuelles. Des stimulations ?lectriques de faible intensit? encouragent le mouvement. - La mesure des ?changes gazeux : les animaux sont temporairement individualis?s (48h) pour permettre la mesure des gaz consomm?s et produits de chaque individu. Afin de limiter la fatigue et l'interf?rence entre les mesures, les tests seront r?partis sur 3 semaines (Pr?l?vements de sang et Analyse de la composition corporelle en semaine 1, tests comportementaux en semaine 2, mesure des ?changes gazeux en semaine 3). L?ensemble du projet jusqu?? ce stade sera r?alis? dans le premier Etablissement Utilisateur. En fin de proc?dure, les animaux seront mis ? je?n durant 2 heures, anesth?si?s pour un pr?l?vement de sang terminal puis mis ? mort pour n?cropsie dans le premier ou le second Etablissement Utilisateur.

Impact sur les animaux

Les tests exp?rimentaux utilis?s pour cette ?tude g?n?rent un faible niveau de stress : - Les pr?l?vements de sang g?n?rent un stress et une douleurs l?gers. Ces pr?l?vements n'auront lieu que tous les 6 mois, soit 3 fois au cours du protocole. - L?analyse de la composition corporelle implique le placement des animaux dans une cellule de confinement exig?e, ce qui g?n?re un stress l?ger et court (moins de 3 minutes au total). - La pr?hension de une ? cinq minutes lors de la mise en place des animaux dans les dispositifs de comportement g?n?re un stress l?ger. - L'?valuation de la coordination motrice g?n?re un stress physique l?ger. Les animaux seront suspendus ? un c?ble m?tallique ? une hauteur de 45 cm pendant maximum 4 minutes. - L'?valuation de la m?moire spatiale ? court terme g?n?re un stress l?ger et court (environ 8 minutes) li? ? un environnement nouveau et non familier. - L'?valuation de la force de pr?hension gen?re un stress lors de la pr?hension mais ?galement un stress physique court lors de l?exp?rience (5 minutes par mesure). - L'?valuation de l'activit? motrice et de l'anxi?t? g?n?re un stress l?ger et court (10 minutes) car l?environnement est nouveau, lumineux et non s?curisant (absence d?enrichissement). - L'?valuation de l'endurance physique g?n?re un stress mod?r? et un inconfort physique dus ? l'exercice forc? (la dur?e de cette intervention est variable en fonction des performances individuelles). Les stimulations ?lectriques sur la grille arri?re sont utilis?es uniquement pour inciter l'animal ? courir et sont calibr?es au niveau minimal efficace (choc aversif l?ger) pour motiver le mouvement par inconfort et non par douleur. - La mesure des ?changes gazeux g?n?re un stress mod?r? li? ? l?individualisation temporaire (48h) des animaux. Les fonds de cage de calorim?trie sont les m?mes que les fonds de cages d?h?bergement habituel, ils sont transparents et les animaux peuvent se voir d?une cage ? l?autre durant l?enregistrement. - Le transport ?ventuel en fin de protocole pour la mise ? mort dans le second Etablissement Utilisateur, entrainera un stress l?ger li? au mouvement des cages durant quelques minutes (300m ? parcourir).

Devenir

Tous les animaux seront mis ? mort en fin de proc?dure afin de proc?der ? des n?cropsies (analyses en biochimie et en expression g?nique sur diff?rents organes d'int?r?t).

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, nous souhaitons analyser comment un traitement anti-GDF15 influence l'?volution des capacit?s intrins?ques et des fonctions m?taboliques d'individus d'?ge avanc?. L'?valuation de ces processus exige l'utilisation d'organismes vivants (humains ou mod?les animaux), car les tests comportementaux essentiels ne peuvent ?tre reproduits par des approches in vitro ou ex vivo. Compte tenu de son esp?rance de vie plus courte et de ses processus physiologiques similaires ? ceux de l'Homme, la souris appara?t comme le mod?le de choix le plus pertinent pour cette ?tude.

Réduction

Le nombre d?animaux a ?t? r?duit au maximum en se basant sur les donn?es de la litt?rature et ce nombre a ?t? corrig? par un calcul de puissance statistique. L'utilisation d'un analyseur de composition corporelle pour ?valuer les masses grasses et maigre constitue ?galement un ?l?ment de r?duction du nombre d'animaux utilis?, en ceci que 60 secondes dans une cellule de contention remplacent l'utilisation d'animaux suppl?mentaires : avant l'utilisation de cet automate, il ?tait n?cessaire de pr?voir un groupe d'animaux d?di? ? la composition corporelle, ?valu?e par pr?l?vement et pes?e des tissus lors d'une n?cropsie.

Raffinement

Les tests exp?rimentaux utilis?s pour cette ?tude g?n?rent peu de stress (pr?hension lors de la mise en place des animaux dans les dispositifs de comportement). Une habituation aux gestes de manipulation sera effectu?e avant chaque lot de tests pendant 5 minutes par souris pendant 3 jours avant le d?but des tests pour limiter le stress g?n?r? par l?exp?rimentateur. Les animaux seront ?galement acclimat?s ? la salle d?exp?rimentation pendant la phase d?habituation. Les pr?l?vements de sang seront r?alis?s sous anesth?sie gazeuse afin de limiter le stress et la douleur, ce geste sera effectu? par une personne ayant une longue ex?rience de ce geste technique. Des ?l?ments d?enrichissement seront mis en place dans la cage d?h?bergement afin d?assurer leur bien-?tre et r?duire le stress : animaux plac?s en groupe dans les cages, mise en place de tunnels en cartons, du papier pour faire un nid. A partir de l??ge de 12 mois, les souris seront plac?es dans des portoirs connect?s DVC (Cage Digitales Ventil?es) permettant d?identifier pr?coc?ment toute perte d?activit? et de prostration. Enfin, si la mise ? mort a lieu dans le second Etablissement Utilisateur, les animaux seront transport?s entre les deux ?tablissements suivant une proc?dure de transport d?clar?e lors de l?agr?ment du second Etablissement Utilisateur (cheminement et conditions de transport valid?s par signature d?une charte de transport). Les animaux sont transport?s dans leur cage d'origine et les cages seront prot?g?es du froid ou de la chaleur dans un container souple occultant et isotherme afin de minimiser le stress, pour un transport d'une dur?e de moins de 10 minutes. Le choix de la mise ? mort dans le premier Etablissement Utilisateur sera privil?gi? si l?organisation des laboratoires et des ?quipements au moment de la mise ? mort le permet.

Choix des espèces

Lors de ce projet, nous cherchons ? ?tudier l??volution des capacit?s intrins?ques (aptitudes physiques et cognitives non li?es ? un apprentissage ou un entrainement) d?un individu d??ge avanc? et ses fonctions m?taboliques en fonction d?un traitement anti-GDF15. Cela n?cessite de l??tudier sur des organismes vivants, humains ou mod?les animaux. La souris semble un choix plus appropri? pour cette ?tude gr?ce ? l?esp?rance de vie plus courte et des processus physiologiques similaires ? l?Homme. Pour ?tudier les diff?rentes trajectoires de vieillissement, une ?valuation des capacit?s et des fonctions m?taboliques sera r?alis?e ? trois ?ges diff?rents : 6, 12 et 18 mois. L?objectif est d?identifier le r?le pr?coce de GDF-15 et de l?action du traitement test? ? long terme.

Espèce en danger critique d'extinction, l'Apron du Rhône fait ici l'objet d'une étude où 160 individus issus d'élevage vont être utilisés, tous mis à mort, dans des procédures classées de souffrance modérée. Chaque poisson est marqué, soumis à une restriction alimentaire, à un test de tolérance à la chaleur poussé jusqu'à la perte d'équilibre et à des mesures d'effort de nage. Le porteur inscrit le projet dans un Plan National d'Action et annonce vouloir améliorer les connaissances utiles à la conservation. L'étude vise donc à protéger une espèce menacée en mettant à mort 160 de ses représentants élevés pour l'occasion, leurs organes prélevés pour analyse.

Objectifs

Ce projet vise ? identifier les m?canismes responsables du d?clin des populations d?Apron du Rh?ne, une esp?ce end?mique du bassin du Rh?ne aujourd?hui class?e en danger critique d?extinction et faisant l?objet d?un Plan National d?Action. De nombreuses ?tudes ont ?t? men?es afin de conna?tre les causes ?cologiques de ce d?clin mais tr?s peu se sont int?ress?es aux m?canismes physiologiques pouvant expliquer la difficult? de cette esp?ce ? maintenir des populations stables. Dans le contexte des changements climatiques et du r?chauffement des rivi?res, il avait ?t? sugg?r? que cette esp?ce pr?sentait une faible capacit? d?acclimatation aux hausses de la temp?rature environnementale. Cependant, lors d?une ?tude r?cente, une ?quipe a montr? que cette esp?ce tol?rait facilement une vague de chaleur. Comme l?augmentation de la temp?rature du milieu s?accompagne chez les poissons (dont la temp?rature corporelle d?pend de l?eau), d?une augmentation de la d?pense d??nergie, une autre hypoth?se attenante serait que l?Apron du Rh?ne ne pourrait tol?rer les variations de temp?rature qu?avec assez de nourriture pour faire face ? cette d?pense d??nergie. Afin de tester cette hypoth?se, des Aprons issus d?une reproduction artificielle seront soumis ? deux temp?ratures diff?rentes et/ou ? une diminution de la quantit? de nourriture pendant 4 semaines au minimum. Puis des mesures de tol?rance thermique, de performances de nage et des d?penses d??nergie de l?animal et fonctionnement ?nerg?tique de ses tissus seront r?alis?es pour d?crire, ? la fois sur l?animal et sur ses tissus, les cons?quences de ces deux contraintes isol?es ou combin?es sur le fonctionnement de cette esp?ce prot?g?e, afin d?am?liorer les connaissances visant ? sa conservation.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d?am?liorer les connaissances sur le fonctionnement et les besoins de l?Apron du Rh?ne, une esp?ce menac?e. Il permettra notamment de mieux comprendre comment les variations de temp?rature de l?eau et la disponibilit? de nourriture peuvent influencer la capacit? de ces poissons ? vivre, ? se d?placer et ? faire face ? des conditions difficiles. Ces r?sultats aideront ? mieux prendre en compte ces facteurs dans les actions de conservation.

Procédures

Les poissons seront soumis ? plusieurs interventions au cours du projet. Toutes les interventions ne concerneront pas n?cessairement chaque individu, car les essais seront organis?s par lots et par s?quences. ? Marquage individuel pour le suivi : 1 fois, dur?e d?environ 5 ? 10 minutes par poisson. ? Manipulations de routine (capture, transfert, pes?e et mesure) : plusieurs fois au cours du suivi (environ 3 ? 6 fois selon les s?quences), dur?e de quelques minutes par poisson ? chaque fois. ? Une restriction alimentaire pour certains groupes : alimentation r?duite ? 50% de la ration ?normale?, pendant la p?riode de conditionnement (jusqu?? ~8 semaines pour le groupe exp?rimental ? restriction alimentaire ?). ? Une mise ? jeun avant certaines mesures afin d??viter l?effet de la digestion sur le m?tabolisme : je?ne standardis? d?environ 24h, avec une dur?e totale strictement inf?rieure ? 48h, r?p?t? avant chaque test m?tabolique (au maximum 2 fois selon la s?quence exp?rimentale). ? Test de tol?rance ? la chaleur (exposition ? une augmentation progressive de la temp?rature jusqu?? un point limite) : au maximum 1 fois par poisson, dur?e totale d?environ 90 minutes. ? Mesures en dispositif de nage : au maximum 1 fois par poisson. Les poissons sont plac?s la veille (vers 16h-18h) dans un tunnel de nage pour une phase d?acclimatation d?environ 12h et le matin (8h-9h) l?enregistrement de performance de nage commence pour maximum 6 heures. ? Mesure de temp?rature pr?f?r?e dans un dispositif d?di? (pr?f?rence thermique) : au maximum 1 fois par poisson, dur?e d?environ 24 heures. ? Fin de proc?dure : euthanasie sur un sous-?chantillons de poissons en fin de protocole, suivie de pr?l?vements d?organes r?alis?s imm?diatement apr?s (quelques minutes) pour des analyses en laboratoire.

Impact sur les animaux

Les effets ind?sirables attendus sont principalement li?s au stress physiologique induit par : - Le changement d?environnement (transport entre les deux animaleries), - Les manipulations exp?rimentales (tunnels de nage, chambre de respirom?trie, ?chauffement thermique, restriction calorique). Ce stress peut favoriser des troubles immunitaires et l?apparition d?infections opportunistes, notamment chez des individus d?j? fragilis?s. Ce risque sera r?duit par des phases de r?cup?ration post-manipulation, une surveillance rigoureuse de l??tat des animaux et une stabulation adapt?e (eau filtr?e, oxyg?n?e, cachettes, densit? contr?l?e). Les autres effets ind?sirables incluent : - Le je?ne alimentaire impos? avant les mesures m?taboliques (~24h, strictement

Devenir

Les poissons seront mis ? mort ? la fin de la proc?dure selon la r?glementation en vigueur, afin de pouvoir pr?lever les organes et r?aliser les mesures de fonctionnement ?nerg?tique des cellules (capacit? des tissus ? produire de l??nergie).

Remplacement

A ce jour, seule l?exp?rimentation sur animaux permet de r?aliser une ?tude int?grative qui prend en compte l?ensemble de l?organisme et ses r?ponses physiologiques, surtout lorsqu?il s?agit d?animaux issus de la faune sauvage, ou non mod?les. Cela permet notamment de caract?riser les interactions complexes entre les tissus et leurs fonctions cellulaires. Cette vision globale est indispensable pour ?tudier de fa?on compl?te, les r?ponses m?taboliques de l?animal face ? son environnement. Afin de ne pas impacter les populations naturelles (tr?s faibles dans le cas de l?Apron du Rh?ne), notre ?tude utilise des poissons uniquement issus d?un ?levage.

Réduction

Compte tenu de la variabilit? interindividuelle attendue (taille, masse, r?ponses physiologiques), le nombre d?animaux a ?t? r?duit au strict n?cessaire tout en garantissant la pertinence scientifique et statistique. Le marquage individuel permet un suivi longitudinal et l?utilisation de mod?les ? mesures r?p?t?es dans lesquels l?individu est l?unit? statistique et peut ?tre int?gr? comme effet al?atoire, ce qui optimise l?information obtenue par poisson et limite le besoin d?augmenter les effectifs. Le projet pr?voit jusqu?? 160 poissons. Le nombre d?animaux n?cessaire pour r?pondre aux objectifs scientifiques est de 136 poissons (r?partis entre les groupes temp?rature ? alimentation). Une r?serve de 24 poissons (?15%) est pr?vue uniquement pour compenser d??ventuelles pertes li?es au transport, ? l?acclimatation ou au retrait pr?coce d?un individu pour raison de bien-?tre. Cette r?serve n?augmente pas le nombre d?animaux effectivement utilis?s si elle n?est pas mobilis?e. Le plan exp?rimental vise ? maximiser l?information recueillie par individu (mesures standardis?es et comparables) afin de limiter le recours ? des animaux suppl?mentaires. Dans notre cas, les effets attendus incluent non seulement l?impact d?une restriction calorique, mais aussi l?interaction crois?e temp?rature ? restriction calorique, pour laquelle les r?ponses peuvent se chevaucher entre groupes et g?n?rer des tailles d?effet plus modestes. Un effectif de 16 individus par groupe nous permet donc de conserver une puissance statistique suffisante pour d?tecter ces effets tout en restant dans un cadre de r?duction.

Raffinement

Le transport (du site d??levage ? l?animalerie) est r?alis? dans des contenants adapt?s (bacs de transport calorifug?s), avec eau bull?e en continu, contr?le de la temp?rature, densit? limit?e et dur?e r?duite (< 5 heures). ? l?arriv?e, les poissons sont plac?s en aquariums pr?par?s ? l?avance et font l?objet d?une surveillance rapproch?e (3 rondes journali?res minimum durant la premi?re semaine). Lors des protocoles in vivo, un des principaux objectifs est de limiter au maximum le stress et la douleur des animaux. Chaque geste contraignant (mesures et changement de milieu ? tunnel, chambre ou nouvel aquarium) sera r?alis? sous anesth?sie l?g?re, suivi par un temps d?acclimatation de 12h dans le tunnel de nage avant les protocoles de respirom?trie. Apr?s chaque exp?rience, les poissons seront replac?s dans leur aquarium de stabulation et toutes les pr?cautions seront prises pour leur ?viter toutes nuisances visuelles et sonores. Les Aprons seront maintenus dans des aquariums de 50L ou 90L en densit? adapt?e ? leur esp?ce, agr?ment?s de plantes artificielles, de gravier et de cachettes en tube PVC. Quel que soit leur groupe exp?rimental, les poissons seront nourris une fois par jour, avec des larves de chironome et lors du nourrissage, leur comportement sera particuli?rement observ?. Un poisson ne se nourrissant pas ou pr?sentant un comportement anormal sera imm?diatement isol? dans un bac de r?cup?ration o? il b?n?ficiera de conditions environnementales optimis?es (r?duction des stimuli, oxyg?nation renforc?e, diminution du stress par apport de sel, acc?s facilit? ? la nourriture). Une observation biquotidienne sera r?alis?e par le personnel animalier et les exp?rimentateurs afin de veiller au bien-?tre des animaux depuis leur arriv?e ? l?animalerie jusqu?? l?euthanasie. Enfin, les ?tats de sant? et de bien-?tre des animaux seront ainsi ?valu?s quotidiennement en prenant en compte les signes cliniques et comportementaux selon des grilles d??valuation afin de d?finir des points limites adapt?s et pr?coces pour mettre fin ? toute douleur incompatible avec les objectifs du projet dans les plus brefs d?lais : retrait du protocole si un poisson pr?sente durablement une respiration anormale, une perte d??quilibre, une incapacit? ? nager correctement, un refus de s?alimenter, ou des l?sions visibles. L?animal est alors plac? en bac de r?cup?ration ; en l?absence d?am?lioration rapide, une euthanasie est pratiqu?e selon les m?thodes r?glementaires.

Choix des espèces

Comprendre les causes du d?clin de l?Apron du Rh?ne n?cessite l?utilisation de ce poisson en tant que mod?le d??tude. Du fait de l?importance des actions de conservation engag?es pour la sauvegarde de cette esp?ce, il existe une litt?rature cons?quente concernant des approches ?cologiques mais les param?tres physiologiques que l?on souhaite caract?riser dans cette ?tude n?ont que tr?s peu ?t? abord?s. Afin de ne pas impacter les populations naturelles, les poissons utilis?s dans cette ?tude proviennent exclusivement d?un ?levage exp?rimental. Les Aprons seront des jeunes adultes (2ans) afin de (i) limiter la variabilit? li?e au d?veloppement rapide des juv?niles (croissance/ontog?nie), (ii) travailler sur des individus dont les fonctions physiologiques sont stabilis?es (morphologie, capacit?s de nage, tol?rance thermique), et (iii) ?viter des biais potentiels li?s ? la maturation/reproduction (changements hormonaux, allocation d??nergie aux gonades) qui peuvent modifier fortement le m?tabolisme et la r?ponse ? la temp?rature et ? l?alimentation.

688 souris vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune enchaînant traitement antibiotique, gavages répétés, inoculations rectales sous anesthésie et tests de tolérance au glucose. Certaines reçoivent en plus l'implantation d'une pompe osmotique sous la peau pendant six semaines et des instillations nasales d'acariens pour induire un asthme. Le projet étudie un métabolite du microbiote intestinal dans l'obésité, le diabète et l'asthme, avec des applications probiotiques adossées à un brevet. Le porteur affirme qu'il reste "nécessaire" de recourir à l'animal vivant, la complexité des interactions entre organes étant difficile à reproduire in vitro.

Objectifs

Ce projet vise ? mieux comprendre comment les bact?ries pr?sentes dans l?intestin influencent certaines maladies chroniques fr?quentes, comme l?ob?sit?, le diab?te de type 2 et l?asthme. Ces maladies sont souvent li?es entre elles et partagent des m?canismes communs, notamment une inflammation persistante de l?organisme et un d?s?quilibre du microbiote intestinal (ensemble des bact?ries vivant dans l?intestin). Certaines bact?ries intestinales produisent naturellement des substances appel?es m?tabolites, qui peuvent avoir des effets b?n?fiques sur la sant?. L?un de ces m?tabolite, est produit uniquement par la flore intestinale, mais son r?le exact dans ces maladies reste encore mal connu. L?objectif de ce projet est d??tudier comment ce m?tabolite d'int?r?t et les bact?ries le produisant, influence le m?tabolisme du glucose et des lipides, ainsi que l?inflammation des voies respiratoires. Pour cela, nous utiliserons des mod?les de souris pr?sentant des caract?ristiques proches de celles observ?es chez l?Homme dans l?ob?sit?, le diab?te et l?asthme. Les effets de ce m?tabolite seront ?tudi?s sur le contr?le de la glyc?mie, la prise de poids, l?accumulation des graisses au niveau du foie et l?inflammation des poumons. Ce projet, men? sur cinq ans, respectera strictement les r?gles ?thiques et le bien-?tre animal. Les r?sultats attendus pourraient contribuer au d?veloppement de nouvelles approches pr?ventives ou th?rapeutiques bas?es sur le microbiote intestinal.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche ouvre des perspectives prometteuses pour le d?veloppement de nouvelles strat?gies th?rapeutiques chez l?Homme fond?es sur des produits probiotiques. L?enrichissement cibl? en bact?ries productrices de m?tabolites b?n?fiques, comme le 4-cr?sol, pourrait non seulement am?liorer l?hom?ostasie glucidique et lipidique, mais aussi att?nuer l?inflammation syst?mique impliqu?e dans l?ob?sit?, le diab?te de type 2 et l?asthme allergique. Le brevet sur lequel ce projet se fonde (Compounds for the prevention and treatment of glucose intolerance related conditions and obesity. Patent Ref. EP 17306326.4 -1466, filed 4 October 2017), et les essais cliniques en cours pour ?valuer l?efficacit? de produits probiotiques, en particulier pour le traitement de la maladie de Crohn, illustrent l?importance des applications th?rapeutiques potentielles des r?sultats des proc?dures exp?rimentales. Les m?canismes sous-jacents, impliquant des interactions complexes entre le microbiote, l'h?te et son environnement, font l'objet de recherches intensives. Bien que des d?fis persistent concernant la s?lection des souches, le dosage ou la variabilit? interindividuelle, ce projet pourrait contribuer ? l??mergence de th?rapies probiotiques de nouvelle g?n?ration en compl?ment ou en alternative aux traitements actuels.

Procédures

Proc?dure 1 Les animaux sont soumis ? des interventions non chirurgicales, r?alis?es chez des animaux vigiles ou sous anesth?sie l?g?re. Ils re?oivent un traitement antibiotique dans l?eau de boisson pendant 11 jours, suivi d?un enrichissement de la flore intestinale par inoculation de bact?ries non pathog?nes, comprenant un gavage oral trois fois par semaine chez l?animal vigile (contention < 30 s) et une inoculation rectale une fois par semaine sous anesth?sie l?g?re ? l?isoflurane. Le poids et la glyc?mie sont mesur?s une fois/semaine ? partir d?une goutte de sang pr?lev?e ? la queue. Un premier test de tol?rance au glucose par voie intrap?riton?ale (IPGTT, dur?e ? 2 h) est r?alis? ? J15, avec 6 pr?l?vements glyc?miques (< 3 ?l) aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 minutes, et 4 pr?l?vements sanguins suppl?mentaires (10?15 ?l) aux temps 0, 15, 30 et 90 minutes pour le dosage de l?insuline. Un second IPGTT est r?alis? deux mois apr?s le d?but des inoculations. Un test de tol?rance au pyruvate (PTT, ? 2 h) est r?alis? ? J30 avec 7 pr?l?vements glyc?miques (0, 15, 30, 45, 60, 90, 120 min). Un test de tol?rance ? l?insuline (ITT, ? 2 h) est r?alis? ? J45 avec 7 pr?l?vements glyc?miques selon le m?me sch?ma temporel. Proc?dure 2 Les animaux subissent une proc?dure chirurgicale unique correspondant ? l?implantation sous-cutan?e dorsale d?une minipompe osmotique, r?alis?e sous anesth?sie ? l?isoflurane et analg?sie pr?ventive. Cette intervention de courte dur?e (? 10 min) permet une perfusion continue de solution saline ou de 4-cr?sol pendant 6 semaines. Deux semaines apr?s l?implantation, les animaux sont soumis ? 4 administrations intranasales d?extraits d?acariens ou de solution saline (J0, J11, J12, J13), r?alis?es chez des animaux vigiles et de tr?s courte dur?e (< 1 min). Proc?dure 3 Les animaux sont soumis ? des interventions non chirurgicales. Ils re?oivent un traitement antibiotique pendant 11 jours, suivi d?un enrichissement de la flore intestinale par gavage oral r?p?t? trois fois par semaine chez l?animal vigile et une inoculation rectale hebdomadaire sous anesth?sie l?g?re ? l?isoflurane. Un suivi clinique hebdomadaire (poids, glyc?mie) est r?alis?. Les animaux sont ?galement soumis ? 4 administrations intranasales d?extraits d?acariens ou de solution saline (J0, J11, J12, J13), chacune de courte dur?e et sans proc?dure chirurgicale.

Impact sur les animaux

Compte tenu de notre exp?rience dans les proc?dures mises en ?uvre dans ce projet, toutes optimis?es et publi?es, nous ne pr?voyons pas de nuisances ou d?effets ind?sirables conduisant ? une mise ? mort anticip?e. Induction de l?ob?sit? et du diab?te par r?gime HFD (Proc?dure?1) : l?ob?sit? induite reste mod?r?e et n?entrave ni les mouvements ni l?acc?s ? la nourriture ; les troubles associ?s correspondent ? une nuisance l?g?re. Enrichissement de la flore par des bact?ries productrices de 4?cr?sol (Proc?dures?1&3) : l?inoculation par gavage, n?cessitant une contention br?ve (10?% avec diarrh?e, une injection sous-cutan?e de s?rum physiologique est r?alis?e. Tests de tol?rance au glucose et ? l?insuline (Proc?dure?1) : les volumes sanguins pr?lev?s sont minimes et espac?s d?une semaine. La micro-coupure distale de la queue induit une douleur mod?r?e ? cicatrisation rapide (nuisance mod?r?e). Administration chronique de 4?cr?sol par minipompes osmotiques (Proc?dure?2) : l?implantation sous?cutan?e dorsale est r?alis?e sous analg?sie par bupr?norphine (0,03?mg/ml, vol. = poids ??6, i.p.) et 30 min plus tard sous isoflurane 3,5?% induction, 1,5?% maintien. Cette proc?dure induit une nuisance mod?r?e avec douleur postop?ratoire transitoire, soulag?e par m?loxicam (5 mg/kg). Les minipompes implant?es pendant 6?semaines sont bien tol?r?es, sans rejet ni infection, et n?entravent ni les mouvements ni l?acc?s ? la nourriture (Brial et al., Cell Reports?2020 ; Gut?2021). Induction de l?asthme par administration intranasale d?extrait d?acariens (HDM) (Proc?dures?2&3) : l?administration intranasale est peu invasive et induit une nuisance l?g?re et transitoire. Les administrations aux jours 0, 11, 12 et 13 (Wypych et al., Nature Immunology, 2021) conduisent ? l?installation progressive d?un mod?le d?asthme allergique exp?rimental avec inflammation des voies a?riennes, sans crise aigu? imm?diate, correspondant ? une nuisance mod?r?e. Les animaux peuvent pr?senter une respiration l?g?rement plus rapide ou superficielle mais conservent activit? normale et acc?s ? nourriture et eau. Une surveillance quotidienne (respiration, activit?, poids) est r?alis?e, et toute aggravation s?v?re, notamment perte de poids >15?%, entra?nera une mise ? mort anticip?e.

Devenir

Les 688 animaux de la proc?dure seront euthanasi?s ? la fin de la proc?dure.

Remplacement

Le contr?le du m?tabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux, avec la contribution de produits du microbiote intestinal, en permanence pour informer l'organisme des besoins ?nerg?tiques et contr?ler les flux ?nerg?tiques en fonction des besoins. Il est tr?s difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des mod?les animaux vivants est encore n?cessaire.

Réduction

Pour r?duire le nombre d'animaux, nous avons effectu? un travail en amont qui nous a permis d'identifier les bact?ries, non virulentes et qui peuvent cro?tre dans des conditions compatibles ? la souris, gr?ce ? des analyses in vitro et in silico. Ainsi cette s?lection, effectu?e en partenariat avec l'?quipe de microbiologie, a abouti ? ne retenir que les bact?ries candidates les plus fiables et ce sont elles qui seront test?es in vivo, r?duisant ainsi le nombre d'animaux n?cessaires ? l'?tude. Les ?chantillons pr?lev?s chez chaque animal permettront de g?n?rer un grand nombre d?informations sur des marqueurs mol?culaires. De plus, nous avons estim? la taille des ?chantillons (n=8) permettant une analyse statistique efficace gr?ce aux donn?es de la litt?rature.

Raffinement

Les animaux feront l?objet d?une observation quotidienne durant les phases d?induction exp?rimentale, notamment lors de l?induction de l?asthme allergique. Un suivi du poids corporel sera ensuite r?alis? trois fois par semaine afin de d?tecter pr?cocement tout signe de mal-?tre ou de d?tresse respiratoire. Toute souris atteignant un point limite pr?d?fini, notamment une perte de poids sup?rieure ? 15 % ou des signes respiratoires s?v?res, sera imm?diatement euthanasi?e conform?ment aux proc?dures en vigueur. Afin de r?duire le stress et l?inconfort, l?enrichissement de la flore intestinale par voie rectale sera r?alis? sous anesth?sie l?g?re apr?s induction ? l?isoflurane. Les sondes utilis?es seront souples et de diam?tre adapt? ? la taille de l?animal afin d??viter toute l?sion. L?inoculation par voie orale sera r?alis?e chez l?animal vigile, cette m?thode ?tant mieux tol?r?e et ne n?cessitant qu?une contention de courte dur?e. Lors des tests de tol?rance au glucose, le volume de sang pr?lev? sera strictement limit? au minimum n?cessaire au dosage de l?insuline (5 ?l de plasma), afin de r?duire la contrainte li?e aux pr?l?vements r?p?t?s. Apr?s l?implantation des minipompes osmotiques, les animaux seront surveill?s attentivement et une analg?sie appropri?e (m?loxicam (5 mg/kg)) toutes les 12h pendant 2 jours sera syst?matiquement mise en place pour pr?venir la douleur postop?ratoire. Enfin, les animaux seront pr?alablement habitu?s ? la contention et au gavage avant le d?but des inoculations, afin de limiter le stress li? aux manipulations r?p?t?es.

Choix des espèces

Les mod?les murins pr?sentent de fortes homologies physiologiques et immunologiques avec l?Homme et constituent des outils indispensables pour ?tudier les m?canismes de r?gulation de l?hom?ostasie ?nerg?tique, incluant les m?tabolismes glucidique, lipidique et inflammatoire. La majorit? des lign?es isog?niques de souris d?veloppent une prise de poids, une hyperglyc?mie et une st?atose h?patique en r?ponse ? un r?gime riche en graisses, reproduisant des caract?ristiques cl?s de l?ob?sit? et du diab?te de type 2 humains. Les voies mol?culaires impliqu?es dans ces pathologies sont largement conserv?es entre la souris et l?Homme. La souris est ?galement le mod?le de r?f?rence pour l??tude de l?asthme allergique. L?exposition intranasale ? des allerg?nes tels que les extraits d?acariens permet de reproduire les principales caract?ristiques de l?asthme humain, notamment l?inflammation des voies a?riennes, le recrutement de cellules immunitaires et les r?ponses de type 2. Les m?canismes immunopathologiques sous-jacents sont fortement conserv?s, justifiant l?utilisation de ce mod?le. Nous utiliserons des souris C57BL/6J ?g?es de 2 ? 6 mois. Cet ?ge a ?t? choisi pour plusieurs raisons. Tout d'abord, ? cet ?ge, le microbiote intestinal est relativement stable, ce qui permet de minimiser les variations interindividuelles et de mieux contr?ler les effets de la manipulation exp?rimentale. De plus, les souris ont atteint leur maturit? physiologique, ce qui est essentiel pour ?tudier les m?canismes sous-jacents ? la question scientifique. Enfin, cet ?ge a ?t? largement utilis? au laboratoire dans des ?tudes pr?c?dentes sur le m?me mod?le, en particulier dans des protocoles de perfusion de 4-cresol avec des minipompes osmotiques (Brial et al. Cell Reports 2021), ce qui peut r?duire le nombre de souris en retirant le besoin d?exp?riences exploratoires, et facilite la comparaison de nos r?sultats avec la litt?rature existante.