Système endocrinien

480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 384 d'entre elles étant ensuite replacées en élevage et les autres tuées. Elles subissent un jeûne pouvant durer 24 heures, un hébergement isolé lors des tests de comportement alimentaire et des prélèvements de sang à la queue et à la joue, pour étudier le rôle de l'hormone hépatique FGF21 dans l'appétence au sucre et à l'alcool. Le porteur indique que le jeûne peut abaisser la glycémie et la température corporelle et que l'isolement peut stresser les animaux. Il affirme que ces mécanismes, faisant intervenir plusieurs organes, ne peuvent être reproduits par des méthodes alternatives.

Objectifs

Le foie est un régulateur central du métabolisme et du dialogue avec les autres organes, notamment avec le cerveau pour assurer le contrôle de différents types de comportements alimentaires. Dans ce dialogue entre le foie et le cerveau, la protéine FGF21 (pour Fibroblast Growth Factor 21), une hormone produite de manière prédominante par le foie (hepatokine), exerce divers effets métaboliques parmi lesquels le contrôle de l’appétence pour le sucre et l’alcool. FGF21 est aussi une hormone dont l’expression est fortement induite lors du jeûne. La majorité des recherches sur cette hormone a été réalisée grâce à l’utilisation de souris déficientes pour FGF21 dans tout l’organisme et avec des souris transgéniques surexprimant FGF21. Dans ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur l’implication de FGF21 spécifiquement du foie lors du jeûne et dans le comportement alimentaire.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus permettront de valider notre modèle de délétion spécifiquement hépatique de FGF21. De plus, ce projet permettra de démontrer ou réfuter que FGF21 d’origine hépatique contrôle la préférence au sucre et à l’alcool. En effet, les résultats décrits jusqu’alors dans la littérature ont été obtenus à partir de souris délétées pour FGF21 dans tout l’organisme ou surexprimant FGF21 dans tout l’organisme. Ces modèles sont peu physiologiques et ne permettent pas de définir l’origine tissulaire de FGF21 dans ces effets.

Procédures

Dans la procédure 1, les animaux seront mis à jeun pendant 24h maximum. Pour la mesure de la glycémie, un prélèvement d’une seule goutte de sang (

Impact sur les animaux

Le jeûne peut induire une baisse du taux de glucose circulant et une baisse de la température corporelle. La consommation d’eau sucrée et d’alcool peut entraîner une augmentation de la glycémie. L’hébergement isolé (1 animal/cage) lors des tests de comportement alimentaire et des récoltes d’urine en cages métaboliques peut entraîner un stress de l’animal. La piqûre pour mesure la glycémie ainsi que le prélèvement de sang peuvent entraîner une douleur.

Devenir

A la fin de la procédure 1 de jeûne, les animaux seront euthanasiés. A la fin de la procédure 2, les animaux seront replacés en élevage après examination par la vétérinaire référente.

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux de laboratoire car les phénomènes biologiques étudiés (jeûne et comportement alimentaire) sont complexes et font intervenir différents tissus agissant en synergie (foie, tissus adipeux, intestin, cerveau, muscle). Il est impossible de mimer ceci par l’utilisation de méthodes alternatives. L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car il est possible d’étudier la protéine d’intérêt (FGF21) grâce à l’utilisation de souris génétiquement modifiées.

Réduction

Le nombre d’animaux pour ce projet est défini pour permettre d’une part de répondre aux questions scientifiques et d’autre part de respecter la réduction du nombre d’animaux au maximum. Ainsi, nous utiliserons le plus petit nombre d’animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux a été déterminé par un calcul de puissance et est basé sur des données provenant d’expériences antérieures du laboratoire. Ce nombre d’animaux est le nombre minimum nécessaire mais suffisant afin d’obtenir des résultats exploitables.

Raffinement

Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement. Tous les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé (température, hygrométrie). Des enrichissements du milieu de vie (cabanes en inox et ouate de coton ou de cellulose) seront disposés dans la cage afin de pouvoir se distraire, se cacher et fabriquer des nids. Pour un meilleur raffinement et limiter le stress, les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux, et nous mesurerons leur consommation alimentaire et hydrique afin de vérifier la bonne tolérance des différentes expérimentations. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres (indice 0 = normal ou léger, indice 3 = changements importants par rapport à la normale). Si un animal présente un signe quelconque de souffrance (inactivité, somnolence, respiration lente, déshydratation) avec un score de 3 après évaluation de ces paramètres, le critère d’arrêt sera atteint. L’animal sera aussitôt retiré de l’étude et replacé dans des conditions d’hébergement standard (hébergement collectif, régime standard et aucune procédure réalisée).

Choix des espèces

L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car le développement des organes métaboliques est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.

369 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 290 tuées à l'issue et 79 gardées vivantes pour être réutilisées. Elles subissent un décalage horaire imposé pendant trois semaines, des frottis vaginaux répétés jusqu'à treize semaines et jusqu'à neuf microprélèvements de sang par jour à la queue pendant une quinzaine de jours, pour étudier l'effet d'un rythme de travail posté sur la fertilité. Le porteur décrit une irritation vaginale et une douleur modérée liée à l'incision de la queue. Il affirme que l'étude de ces mécanismes exige des "organismes entiers vivants" et ne peut se faire sur des cellules isolées.

Objectifs

La rythmicité journalière est très importante dans la régulation des fonctions biologiques. Cette rythmicité est dépendante d'une horloge endogène principale, essentiellement synchronisée par l'alternance lumière/obscurité. Chez les mammifères femelles, la fonction de reproduction présente des cycles dont la régularité repose sur ce système circadien. Ainsi, le pic préovulatoire de l'hormone lutéinisante (LH), qui déclenche l'ovulation, dépend du signal journalier généré par l’horloge endogène, en plus du rétrocontrôle positif de l’estrogène produit par les follicules ovariens matures, ce qui permet à l'ovulation d'avoir lieu au moment le plus favorable au succès reproducteur. Dans ce contexte, la désynchronisation de l’horloge biologique, induite par des altérations chroniques du cycle lumière/obscurité, a un impact négatif sur la fonction de reproduction. Il a été récemment mis en évidence qu’un protocole de décalage horaire chronique sur plusieurs semaines, mimant les horaires d’une personne en travail posté, conduit à une altération de l’occurrence du pic préovulatoire de LH et à une diminution de la fertilité chez les souris femelles. Ce projet a pour objectif de comprendre comment un décalage horaire chronique comme celui observé chez les femmes en travail posté, perturbe la transmission de l'information journalière de l'horloge principale vers l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique, conduisant alors à une altération de la fonction de reproduction et de la fertilité.

Bénéfices attendus

A court terme, les conclusions de ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes neuroendocriniens impliqués dans la régulation de la fonction de reproduction par le système circadien et comment ils sont altérés par une perturbation du cycle lumière/obscurité chez la souris femelle. A plus long terme, cette étude permettra d'ouvrir la voie à l'élaboration de recommandations pour limiter les effets néfastes de la perturbation du rythme circadien sur la fertilité des femmes dans le cadre du travail posté.

Procédures

Les animaux pourront être soumis à un décalage horaire chronique pendant 3 semaines, à un ou deux frottis vaginaux par jour, d'une durée d'environ 30 secondes chacun, au maximum pendant 13 semaines et à 9 microprélèvements sanguins à la queue par jour, d'une durée d'environ 30 secondes chacun, pendant une quinzaine de jours.

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables pouvant être attendu sur les animaux est un stress dû à la perturbation du cycle lumière/obscurité et donc veille/sommeil induite par des avances et des retards successifs de la phase obscure, ayant pour but de mimer un décalage horaire chronique. Un stress peut aussi être induit par la manipulation des animaux au cours de la réalisation des frottis vaginaux et des microprélèvements sanguins à la queue. L'isolement des femelles gestantes peut également être une source de stress. Une irritation modérée de l'orifice vaginale due au frottis vaginaux répétés, ainsi qu'une douleur modérée due à l'incision de l'extrémité distale de la queue pour réaliser des microprélèvements de sang sont d'autres effets indésirables pouvant être attendus sur les animaux.

Devenir

Pour répondre aux questions scientifiques posées, il est nécessaire de mettre à mort 290 animaux. 79 animaux seront gardés en vie pour être réutilisés dans d'autres procédures expérimentales, sinon ils seront mis à mort.

Remplacement

Ce projet est une étude de physiologie intégrée per se. La régulation de l'activité de reproduction est un mécanisme qui fait intervenir plusieurs structures nerveuses et endocrines. L'étude des relations entre ces différents acteurs nécessite l'utilisation d'organismes entiers vivants et ne peut pas se faire sur des organes ou des cellules isolés.

Réduction

Pour chaque procédure expérimentale, le nombre d'animaux par groupe a été réduit au maximum en tenant compte des variabilités interindividuelles et des règles statistiques en vigueur, nous permettant d'obtenir des résultats fiables et robustes. Ces résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques appropriés. De plus, dès que l'expérience s'y prête, un suivi longitudinal de la variable étudié a été privilégié. C'est-à-dire que le même animal sera suivi pour cette variable sur plusieurs jours voir plusieurs semaines, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux nécessaire.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux ou seront isolées, en fonction des contraintes des protocoles expérimentaux. Pour limiter le stress des animaux, les cages seront enrichies avec un bâton à ronger, du matériel pour la nidification (morceaux de coton) et un tunnel. Ce même tunnel sera utilisé pour déplacer la souris lors du change ou pour la capturer afin d’éviter la préhension par la queue. Après leur arrivée à l'animalerie, les souris auront une semaine pour s'habituer à leur nouvel environnement, sans manipulation. Puis, elles seront manipulées quotidiennement pendant 2 semaines avant le début des procédures expérimentales. Des points limites ont également été établis pour identifier les animaux en souffrance et pouvoir les soustraire à cette souffrance.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi pour ce projet est la souris car le fonctionnement de son axe reproducteur est bien connu et présente un cycle régulier d’ovulation spontanée comparable à celui de la femme. Pour répondre aux questions scientifiques posées, nous utiliserons des jeunes adultes afin d’étudier le fonctionnement de l'axe reproducteur mature et non sénescent ainsi que des souris nouveau-nées afin d'étudier le développement de l’axe reproducteur et métabolique.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime enrichi en graisses et en sucre pendant 23 semaines, six séances d'imagerie sous anesthésie avec injection d'un radiotraceur et des tests comportementaux d'activité motrice, de dépression et d'anxiété, pour étudier par imagerie l'atteinte cérébrale liée à une maladie du foie. Le porteur décrit comme effets attendus une prise de poids et un possible stress au réveil des anesthésies. Il affirme qu'un modèle animal est "indispensable" pour cette approche globale et présente le rongeur comme le "modèle de choix".

Objectifs

La NAFLD (acronyme anglais, non-alcoholic fatty liver disease) regroupe un large spectre de maladies hépatiques chroniques caractérisées par une accumulation excessive de graisses dans le foie (stéatose) sans lien avec l’alcool, et qui touchent environ 25% de la population générale et 80% des personnes en obésité morbide. Dans certains cas, la maladie évolue vers la stéatohépatite non alcoolique (NASH, acronyme anglais non-alcoholic steatohepatitis), une forme sévère et irréversible avec inflammation. Cette forme agressive de la maladie favorise l’accumulation de fibrose et peut évoluer vers la cirrhose et ses complications, principalement cardiovasculaires. Cette maladie hépatique est désormais reconnue comme un dysfonctionnement multisystémique, c’est-à-dire que le mauvais fonctionnement du foie entraine le mauvais fonctionnement d’autres organes, comme le cerveau. L’encéphalopathie hépatique est la complication la plus fréquemment décrite et des études ont mis en évidence l’impact de l’obésité et d’une mauvaise alimentation sur le fonctionnement cérébral et cognitif. Cependant, les mécanismes cérébraux sous-jacents restent inconnus à ce jour. L’imagerie fonctionnelle offre la possibilité d’explorer in vivo certains des mécanismes élémentaires qui affectent le fonctionnement cérébral tels que le métabolisme cérébral, la densité synaptique ou l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BHE). L’objectif de ce travail est de mettre en œuvre ces méthodes d’imagerie déjà développées et appliquées dans notre laboratoire, à un modèle rongeur NAFLD/NASH bien caractérisé afin d’identifier les mécanismes physiopathologiques à l’origine des dysfonctionnements cérébraux observés dans cette maladie hépatique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier les différents mécanismes physiopathologiques impliqués dans le dysfonctionnement cérébral observé dans la NAFLD/NASH, et d’établir un score de corrélation entre ces dysfonctionnements cérébraux et les comportements observés chez ces animaux. Cela permettra également d’identifier quelle(s) méthode(s) d’imagerie sera la plus pertinente pour continuer le développement de cette approche chez l’homme. A plus long terme, cela permettra d’envisager l’étude de cette pathologie in vivo chez des patients atteints par ces pathologies avec pour objectif d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : -Administration d’un régime alimentaire enrichi en graisses et sucre, pendant 23 semaines. -Réalisation de sessions d’imagerie (6 par animale) sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum,) -Injection d’un radiotraceur (1 minute) -Les rongeurs seront soumis à des tests comportementaux ( 5/animale) afin de mesurer l'activité motrice qui dure 30 minutes, la dépression qui dure 6 minutes et l’anxiété qui dure 5 minutes. -

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux : - Accumulation de gras dans le foie (asymptomatique) et prise de poids - Possible stress et désorientation au réveil de l’anesthésie relativement longue. - Stress possiblement induit par les tests de comportement

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédure afin d’extraire les organes et réaliser des manipulations ex vivo permettant de corréler les mécanismes biologiques, la distribution des biomarqueurs d’intérêt avec les données en imagerie.

Remplacement

Ce projet a pour objectif d’évaluer l’atteinte multisystémique d’une maladie hépatique. Un modèle animal est indispensable afin d’envisager cette approche globale de la pathologie. Le modèle rongeur NAFLD/NASH est le modèle de choix pour cette approche car déjà largement utilisé pour l’étude de cette maladie avec une atteinte cérébrale mise en évidence par certaines études. Le choix du rongeur est également adapté aux différentes expérimentations envisagées (imagerie et comportement) qui pourront être conduites aisément avec ces animaux.

Réduction

L’utilisation des différentes modalités d’imagerie permettra de réduire drastiquement le nombre d’animaux. Dans la mesure du possible, un même animal passera plusieurs examens d’imagerie sur plusieurs jours d’une même semaine (2 au maximum). Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé comme minimal grâce à une approche statistique.

Raffinement

Les souris, âge de 4 semaines, seront hébergés par groupe dans une cage enrichie avec un tunnel de camouflage, bâtonnets de bois et du matériel pour la fabrication de nids. Les animaux seront observés quotidiennement par les zootechniciens en charge de leurs soins et par les expérimentateurs. Une semaine d’acclimatation est prévue au début de leur séjour et avant de débuter le régime alimentaire HFHSD. Un suivi régulier permettra d’éviter toute souffrance animale. Les animaux traités par le régime HFHSD feront l’objet d’une surveillance journalière et d’un suivi hebdomadaire du poids au cours du traitement. Toutes les interventions invasives (injections intraveineuses) sont réalisées sous anesthésies générales par voie gazeuse afin de minimiser le stress de l’animal et les douleurs liées aux interventions. Afin de minimiser le stress, la phase de réveil sera réalisée dans leur cage. Si un changement de cage est prévu, le transfert d’un peu de litière (généralement un papier absorbant) sera prévu dans la cage propre. En cas de complications, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. L’étude comportementale sera réalisée avec des animaux vigiles mais sera conduite de manière la plus brève possible afin d’éviter tout stress supplémentaire aux animaux. Des points limites sont définis pour éviter toute souffrance animale. .

Choix des espèces

Ce projet a pour objectif d’évaluer l’impact sur le cerveau d’affections hépatiques. La souris est l’animal de choix car plusieurs modèles ont déjà été développés sur cette espèce pour reproduire des dysfonctionnements observés dans cette pathologie. Cette espèce présente également l’avantage d’être particulièrement adaptée aux études d’imagerie par TEP et IRM ainsi qu’à l’étude comportementale. Les souris utilisées seront au stade adulte quand le cerveau a atteint sa maturité et son développement complet (5 semaines à 8 semaines).

7 520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un régime gras pendant douze semaines, des injections, des périodes de jeûne, une chirurgie abdominale et une perfusion dans le cœur, pour étudier des cellules immunitaires des îlots du pancréas. Le porteur indique que 3 630 souris sont tuées d'emblée parce que leur génotype est inutilisable, avant toute procédure. Il affirme que les modèles animaux sont "nécessaires" et rattache l'étude au diabète, sans bénéfice thérapeutique précis annoncé.

Objectifs

Dans le pancreas, les ilots de Langherans sont centraux dans la régulation de la glycémie. Ces micro-organes ont pour fonction de produire les hormones permettant de réguler la glycémie. Les macrophages jouent une rôle important dans la fonction des ilots. Comme tous les tissus, les ilots sont reliés au cerveau par le système nerveux périphériques. Cependant, leur rôle dans la fonction des ilots pancréatiques n’est pas bien connu. En particulier, l’interaction entre les macrophages et le réseau nerveux n’a jamais été étudié. Dans ce projet nous proposons d’étudier les mécanismes d’interaction entre les macrophages et le réseau nerveux des ilots pancréatiques ainsi que le rôle de ces interactions dans la fonction des ilots en condition normal, ainsi que dans trois contextes de stress glycémique: le jeun, l’altération des ilots et le diabète, une maladie caractérisée par une dérégulation de la glycémie. Ce projet se déroulera dans deux établissement utilisateurs.

Bénéfices attendus

Il est aujourd'hui admis que les macrophages jouent un rôle primordial dans la régulation de la glycémie par le gras et le foie. Les macrophages résidant dans les ilots pancréatiques n'ont eux été décrits que tardivement et les contraintes liées à leurs techniques d'analyse font qu'ils restent encore largement ignorés. L'interaction entre les macrophages et le système nerveux a été montré comme primordiale dans la fonction de multiples organes. Cependant de part la difficulté d'étudier les macrophages des ilots pancréatiques, cette interaction n'est pas encore décrit dans les ilots. Ce projet permettra de mieux comprendre les interaction macrophage/réseau nerveux dans la fonction ilots pancréatiques et leurs implication dans le stress glycémique.

Procédures

Etablissement utilisateur 1: 1 biopsie de queue, 1 prélèvement de sang à la joue (10s), 1 régime riche en gras (12 semaines), 9 injection intra-péritonéale (20s), 1 injection sous-cutanée, 1 jeun (6h ou 16h) , 1 injection intra-veineuse, 12 prélèvement de sang à la queue (3s), 1 anesthésies gazeuses (10min), 1 perfusion intra-cardiaque. Etablissement utilisateur 2: 1 anesthésie gazeuse (2h), 1 chirurgie abdominale (2h).

Impact sur les animaux

-Injections intrapéritonéale (ip) : douleur légère due à la piqure. -Injection iv rétro-orbitale (iv) : gêne, douleur légère au point de prélèvement. Les animaux sont sous anesthésie gazeuse au moment du prélèvement. -Injection sous-cutanée (sc) : douleur légère due à la piqure. -Diabète : prise de poids progressive. Les souris peuvent devenir moins actives. Le souris urinent plus souvent. -Chirurgie abdominale : Douleur modérée. Les souris recevront un analgésique opioïde 15min avant la procédure. - Perfusion intra-cardiaque : Douleur modérée. Les souris recevront un analgésique opioïde 15min avant la procédure. - Mise à jeun : gêne due à la sensation de faim. - Micro-coupure à la queue : douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure. -Prélèvement de sang à la joue : douleur légère. -Biopsie de queue : douleur modérée.

Devenir

Procédure 1 : 3630 souris seront mises à mort car leur génotype ne sera pas utilisable. 2280 souris auront le génpotype requis et seront utlisées dans les procédures 2 à 5. Procédure 2 à 5 : Toutes les souris seront mises à mort pour permettre le prélèvement des organes d'intérêts.

Remplacement

Cette étude a pour but d'étudier l'interaction des macrophages avec le système nerveux des ilots pancréatiques en condition normale et de stress glycémique, tels que le diabète. Les ilots pancréatiques répondent à la prise de poids et au dialogue entre différents organes. Cela implique donc d’étudier différents paramètres dans différents organes. Ainsi les modèles animaux sont nécessaires pour mener à bien ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé pour permettre l’analyse des résultats selon des tests statistiques adaptés. Des tests in vitro ainsi que des études pilotes avec des petits nombres d’animaux ont été inclues pour mettre en place des protocole adaptés et réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Dans les cages les souris bénéficient de coton et de « maisons » afin d’augmenter la diversité de leurs activités et qu’elles puissent se construire un nid. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum). Lorsque nécessaire, la douleur et la gêne des souris sont réduites à un niveau modéré par l’administration d’opioïdes et par l’anesthésie. Les souris sont surveillées régulièrement et lors des procédures, les paramètres de santé qui peuvent être affectés sont évalués et notés régulièrement

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de référence dans l'étude de l'obésité. De nombreux outils sont disponibles chez la souris. Les souris sont utilisées entre l’âge de 10 jours et 22 semaines.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues diabétiques par cinq injections de streptozotocine, elles reçoivent des îlots humains encapsulés par chirurgie abdominale, puis sont suivies trois mois avec prises de sang par section de la queue et tests de tolérance au glucose avant une seconde chirurgie et la mise à mort. Le porteur liste parmi les effets une perte de poids, une hyperglycémie et une possible nécrose de l'extrémité de la queue. Il juge le recours à l'animal "indispensable" et choisit la souris pour consommer moins d'îlots humains, "tissu rare", que le rat.

Objectifs

La transplantation d’îlots pancréatiques est une thérapie prometteuse du diabète de type 1. Celle-ci vise à remplacer les cellules béta pancréatiques (sécrétrices d’insuline) défectueuses par l’injection d’îlots sains (issus de dons multi-organe) par voie intra-portale dans le foie de patients diabétiques. Cette stratégie thérapeutique qui permet une régulation glycémique plus physiologique et moins contraignante que les injections pluriquotidiennes d’insuline. Cependant, cette approche thérapeutique comporte encore de nombreux verrous limitant son application clinique à grande échelle. En effet, un des verrous majeurs est la réaction inflammatoire massive générée au moment de la transplantation qui est à l’origine de la perte de près de 40% de la masse d’îlots implantée. Un second verrou majeur est la réaction immunologique de rejet qui nécessite la mise en place d’un traitement immunosuppresseur connu pour être délétère pour la survie et la fonction de la greffe à plus ou moins long terme. Depuis les années 80, de nombreuses équipes ont tenté de mettre en place un pancréas bioartificiel basé sur l’encapsulation des îlots pancréatiques. Néanmoins, à ce jour, aucun système n’a réellement montré d’efficacité à long terme sur la survie et la fonction des îlots. Ainsi, cette approche de protection des îlots doit être encore améliorée et c’est dans ce contexte que nous situons notre projet de recherche. Ainsi, dans le but de promouvoir cette thérapie en levant ces verrous, nous souhaitons tester différentes méthodes d’encapsulation des îlots à l’aide d’hydrogels. Nous souhaitons donc tester in vivo l’impact de l’encapsulation d’îlots humains dans le cadre d’une xénogreffe (le donneur est d'une espèce biologique différente de celle du receveur) dans la cavité abdominale de souris rendues diabétiques par injection intra-péritonéale de streptozotocine. Cette étude permettra d’évaluer l’effet protecteur de notre encapsulation sur les réactions de rejet et les réactions inflammatoires.

Bénéfices attendus

La transplantation d’îlots pancréatiques comporte de nombreux verrous limitant son application clinique à grande échelle. En effet, un des verrous majeurs est la réaction inflammatoire massive générée au moment de la transplantation qui est à l’origine de la perte de près de 40% de la masse d’îlots implantée. Un second verrou majeur est la réaction immunologique de rejet qui nécessite la mise en place d’un traitement immunosuppresseur connu pour être délétère pour la survie et la fonction de la greffe à plus ou moins long terme. Ainsi, l’encapsulation d’îlots pancréatiques permettrait de protéger leur destruction par les réactions inflammatoires et de rejet. De plus au vu de la pénurie d’organe inhérent à toute greffe d’organe, l’encapsulation permettrait d’utiliser des îlots pancréatiques d’espèces différentes. Par ailleurs, l’implantation de d’îlots encapsulés dans la cavité abdominale permet de se soustraire de ces réactions inflammatoires médiées par le sang à l’origine d’une destruction massive des îlots post transplantation. Ainsi, notre stratégie permettrait de maintenir à long terme la survie et la fonction des îlots et d’appliquer la stratégie de transplantation d’îlots pancréatiques à un plus grand nombre de patients diabétiques.

Procédures

L’injection de streptozotocine se fera en intra péritonéale à l’aide d’une aiguille 23G. L’injection réalisée sur animal vigile par 1 injection par jour sur 5 jours. La durée de l’intervention (et la contention) durera quelques secondes pour chaque injection. 24 h après la dernière injection, une mesure de glycémie sera effectuée à l’aide d’un glucomètre à partir d’une micro goutte de sang prise à la queue pour vérifier si l’animal est bien diabétique (durée de l’acte quelques secondes). Chez les souris devenus diabétiques, 2 modules d’encapsulation seront implantés dans l’abdomen. Ceci nécessitera une incision de l’abdomen de 1 cm. Chirurgie réalisée sous anesthésie générale et analgésie adaptée et durera environ 15 minutes. Des anti-inflammatoires seront administrés post-chirurgie au maximum pendant 3 jours. Concernant le suivi de la survie et de la fonction des îlots implantés, celui-ci durera 91 jours. Pour cela, tous les 15 jours la prise de poids (quelques secondes), la glycémie capillaire (lecteur de glycémie, quelques secondes) seront mesurées, une prise de sang par incision de l’extrémité de la queue sera effectuée pour la réalisation de divers dosage plasmatique (durée 5 minutes par souris) et un test de tolérance au glucose sera réalisé. Ce test est nécessaire afin de déterminer la fonction réelle de la greffe. Ce test durera deux heures et consistera à injecter dans le péritoine une solution sucré en utilisant une aiguille 23G et de mesurer la glycémie capillaire à l’aide d’un lecteur de glycémie toutes les 5, 10, 15, 30, 45, 60 et 120 min post injection du sucre. Avant le test, les animaux seront mis à jeun 4h (accès à l'eau ad libitum). Une mesure de la glycémie sera effectuée à jeun juste avant l'injection intrapéritonéale du glucose (durée par mesure de quelque seconde). 84 jours après implantation, les implants seront retirés (même méthodologie dispositions prises et durée d’intervention que pour l’implantation). Enfin, 7 jours plus tard les animaux seront mis à mort pour prélèvement final des organes.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus sont : - Perte de poids en lien avec l’induction du diabète - Douleurs post-opératoires faisant suite à la chirurgie réalisée pour la mise en place des hydrogels (Laparotomie) - Risque d’infection suite aux implantations des hydrogels - Stress en lien avec la répétition des injections d’insuline (si nécessaires) ou les mesures de glycémies et prises de sang au cours du suivi - Hyperglycémie lié au développement du diabète au cours de l’étude et durant les tests de tolérance au glucose - Détérioration (infection, nécrose) de l’extrémité de la queue suite aux prises de sang et aux mesures glycémiques -Hémorragie post section de la queue - Périodes de mise à jeun.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour la collecte de sang/organes et analyses.

Remplacement

Nous souhaitons valider de nouveaux hydrogels sur la fonction du greffon chez un sujet diabétique. Or la régulation glycémique est un mécanisme complexe faisant intervenir de nombreux organes tous interconnectés entre eux. Ainsi, afin d’étudier si un pancréas bio artificiel est efficace, il ne suffit pas de s’intéresser uniquement à la cellule à insuline isolé mais il est impératif de l’évaluer dans un environnement complexe où tous les acteurs impliqués dans l’homéostasie du glucose sont présent. Le recours à une étude in vivo est alors indispensable.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum tout en permettant, grâce à des tests statistiques adaptés, de mettre en évidence des différences significatives au niveau des paramètres étudiés. De plus, ce nombre est basé sur les différences interindividuelles des animaux et des préparations d’îlots humains que nous isolerons mais aussi sur notre longue expérience obtenue au cours de la réalisation de nombreuses études métaboliques réalisées sur animaux rendus diabétiques par injection de STZ. Cette étude nécessitera 360 souris. Enfin, la succession des interventions sur les mêmes animaux permettra de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour répondre à nos hypothèses.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages collectives ventilées et enrichies. En cas de procédure invasive une anesthésie et une analgésie adaptées seront mise en place. De plus, des points limites prédictifs et précoces ont été établis permettant de soustraire l’animal à la souffrance. Les animaux demeurant diabétique recevront une insulinothérapie. Les souris immunodéficientes seront maintenues et manipulées dans des conditions permettant de garantir leur état de santé.

Choix des espèces

Pour répondre à nos objectifs, nous avons choisi le modèle de la souris pour recevoir les îlots encapsulés car celui-ci a l’avantage d’avoir des caractéristiques physiologiques proches de l’Homme. De plus, dans un implant nous souhaitons encapsuler 10000 îlots/kg de poids corporel (quantité utilisée dans le cadre de la transplantation d’îlots chez l’homme nécessaire pour rétablir un équilibre glycémique). Ainsi, nous utiliserons moins d’îlots humain (tissus rare) que si nous utilisions le modèle du rat qui est 10 fois plus gros que la souris. La souche C57BL/6 nous permettra d’évaluer la capacité immuno protectrice de nos hydrogels sur les îlots pancréatiques humains. La souris de souche NSG nous permettra de contrôler la survie et la fonction de nos îlots humains encapsulés et implantés dans un environnement immunodéficient (Contrôle). Pour ce projet les souris seront uniquement utilisés à un stade adulte (Age: 8-12 semaines à leur arrivée à l’animalerie), stade de maturité sexuelle et possédant un système immunitaire mature.