Système endocrinien

20 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur pose un cathéter veineux sous anesthésie pour administrer une formulation injectable de mitotane et réaliser un prélèvement sanguin quotidien pendant sept jours, afin d'établir le profil pharmacocinétique de la molécule avant un passage chez l'humain. Le porteur indique que le traitement peut provoquer diarrhées, vomissements et anorexie, et précise avoir réduit les doses par rapport à la littérature. Il affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal, les modèles cellulaires ne permettant pas selon lui d'établir un tel profil.

Objectifs

Le but de ce projet est de réaliser les premières étapes d’un essai pré-clinique dans le but de développer une formulation injectable de mitotane, qui aura pour objectif de réduire drastiquement de délais d’action de la molécule, de réduire les effets indésirables par la diminution des posologies efficaces, et donc à terme d’améliorer l’efficacité du traitement et la qualité de vie du patient.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet Atteinte de l’intervalle thérapeutique du mitotane compris entre 14 et 20mg/L en une semaine avec libération du mitotane principalement dans les glandes surrénales chez les Rats bénéficient de la formulation optimisée. Cela permettra la validation d’un modèle pré-clinique et de passer à des essais cliniques de phase chez l’Homme. Les bénefices sont une meilleure prise en charge des patients et une baisse des effets indésirables.

Procédures

Les animaux auront un catheter veineux de posé (temps de pose évalué à une demi-heure), afin de pouvoir leur administrer un traitement avec une nouvelle formulation, ainsi que pour les prélèvements (1 prélèvement par animal et par jour , pour une durée de 7 jours, intervention quotidienne de cinq minutes).

Impact sur les animaux

Troubles Gastro-intestinal fréquemement obervés et troubles psychologiques observès -pour les troubles digestifs : diarrhées, vomissements -pour les troubles psychologiques : anorexie -afin de réduire ces troubles, le dosage utilisé pour réaliser les études de pharmacocinétique sont bien plus faible que ceux décrient dans la littérature.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés, afin de pouvoir réaliser les différents prélèvements et les les organes.

Remplacement

Il est indispensable pour notre étude d’avoir recours à l’animal. En effet, les modèles cellulaires ne permettent pas la réalisation d’un profil pharmacocinétique. Il est donc primordial avant de passer sur un modèle Humain de définir la pharmacocinétique chez l’animal.

Réduction

Des recherches sur la DL 50 ont été effectuées, afin de ne pas sacrifier inutilement des animaux. Seuls deux groupes seront utilisés, de 10 Rats chacun, ce qui nous semble le strict minimum pour établir la pharmacocinétique de notre formulation et afin d’éviter les variabilités inter-individuelles. Le nombre d'animaux a été obtenu, afin d'avoir une approche statisitique idéale.

Raffinement

Une chirurgie est réalisée à J0 (sous analgésie et anesthésie générale (buprecare 0.1 mg/kg et isofurane 2%), afin de poser un cathéter veineux aux animaux, afin de limiter les prélèvements sanguins répété au niveau de la queue de l’animal. Tous les prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale (ISOFLURANE). La chirurgie et les prélèvements sanguins sont réalisés dans une pièce isolée, calme avec seulement un seul ou deux manipulateur expérimentés présents. Les doses utilisées dans ce projet sont considérablement plus faibles que ce qui est décrit dans la littérature.

Choix des espèces

Le Rat est un modèle couramment utilisé et reconnu pour sa pertinence pour étudier la pharmacocinétique d’une molécule Les animaux utilisés sont au stade adulte, la taille à cet age permet une réalisation facile de la partie opératoire (pose du catheter) et de plus , correspond à un age habituel dans la littérature scientifique.

800 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent de multiples injections, jusqu'à douze prélèvements de sang à la queue et une perfusion intracardiaque décrite comme une "douleur modérée", certaines étant rendues diabétiques, pour étudier la communication entre cellules immunitaires et réseau nerveux des îlots pancréatiques. Les organes sont prélevés après mise à mort. Le porteur indique que ce dialogue "n'a jamais été étudié" et affirme que les modèles animaux sont nécessaires pour analyser plusieurs organes à la fois.

Objectifs

Dans le pancreas, les ilots de Langherans sont centraux dans la régulation du glucose dans le sang. Ces micro-organes produisent les hormones permettant de réguler le taux de glucose. Des cellules immunitaires sont présentes dans les ilots et jouent une rôle important dans leur fonction. Comme tous les tissus, les ilots sont reliés au cerveau par le système nerveux périphériques. Cependant, la communication entre les cellules immunitaires et le réseau nerveux n’a jamais été étudié et son rôle dans la fonction des ilots pancréatiques n’est pas bien connu. Dans ce projet nous proposons d’étudier les mécanismes de communication entre les cellules immunitaires et le réseau nerveux des ilots pancréatiques ainsi que le rôle de ces moyens de communications dans la fonction des ilots en condition normal et diabètique, une maladie caractérisée par une dérégulation du glucose dans le sang.

Bénéfices attendus

Il est aujourd'hui admis que les cellules immunitaires jouent un rôle primordial dans la régulation du taux de glucose sanguin par le gras et le foie. Les cellules immunitaires présentes dans les ilots pancréatiques n'ont elles été décrites que tardivement et les contraintes liées à leurs techniques d'analyse font qu'elles restent encore très peu connues. La communication entre les cellules immunitaires et le système nerveux a été montrée comme primordiale dans la fonction de multiples organes. Cependant, de part la difficulté d'étudier les cellules immunitaires des ilots pancréatiques, ces moyens de communications n'ont pas encore été décrits dans les ilots. Ce projet permettra de mieux comprendre les moyens de communication entre cellules immunitaires et réseau nerveux dans la fonction ilots pancréatiques et leurs implication dans la régulation du taux de glucose sanguin.

Procédures

9 injection intra-péritonéale (20s), 1 injection sous-cutanée, 1 injection intra-veineuse, 12 prélèvement de sang à la queue (3s), 1 anesthésie gazeuse (10min), 1 perfusion intra-cardiaque.

Impact sur les animaux

-Injections intrapéritonéale (ip) : douleur légère due à la piqure. -Injection iv rétro-orbitale (iv) : gêne, douleur légère au point de prélèvement. Les animaux sont sous anesthésie gazeuse au moment du prélèvement. -Injection sous-cutanée (sc) : douleur légère due à la piqure. -Diabète : prise de poids progressive. Les souris peuvent devenir moins actives. Le souris urinent plus souvent. - Perfusion intra-cardiaque : Douleur modérée. Les souris recevront un analgésique opioïde 15min avant la procédure. - Micro-coupure à la queue : douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement des organes d'intérêts.

Remplacement

Cette étude a pour but d'étudier la communication entre les cellules immunitaires et le système nerveux des ilots pancréatiques en condition normale et de dérégulation du taux de glucose sanguin, tels que le diabète. Les ilots pancréatiques répondent à la prise de poids et au dialogue entre différents organes. Cela implique donc d’étudier différents paramètres dans différents organes. Ainsi les modèles animaux sont nécessaires pour mener à bien ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé pour permettre l’analyse des résultats selon des tests statistiques adaptés. Des tests in vitro ont été inclues pour mettre en place des protocole adaptés et réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Dans les cages les souris bénéficient de coton et de « maisons » afin d’augmenter la diversité de leurs activités et qu’elles puissent se construire un nid. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum). Lorsque nécessaire, la douleur et la gêne des souris sont réduites à un niveau modéré par l’administration d’anti-douleur et par l’anesthésie. Les souris sont surveillées régulièrement et lors des procédures, les paramètres de santé qui peuvent être affectés sont évalués et notés régulièrement. Les souris diabétiques urinant plus souvent, pour permettre une bonne hygiène des souris les cages seront changées deux fois par semaines.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de référence dans l'étude de l'obésité. De nombreux outils sont disponibles chez la souris. Les souris sont utilisées entre l’âge de 10 jours et 22 semaines.

48 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime obésogène pendant douze à vingt-quatre semaines, des injections deux fois par semaine, des mises à jeun et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline nécessitant gavages et prélèvements caudaux répétés. Le porteur indique que le surpoids peut gêner les déplacements et que la contention dans le tube d'échoMRI peut être anxiogène. Il affirme que le recours au modèle animal est "indispensable" pour une approche intégrée de plusieurs organes, et limite l'étude aux mâles.

Objectifs

L'obésité et le diabète de type 2 constituent des défis majeurs pour la santé publique à l'échelle mondiale, engendrant des conséquences graves sur la qualité de vie des individus et imposant un fardeau économique croissant. Ces affections sont souvent associées à un état inflammatoire , communément appelée "inflammation à bas bruit". L'inflammation à bas bruit représente un état caractérisé par des niveaux d'inflammation systémique faibles, mais persistants, qui peuvent ne pas être détectés par les symptômes cliniques traditionnels. Cette inflammation chronique de bas niveau a été étroitement associée à la pathogenèse et à la progression de l'obésité et du diabète de type 2. Cependant cette inflammation à bas bruit est-elle la cause ou la conséquence de ces pathologies est une question qui n’est pas encore tranchée dans la communauté scientifique. Comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent cette relation complexe est impératif pour développer des stratégies de prévention et de traitement efficaces visant à atténuer l'inflammation à bas bruit et, par conséquent, à améliorer la prise en charge des maladies métaboliques. Ce projet de recherche vise à approfondir notre compréhension de cette interaction complexe en examinant en détail les voies biologiques et les facteurs déclencheurs qui contribuent à l'inflammation à bas bruit dans le contexte de l'obésité et du diabète de type 2. En particulier nous allons étudier l’effet d’un composé pharmacologique aux propriétés anti inflammatoire développé par une start-up dans deux situations distinctes : La prévention ou la thérapie de ces maladies métaboliques. En d’autres termes nous espérons apporter des éléments de réponse à la question : Inflammation et maladies métaboliques :cause ou conséquence ?

Bénéfices attendus

Ce travail devrait permettre de répondre aux questions suivantes : Le composé pharmacologique aux propriétés anti-inflammatoires démontrées, est-il en capacité de prévenir l’installation des maladies métaboliques et/ou de traiter ces maladies une fois qu’elles sont installées. Les résultats obtenus devraient nous permettre d’apporter des éléments de réponses quant à l’association des maladies métaboliques à l’inflammation à bas bruit. De plus si ce composé à des effets bénéfiques, alors on peut imaginer que cela puisse un jour être un traitement pour ces maladies.

Procédures

L’ensemble de l’effectif du projet recevra un régime alimentaire obésogène de type HFHS et sera soumis à un suivi de masse corporelle hebdomadaire (12 24 pesées sur 12 ou 24 semaines de régime pour la procédure 1 ou 2 respectivement ). Une mesure de masse grasse et masse maigre par EchoMRI (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 3 minutes) en semaines 12 et 24 sera réalisée. Des prélèvements sanguins au niveau caudal après légère incision du bout de la queue (0,5-1mm) et post anesthésie locale (crème EMLA 30-45 minutes avant le premier prélèvement) seront également réalisés en semaines -S11 (pocédure 1 et 2) et S23 (procédure 2) pour la réalisation des tests métaboliques (OGTT et ITT). Dans chaque procédure il y a aura deux injections par semaines pendant 12 semaines soit 24 injections. Une injection IP (volume 100µl), réalisée par un expérimentateur maitrisant le geste technique ne prends pas plus de 10 secondes, préhension de l’animal incluse. Concernant OGTT et ITT, respectivement 6 et 5 prélèvements caudal seront nécessaire. Un prélèvement réalisé par un expérimentateur maitrisant le geste technique ne dépasse pas 15 secondes, préhension de l’animal incluse

Impact sur les animaux

Les animaux en régime High Fat /High Sucrose peuvent avoir des difficultés à se mouvoir en raison du surpoids. Toutefois, cela n’a jamais observé après 12 semaines de régime. Une attention particulière sera portée aux animaux de la procédure 2 qui eux seront sous régime HF/HS pendant 24 semaines Les préhensions des animaux lors des pesées, des injections intra péritonéales peuvent causer au moins au début du protocole un peu de stress sur les animaux. Pour diminuer au maximum ce stress (et éviter également que ce dernier puisse perturber le protocole), les animaux seront manipulés lors de la deuxième semaine d’acclimatation par le même expérimentateur qui procédera au différentes mesures hebdomadaires. De la même manière, les injections intrapéritonéales seront réalisées par un expérimentateur maitrisant parfaitement ce geste technique Les test de tolérance oral au glucose (OGTT), les test de tolérance à l’insuline (ITT) nécessitent des mises à jeun de 4h. Les mises à jeun de 4h se font sur la matinée en dehors de leur phase de nourriture nocturne et n’a donc que peu d’impact mais permet de s’affranchir des variations interindividuelles du métabolisme glucidique. L’OGTT, nécessite une préhension des animaux afin de les gaver avec la solution de glucose ce qui est invasif pour les souris (maîtrise du geste par un expérimentateur formé). L’ITT nécessite une préhension des souris et une injection intrapéritonéale d’insuline qui peut également être invasive (maîtrise du geste par un expérimentateur formé). OGTT et ITT nécessitent des mesures de glycémie pendant 2h. Ces mesures sont réalisées à l’aide d’un glucomètre par prélèvement d’une micro goutte de sang L’EchoMRI nécessite de faire entrer les souris dans un tube plastique dans lequel elles doivent rester 3 minutes, ce qui peut être anxiogène (maîtrise du geste par un expérimentateur formé).

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés sous anesthésie selon le planning prévu par l’étude afin de réaliser des prélèvements sanguins et tissulaires.

Remplacement

Le remplacement est impossible car il s’agit d’étudier des processus physiologiques mettant en jeu plusieurs organes (intestin, tissu adipeux et foie). Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour une approche intégrée.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires et le nombre d’expériences réalisées sur chaque animal, nous avons adopté la stratégie suivante : - Réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à une analyse statistique robuste de cette expérience à l’aide de tests non paramétrique sachant qu’il y a des variations individuelles dans la mise en place de l’obésité. - Cette série d’expérience se fait uniquement sur les mâles. Si des effets sont observés, la necessité impérative de reproduire les données avant publication se fera alors sur les deux sexes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales avec un enrichissement de leur milieu adapté. Ils bénéficieront d’un suivi quotidien de leur état général. Lors des procédures expérimentales, les actes susceptibles d’entrainer une souffrance ou une douleur seront réalisés soit sous anesthésie locale, soit sous anesthésie générale. S’agissant d’un projet nécessitant l’utilisation d’animaux vivants, l’utilisation de techniques non invasives et indolores est privilégiée afin d’acquérir les paramètres physiologiques nécessaires au projet tout en respectant les questions d’éthiques en expérimentation animale et la règle des 3R. De plus, des points limites en adéquation avec ce projet ont été définis. En cas d’atteinte d’un de ces points limites, l’animal concerné sera retiré du projet. Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet.

Choix des espèces

La souris est utilisée car son métabolisme présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme. . Ce modèle est largement documenté dans la bibliographie scientifique dans les études de maladies métaboliques Les animaux seront réceptionnés au centre de zootechnie à l’âge de 8 semaines, stade adulte des souris. Le début du régime HF/HS commencera à partir de 10 semaines et se terminera soit a 22 semaines (S12) (procédure 1) soit à 34 (S24) semaines (procédure 2)

2500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris immunodéprimée reçoit une transplantation de cellules pancréatiques humaines sous la capsule rénale et un prélèvement sanguin hebdomadaire à la queue, pour évaluer la fonction du greffon avant transplantation chez le patient. Le porteur indique n'avoir noté aucune incidence sur le bien-être des souris lors du projet précédent et traiter la douleur chirurgicale, toutes les souris étant tuées pour récupérer le rein porteur du greffon. Il affirme travailler à une technique in vitro de remplacement mais la juge encore trop peu robuste pour fournir des résultats exploitables.

Objectifs

Lors de la transplantation des îlots de Langerhans chez le patient, la fonction primaire du greffon apparait comme le principal facteur pronostic de succés et son amélioration représente l'un des principaux enjeux dans le domaine. Aprés l'isolement de ces cellules, même aprés avoir obtenu une préparation d'îlots quantitativement importante, il est difficile de prédire la fonction après transplantation. L'évaluation pré-greffe (in vitro) consiste en un comptage, une viabilité, la pureté et la capacité à secréter de l'insuline. Malheureusemment, ces techniques ne corrèlent pas avec la fonction greffée chez le patient. Le modèle de souris xénogreffée montre, quant à lui, une bonne corrélation de fonction. L'objectif général du projet est donc, d'étudier les cellules pancréatiques humaines transplantées chez le patient, en transplantant une fraction chez la souris immunodéprimée, afin d'en évaluer la fonction. Cela se fait notamment par dosage spécifique du Peptide-C humain circulant dans le plasma de la souris.

Bénéfices attendus

La transplantation des cellules pancréatiques nous permettra : - D'une part, d'étudier la fonction des cellules pancréatiques humaines provenant de donneurs de phénotype différent (age, taille, poids, habitus...) et - D'autre part, de prédire la fonction du greffon cellulaire transplanté chez le patient recevant les cellules issues du meme donneur.

Procédures

Les animaux subiront un seul acte chirurgical à savoir la transplantation de cellules humaines sous la capsule rénale, traité par les anti-douleur adéquats (durée 15 minutes). Aussi, un prélevement sanguin hebdomadaire au niveau de la queue permettra de doser les hormones plasmatiques.

Impact sur les animaux

Ce projet etant un renouvellement d'un projet précédent, nous n'avons noté aucune incidence néfaste au bien etre des animaux transplantés. Les eventuelles douleurs notamment dues à la chirurgie sont palliées par un traitement anti-douleur adéquat. De la même manière, un traitement anti-douleur local (xylocaine) sera effectuée au niveau de la queue pour la prise de sang hebdomadaire.

Devenir

Nous envisageons la mise a mort de tous les animaux car en fin de protocole, nous récupérons le rein proteur du greffon pour étude immunohistochimique ou étude dynamique ex-vivo.

Remplacement

L'étude de fonction des ilots transplantés ne peut se faire sans faire avoir recours à l'animal car il n'xiste pas de technique in vitro performante qui permet de maintenir les cellules pancréatiques vivantes sur le long terme. Nous travaillons sur la mise en place d'une technique in vitro d'étude des cellules appelée périfusion en vue de remplacer l'animal, mais les données ne sont actuellement pas suffisemment robustes pour obtenir des résultats quantifiables et statistiquement exploitables. De plus, du fait de l'extreme hétérogénéité des donneurs d'organe, il n'existe pas de modèle d'étude ex vivo, organe-sur-puce, ou autre modele biostatistique qui permettent d'obtenir des résultats satisfaisants à l'heure actuelle. Aussi, l'usage de l'animal est necessaire pour 1) reproduire l'acte de la transplantation, 2) étudier les cellules humaines dans un organisme entier, et 3) maintenir les cellules vivantes pendant plusieurs semaines.

Réduction

Nous utiliserons le juste nombre d'animaux (n=5 animaux par pancréas traités) afin d'obtenir des résultats probants et statistiquement satisfaisants.

Raffinement

Les animaux seront hébergés et traités avec soin (nourriture et eau en illimité, visite quotidienne, cycle jour/nuit régulier). Les animaux recevant une chirugie seront surveiller pluriquotidiennement les 3 premiers jours après chirurgie puis quotidiennement. L'acte chirugicale se fera sous anesthésie et traitement de la douleur (pré et post opératoire - buprénorphine 0,05mg/kg) renouvelé selon le besoin. De plus, la chirurgie et les prélèvement sont réalisées par du personnel formé et sensible aux régles d’éthique expérimentale et qui manipule les animaux quotidiennement afin de les faire coopérer.

Choix des espèces

Les outils génétiques permettent de générer des animaux mutants immunodéficients disponibles facilement. De plus, nous disposons de tous les outils (anticorps, kits de dosages, animalerie) pour mener une étude facilité sur cet animal. Les souris Swiss Nude constituent un bon compromis puisque leur déficience d'immunité permet une bonne implantation des cellules humaines. Nous utiliserons des animaux adultes pour un geste chirurgical aisé.

Une souris, un rat ou un hamster immobile, au poil hérissé ou au dos courbé est mis à mort sur-le-champ, et une perte de plus de 20 % du poids en trois jours, associée à d'autres signes, conduit à la mise à mort ou à une adaptation de la dose. Au total, 4 750 rongeurs vont être utilisés (2 750 souris, 500 rats et 1 500 hamsters dorés), tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À partir de quatre ou six semaines d'âge et jusqu'à 34 semaines, ils reçoivent des régimes hypercaloriques, parfois avec des boissons enrichies en fructose, en éthanol ou en composé pro-inflammatoire, des traitements une à deux fois par jour et trois prises de sang, puis passent une échographie du cœur et 24 heures isolés sur grille en cage métabolique. Ces régimes doivent permettre de tester des molécules contre l'obésité, le diabète ou la stéatose hépatique. Le porteur retient le hamster pour l'alcool parce qu'il en "consomme spontanément", et invoque la hausse de la consommation pendant les confinements liés au COVID-19.

Objectifs

L’augmentation de l'urbanisation dans le monde, combinée à la consommation d'aliments contenant des quantités importantes de graisses, d’acides gras saturés et de fructose sont considérés comme les principaux responsables des troubles métaboliques. Les mécanismes physiologiques ancestraux favorisant le stockage de l'énergie sous forme de graisse dans le tissu adipeux, le foie et le sang pour assurer la survie de l’individu en cas d’absence de nourriture, sont maintenant associés à l’obésité, la résistance à l'insuline, au diabète de type 2 et la Stéatose Hépatique Non-Alcoolique (NASH) . Dans ce contexte, un effort de recherche continu est engagé pour développer un ou des traitement (s) pour lutter contre ces dysfonctionnements. Ces dysfonctions métaboliques sont très complexes et sont liées entre elles, les études in vitro servent pour cibler le potentiel thérapeutique des molécules mais il est essentiel de pouvoir tester ces molécules sur des modèles animaux proche de l'Homme. Il est important de mesurer les dysfonctions métaboliques, cardiaques et rénales car à ce jour, il n’y a pas de thérapies efficaces pour les traiter. En outre, ces modèles animaux ne tiennent pas compte du fait que les patients atteints de NASH consomment également de l'alcool. Il a été démontré que la consommation d'alcool favorise la progression de la NASH vers des formes plus sévères. De plus, cette consommation d'alcool a considérablement augmenté dans la population générale depuis la pandémie de COVID-19, à cause des périodes de confinements. Par conséquent, il est important d'inclure la contribution de l'alcool dans les complications hépatiques liées à l'obésité et la NASH afin de mieux modéliser le contexte humain. Si les modèles d'alcool chez le rat ou la souris ne sont pas très pertinents car ces deux espèces ne sont pas naturellement attirées par l’alcool, le hamster est un modèle intéressant car il consomme spontanément et métabolise efficacement l'éthanol. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés, a lieu dans la poche pré-gastrique. Ces modèles seront utiles pour tester des thérapeutiques potentielles ciblant l'obésité, le diabète, la dyslipidémie, la stéatose, la NASH, la fibrose et l'inflammation.

Bénéfices attendus

L'intérêt de ce projet est le développement de modèles nutritionnels ressemblant à la réalité humaine occidentale (sédentarité et régime hyperénergétique avec ou sans alcool) qui permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques et ainsi de tester et valider plus rapidement de nouvelles thérapies pour le traitement de l'obésité, de la NASH, de la fibrose, des maladies cardiovasculaires et rénales associées aux maladies métaboliques, qui sont parmi les maladies les plus problématiques pour la santé publique française et mondiale.

Procédures

Pour induire des dysfonctions métaboliques chez la souris, le rat et le hamster, des régimes hypercaloriques associés ou non à des boissons enrichies en fructose et/ou en éthanol et/ou en composé chimique pro-inflammatoire seront mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 4 ou 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 34 semaines). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles : orale, sous-cutanée et intrapéritonéale sur animal vigile et intraveineuse sur animal anesthésié. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. Trois prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal (en début, milieu et fin de projet) afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. Un test de tolérance au glucose et un test de tolérance à l’insuline pourront être effectué la semaine précédant la fin de projet. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Afin de déterminer si le traitement a un impact sur la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer l'impact sur la fonction rénale des animaux, nous mesurerons le débit de filtration glomérulaire (GFR) en début et en fin de projet et la mesure de divers paramètres urinaires en cage métabolique uniquement en fin de projet. La GFR consiste à administrer un composé fluorescent par voie veineuse (sous anesthésie pendant environ 10 minutes) et de mesurer sa distribution via un capteur posé sur la peau pendant 2h (animal vigile). Pour faire les échographies et les GFR, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes. Les récoltes d'urine se feront sur 24h en cage métabolique.

Impact sur les animaux

Les animaux seront nourris à partir de 4 ou 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 34 semaines) avec des régimes enrichis en graisse et ou en sucre, cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer de la douleur. Les administrations et les prélèvements peuvent engendrer un léger stress et une douleur légère. Les animaux auront des mises à jeun alimentaires de 6 heures maximum. Certaines techniques nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 24h.

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le foie, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...)

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screnning, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Avec un nombre final d'animaux égal à 10 par groupe de traitement, une différence de +/- 30% est théoriquement détectable. La stratégie expérimentale consiste à mesurer les valeurs de chaque paramètre mesurable de façon longitudinale (taux de lipides, glycémie, taux de transaminases, marqueurs inflammatoires dans le sang/plasma), l'animal est donc son propre contrôle, dans la mesure du possible, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux par groupe.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rongeurs de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant souvent longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal ne suit pas la courbe de poids attendue, une recherche approfondie d’éventuels symptômes sera faite. Les points limites de ce projet seront les suivants : absence de mouvement, piloérection et dos courbé. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une dermatite, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Si l'état de l'animal ne s'améliore pas dans les 48 heures, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et l'euthanasieront. Si un animal atteint l'un des points limites, il sera euthanasié immédiatement. Pendant la phase de traitement, si la perte de poids est supérieure à 20% en l'espace de 3 jours et associée à d'autres signes tels que la prostration, le dos courbé et l'absence de toilettage, l'animal doit être euthanasié ou la dose et la fréquence de traitement adaptées.

Choix des espèces

Les souris et les rats sont suffisamment caractérisés pour l'étude des maladies métaboliques. Les hamsters présentent un métabolisme du cholestérol et des acides biliaires semblable à celui des humains. Les rats et les hamsters peuvent aider à étudier les effets de médicaments potentiels pour les complications cardiovasculaires (dysfonctionnement diastolique) et rénales. Chez les hamsters, la combinaison d'un régime riche en graisses, en cholestérol et en fructose et de la consommation d'alcool peut imiter le mode de vie de certains patients atteints de NASH, notamment pendant et après le confinement lié à la pandémie COVID-19. Si le modèle associé à la consommation d'alcool chez le rat ou la souris n'est pas très pertinent, le hamster est un modèle intéressant car il consomme et métabolise l'éthanol très facilement. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés a lieu dans la poche prégastrique. Les animaux sont utilisés à partir de 4 ou 6 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique) dès le jeune âge.