Biologie du développement

Toutes les femelles qui ont mis bas seront tuées, leurs petits aussi, pour prélèvement de structures du cerveau, tandis que les femelles non fécondées restent en vie et seront réutilisées. 350 souris vont être utilisées au total dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 50 d'entre elles étant gardées vivantes. Les femelles gestantes sont hébergées seules pendant toute la gestation, puis soumises à trois séances de stress de 45 minutes par jour pendant sept jours, les descendants recevant ensuite des injections dans le péritoine, jusqu'à cinq chez les adultes, et quatre gavages espacés de douze heures. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'il n'existe pas de culture in vitro capable de reproduire "l'environnement complexe caractéristique de l'hippocampe en développement".

Objectifs

Le stress prénatal, subi durant le développement foetal, est associé à un risque accru de développer des troubles comportementaux, caractérisés notamment par des déficits de mémoire et une altération émotionnelle, et à une vulnérabilité à développer des troubles psychiatriques (dépression, stress post-traumatique, troubles anxieux...). Il a été montré que ces troubles dépendent d'une altération des neurones dans une région clé du cerveau impliquée dans le controle de la mémoire et des émotions. Notre objectif est de comprendre les mécanismes par lesquels le stress prénatal peut impacter ces neurones en utilisant un modèle animal. Pour cela, nous utiliserons 2 approches: dans la première nous comparerons la croissance des neurones entre les animaux contrôles et stressés à 2 moments clés du développement (premières semaines de vie et âge adulte); dans la seconde, nous déterminerons si le stress prénatal modifie l'expression de molécules clés durant le développement des neurones.

Bénéfices attendus

En caractérisant l’effet du stress prénatal sur le développement des neurones de l'hippocampe, cette étude pourrait contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels un stress précoce peut entrainer des modifications à long terme dans la structuration d'une structure clé pour la gestion de nos émotions et de nos capacités cognitives. L'objectif ultime est de repérer des biomarqueurs ouvrant la voie à des stratégies de prévention et d'intervention ciblées.

Procédures

Hébergement individuel des femelles gestantes pendant la duré de la gestation. Stress: 3 sessions de 45 min par jour pendant 7 jours. Injections intrapéritonéales : 1 pour les animaux en développement, 5 pour les animaux adultes, espacées de 24h. Chaque injection dure moins d'1 minute, préhension de la cage inclue. Gavage: 4 espacées de 12h . Chaque intervention dure moins d'1 minute, préhension de la cage inclue.

Impact sur les animaux

1) l'hébergement individuel des femelles gestantes engendre une nuisance légère en limitant les interactions sociales directes; 2) Le stress appliqué aux femelles gestantes engendre un état de stress transitoire avec une baisse de la prise de poids associée à la gestation. 3) Les injections intrapéritonéales peuvent engendrer un incomfort de courte durée. 4) Le gavage nécessite une préhension de l'animal et peut générer un inconfort modéré de faible durée.

Devenir

Toutes les femelles ayant mis bas sont mises a mort, parce qu'elles ne peuvent être réutilisées. Les femelles non fécondées sont maintenues en vie. Les animaux issus des reproduction et utilisées en expérience sont mises à mort pour prélèvement de structure.

Remplacement

L’objectif de ce projet étant d’étudier les propriétés des neurones de l'hippocampe après exposition à un stress prénatal, il est nécessaire de réaliser ces manipulations sur des animaux vivants. De plus, les caractéristiques des neurones sont dictées en partie par l'environnement cérébral et dépendent donc de l'intégrité du cerveau. Il n’existe pas à l'heure actuelle de modèle en culture ou in vitro permettant de reproduire l’environnement complexe caractéristique de l'hippocampe en développement. Ceci justifie donc l’utilisation des animaux pour atteindre les objectifs de ce projet.

Réduction

Nous nous engageons à utiliser le nombre minimal de souris nécessaire pour garantir la robustesse et la fiabilité des analyses statistiques. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les frères et soeurs d’une même portée seront répartis entre les différents lots. Enfin, les femelles mises en reproduction mais non gestantes seront conservés en vie et réutilisés pour des expériences ultérieures, ce qui contribuera à limiter le nombre total d’animaux utilisés dans le cadre de ce projet.

Raffinement

Pour l'ensemble des animaux, un suivi sera assuré en utilisant des grilles permettant de scorer de façon objective le bien-être de l'animal par la mesure du poids, l’évaluation de l’apparence physique (poil hérissé, apathie...) et du comportement (comportements répétés, vocalisations..) . Ces grilles permettent d'établir des points limites au-delà desquels une décision de traitement ou de retrait de l'expérience est prise. Ainsi, si un animal montre des signes de détérioration rapide de son état de santé évalué sur ces critères avant la fin des procédures, celles-ci seront ajustées ou stoppées pour éviter toute souffrance prolongée ou excessive.

Choix des espèces

La neurogenèse (création de nouveaux neurones) a été largement étudiée chez les rongeurs, lesquels représentent un modèle pertinent en raison de la similitude de leurs réponses physiologiques au stress avec celles des humains. Ils permettent ainsi une exploration intégrée des effets comportementaux, neurobiologiques et génétiques du stress. La souris a été choisie dans ce projet car 1) les études précédentes sur lesquelles il se base ont été réalisées sur des souris , et 2) une partie du projet repose sur l'utilisation de souris transgéniques, seul modèle disponible pour isoler les cellules d'intérêt et mener à bien le projet. Les souris utilisées pour la reproduction ont entre 7 et 8 semaines puisqu'il s'agit de l'âge optimal pour la reproduction. Les descendants étudiés seront âgés de 3 jours à 5 mois puisque nous étudions les neurones pendant le développement précoce et à l'âge adulte.

Ouvertes par laparotomie pendant une heure pour atteindre les embryons, les femelles gestantes servent de voie d'accès à une greffe d'interneurones humains injectés in utero. D'autres souris sont greffées à deux ou quatre jours de vie, brièvement séparées de leur mère, d'autres encore à l'âge adulte par une chirurgie de trois heures qui ouvre le crâne et y scelle une fenêtre permanente. Suivent des séances d'imagerie répétées, tête immobilisée, sur des souris parfois éveillées, à un, trois et sept mois après la greffe. 998 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, le prélèvement du cerveau interdisant, écrit le porteur, toute réutilisation, replacement ou adoption.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre comment un gène propre à l’être humain, influence la formation et le fonctionnement des réseaux cérébraux. L’objectif général est de déterminer comment ce gène modifie la survie, la migration, la maturation, l’intégration synaptique et l’activité d’interneurones humains greffés dans un cerveau vivant. Ces cellules jouent un rôle de « frein » et limitent les excès d’activité. Deux contextes pathologiques seront étudiés séparément : la schizophrénie et la maladie d’Alzheimer. Dans l’axe « Schizophrénie », le projet s’appuie sur les associations génétiques rapportées entre le gène et cette pathologie. La schizophrénie est associée à des anomalies de maturation des circuits corticaux inhibiteurs. Le projet testera si la présence, l’absence ou le dosage de ce gène modifie le développement d’interneurones humains greffés avant ou juste après la naissance, en étudiant leur migration, leur maturation, leur capacité à établir des connexions et l’organisation de leur activité. Dans l’axe « Maladie d’Alzheimer », les effets de ce gène seront étudiés dans un cerveau adulte présentant un environnement amyloïde. Le projet déterminera si le gène augmente ou réduit la vulnérabilité fonctionnelle et moléculaire de ces cellules. Le projet n’a pas d’objectif comportemental, car le nombre de cellules humaines greffées est insuffisant pour modifier le comportement de la souris. Les conclusions reposeront sur des analyses cellulaires, histologiques, transcriptomiques et sur des mesures répétées de l’activité calcique, complétées par des analyses du cerveau en fin d’étude. Les bénéfices attendus sont l’identification de mécanismes reliant le gène à la fragilité ou à la résistance des circuits, ainsi que de signatures pouvant orienter les stratégies ciblant les réseaux impliqués dans la schizophrénie et la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

À l’échelle du projet, les bénéfices attendus sont d’abord mécanistiques. Dans l’axe « Schizophrénie », les expériences permettront de déterminer si le gène étudié modifie la migration, la maturation, l’identité et l’activité d’interneurones humains pendant des fenêtres précoces du développement cérébral. Elles permettront de distinguer un effet sur la survie d’un effet sur la vitesse ou la qualité de maturation. Dans l’axe « Alzheimer », le plan déterminera si le gène étudié modifie spécifiquement la réponse des interneurones humains à un environnement amyloïde, notamment les programmes de stress, de maturation synaptique et l’activité calcique. La combinaison de l’histologie, de la transcriptomique et de l’imagerie longitudinale doit produire des résultats interprétables à plusieurs niveaux : localisation et maturation des cellules, mécanismes moléculaires et fonctionnement au cours du temps. Les résultats pourront identifier des signatures de vulnérabilité ou de résilience dépendantes de ce gène et améliorer la pertinence des modèles précliniques portant sur le récepteur α7, puisque les souris ne possèdent pas naturellement de ce gène. Aucun bénéfice thérapeutique immédiat ni effet comportemental n’est attendu. À plus long terme, les mécanismes identifiés pourront orienter des études pharmacologiques ciblant l’axe étudié et aider à sélectionner des marqueurs cellulaires ou fonctionnels pour de futurs projets. L’utilisation des animaux imagés pour les analyses terminales maximise les informations obtenues et pourra réduire les effectifs de travaux ultérieurs.

Procédures

- Chirurgie abdominale chez la souris gestante. Chaque chirurgie dure environ 60 min, en excluant les temps de préparation de l’animal et les temps post-opératoires. - Greffe de cellules chez l’embryon de souris au dernier tiers de gestation : injection 30 secondes au total. - Greffe de cellules chez la souris nouveau-né au dernier tiers de gestation : injection 45 secondes au total par hémisphère. - Greffe de cellules chez la souris adulte par injection dans le cerveau : injection 60 min /souris. - Pour les animaux inclus dans le suivi d’imagerie longitudinale, une fenêtre crânienne chronique est implantée au moment de l’intervention adulte; la chirurgie complète (craniotomie, injection éventuelle, pose de fenêtre et fixation) dure au maximum 3 heures, hors préparation et réveil.

Impact sur les animaux

Chez les nouveau-nés, les effets indésirables attendus sont liés à la manipulation et au geste d’injection d’une durée courte (quelques minutes) : stress transitoire associé à une courte séparation d’avec la mère (et réciproquement, stress de la mère vis-à-vis de la portée), ainsi qu’une douleur modérée (de quelques jours, lié à la chirurgie). Chez les femelles gestantes subissant une chirurgie abdominale (laparotomie pour accès in utero), les nuisances attendues comprennent une douleur post-opératoire modérée et une gêne transitoire liées à la cicatrisation. Chez les adultes subissant une chirurgie stéréotaxique, les effets indésirables attendus correspondent principalement à une douleur post-opératoire modérée, une baisse transitoire d’activité et, plus rarement, une perte de poids modérée immédiatement après l’intervention. Pour les animaux qui sont inclus dans la procédure d’imagerie avec fenêtre crânienne, des nuisances additionnelles sont attendues. Dans les jours suivant la craniotomie et la pose de la fenêtre, certains animaux peuvent présenter un inconfort local et un grattage autour de la zone opérée ou du matériau de scellement ; ce comportement est généralement transitoire et diminue au cours de la première semaine. Enfin, l’imagerie in vivo nécessite une phase d’habituation (manipulations répétées, installation sur le dispositif et, lorsque l’enregistrement est réalisé chez l’animal éveillé, contention légère et immobilisation de la tête). Ces étapes peuvent entraîner un stress et un inconfort léger, surtout lors des premières séances, parfois suivis d’une irritabilité transitoire.

Devenir

À l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort. Les objectifs du projet reposent sur l’analyse détaillée du cerveau ce qui nécessite le prélèvement des tissus cérébraux et donc ne permet pas de conserver l’animal en vie. En conséquence, les animaux ne peuvent pas être réutilisés, replacés ni proposés à l’adoption, car le prélèvement du cerveau est indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Remplacement

L’objectif central du projet est de recréer un contexte cérébral in vivo pour analyser le développement, l'intégration et le fonctionnement de neurones d'origine humaine au sein de réseaux nerveux intacts, et leur modulation dans des contextes pathologiques pertinents pour la maladie d'Alzheimer et la Schizophrénie. Ce niveau d'organisation (architecture tridimensionnelle, vascularisation, interactions cellulaires, connectivité à longue distance, activité des circuits) n'est pas accessible in vitro. Les protocoles nécessitent des méthodes standardisées chez les rongeurs, avec des outils robustes. La souris est un modèle de choix : élevage maîtrisé, lignées génétiques, suivi longitudinal. La xénogreffe de neurones humains permet d'étudier des gènes humains dans un cerveau vivant, indispensable pour relier mécanismes cellulaires et phénotypes de réseau. Les organoïdes cérébraux et les systèmes microphysiologiques sont des avancées majeures, mais ne reproduisent pas un cerveau fonctionnel intact. Ils modélisent certaines étapes du développement et des interactions locales, mais sans vascularisation perfusée, système immunitaire, innervation périphérique ou interactions systémiques. Ces limites restreignent leur maturation et empêchent d'étudier la connectivité à longue distance, la régulation neurovasculaire, les réponses métaboliques/hormonales et les propriétés pharmacocinétiques/pharmacodynamiques. Outils complémentaires in vitro, ils demeurent insuffisants pour la dynamique fonctionnelle, la plasticité et les interactions de réseaux dans un cerveau vivant. Les approches in vivo restent indispensables pour comprendre l'intégration de cellules humaines dans un environnement cérébral complet, en conditions physiopathologiques réalistes.

Réduction

Le projet combine des approches transversales (prélèvements terminaux à des temps définis pour différents analyses) et longitudinales (suivi répété des mêmes animaux, notamment par imagerie fonctionnelle), afin de maximiser l’information obtenue par animal. Une partie des animaux suivis longitudinalement est ensuite utilisée pour les analyses terminales, ce qui permet de relier des phénotypes fonctionnels à des mesures tissulaires et moléculaires sans augmenter les effectifs. Les tissus non immédiatement analysés peuvent être conservés dans des conditions adaptées afin d’éviter de nouveaux prélèvements. Les analyses sur cellule ou noyau unique reposent sur des protocoles déjà établis, capables de générer une grande quantité d’information à partir d’un nombre limité d’échantillons, ce qui contribue directement à la réduction du nombre d’animaux. Pour les greffes in utero, la taille des portées permet de limiter le nombre de femelles gestantes nécessaires. Le stade d’injection retenu a été optimisé lors d’études précédentes et assure une bonne survie de la progéniture. Les mâles et les femelles sont inclus avec une répartition aussi équilibrée que possible. Les animaux sont mis à mort en fin de protocole car les objectifs nécessitent le prélèvement du cerveau ; ils ne peuvent donc pas être réutilisés.

Raffinement

Les chirurgies seront réalisées dans un laboratoire dédié exclusivement à la chirurgie. L’élevage sera en cage individuelle par portée et des mesures seront prises pour éviter tout animal isolé au-delà d’une période de 24h. Les animaux seront placés sur dispositif chauffant pour maintenir une bonne température corporelle avant, pendant et après l’expérience et seront étroitement surveillés après chirurgie sous anesthésie et analgésie multimodale. Les points limites spécifiques et précoces pour chaque étape du projet serons appliqués. Dans les procédures expérimentales, les souris feront l’objet d’une surveillance renforcée, de soins pré- et post-opératoires adaptés, des mesures de gestion de la douleur seront entreprises pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des souris. De façon générale et pour l’ensemble des protocoles de chirurgies sous anesthésie, nous rechercherons à minimiser la douleur par antalgiques, ajout de gel hydrique, par un réchauffement continu des animaux, et par des solutions de réhydratation maintenues à la température corporelle. Un renforcement des mesures de bien-être animal sera systématiquement appliqué à chaque étape. Il inclut une surveillance accrue durant la période critique post-opératoire, une évaluation plus fréquente de la douleur et de l’état général des animaux, et l’intervention rapide en cas de signes de gêne ou de souffrance. Le renforcement de l’enrichissement des cages sera intensifié par l’ajout de matériaux de nidification, de dômes en carton et d’éléments favorisant le comportement naturel. L’utilisation et l’état des cotons et nids seront surveillés pour s’assurer du confort thermique et comportemental des animaux.

Choix des espèces

L’évaluation du rôle du système nicotinique et d’un récepteur particulier chez l’homme dans les processus associés à la maladie d’Alzheimer et la Schizophrénie ne peut être réalisée autrement que sur animaux vivants, présentant des niveaux de développement cognitif et de capacités mnésiques suffisants pour représenter un modèle d’étude pertinent. Les protocoles décrits ne peuvent s’effectuer que chez les rongeurs (rat ou souris) du fait des outils disponibles (taille des appareillages), et de la manipulation plus aisée. La souris représente un des meilleurs modèles, jusqu’à présent, sur lesquels on peut étudier les comportements liés à la psychiatrie, dont l’élevage et le maintien en bonnes conditions reste pratique à réaliser en laboratoire, et dont on sait également analyser et manipuler le génome (pour étudier notamment le rôle des sous-unités nicotiniques dans le cadre de ce projet). La Procédure 1 utilise des femelles adultes en fin de gestation. Cette intervention permet l’accès aux embryons à E17.5 et la réalisation des greffes in utero décrites dans la Procédure 2. Les descendants sont ensuite analysés à 1, 3 et 7 mois post-greffe. Ces temps correspondent respectivement à la prise de greffe et à la migration initiale, à une phase intermédiaire de différenciation et de maturation, puis à une maturation plus avancée et à l’intégration fonctionnelle. La Procédure 3 utilise des souriceaux à P2-P4. Ce stade postnatal précoce reste compatible avec une forte plasticité cérébrale, tout en permettant d’étudier la survie, la maturation et l’intégration d’interneurones humains dans un hôte immunodéficient permissif. Les analyses sont réalisées aux mêmes temps, à 1, 3 et 7 mois post-greffe. La Procédure 4 utilise des souris adultes âgées d’au moins 2 mois, dont les circuits cérébraux sont établis. Les analyses à 3, 4 et 7 mois post-greffe permettent d’évaluer successivement l’intégration initiale, les réponses précoces, puis les effets plus tardifs sur la maturation et l’activité des cellules greffées. Les modèles embryonnaire, néonatal et adulte répondent ainsi à des questions complémentaires et ne seront pas interprétés comme une comparaison reposant uniquement sur l’âge de greffe.

Pour mesurer comment une naissance prématurée, un régime maternel gras ou un déséquilibre hormonal marquent durablement le cerveau, 12 134 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes ou allaitantes reçoivent des molécules ou un régime enrichi en graisses, puis leur descendance est suivie de la naissance à l'âge adulte, prélèvements de tissu à l'oreille ou à la queue, injections de vecteurs viraux, prélèvements sanguins, chirurgies de deux à quatre heures sous anesthésie, et des évaluations du comportement dont aucun test n'est nommé. Le porteur annonce des conditions d'hébergement dérogeant aux standards réglementés, séparation des congénères de 24 heures à deux semaines et répétable, restriction alimentaire jusqu'à dix jours, jeûne de 24 heures, exposition à 4 °C pendant 24 heures jusqu'à quatre fois. 11 634 souris seront tuées pour prélever des tissus et 500 proposées à un autre projet, pendant que les retombées annoncées pour la prévention de l'obésité, du diabète et de l'infertilité restent au conditionnel.

Objectifs

Les premiers mois de vie constituent une période essentielle pour le développement du cerveau et de l’organisme. Durant cette phase, des facteurs tels qu’une naissance prématurée, une alimentation maternelle déséquilibrée, des variations hormonales ou certaines maladies génétiques peuvent influencer durablement la santé. Ces perturbations précoces peuvent augmenter, à long terme, le risque de développer des troubles métaboliques (comme l’obésité ou le diabète), des problèmes de fertilité (par exemple le syndrome des ovaires polykystiques), ainsi que des difficultés cognitives. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre comment l’environnement précoce influence le développement du cerveau, en particulier les circuits neuronaux qui contrôlent des fonctions essentielles comme l’alimentation, l’équilibre énergétique et la reproduction. Plus précisément, ce projet vise à : - explorer l’impact des perturbations précoces sur le développement du cerveau et sur certaines fonctions essentielles tout au long de la vie, de la naissance à l’âge adulte ; - comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans ces processus ; - identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour prévenir ou corriger certaines maladies, comme l’obésité, le diabète ou les troubles de la fertilité (par exemple le syndrome des ovaires polykystiques). Ce projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs EU 1/2 et EU 2/2 et le transfert des animaux entre les établissements sera limité au maximum.

Bénéfices attendus

Les premiers mois de vie sont une période cruciale pour le développement du cerveau. Des perturbations durant cette phase, comme une naissance prématurée, des déséquilibres hormonaux ou une alimentation maternelle inadaptée, peuvent avoir des conséquences durables sur la santé de la descendance. Elles augmentent notamment le risque de troubles métaboliques (comme l’obésité, le diabète ou certaines maladies cardiovasculaires), de difficultés reproductives, ainsi que de troubles du développement cognitif à l’âge adulte. Les résultats de ce projet présentent un double intérêt. D’une part, ils permettront d’acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes cellulaires et neuronaux impliqués dans le développement postnatal des circuits cérébraux qui régulent ces fonctions essentielles. D’autre part, ils pourraient contribuer à la santé publique en ouvrant la voie à de nouvelles stratégies de prévention ou de prise en charge des maladies métaboliques et reproductives. Enfin, ces travaux participeront au développement de modèles expérimentaux plus fiables et mieux adaptés pour la recherche en endocrinologie, en neurodéveloppement et en reproduction.

Procédures

Les interventions décrites ici pourront avoir lieu dans les 2 établissements utilisateurs. Les interventions d’une même procédure auront lieu soit intégralement dans l’EU1/2 soit intégralement dans l’EU2/2. Aucun transport d’animaux n’aura lieu en cours de procédure. Les animaux dont le modèle aura été créé dans l’EU2/2 seront transportés vers l’EU1/2 pour l’évaluation métabolique et comportementale. Chez les mères: Des femelles gestantes et/ou allaitantes recevront des molécules actives (par voie orale ou par injection) ou feront l’objet d’interventions nutritionnelles (régime enrichi en graisses). Les effets de ces traitements seront évalués chez les souriceaux dès la naissance, au cours d’un suivi longitudinal à moyen et long terme. Ce suivi comprendra différentes procédures d’évaluation de la reproduction (à partir de 8 semaines), du métabolisme (entre 4 et 20 sem.), du comportement (vers 8 sem.) et de l’activité cérébrale (jusqu’à 8 sem.). Chez la descendance: Tous les animaux issus des mères gestantes seront identifiés et prélevés au niveau de l’oreille ou de la queue. Des souriceaux (mâles et femelles) recevront, à des âges définis, des injections de molécules ou de vecteurs viraux. Ils feront ensuite l’objet d’un suivi longitudinal similaire, incluant des analyses de la reproduction, du métabolisme, du comportement et de l’activité cérébrale. Types d’interventions et durée : Les animaux pourront recevoir différents types de traitements par voie orale, par injections ou implantation de dispositifs. Des prélèvements sanguins seront réalisés (veines mandibulaire, caudale ou latérale), en respectant les volumes et fréquences maximaux autorisés. La durée de ces interventions est généralement comprise entre 5 et 20 minutes. Certains groupes seront soumis à des interventions chirurgicales dans le but d’évaluer la reproduction (anesthésie: 1h; intervention: 15 à 20 minutes) ou de réaliser un enregistrement de l’activité cérébrale (anesthésie et intervention: 2 à 4 h). Au cours de ces procédures, des anesthésiques et des analgésiques seront utilisés chaque fois que nécessaire. Les anesthésies seront réalisées par injection ou par inhalation et l’analgésie sera administrée par injection ou par application locale. Les animaux impliqués dans l’étude du métabolisme pourront recevoir des régimes spéciaux (régime enrichi en graisses pendant 3 à 12 mois), une restriction alimentaire (jusqu’à 10 jours) ou des périodes de jeûne (durée maximale de 24 heures).

Impact sur les animaux

Les manipulations réalisées sur les animaux peuvent entraîner du stress, de la fatigue et un certain inconfort. Certaines procédures, telles que les interventions chirurgicales, les injections ou les prélèvements sanguins, peuvent provoquer des douleurs légères de courte durée pouvant être répétées. Dans le cadre des études métaboliques ou comportementales, les animaux seront soumis à des conditions d’hébergement dérogeant aux standards réglementés. En effet les animaux pourront être privés de leur congénères (sans isolement visuel et olfactif) pendant des durées allant de 24h à 2 semaines et pouvant être répétées. Les animaux pourront être restreints en quantité de nourriture (maximum 10 jours) et/ou être exposés à des jeûnes allant jusqu’à maximum 24h. Enfin, pour évaluer la réponse aux changements de température, les conditions standards de température d’hébergement pourront également modifiées (maximum 24h d’exposition à 4°C, 4 expositions au maximum espacées d’au minimum 72h OU 24-72h à 30°C).

Devenir

À l’issue des procédures, les animaux sont mis à mort selon des méthodes réglementaires et encadrées, afin de permettre le prélèvement des tissus nécessaires aux analyses scientifiques. Ces prélèvements sont indispensables pour comprendre en détail les mécanismes étudiés et ne peuvent pas être réalisés autrement. Les animaux ne présentant pas le bon génotype pour l'étude seront proposés pour un autre projet.

Remplacement

Pour évaluer l’impact de l’environnement périnatal sur le développement des systèmes neuroendocriniens, il n’existe actuellement pas d’alternative à l’expérimentation animale. La complexité des phénomènes étudiés, notamment l’influence de l’environnement maternel sur le développement de l’organisme, implique des interactions étroites entre plusieurs organes (cerveau, tissus périphériques, systèmes hormonaux) qui ne peuvent pas être reproduites de manière fiable par des modèles informatiques. Les animaux invertébrés ne peuvent pas être utilisés dans ce contexte, car leur organisation biologique est très différente de celle des mammifères. Ils ne possèdent pas les mêmes structures cérébrales ni les mêmes systèmes hormonaux, ce qui ne permet pas d’étudier les mécanismes neuroendocriniens pertinents pour la santé humaine. Par ailleurs, les modèles in vitro, tels que les organoïdes ou les cellules souches, bien qu’utiles pour certaines questions spécifiques, ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions entre les organes ni les réponses physiologiques intégrées de l’organisme entier. Or, ces interactions sont essentielles pour répondre aux objectifs de nos recherches en physiologie intégrée.

Réduction

​​​​​Le nombre d’animaux nécessaires a été déterminé à l’aide de calculs de puissance statistique, afin de garantir l’obtention de données fiables tout en limitant leur utilisation au strict minimum. La taille de chaque groupe expérimental a été définie à l’aide d’outils de planification adaptés, permettant d’éviter l’utilisation d’animaux en excès tout en assurant la robustesse des résultats. Par ailleurs, certaines expériences ne seront entreprises que si les résultats des étapes précédentes le justifient, ce qui permet d’éviter des expérimentations inutiles. Enfin, les protocoles expérimentaux ont été conçus pour optimiser l’utilisation de chaque animal. Lorsque cela est possible, plusieurs types d’analyses seront réalisés sur un même individu (par exemple, des évaluations physiologiques et des analyses moléculaires sur différents organes), réduisant ainsi le nombre total d’animaux nécessaires.

Raffinement

​Les animaux sont hébergés dans des conditions strictement contrôlées, garantissant leur bien-être et un bon état de santé. Ils ont accès en permanence à l’eau et à la nourriture, et leur environnement est enrichi (par exemple avec des matériaux pour construire un nid), afin de leur permettre d’exprimer des comportements naturels et de réduire le stress. Les manipulations sont réalisées par du personnel formé et les animaux sont progressivement habitués à être manipulés afin de diminuer leur stress. Une attention particulière est portée à la réduction de toute douleur, peur ou inconfort. Lorsque des interventions sont nécessaires, elles sont réalisées sous anesthésie adaptée et des traitements contre la douleur sont administrés si besoin, avant et après les procédures. Après chaque intervention, les animaux sont surveillés attentivement jusqu’à leur réveil complet, puis leur état de santé est suivi quotidiennement (activité, alimentation, poids, comportement) avec le moins de perturbations possibles. Une attention particulière sera apportée afin de prévenir tout transfert d‘odeurs étrangères à la cage qui pourraient compromettre le lien entre la mère et ses petits. Des critères précis sont définis pour intervenir rapidement en cas de problème. Si un animal montre des signes de souffrance ou de détresse, il est immédiatement pris en charge et, si nécessaire, retiré de l’étude afin d’éviter toute souffrance prolongée. Dans le cadre des études métaboliques ou comportementales, les différentes contraintes sont appliquées de manière séquentielle avec des périodes de récupération permettant la stabilisation physiologique entre étapes et les animaux disposent d’un enrichissement compatible avec les mesures (litière et matériel de nidification). Lors du déplacement des animaux de l’EU2/2 vers l’EU1/2, les animaux seront transportés dans un véhicule climatisé dans des cages de transport agréées sous condition d’autorisation pour le statut sanitaire (distance 11,1 km ; statuts sanitaires équivalents) entre les EU. Les animaux seront acclimatés pour une période de 7 jours sur le site d’accueil avant toute manipulation. Des points limites ont été définis et seront appliqués. Tout animal présentant des signes s’approchant ou atteignant l’un d’entre eux seront retirés de l’étude et si nécessaire, mis à mort.

Choix des espèces

​Nos projets de recherche en physiologie intégrée visent à comprendre les interactions entre le corps et le cerveau afin d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques pour des pathologies telles que le diabète, l’obésité et l’infertilité. Nous étudierons des souris de la naissance à l’âge adulte afin de couvrir l’ensemble des étapes clés du développement et de la maturation des systèmes biologiques. La période néonatale correspond à une phase critique de mise en place et d’organisation des structures, notamment au niveau neuroanatomique et neuroendocrinien, tandis que l’âge adulte reflète un état fonctionnel stabilisé de ces systèmes. Cette approche permet d’appréhender la dynamique des mécanismes physiologiques au cours du temps et d’identifier d’éventuelles origines développementales aux altérations observées à l’âge adulte. Le recours aux animaux est strictement limité aux situations dans lesquelles aucune méthode alternative ne permet d’obtenir un niveau d’information équivalent. L’espèce utilisée a été choisie de manière à maximiser la pertinence scientifique tout en minimisant la douleur, la souffrance et le nombre d’animaux utilisés. La souris est privilégiée car des données essentielles à l’interprétation des résultats ne sont disponibles que dans cette espèce, ce qui contribue également à réduire la variabilité expérimentale et, par conséquent, le nombre d’animaux nécessaires. De plus, les études physiologiques en neuroendocrinologie ainsi que les recherches sur l’obésité et l’infertilité ont historiquement été menées chez la souris, facilitant la comparaison avec les données existantes. Enfin, certaines expériences proposées nécessitent l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour lesquels la souris constitue de loin le modèle expérimental le plus pertinent et le mieux caractérisé.

Six tests comportementaux par souris sur trois semaines, dont un labyrinthe en Y et une piscine équipée d'une plateforme de sortie, plus quatre prélèvements sanguins isolés et trois séries de prélèvements étalées sur deux heures : 288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux de dix-huit jours reçoivent de l'ovalbumine par voie intrarectale sous anesthésie, puis sont tués par dislocation cervicale une heure après leur réveil. L'objet est de mesurer les effets des additifs des laits infantiles sur l'intestin et le cerveau, avec des résultats destinés à éclairer l'Efsa et l'Anses. Le porteur qualifie ces tests comportementaux de "non invasifs et n'induisant pas de stress", tout en annonçant que certaines souris pourraient développer une inflammation intestinale chronique et un comportement anxieux.

Objectifs

Le lait maternel joue un rôle essentiel dans la croissance des nouveau-nés. Il module entre autres le microbiote intestinal, qui lui-même participe au bon développement du cerveau et de la santé. De nombreux nourrissons sont alimentés avec des laits de substitution en poudre. Ces préparations contiennent des additifs, utilisés notamment pour améliorer leur texture ou leur conservation. Il a déjà été montré que certains de ces additifs peuvent perturber l’équilibre du microbiote intestinal, entraînant une dysbiose et une inflammation intestinale chez l’adulte. En revanche, leurs rôles et leurs conséquences sur le développement du cerveau durant la période néonatale sont peu explorées et leurs effets à plus long terme sur le comportement restent inconnus. Ce projet a pour objectif d'étudier chez l'animal les effets de la consommation durant la période néonatale de laits contenant ces additifs sur l’axe intestin-cerveau à différentes périodes de la vie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont multiples. Sur le plan fondamental, ce projet apportera des connaissances nouvelles sur les mécanismes par lesquels l'alimentation agit sur la santé intestinale et le développement cérébral durant la période néonatale, et sur la façon dont les perturbations précoces du microbiote peuvent influencer l’apparition d’inflammation intestinale et le comportement à long terme. Sur le plan appliqué, les résultats viendront éclairer les évaluations des risques sanitaires liés à ces additifs chez les nourrissons. Ils pourront orienter l'optimisation des formulations des laits infantiles et fournir des éléments scientifiques utiles aux instances de réglementation (Autorité européenne de sécurité des aliments (Efsa), agence nationale de sécurité sanitaire (Anses)), dans une perspective de meilleure protection de la santé des nouveau-nés. Enfin, ces travaux contribueront à enrichir les recommandations nutritionnelles destinées aux familles et aux professionnels de santé.

Procédures

Les animaux subiront 4 prélèvements uniques de sang pour une durée inférieure à 1 minute afin de mesurer la gly-cémie. Les animaux subiront 3 prélèvements multiples de sang sur une durée de 2h, chacun de ces prélèvements mul-tiples seront séparés d’au moins une semaine afin de mesure la glycémie lors d’un test de tolérance au glucose. Les animaux adultes seront impliqués dans des tests de comportement non invasifs et n'induisant pas de stress chez l'animal. Les animaux adultes seront au préalable soumis à une phase d’habituation d’une semaine qui n'induira que peu ou pas de stress chez: chaque jour, ils seront exposés à l’expérimentateur et à la salle de comportement pendant une durée de 30 minutes à 1 heure, afin de réduire le stress lié à la manipulation et à l’environnement expérimental. À l’issue de cette période, une série de tests comportementaux sera réalisée pour évaluer différents aspects tels que l’anxiété, la sociabilité, la mémoire et l’hyperactivité. Ces évaluations reposeront sur les paradigmes suivants : • tes de l’anxiété : Les dispositifs expérimentaux combineront des zones ouvertes/éclairées et des zones fermées/protégées. Le temps de présence dans chaque type de zone sera quantifié sur une période de 10 minutes • évaluation de la mémoire : phase d’habituation de 10 minutes durant laquelle l’animal est placé dans une arène contenant des objets, dans un labyrinthe en Y ou dans une piscine équipée d'une plateforme pour permettre à l'animal de sortir de l'eau. Suite à une modification de la configuration (changement d’objets ou d’accessibilité des zones), une phase de test de 10 minutes permettra de mesurer la capacité de reconnaissance ou de spatialisation de l’animal. • évaluation de la sociabilité : mesureront la préférence naturelle de l’animal à interagir ou à passer du temps à proximité d’un congénère plutôt que d’un objet inanimé, sur une durée de 10 minutes Chaque test comprendra une phase d’habituation de 10 minutes à l’arène, suivie d’une phase de test de 10 minutes par animal. La fréquence des tests est limitée à un seul test par jour et par animal au maximum, pour un total d’environ 6 tests par animal répartis sur une période de trois semaines. • animaux jeunes adultes agés de 18 jours subiront une administration intrarectale d’ovalbumine après anesthésie à l’isoflurane. Après 1h de phase de réveil, ils seront mis à mort par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Certaines procédures pourraient induire une inflammation intestinale chronique de bas bruit sans ulcération majeure et qui n’a pas de conséquences visibles sur le phénotype. De plus, certains animaux pourraient développer des dérégulations métaboliques, caractérisées notamment par une augmentation de la masse grasse ainsi que présenter un comportement anxieux. Les tests comportementaux réalisés sur animaux adultes entraineront peu ou pas de stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car l’analyse de leurs organes est nécessaire pour répondre à notre hypothèse de travail.

Remplacement

Des modèles in vitro de culture de microbiote intestinal ainsi que des modèles cellulaires permettant de mimer la barrière intestinale existent. Cependant, le recours au modèle murin est indispensable dans le cadre de ce projet afin de comprendre les interactions hôte / microbiote et notamment cerveau/intestin/microbiote en lien avec le développement d’inflammation chronique de bas bruit et de troubles du comportement. Des animaux plus simples tels que la drosophile, C. elegans ou le poisson zèbre ne peuvent pas non plus être utilisés car la physiologie du développement cérébral et du comportement de ces animaux est très différente de celle des mammifères.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions sera inclus dans chaque groupe. Des études précédentes ont montré que dans le même type de procédure, l’utilisation de 12 souris par condition et par sexe était nécessaire afin d’atteindre des résultats interprétables et garantir l’utilisation de tests statistiques appropriés. Les tests statistiques envisagés dans le cadre de ce projet l’ont été après avis recueilli auprès de biostatisticiens pour des projets similaires. De plus, il s’agit d’une expérience au design longitudinal, ce qui nous permet d’observer le phénotype des souris aux différents stades de développement et donc limiter le nombre de souris nécessaires.

Raffinement

Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Dans un souci de raffinement, un suivi étroit des animaux et des points limites précoces et adaptés seront mis en place tout au long des expérimentations. Des points limites spécifiques et précoces sont définis pour chaque protocole. Dès l’apparition d’un signe clinique, différentes méthodes de raffinement seront appliquées pour éviter ou minimiser l’inconfort ou la douleur : utilisation de gel de réhydratation, réhydratation sous-cutanée, renforcement de l’enrichissement.

Choix des espèces

Cette étude privilégie la souris comme modèle de référence pour analyser l'impact des additifs alimentaires sur le microbiote intestinal et le développement cérébral néonatal. Ce choix se justifie par la capacité à suivre précisément les interactions microbiote-système immunitaire dès la naissance grâce à des outils d'analyse avancés. Bien que simplifiée, la physiologie mu-rine offre une pertinence conceptuelle et souvent directe pour comprendre les mécanismes chez le nouveau-né humain. En pratique, la souris est indispensable : sa reproduction rapide permet d'obtenir de grandes portées pour suivre les effets à long terme d'une exposition nutritionnelle précoce, de la nais-sance à l'âge adulte. De plus, c'est l'espèce la mieux maîtrisée pour évaluer les fonctions co-gnitives et comportementales en milieu contrôlé. Ces avantages combinés garantissent une efficacité optimale dans la recherche tout en assurant une représentation physiologique fiable des processus biologiques humains. Le premier groupe sera suivi jusqu’à l’âge du sevrage, soit environ trois semaines. Cette période constitue la phase d’exposition aux additifs ; c’est également une fenêtre de développement où le microbiote intestinal et le cerveau sont particulièrement sensibles à l’environnement nutritionnel. Le second groupe sera suivi jusqu’au 18ème jour de vie. Cette période constitue la phase d’exposition aux additifs ; c’est également une fenêtre de développement où le microbiote intestinal et le système immunitaire sont modulés par l’environnement nutritionnel. Le troisième groupe sera maintenu dans les mêmes conditions jusqu’à l’âge adulte, l’exposition aux additifs étant limitée à la seule période néonatale. Ce suivi longitudinal permettra de vérifier si les éventuelles perturbations observées chez le jeune animal perdurent et influencent le comportement et l’état général à long terme. L’utilisation de ces deux stades est indispensable à la démarche scientifique : la période néonatale représente le moment critique de l’exposition alimentaire, tandis que l’évaluation à l’âge adulte est nécessaire pour mesurer l’existence d’effets différés.

Pour reproduire chez la souris une malformation d'une veine du cerveau qui touche les enfants, 572 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles gestantes subissent l'ouverture de l'abdomen sous anesthésie générale pendant 45 minutes, avec points de suture, puis des injections sous anesthésie une fois par jour pendant deux jours. Les embryons reçoivent dans le cerveau une injection de cinq secondes, qui peut provoquer leur mort. L'effectif n'est adossé à aucun calcul détaillé, le porteur indiquant l'avoir réduit "au minimum nécessaire" et renvoyant l'analyse à un test statistique qu'il qualifie d'"adéquat".

Objectifs

Notre projet a pour objectif de générer un modèle d’étude de la malformation anévrysmale de la veine de Galien chez la souris. Cette pathologie pédiatrique due à la connexion directe anormale entre une artère et une veine cérébrales et conduisant à un anévrysme est associée à des troubles neurologiques graves. Ce projet vise à étudier l’interaction entre le développement du cortex cérébral et du système vasculaire, en exprimant la forme humaine contrôle et des formes mutées de deux gènes impliqués dans cette pathologie chez un modèle de souris contrôle.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu du projet est de connaître l’implication du système neuronal, en particulier le rôle de certains neurones, dans l’apparition des troubles neurologiques de la malformation de la veine de Galien dans un modèle de souris contrôle. Ce projet permet également d’étendre nos connaissances sur le rôle de ces cellules d’intérêt sur le développement vasculaire cérébral et du cerveau en général.

Procédures

Les femelles gestantes subiront une anesthésie générale de 45 minutes au cours d’une chirurgie qui comprendra l’ouverture de l’abdomen et des points de suture. Certaines subiront 1 fois 1 injection intra-péritonéale sous anesthésie générale. Elles subiront des injections sous anesthésie générale, 1 fois par jour pendant 2 jours. Des embryons subiront une injection intracérébrale d’une durée de 5 secondes.

Impact sur les animaux

L’induction de l’anesthésie gazeuse et la chirurgie des femelles gestantes entrainent un stress modéré. Les injections intra-cérébrales in utero peuvent entrainer la mort de certains embryons.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure pour prélèvement d’organes et analyses phénotypiques.

Remplacement

Les questions abordées dans ce projet nécessitent un modèle animal. En effet, le développement cérébral et vasculaire ne peut être étudié qu’à l’échelle de l’organisme car aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité des interactions entre les types cellulaires du cerveau et des vaisseaux sanguins.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés par une approche statistique, ainsi que par des expériences antérieures sur ce type d’études de modèles animaux. Ce nombre a été réduit au minimum nécessaire pour atteindre des résultats statistiquement significatifs. L’analyse statistique sera réalisée par un test statistique adéquat.

Raffinement

Tous les animaux seront maintenus dans un environnement enrichi avec eau et nourriture à volonté. Lors des actes chirurgicaux, les souris seront anesthésiées et placées sur une plaque chauffante et régulièrement hydratées. Elles recevront des analgésiques en pré et en post-opératoire. Une litière spécifique, adaptée aux animaux opérés, sera utilisée afin de minimiser le risque d’infection post-opératoire. Un gel ophtalmique sera appliqué durant toute l’anesthésie pour prévenir le dessèchement des yeux. Après l'opération chirurgicale, la surveillance des animaux sera quotidienne afin de détecter d’éventuels signes de souffrance. Une grille de score d'évaluation des animaux sera mise en place. Une injection d'analgésique ou la mise à mort de l'animal sera réalisée en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites.

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle de choix pour mener des études sur le développement du système nerveux, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral et de la vascularisation du cerveau entre les rongeurs et l’humain. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce permettant de répondre à nos questions scientifiques tels que les modèles génétiquement modifiés. Les femelles gestantes sont des adultes de 2 à 6 mois. Les expérimentations sont menées sur des animaux aux stades de développement embryonnaire et postnataux où interviennent les phénomènes étudiés.