Biologie du développement

Quatorze jours consécutifs d'injections sous-cutanées d'hormones, six prélèvements de sang, une transplantation de cellules mammaires dans le coussin adipeux de souris receveuses de trois semaines : 5 072 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort pour prélever leurs glandes mammaires et leurs tumeurs. Le projet relève de la recherche fondamentale, comprendre comment le gène p16 limite la plasticité des cellules mammaires hors de son rôle dans le cycle cellulaire. Le porteur estime à un à deux mois l'inconfort lié au développement des tumeurs mammaires, et à 24 ou 48 heures la douleur modérée qui suit la pose d'un implant ou la greffe. Il justifie le recours à la souris par les cinq paires de glandes collectables sur un même individu, et étudie des femelles vierges, gestantes, allaitantes, ou âgées de 18 mois selon le stade visé.

Objectifs

La glande mammaire est un organe doté d’une plasticité exceptionnelle et d’un développement postnatal dynamique. Elle contient des types cellulaires spécifiques, essentiels pour les remaniements morphologiques postnataux. Cependant, les mécanismes permettant à ces cellules de maintenir leur plasticité restent encore mal compris. Le cancer du sein de type basal, un sous-type particulièrement agressif, se caractérise par la perte d'expression des récepteurs hormonaux et du récepteur du facteur de croissance épidermique humain. Certaines cellules ont été identifiées comme les cellules d’origine de ce cancer, suggérant qu’elles acquièrent une plasticité anormale lors de la tumorigenèse. Ainsi, l’un des objectifs centraux de ce projet est d’élucider comment ces cellules limitent leur plasticité en situation d’homéostasie. Nos résultats préliminaires indiquent qu’un gène pourrait réguler la plasticité de cellules mammaires qui nous intéressent même en dehors de son rôle classique dans le contrôle du cycle cellulaire. Ce projet s’articule autour de deux questions majeures : 1. Comment notre gène d’intérêt régule-t-il la plasticité dans un contexte normal ? 2. Quelles sont les conséquences d’une dérégulation de cette plasticité sur les processus physiologiques (comme la lactation et/ou l’involution) et pathologiques (comme la tumorigenèse) de la glande mammaire ? En répondant à ces questions, nous espérons approfondir notre compréhension des mécanismes qui gouvernent la plasticité cellulaire mammaire et leurs implications dans la tumorigenèse.

Bénéfices attendus

La souris est fréquemment utilisée pour étudier le développement de la glande mammaire après la naissance, car il s’agit d’un mammifère dont l’organisation de la glande mammaire présente de nombreuses similarités avec celle de l’être humain. De plus, il existe des modèles de souris génétiquement modifiées qui permettent d’étudier précisément le rôle de certains gènes, dans différentes étapes de la vie de la glande mammaire comme la gestation, la lactation et l’involution (retour de la glande à son état normal après l’allaitement). Ces modèles permettent également d’étudier les mécanismes impliqués dans la régénération des tissus et dans le développement des cancers du sein. La souris possède également plusieurs glandes mammaires, ce qui permet de réaliser différentes analyses à partir d’un même animal afin de limiter le nombre de souris utilisées. Les tissus prélevés permettront d’étudier la structure des glandes, l’expression de certains gènes ainsi que l’activité de mécanismes biologiques impliqués dans le fonctionnement normal ou pathologique des cellules mammaires. Ce projet de recherche fondamentale vise à mieux comprendre comment certaines cellules de la glande mammaire conservent leurs caractéristiques tout en étant capables de s’adapter aux besoins du tissu au cours de la vie. Nous cherchons également à comprendre pourquoi des dérèglements de ces mécanismes peuvent favoriser l’apparition de cancers du sein. Plus précisément, nous étudierons le rôle d’un gène qui produit une protéine connue pour limiter la multiplication des cellules et prévenir la formation de tumeurs. Nos premiers résultats obtenus en laboratoire suggèrent que cette protéine pourrait aussi jouer un rôle important dans le maintien de l’identité des cellules mammaires.

Procédures

Dans ce projet, 9 types de manipulations sont prévues : 1/ Implantation ou retrait d’implants hormonaux : 1 fois, 15 minutes par souris 2/ Injection de substance en intrapéritonéal (dans la cavité abdominale) : 1 à 4 jours consécutifs sur souris vigiles, quelques secondes par souris 3/ Administration de substance par gavage : 1 à 4 jours consécutifs sur souris vigiles, quelques secondes par souris 4/ Injection sous cutanée d’hormones : 14 jours consécutifs sur souris vigiles, quelques secondes par souris 5/ Procédure chirurgicale de transplantation sous anesthésie gazeuse, de cellules mammaires dans le coussin adipeux de souris receveuses pré-pubères de 3 semaines : 1 fois, 15 minutes par souris 6/ Prélèvement de sang : 6 fois sur plusieurs semaines, quelques secondes par souris 7/ Injection d’une autre substance en intrapéritonéal : 1 à 4 jours consécutifs sur souris vigiles, quelques secondes par souris 8/ Injection de cellules tumorales dans la glande mammaire (sous cutanée) : 1 fois, quelques secondes par souris 9/ Procédure chirurgicale de retrait de tumeur primaire sous anesthésie : 1 fois, 15 minutes par souris

Impact sur les animaux

Pour les femelles qui entreront dans ces procédures, ce projet occasionnera essentiellement un stress léger à modéré dû : 1- à l’administration des différentes molécules destinées à moduler l’expression d’un gène ou d’une protéine (introduction d’une aiguille ou d’une sonde de gavage). La durée de ce stress est estimée à quelques secondes lors de l’introduction de l’aiguille ou de la sonde de gavage. 2- à la procédure chirurgicale de transplantation cellulaire ou de greffe d’implant (gène de déplacement lié à l’implant dorsal). La durée de ce stress (inconfort et douleur modérée) est estimée à 24h (implant) à 48h (greffe), mais sera contrôlée par la mise en place d’un traitement analgésique 3- au développement des tumeurs (gène de déplacement lié au développement du tumeurs mammaires). L’inconfort lié à cette procédure expérimentale est estimé à 1 à 2 mois

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car pour l’ensemble des procédures expérimentales, le but est de collecter les glandes mammaires et/ou tumeurs en vue de leurs analyses.

Remplacement

Pour étudier le rôle de p16 dans le développement et la tumorigenèse de la glande mammaire, nous ne pouvons pas utiliser exclusivement la culture cellulaire in vitro. En effet, nous n’avons pas réussi pour le moment à mimer fidèlement l’organisation 3D du tissu et à reproduire l’ensemble du cycle reproductif de la glande mammaire ainsi que du développement tumoral. Nous souhaitons donc utiliser la souris comme organisme modèle. Cet animal présente de nombreux avantages pour notre étude. C’est un mammifère dont l’organisation du tissu mammaire est similaire à celle de l’être humain.

Réduction

Toutes les souris utilisées seront du même fond génétique entre les groupes contrôles et les groupes traités ou génétiquement modifiés, ce qui préviendra la fluctuation des résultats due aux variations génétiques entre les animaux et permettra d’obtenir des résultats fiables tout en utilisant moins d’animaux. Le nombre nécessaire et suffisant d’animaux est déterminé par rapport aux expériences préliminaires ne nécessitant pas d’autorisation (mise à mort des animaux afin de collecter leurs tissus sans utilisation de gestes technique au préalable), ainsi que sur les méthodes employées dans la littérature scientifique relative à l’élaboration de ces modèles animaux. De plus, la souris possède 5 paires de glandes mammaires, permettant de réaliser à partir d’une seule souris de nombreuses analyses et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Nous allons utiliser le nombre minimum d’animaux nous permettant d’obtenir des résultats homogènes et suffisant pour obtenir des différences statistiquement significatives entre les groupes contrôles vs les groupes expérimentaux (Mutants ou traités). Les animaux seront générés à partir de croisement nous permettant de garder le maximum d’animaux d’une même portée pour les utiliser soit dans des procédures expérimentales, soit maintenir les génotypes pour les accouplements. Par conséquent, la majorité des animaux obtenus à partir des accouplements pourront être utilisés dans des expériences en évitant ainsi la surproduction inutile de souris. Les mâles seront utilisés comme mâles reproducteur afin d’induire les gestations. Lors de procédures nécessitant des gestations synchronisées de façon très précises entre 2 groupes et éviter de faire se reproduire des animaux qui ne pourraient finalement pas être inclus dans notre études, nous mettrons également en place une procédure chirurgicale légère consistant à l’introduction d’un implant en silicone permettant la libération d’hormones en continue afin de mimer une pseudo gestation et garantir la synchronisation des animaux.

Raffinement

La manipulation des animaux sera strictement limitée aux interventions décrites dans les protocoles et aux soins, afin de limiter leur stress. Nous surveillerons régulièrement les souris et respecterons les points limites définis pour limiter la souffrance des animaux. Quelles que soit les procédures mises en place : injection intra-péritonéale, gavage, transplantation dans le coussin adipeux et prélèvement sanguin, les souris serons systématiquement évaluées quotidiennement pendant 3 jours, puis de façon hebdomadaire ou bi-hebdomadaire dans les procédures induisant un développement tumoral mammaire et des points limites spécifiques et précoces seront mis en place. La douleur chez les souris sera évaluée selon l’apparence (normale, pelage ébouriffé avec expression modérée, dos voûté avec expression sévère), le score de condition corporelle, le poids corporel et l’apparition de lésion nécrotique. Du gel nutritif sera mis à disposition des animaux dès l’apparition des signes cliniques afin de favoriser leur hydratation et un traitement avec un désinfectant sera appliqué sur les petites lésions nécrotiques. De plus, une litière douce et adaptée sera utilisée lorsque les souris commenceront à développer des tumeurs.

Choix des espèces

En tant que mammifère, la souris est le modèle animal le plus approprié pour étudier le développement de la glande mammaire car la structure du tissu mime fidèlement celui retrouvé chez la femme. De plus, il existe déjà de nombreux modèles murins génétiquement modifiés mimant les altérations existantes dans les pathologies humaines, notamment pour le cancer du sein. Enfin, la souris possède 5 paires de glandes. A partir d’un seul individu, nous pouvons donc collecter une grande quantité de matériel, réduisant ainsi la quantité d’animaux utilisés dans cette étude. Les animaux utilisés pour les expériences seront pour la plupart des souris adultes âgées de plus de 8 semaines. Nous étudierons soit des souris vierges et donc avant leur mise en accouplement, soit des souris qui auront été accouplées et que nous analyserons au cours du cycle de développement de la glande mammaire, à savoir : la gestation, la lactation et l’involution. De plus, certaines procédures expérimentales incluront des souris de 6 semaines afin d’analyser les glandes mammaires au cours de la puberté. Le choix de ces stades de développement est totalement dicté par le développement de la glande mammaire qui est essentiellement post natal et qui subit de nombreuses modifications au cours des cycles reproductifs que nous souhaitons étudier. Enfin, nous utiliserons également des souris âgées de 3-4 semaines dans les expériences de transplantation (souris receveuses) et des souris de 18 mois afin de suivre le développement des tumeurs.

Des femelles gestantes sont anesthésiées et opérées vingt à trente minutes pour qu'une injection atteigne directement l'embryon, d'autres reçoivent un gavage de deux minutes sans anesthésie. Leurs petits passent ensuite des tests comportementaux entre trois et vingt et un jours après la naissance, que le résumé ne nomme pas. 1 578 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec un risque d'avortement ou de résorption embryonnaire après la chirurgie. Toutes seront tuées à la fin des procédures pour le prélèvement de tissu cérébral. Le porteur écrit avoir "réduit au maximum le nombre d'animaux nécessaire à ce projet de grande nécessité".

Objectifs

Le cerveau contient différents types de cellules, dont les astrocytes, qui jouent un rôle essentiel dans la communication entre les neurones et dans le bon fonctionnement cérébral. Ce projet vise à mieux comprendre la diversité et les fonctions des sous-populations d’astrocytes dans une partie du cerveau nommée cortex, depuis leur formation jusqu’à leur implication dans des troubles du neurodéveloppement, tels que les troubles du spectre de l’autisme et la schizophrénie. Pour cela, plusieurs modèles de souris seront utilisés afin de suivre ou d’éliminer spécifiquement certaines populations d’astrocytes et ainsi comprendre leurs rôles en contexte sain et pathologique. Les objectifs principaux du projet sont : 1. Comprendre d'où viennent ces cellules et comment elles se développent. 2. Déterminer leur rôle au cours du développement. 3. Analyser les conséquences de ces cellules sur le comportement social, cognitif et sensoriel. 4. Étudier leur rôle sur l’activité électrique des neurones en conditions saines et dans des modèles de troubles du neurodévelopement. Les connaissances obtenues permettront de mieux comprendre comment et pourquoi les astrocytes sont essentiels au bon fonctionnement du cerveau et jouent un rôle dans les maladies neuroveloppementales, offrant ainsi de nouvelles pistes diagnostiques et/ou thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer la compréhension du fonctionnement du cerveau en caractérisant une population de cellules du cerveau appelée "astrocytes", longtemps considérée comme un groupe de soutien des neurones, mais aujourd’hui reconnues comme des acteurs essentiels de la communication entre les neurones. Les résultats attendus permettront de mieux comprendre comment ces cellules se développent, interagissent avec les neurones et contribuent à la formation du réseau de neurones pendant le développement et ainsi aux comportements cognitifs, sensoriels et sociaux. Cette connaissance est essentielle pour identifier de nouvelles pistes pour lutter contre les symptômes des troubles complexes que sont les troubles du neurodéveloppement (dont les troubles du spectre de l'autisme et la schizophrénie) en constante augmentation et dont les causes restent à ce jour inconnues. À terme, les bénéfices potentiels de ce projet sont : 1. Une meilleure compréhension des mécanismes à l’origine des troubles du neurodéveloppement ; 2. La mise en évidence de nouvelles pistes de cibles diagnostiques et/ou thérapeutiques centrées sur les astrocytes ; 3. La caractérisation de modèles animaux de troubles du spectre de l'autisme et de la schizophrénie qui seront utiles pour développer, tester et valider de nouvelles stratégies de prévention, de diagnostique et/ou de traitement. Ce projet apportera donc des avancées fondamentales en neurosciences susceptibles d’avoir, à long terme, un impact positif sur la santé humaine.

Procédures

Les nuisances prévues dans ce projet sont modérées, mais strictement encadrées pour limiter la douleur, le stress et la souffrance des animaux. Les animaux seront soumis à différents types d’interventions selon l’étude concernée : Procédures chirurgicales sur femelles gestantes : pour les expériences nécessitant une injection directement dans l’embryon, les mères seront mises sous anesthésie générale, puis subiront une chirurgie de courte durée (20 à 30 minutes), suivie d’une période de traitement antidouleur de 24 h. Certaines études nécessiteront une alimentation dirigée directement dans l'oesophage de femelles gestantes : manipulation rapide (2 minutes/femelle) sans anesthésie, induisant un stress modéré et transitoire. Tests comportementaux : manipulations non invasives de courte durée (quelques minutes à 1 h selon le test de 3 jours à 21 jours après la naissance), susceptibles d’entraîner un stress léger mais sans douleur ni lésion tissulaire.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales sont susceptibles d’induire chez les animaux plusieurs effets indésirables, malgré la mise en place de mesures analgésiques et de raffinement. Les effets attendus incluent : une douleur post-opératoire transitoire liée aux interventions chirurgicales, généralement de faible à modérée intensité grâce à la prise en charge analgésique ; un stress lié à la contention, aux manipulations et à l’environnement expérimental ; une altération temporaire de l’état général (diminution de l’activité, modification de la prise alimentaire) ; chez les femelles gestantes, un risque d’avortement ou de résorption embryonnaire en post-chirurgie. Ces effets sont surveillés et limités par des protocoles de suivi adapté et des critères d’arrêt prédéfinis.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de toutes les procédures pour prélevement de tissu cérébral.

Remplacement

Pour comprendre comment se développent les astrocytes et à quoi ils servent, il est nécessaire de les étudier pendant le développement du cerveau, or, aucun modèle à part les animaux ne permet aujourd’hui de reproduire la complexité de la mise en place des interactions entre les différents type de cellules pendant et après le développement du cerveau. Cette étude nécessite donc l'utilisation d'animaux mais nous avons réduit au maximum le nombre d'animaux nécessaire à ce projet de grande nécessité.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé à partir de données préliminaires et d’analyses statistiques pour garantir la validité scientifique et détecter une possible différence entre les mâles et les femelles, tout en minimisant les effectifs. Les animaux seront utilisés pour plusieurs types d’analyses complémentaires afin d’optimiser l’utilisation de chaque animal et éviter la génération d’animaux surnuméraires.

Raffinement

Toutes les procédures seront réalisées, sous anesthésie et analgésie appropriées lorsque nécessaire, et les animaux maintenus dans des conditions d’hébergement enrichies. Les manipulations seront limitées en durée et en fréquence, la surveillance quotidienne assurera le bien-être des animaux, et toute source de douleur ou de stress sera prévenue ou immédiatement traitée.

Choix des espèces

L’espèce choisie est la souris (Mus musculus), modèle de référence en neurosciences, avec une organisation et un développement cérébral comparables à l’Homme, présentant des comportementaux sociaux élaborés dont les altérations peuvent être détectées, analysées et quantifiées par des tests comportementaux standardisés et largement utilisés par la communauté scientifique. Les stades étudiés couvrent les périodes clés du développement d'une région cérébrale nommée cortex : les stades embryonnaires (jour embryonnaire 13 à 18) pour le marquage et le suivi des cellules souches neurales et de leur descendance, jour post-natal 0 et 14 pour la différenciation et l’intégration de certaines sous-populations cellulaires d'intéret dans les circuits neuronaux, et jour post-natal 21 et 60 pour la maturation fonctionnelle et l’analyse comportementale et de la communication entre les neurones. Ces stades permettent d’associer observations anatomiques et fonctionnelles, de la circuiterie neuronale aux manifestations comportementales, de manière pertinente.

Les femelles gestantes opérées sont tuées après le sevrage de leurs portées, et leur descendance après prélèvement du cerveau : 3 129 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À 13,5 jours de gestation, chaque femelle subit sous anesthésie générale l'ouverture de la cavité abdominale, l'exposition des cornes utérines, une injection dans le cerveau des embryons et une électroporation, en trente minutes au maximum. Les souriceaux ainsi porteurs d'un médulloblastome reçoivent, pour une partie d'entre eux, deux injections par jour en contention entre le quatrième et le quatorzième jour de vie, et le porteur annonce des pertes embryonnaires, une croissance ralentie et des troubles neurologiques aux stades avancés. Il écrit que la mise à mort de l'ensemble des souris est justifiée par "la nécessité scientifique des analyses réalisées, l'impossibilité de réutilisation et la prise en compte prioritaire du bien-être animal".

Objectifs

Le médulloblastome est la tumeur cérébrale maligne la plus fréquente chez l’enfant et représente environ 20 % des cancers du système nerveux central pédiatrique. Il est lié à une croissance anormale de certaines cellules du cervelet, une région du cerveau impliquée dans la coordination des mouvements et l’équilibre. Normalement, ces cellules se développent de manière contrôlée au cours de l’enfance puis arrêtent de se multiplier. Lorsque ce processus est perturbé, elles peuvent se multiplier de façon excessive et former une tumeur. Des travaux récents suggèrent que des mécanismes moléculaires liés au développement normal du cerveau, ainsi que l’activité des neurones, pourraient influencer la croissance de ces tumeurs. Mieux comprendre ces interactions est essentiel pour progresser dans la compréhension de la maladie. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’apparition et la progression du médulloblastome. Il vise à mettre en place un modèle expérimental chez la souris permettant d’étudier le développement de cette tumeur, à identifier les mécanismes moléculaires qui contrôlent la croissance des cellules tumorales, à étudier le rôle de l’activité des cellules nerveuses dans l’évolution de la tumeur et enfin, à explorer les interactions entre les cellules tumorales et leur environnement dans le cervelet. Les résultats permettront d’améliorer la compréhension de cette maladie et pourraient contribuer, à long terme, à l’identification de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le médulloblastome est la tumeur cérébrale maligne la plus fréquente chez l’enfant. Bien que des traitements existent, ils peuvent entraîner des effets secondaires importants et ne sont pas toujours efficaces à long terme. Il est donc essentiel de mieux comprendre les mécanismes qui contrôlent l’apparition et la croissance de ces tumeurs afin d’améliorer leur prise en charge. Ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur la manière dont certaines cellules du cervelet deviennent tumorales et sur les facteurs qui influencent leur prolifération. En particulier, il vise à mieux comprendre le rôle de l’environnement et l’activité des cellules nerveuses et tumorales dans l’évolution de la maladie. Les résultats obtenus pourraient contribuer à identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans le développement du médulloblastome. À plus long terme, ces connaissances pourraient orienter la recherche vers de nouvelles approches thérapeutiques, potentiellement plus ciblées et mieux tolérées par les patients. Par ailleurs, ce projet présente également un intérêt plus large en biologie, car il permettra d’améliorer la compréhension du développement normal du cervelet, en particulier des mécanismes qui régulent la croissance et la maturation de certains neurones.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale unique d’électroporation in utero, ainsi qu’à une procédure terminale de prélèvement des tissus. La procédure principale est réalisée chez des femelles à 13,5 jours de gestation. Cette intervention est réalisée une seule fois par femelle et dure 30 minutes maximum. Elle consiste en une anesthésie générale suivie d’une ouverture de la cavité abdominale, de l’exposition des cornes utérines, d’une injection dans le cerveau des embryons, puis d’une électroporation permettant l’entrée du matériel génétique dans les cellules du cervelet. Elle est suivie d’une phase de récupération et d’un suivi post-opératoire des femelles gestantes. L’intervention sur chaque embryon dure quelques minutes. Chez les animaux du lot d’étude de l’activité neuronale, des injections seront réalisées sur animaux vigiles maintenus par contention, deux fois par jour (en alternant de côté) entre 4 et 14 jours après la naissance, et durent quelques secondes par injection. La procédure terminale correspond à l’injection d’un euthanasiant sous anesthésie générale avant traitement puis prélèvement postmortem des tissus. Cette intervention est réalisée une seule fois par animal et dure une dizaine de minutes.

Impact sur les animaux

Les femelles gestantes subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale afin de réaliser l’électroporation in utero. Cette procédure peut entraîner une douleur post-opératoire modérée, un stress lié à la manipulation, ainsi qu’un risque faible d’infection ou de complication au niveau de la plaie chirurgicale. Chez les embryons manipulés, la procédure peut entraîner des pertes embryonnaires ou une variabilité dans le développement. Après la naissance, les souriceaux peuvent présenter une variabilité de croissance, notamment en raison de la procédure ou de l’efficacité de l’électroporation. Chez les animaux développant une tumeur, des effets indésirables peuvent apparaître au cours de la progression tumorale, tels qu’une diminution de la croissance, une altération du comportement, une réduction de l’activité ou, dans les cas les plus avancés, des troubles neurologiques. Dans le cadre de la modulation de l’activité neuronale, les injections répétées peuvent entraîner un stress léger, ainsi qu’une irritation locale au point d’injection.

Devenir

À l’issue des expériences, l’ensemble des animaux sera mis à mort de manière éthique et conforme à la réglementation en vigueur. Les animaux sont utilisés pour des analyses histologiques et moléculaires nécessitant le prélèvement des tissus cérébraux. Ces analyses impliquent soit une fixation des tissus, soit une extraction de matériel biologique qui ne permet pas le maintien en vie de l’animal. Par conséquent, aucune réutilisation des animaux n’est possible. De plus, le développement tumoral induit dans ce projet peut entraîner, à des stades avancés, une altération de l’état général et du bien-être des animaux. Afin d’éviter toute souffrance prolongée, des points limites stricts ont été définis et toute atteinte de ces critères entraîne une mise à mort immédiate. Les femelles gestantes utilisées pour les procédures chirurgicales ne sont pas réutilisées après les expériences et seront également mises à mort après le sevrage des portées, conformément aux pratiques de bien-être animal. Ainsi, la mise à mort de l’ensemble des animaux est justifiée par la nécessité scientifique des analyses réalisées, l’impossibilité de réutilisation et la prise en compte prioritaire du bien-être animal.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est nécessaire pour ce projet, car il n’existe pas de méthodes alternatives permettant de reproduire de manière fiable le fonctionnement complexe du cerveau en développement et la formation des tumeurs. En particulier, certaines interactions entre les cellules du cerveau et leur environnement, ainsi que l’influence de l’activité des neurones, ne peuvent pas être étudiées correctement en laboratoire sur des cellules isolées. Cependant, afin de limiter autant que possible le recours aux animaux, des expériences préliminaires ont été réalisées sur des cellules en culture et sur des tissus en dehors de l’organisme. Ces approches ont permis de tester et d’optimiser les outils expérimentaux avant leur utilisation chez l’animal. Grâce à cette étape préalable, seules les conditions les plus pertinentes et les plus fiables sont utilisées dans ce projet, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires tout en garantissant la qualité des résultats.

Réduction

Le projet a été conçu de manière à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible en garantissant des résultats fiables. Le nombre d’animaux a été estimé en tenant compte des contraintes techniques et de la variabilité du modèle étudié. Ce calcul prend en compte les pertes expérimentales attendues, liées à la réussite des gestations et à l’efficacité de la procédure utilisée. Les expériences sont réalisées sur plusieurs portées indépendantes afin d’assurer des résultats représentatifs. Les expériences seront arrêtées dès que le nombre nécessaire d’animaux permettant une analyse fiable sera atteint. Par ailleurs, la méthode utilisée permet de limiter le recours à la création de nouvelles lignées animales qui nécessiteraient la production d'un très grand nombre d'animaux pour très peu d'animaux ayant les bonnes caractéristiques pour l'étude). Plusieurs types d’analyses sont réalisés sur les mêmes animaux, ce qui permet d’obtenir un maximum d’informations à partir de chaque individu.

Raffinement

Les animaux seront suivis attentivement tout au long du projet, en particulier pendant et après les interventions. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale, avec des traitements adaptés pour limiter la douleur et le stress. Des mesures strictes d’hygiène sont appliquées afin de réduire les risques d’infection. Après chaque intervention, un suivi régulier est mis en place pour vérifier l’état général des animaux, leur comportement et leur récupération. Une attention particulière est portée à leur croissance, leur mobilité et à tout signe de gêne ou de douleur. L’état des animaux est évalué à l’aide de grilles de suivi standardisées permettant de détecter rapidement toute altération. Les animaux sont observés au minimum une fois par jour, et plus fréquemment si nécessaire, notamment lorsque la maladie progresse. Si des signes de mal-être apparaissent, des mesures de soutien sont mises en place, comme un accès facilité à la nourriture et à l’eau ou une surveillance renforcée. Des critères clairs ont été définis pour intervenir rapidement si l’état d’un animal se dégrade. Si ces critères sont atteints, l’animal est mis à mort sans délai afin d’éviter toute souffrance. Des grilles spécifiques sont également utilisées pour le suivi des femelles après chirurgie.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies comme modèle expérimental en raison de leur grande pertinence pour l’étude des mécanismes biologiques et des pathologies humaines. Le développement du système nerveux central chez la souris présente de fortes similarités avec celui de l’homme, ce qui permet d’étudier de manière fiable les processus impliqués dans la formation des tumeurs cérébrales. De plus, l’existence de lignées génétiquement modifiées adaptées aux objectifs du projet constitue un atout majeur pour répondre aux questions scientifiques posées. Les animaux seront utilisés à différents stades du développement, en lien direct avec les étapes de la progression tumorale. L’induction tumorale sera réalisée au stade embryonnaire correspondant à 13.5 jours de gestation chez les femelles, période clé du développement des progéniteurs à l’origine des neurones conduisant au type de médulloblastome étudié. Les analyses seront ensuite effectuées à plusieurs stades après la naissance, afin de couvrir les différentes phases de la maladie. L’initiation tumorale et les premiers événements de prolifération neuronale seront étudiés entre 7 et 14 jours après la naissance, la phase intermédiaire de croissance sera étudiée 21 jours après la naissance et la phase tardive caractérisée par des tumeurs établies 60 jours après la naissance.

Une partie des 1 220 souris utilisées sont des femelles gestantes, dont l'abdomen est ouvert sous anesthésie de 45 minutes pour injecter des particules dans le cerveau de leurs embryons, une injection de cinq secondes qui peut tuer certains d'entre eux. D'autres souris adultes restent anesthésiées deux heures pour une chirurgie du cerveau de quinze minutes, et des souriceaux sont anesthésiés par hypothermie pendant dix minutes avant une injection. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, et une autre partie du projet consiste à induire chez des souris témoins les mutations responsables de la microcéphalie pour en caractériser les défauts. Les femelles gestantes sont tuées pour prélever leurs embryons, et les embryons, souriceaux et adultes ayant subi une procédure sont tués pour prélèvement d'organes et analyses génétiques.

Objectifs

Notre laboratoire s’intéresse au développement du cerveau. Des anomalies génétiques chez l’homme affectant les processus de prolifération et de différentiation cellulaire peuvent entraîner des malformations cérébrales. Des études préliminaires nous ont permis de mettre au point des particules (PLA) ayant la faculté d’entrer spécifiquement dans les cellules en division du cerveau embryonnaire. Ce projet vise (i) à déterminer si ce type de PLA est pertinent pour développer une approche de thérapie génique au cours du développement. Nous voulons donc tester chez la souris, la capacité des PLA à compenser la perte de ce gène et corriger les anomalies de développement du cerveau qui lui sont associées. Nous voulons également (ii) utiliser cet outil pour étudier un autre type de malformation cérébrale, la microcéphalie, en induisant des mutations du gène responsable de cette pathologie chez des souris contrôles, afin de mieux caractériser les défauts liés à la perte de ce gène.

Bénéfices attendus

Le premier bénéfice attendu du projet est de déterminer si l’utilisation de PLA pour corriger une anomalie génétique constitue une approche thérapeutique valide. Le deuxième bénéfice est de comprendre les défauts développementaux qui apparaissent après une mutation d'un gène entraînant une microcéphalie chez l'humain.

Procédures

Des animaux adultes subiront une injection dans la queue d'une durée de 20 secondes. Des femelles gestantes subiront une anesthésie générale de 45 minutes au cours d’une chirurgie qui comprendra l’ouverture de l’abdomen et des points de suture. Des animaux subiront des injections d’une minute 1 fois par jour pendant 2 jours. Des embryons subiront une injection d’une durée de 5 secondes. Des animaux adultes subiront une anesthésie de 2 heures lors d’une chirurgie d'une durée de 15 minutes qui permettra l’injection des PLA dans le cerveau d’une durée de 4 minutes et des points de suture. Des souriceaux subiront une anesthésie par hypothermie de 10 minutes, et une injection d’1 minute. Des animaux subiront, au moment de la mise à mort, une anesthésie et analgésie générale terminale.

Impact sur les animaux

Les injections entraînent un stress léger et une douleur légère de quelques secondes. L’induction de l’anesthésie gazeuse lors des chirurgies entraîne un stress moyen de quelques secondes, une hypothermie, un déssèchement des yeux et une déshydratation. Les injections intra-cérébrale in utero peuvent entrainer la mort de certains embryons. L'anesthésie pour les injections stéréotaxique entraîne un stress léger de quelques secondes, une hypothermie et un déssèchement des yeux.

Devenir

Les femelles gestantes sont mises à mort pour prélèvement des embryons. Les embryons, nouveaux nés et animaux adultes qui ont subi une procédure sont mis à mort à l’issue de la procédure pour prélèvement d’organes et analyses génétiques et phénotypiques.

Remplacement

Les questions scientifiques posées dans le cadre de ce projet concernent le développement du cortex cérébral, un processus complexe qui ne peut être étudié que sur des cerveaux prélevés sur des embryons de mammifères. A l’heure actuelle, aucun modèle de culture cellulaire ne permet de reproduire l’ensemble des étapes de développement cortical ni d’en mimer la diversité cellulaire et les interactions qui s’y déroulent. Le modèle murin, en particulier la souris, constitue une référence dans ce domaine en raison de la richesse des outils génétiques disponibles et de la caractérisation fine des processus qui permettent le développement du système nerveux, ce qui en fait un modèle de choix pour la conduite de ces recherches.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec le nombre minimal d’animaux nécessaires à l’obtention d’un résultat significatif déterminé par une approche statistique.

Raffinement

Tous les animaux seront maintenus dans un environnement enrichi avec eau et nourriture à volonté et en groupe social avant et après la procédure. Lors des actes chirurgicaux les souris, placées sur une plaque chauffante, seront anesthésiées et recevront des analgésiques en pré et en post-opératoire. Une litière spécifique, adaptée aux animaux opérés, sera utilisée afin de minimiser le risque d’infection post-opératoire. Un gel ophtalmique sera appliqué durant toute l’anesthésie pour prévenir le dessèchement des yeux et du PBS chauffé à 37°C sera administré aux femelles afin de prévenir la déshydratation. Après l'opération chirurgicale, la surveillance des animaux sera quotidienne afin de détecter d’éventuels signes de souffrance. Une grille de score d'évaluation des animaux sera mise en place. Une injection d'analgésique ou la mise à mort de l'animal sera réalisée en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites.

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle de choix pour mener des études sur le développement du système nerveux, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cerveau entre les rongeurs et l’humain. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce permettant de répondre à nos questions scientifiques tels que les modèles génétiquement modifiés. Les femelles gestantes sont des adultes de 2 à 6 mois. Une expérimentation est menée sur des embryons entre les jours embryonnaires E12.5 et E15.5, ce qui correspond aux fenêtres d’expression de nos gènes d’intérêt. Une expérimentation se déroulera sur des animaux adultes, car la question à laquelle veut répondre cette expérimentation ne nécessite pas de stade de développement particulier. Des animaux utilisés dans une autre expérimentation seront injectés au jour post-natal P0 et mis à mort à P15 et P30. Cela nous permet d’étudier les effets de notre traitement sur les défauts qui apparaissent à ces stades.