Biologie du développement

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, hors animaux reproducteurs et de maintien de la lignée. Porteuses d'une mutation reproduisant l'ataxie de Friedreich, les homozygotes développent une ataxie vers trois mois et sont suivies par des tests comportementaux réguliers et des électromyogrammes, avant l'injection d'un vecteur de thérapie génique et une mise à mort à neuf mois pour analyses. Le porteur qualifie ces tests de comportement d'"indolores et sans stress" pour l'animal. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'évaluer cette approche et qu'une validation in vivo est "indispensable".

Objectifs

L’ataxie de Freidreich (AF) est une maladie génétique rare qui se caractérise par une maladie neurologique avec une dégradation progressive des fonctions motrices et sensorielles qui conduit à une perte des mouvements volontaires. La maladie est dû a une perte de frataxine, une protéine essentielle pour le bon fonctionnement des neurones. Les approches thérapeutiques pharmacologiques développées ciblant principalement les effets secondaires sont à ce jour faiblement efficaces et l’AF reste une maladie incurable. Une approche de thérapie génique permettant de restaurer les taux physiologiques de frataxine est en cours de développement. Un nouveau modèle murin avec une mutation ponctuelle dans la frataxine a été généré, afin de mimer les effets d’une mutation ponctuelle identifiée chez certains patients. Ce modèle est en cours de caractérisation, mais nous savons que ce modèle développe un phénotype neurologique progressif entre 3 et 9 mois, similaire à la maladie humaine. Ce modèle murin nous permettra donc de comprendre les états précoces de la maladie, et de développer une approche préclinique de thérapie génique. Le projet a 2 axes : 1) caractériser le phénotype neurologique du modèle au cours du temps, notamment au cours des trois premiers mois et 2) appliquer et optimiser un protocole de thérapie génique avec un vecteur permettant d’exprimer la frataxine à des niveaux proches de l’endogène.

Bénéfices attendus

Il y a plusieurs bénéfices attendus de ce projet. Le premier sera de valider ce nouveau modèle qui présente des faibles taux de frataxine de façon ubiquitaire et une mutation retrouvée chez l’Homme. Ce modèle pourra être utiliser pour continuer à comprendre la pathophysiologie de la maladie afin de développer des nouvelles approches thérapeutiques. Le deuxième bénéfice sera de continuer à développer au niveau préclinique une approche de thérapie génique.

Procédures

A partir de la naissance les animaux seront observés 2x /semaine (pour surveiller leur poids et taille). Des tests de comportement indolores et sans stress pour l’animal, effectués par le même expérimentateur, nous permettront d’identifier avec précision les défauts locomoteurs et de suivre l’évolution du phénotype. Les tests seront utilisés en conformité avec la littérature et les procédures établies au laboratoire. Ces tests seront effectués tous les 15 jours jusqu’à 12 semaines, et ensuite 1 fois par mois jusqu’à l’âge de 9 mois. Des mesures d’électrophysiologie par électromyogramme (EMG) seront effectués afin de mesurer la réponse proprioceptive des animaux et de corréler ses résultats aux données comportementales à 2 et 3 mois, puis 1 fois tous les 2 mois. A 9 mois, les souris seront mises à mort et les tissus d’intérêt seront prélevés pour des analyses biochimiques et histopathologiques. (Procédure 1) Une deuxième cohorte de souris sera générée pour le prélèvement de tissus pour une caractérisation biochimique et histopathologique, à différents temps (naissance, 7 jours, 3 semaines, 6 semaines, 3 mois et 6 mois), ce qui correspond à différentes phases clés dans la progression de la maladie. Le point de 9 mois sera obtenu à partir de la cohorte de la procédure 1. (Procédure 2) Enfin deux autres cohortes seront générées pour évaluer une approche de thérapie génique, d’abord en pré-symptomatique puis en postsymptomatique. Après injection intraveineuse du vecteur médicament (vecteur exprimant la frataxine) soit avant symptômes (Procédures 3) ou après l’apparition des symptômes (Procédure 4), des tests de comportements ainsi que des mesures d’électrophysiologie seront effectués comme en procédure 1 pour évaluer l’effet thérapeutique. A 9 mois, les souris seront mises à mort pour prélèvement de tissus pour des analyses.

Impact sur les animaux

Les lignées utilisées pour l'élevage sont maintenues à l’état hétérozygote, portant un seul allèle muté et un allèle sauvage. Elles n'ont pas de phénotype dommageable et ne nécessitent donc pas de surveillance particulière. Seuls les animaux homozygotes pour la mutation du gène de la frataxine issues des croisements entre deux souris hétérozygotes ont une réduction de la taille globale et développent des symptômes d’ataxie vers le 3ème mois, aspect qui nécessite d’être affiné. De la nourriture gélifiée sera proposée aux animaux dès l’apparition des signes de la maladie, détectés par les tests de comportement que nous effectuerons.

Devenir

Pour des analyses biochimiques et histologiques une mise à mort est nécessaire en fin de procédure en respectant les points limites et la progression de la maladie.

Remplacement

Ce projet vise à optimiser une approche de thérapie génique pour l’ataxie de Friedreich afin d’améliorer la vie des patients et de ralentir la progression de la maladie, voire la stopper de façon pérenne sans induire des effets secondaires invalidants. Tous les outils moléculaires utilisés ont été testés dans des cellules en culture mais il est indispensable de réaliser une validation in vivo sur un modèle murin de la maladie. Ce modèle est le premier modèle qui reproduit génétiquement une mutation ponctuelle retrouvée chez l’homme.

Réduction

Il est estimé que le projet mobilisera sur 5 ans un maximum de 720 animaux hors animaux reproducteurs et maintien de la lignée. Toutes les procédures sont conçues pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, tout en tenant en compte du nombre minimum nécessaire pour pouvoir appliquer les tests statistiques adaptés. Les travaux de notre équipe et les données préliminaires de nos collaborateurs nous permettent d’estimer le nombre de souris pour avoir une valeur statistique suffisante (20 souris par condition pour les tests de comportement et 10 souris par condition pour les analyses biochimiques et histologiques). Autant que possible, les mêmes animaux seront utilisés pour réaliser les analyses fonctionnelles, histologiques, moléculaires et biochimiques. Si aucun phénotype moléculaire/histologique n'est observé à 6 semaines, les cohortes prévues pour les points plus précoces ne seront pas générés. En l’absence de différence entre les mâles et les femelles, les données seront combinées afin de diminuer de moitié l’effectif.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement et leur poids et taille seront mesurés 2x / semaine. Dès les premiers signes cliniques (défauts à la locomotion ou perte de poids), de la nourriture gélifiée sera mise à leur disposition dans la cage. Des points limites prédictifs sont déjà établies et validés par la communauté scientifique avec un « scoring » adapté aux modèles d’ataxie.

Choix des espèces

Il n’existe à ce jour pas de méthodes alternatives pour évaluer la pertinence d’une approche de thérapie génique pour le traitement de l'Ataxie de Friedreich, notamment de la composante neurologique de la maladie. Il est alors nécessaire d’utiliser un modèle animal pour comprendre et proposer des approches thérapeutiques de la pathologie. La frataxine humaine sauvage est capable de compenser l’absence de frataxine murine endogène dans des modèles cellulaires et murins. Malgré l’existence de modèles cellulaires, une étude chez l’animal est indispensable pour déterminer la pertinence de cette approche de thérapie génique et afin d’établir une preuve de concept et l’innocuité de cette stratégie. Cette étape préliminaire est cruciale avant de pouvoir considérer une application chez l’Homme. Les études aux stades post-nataux débuteront à la naissance et se termineront à 9 mois au plus tard, et avant d’atteindre les points limites fixés dans cette étude. Nos collaborateurs ont déjà établi que les animaux avaient un phénotype à 3 mois, mais n’ont pas testé les stades avant.

3 880 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiés pour porter des mutations liées à des malformations humaines du visage et du cœur, ils subissent un prélèvement d'un fragment de nageoire sous anesthésie, et le porteur indique que les lignées peuvent présenter des malformations du squelette et de la tête. Des tests comportementaux de nage en réponse à des stimuli sonores et lumineux sont réalisés sur les larves. Il affirme que le recours à l'animal est "indispensable" car les études in vitro ne rendent pas compte du développement en trois dimensions du cœur ou des mâchoires.

Objectifs

Les malformations congénitales, diagnostiquées dans 2-3% des naissances sont un enjeu majeur de Santé Publique. Les malformations du visage et du cœur sont une composante fréquente des syndromes de malformations congénitales humaines et sont donc d'une importance clinique majeure. Les deux impliquent généralement une lourde charge médicale et chirurgicale. De plus, parmi les malformations congénitales humaines, les malformations affectant la forme du visage sont peut-être les plus frappantes en raison des attentes culturelles et des conséquences psychologiques. La majorité des alterations du visage et du coeur sont la conséquence d’un défaut de développement de l’embryon qui est provoqué par la mutation d’un gène. L’objectif de ce projet est d'élucider les mécanismes moléculaires et développementaux qui causent des malformations grâce à l’analyse de poissons zèbres qui portent des mutations dans certains gènes.

Bénéfices attendus

L'étude des poissons zèbres qui portent des mutations dans des gènes récemment identifiés dans des pathologies humaines devrait fournir de nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires responsables de ces maladies rares et sur le développement normal du visage, du cœur et du cerveau.

Procédures

Les animaux subiront des prélèvements sous anesthésie d'un bout de nageoire, pour l’analyse de l’ADN. La procédure consiste à anesthésier le poisson adulte jusqu’à absence de réflexe au toucher (environ 3 minutes) puis un segment de 3mm de la nageoire caudale est coupé. Le poisson est ensuite placé à nouveau dans l’eau et il se réveille au bout de 1-2 minutes. Les poissons régénèrent spontanément leurs nageoires en quelques jours et il n’y a pas d’effets nocifs à long terme. Cette procédure sera nécessaire pour chaque animal génétiquement modifié et sera effectuée une seule fois au cours de la vie de l'animal.

Impact sur les animaux

Les lignées génétiquement modifiées pourront présenter des malformations du squelette, de la tête (diminution de la taille de la mâchoire, aplatissement de la face) ou des altérations des paramètres de la nage témoignant de problèmes moteurs ou de nutrition (amaigrissement).

Devenir

Procédure 1 : Tous les poissons génétiquement modifiés et âgés entre 20-24 mois (âge à partir duquel ils n’arrivent plus à se reproduire) ou toujours en vie à la fin du projet, seront euthanasiés par surdosage d’anesthésique. Procédure 2 : À la fin de la procédure qui a pour but l'étude post-mortem de l’ensemble des caractères visibles de poissons mutants, les poissons seront euthanasiés par surdosage d’anesthésique. Procédure 3 : À la fin de la procédure, qui a pour but l'observation, sur une brève période, du comportement de nage des larves en réponse à des stimuli sonores et lumineux, les poissons seront euthanasiés par surdosage d’anesthésique.

Remplacement

Notre objectif est de comprendre les mécanismes moléculaires et développementaux qui sous-tendent certaines malformations du visage et du cœur et la déficience intellectuel. Le recours à des modèles animaux est indispensable pour réaliser ces études car les études in vitro ne peuvent pas complètement rendre compte de la complexité des processus mis en jeu, par exemple, le développement complexe en 3 dimensions du coeur ou les interactions entre des populations de cellules qui donneront lieu aux mâchoires.

Réduction

Nous limiterons le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses. Nous générerons uniquement le nombre d’animaux nécessaires à nos projets. La fécondité élevée chez cette espèce est un avantage, car elle permet d’obtenir beaucoup d’embryons, à partir d’une population restreinte de reproducteurs adultes.

Raffinement

Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, les procédures se dérouleront avec une surveillance journalière, avec un dénombrement des poissons affectés par symptôme. Compte-tenu des gènes impliqués, des malformations du squelette de la tête ou de la capacité de nager sont attendues parmi les phénotypes spécifiques. De ce fait, ces altérations ne seront pas un critère éliminatoire. Néanmoins l’apparition de symptômes morphologiques (érosion, lésion) ou comportementaux (fort amaigrissement, immobilité) seront suivis et scorés tout au long de la croissance du poisson. Les poissons dépassant les points limites définis seront euthanasiés. La procédure de prélèvement d’un fragment de la nageoire caudale (pour l’analyse de l’ADN) sera réalisée sous anesthésie générale. De plus, un enrichissement du milieu sera effectué par la constitution de groupes sociaux, la mise en reproduction régulière et l’ajout de nourriture vivante.

Choix des espèces

Le poisson zèbre se révèle être un modèle de choix pour l’étude du développement du squelette de la tête et de la mise en place de l’orientation du cœur car ces processus chez le poisson zèbre sont similaires à ceux des mammifères. Le poisson permet du fait de la transparence des embryons et des larves, une observation non invasive des organes et cellules in vivo. Il permet d’établir des lignées génétiquement modifiées. -Pour la sélection des nouvelles lignées, le prélèvement d’un fragment de nageoire caudale pour l’analyse d’ADN sera réalisé sur poisson adulte, car prélever ce tissu aux stades plus jeunes serait trop endommageant. -L'analyse d'orientation du cœur sera réalisée sur des embryons âgés de moins de 5 jours post fertilisation, car l'orientation du cœur est déjà établie avant ce stade. -Les analyses du développement du squelette seront réalisées à trois stades clefs du développement : formation du squelette de la mâchoire à 5-7 jours post fertilisation ; début de la formation du crâne à 4 semaines post fertilisation ; squelette entièrement formé à 3 mois de vie. -L’observation de la taille sera réalisée sur des poissons à trois stades clefs de la croissance du poisson : à 18 jours post fertilisation, un stade larvaire ; à 28 jours post fertilisation, un stade juvénile, lorsque la plupart des caractéristiques adultes ont été acquises, sans maturité sexuelle ; à 11 semaines post fertilisation, un stade adulte. -Les tests comportementaux seront réalisés sur des poissons âgés de 10 jours post fertilisation, une étape à laquelle le développement neurologique est suffisamment mature pour pouvoir tester le comportement en réponse à des stimuli.

140 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées pour prélever leur cerveau. Le protocole applique aux nouveau-nés une séparation maternelle répétée de trois heures par jour, pour reproduire un facteur de risque de troubles du développement et étudier le réseau de l'ocytocine. Le porteur indique que les souris devenues adultes peuvent être plus anxieuses, effet recherché par les tests comportementaux qui suivent. Il précise que les souris servant de stimulus social sont réutilisées dans un autre projet, et revendique la souris comme modèle "essentiel".

Objectifs

Contexte de l’étude : L’ocytocine largement distribuée dans le cerveau, est fortement impliquée dans les interactions sociales à l’âge adulte (par exemple en favorisant la reconnaissance et la perception des émotions, la mémoire sociale, ou encore la confiance en autrui), mais est également soupçonnée de participer à l’établissement de la sociabilité au cours du développement de l’enfant. Il a été récemment mis en évidence l’existence de deux réseaux de l’ocytocine, l’un inné et constitutif, présent dès la naissance, l’autre acquis précocement après la naissance, et qui se développerait avec l’expérience. Ces résultats indiquent que le développement cérébral est soumis à une plasticité ciblée du système ocytocinergique. Objectif principal : Ce phénomène de maturation neuronale qui se prolonge dans l’enfance, est donc susceptible d’être affecté par l’environnement, et modifié par l’expérience sociale et pourrait constituer un facteur de risque précoce dans les troubles du développement. En effet, parmi les nombreux facteurs génétiques, anténataux et environnementaux, l’hypothèse d’un lien entre des évènements stressants de vie au cours des premières années constitue un facteur de susceptibilité. Ce présent projet vise à vérifier l’hypothèse selon laquelle l’expression des réseaux de l’ocytocine est 1) influencée par l’expérience sociale précoce, et 2) que cela se traduit par des comportements sociaux inadaptés à l’âge adulte. Ainsi afin d’étudier les effets cellulaires et comportementaux des interactions socio-parentales, nous prévoyons d’utiliser un modèle de séparation maternelle précoce. En effet de précédentes études ont permis de montrer que l’isolement maternel néonatal, qui influence le lien d’attachement entre la mère et ses petits, peut entrainer plus tardivement des comportements associés à l’autisme. Cette étude a donc pour objectif principal de comparer le développement postnatal du réseau ocytocinergique et ses conséquences sur le comportement social chez des souris issues de portées élevées en condition standardisée, avec des souris séparées transitoirement de leur mère et de leur fratrie.

Bénéfices attendus

Les résultats de ces travaux permettront dans un premier temps d’approfondir la connaissance du système ocytocinergique et son implication dans le développement des troubles du neurodeveloppement affectant la dimension sociale du comportement. Les données obtenues chez le rongeur ont considérablement accrue notre compréhension du système nerveux central. Ainsi ces travaux de recherche permettront également d’identifier les bases neuronales du comportement social et permettrait de développer de nouvelles approches thérapeutiques ciblées. A moyen et long-terme, ces expériences pourraient avoir des applications cliniques pour des pathologies telles que l’autisme et l’anxiété sociale.

Procédures

Les animaux ne subiront pas d'intervention, seulement un stress potenitel lié a la séparation maternelle de 3H par jour.

Impact sur les animaux

L’accès à la nourriture et à l’eau se fera ad libitum (à l’exception des heures de séparation maternelle), quelle que soit les conditions expérimentales. Suite aux procédures de séparation maternelle (de 3, 7 ou 14 jours), il n’y a pas d’effet indésirable attendu concernant le poids. Pour autant, les animaux seront pesés quotidiennement par les expérimentateurs pendant la durée de la séparation, puis toutes les semaines le cas échéant (protocole à long terme), afin d’effectuer un suivi régulier de poids. Il est possible que les animaux devenus adultes soient plus anxieux que les portées élevées en condition standard, ce qui pourrait se ressentir lors des tests expérimentaux. Nous n’attendons pas d’anxiété excessive lors de l’hébergement. Une surveillance quotidienne, puis hebdomadaire de la qualité du pelage sera effectuée en parallèle de celle du poids. Nous n’attendons cependant pas d’anxiété excessive car ce sont des fratries ayant toujours vécues ensemble dans la cage d’accueil d’origine. En cas de pelage d’apparence détérioré du a un toilettage excessif, aucune médication n’est prévue. En revanche, un enrichissement supplémentaire (tunnel, briquettes de bois) pourra être alors fourni afin d’atténuer le stress des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis a mort à l’issu des procédures 1 et 2, car la collecte du cerveau est nécessaire à l’étude anatomique du système ocytocinergique. Les animaux étrangers utilisés pour les tests comportementaux seront replacés dans un autre projet de l’établissement utilisateur.

Remplacement

Notre projet de recherche porte sur l’anatomie du réseau de l’ocytocine et la fonction de plusieurs régions cérébrales. Par conséquent, les études in vitro ou la modélisation ne peuvent pas constituer des modèles expérimentaux satisfaisant et le recours aux a l’expérimentation animale est nécessaire pour cette étude. De plus l’analyse fonctionnelle du réseau ocytocinergique par la mise en place de tests comportementaux ne peut se faire que par une approche in vivo.

Réduction

Approche statistique pour réduire au minimum le nombre d’animaux : Le nombre d’animaux a été calculé statistiquement par un test anova afin de limiter le nombre d’animaux et de n’utiliser que le nombre nécessaire. Une étude pilote est également prévue afin de déterminer le nombre de jours adéquat de séparation maternelle pour obtenir un effet. Cela également dans un but de réduction de groupes expérimentaux qui seront utilisés, par identification de la période nécessaire de séparation à mettre en place pour l’étude à long terme. Nous groupons également les analyses histologiques et comportementales afin de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. Pour les tests comportementaux incluant l’utilisation d’animaux étrangers (test 3 chambres et résident-intrus), nous utiliserons si possible des animaux de l’animalerie d’accueil déjà inclus dans d’autres protocoles, et ce dans un but de réduction afin de ne pas commander d’animaux supplémentaires pour un seul test comportemental. Si cela n’est possible les animaux utilisés pourront être replacés à la fin du protocole.

Raffinement

Ces travaux de recherche fondamentale nécessitent des observations sur des animaux vivant dans de bonnes conditions psychophysiologiques. Les souris utilisées pour ce projet sont nées et ont été élevées dans des établissements agrées. Le bien-être des animaux est impérativement pris en compte à chaque étape de l’expérimentation. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage que pourraient ressentir les animaux. De plus le bien-être animal conditionne le bon déroulement et les résultats de nos tests comportementaux, nous sommes donc extrêmement exigeants sur la qualité de vie des animaux. De plus, dans un objectif de raffinement, nous procéderons à une étude pilote, qui permettra de déterminer la durée de séparation maternelle. Nous laissons notamment une période d’acclimatation pour les animaux dans la salle de comportement avant de démarrer les tests afin de diminuer le stress causé par un nouvel environnement. Nous surveillons en temps réel les bébés lors de la séparation et nous filmons les retrouvailles avec la mère afin de s’assurer du bon déroulement de l’étude par ailleurs ceci nous permet de pouvoir intervenir si besoin directement. Des mesures de suivi de poids et de pelage seront aussi effectuées quotidiennement afin de s'assurer du dévelopememnt normal des animaux.

Choix des espèces

Dans le cade de ce projet, la souris (Mus musculus) est le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques avec l'homme. Les souris apparaissent comme essentiel dans l’étude anatomique et fonctionnelle de l’ocytocine, puisque les réseaux de ce peptide sont très conservés, y compris chez les rongeurs. De façon intéressante, le rôle fonctionnel et comportemental de l’ocytocine est conservé dans de nombreuses espèces animales, y compris la souris, rendant l’étude de ce modèle animal pertinent pour la compréhension des mécanismes neuronaux sous-jacents. De plus, les études de référence sur le système ocytocinergique porte sur cette espèce, ce qui permettra d’inclure ces données dans celles de la littérature . Par conséquent, ce modèle animal offre la possibilité de caractériser l’anatomie des systèmes mis en jeu lors de perturbations environnementales précoces et leurs liens avec les troubles de la sociabilité observés ultérieurement. La souris est donc l’espèce animale susceptible de fournir des résultats fondamentaux très satisfaisants

350 équidés vont être utilisés, gardés en vie et réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une fois par an une ponction folliculaire de 45 minutes et une chirurgie de transfert embryonnaire d'environ une heure, le porteur reconnaissant un risque d'infection et de douleurs post-opératoires. Le projet met au point la fécondation in vitro par ICSI, présentée comme un moyen de sauvegarder des races équines et asines menacées. Le porteur indique aussi que la filière pourra employer la technique pour reproduire des animaux peu ou pas fertiles.

Objectifs

L'objectif du projet est de mettre au point la technique d'ICSI (Intra Cytoplasmic Sperm Injection) pour permettre la reproduction des animaux peu ou pas fertiles et sauvegarder ainsi des races équines et asines menacées d'extinction.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de mettre au point et développer la production d'embyons in vitro via l'ICSI. Cette technique sera utilisée pour préserver les races équines et asines menacées d'extinction. La filière pourra également utiliser cette technique pour reproduire des animaux peu ou pas fertiles.

Procédures

La synchronisation sera effectuée une fois par an par animal. La durée est le temps de l'injection soit quelques secondes. La ponction folliculaire sera également réalisée une fois par an par animal et dure 45 minutes. La chirurgie pour le transfert embryonnaire sera réalisée une fois par an par animal et l'intervention dure environ 1 heure.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut engendrer des infections et des douleurs post opératoire.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie

Remplacement

Notre objectif est de développer une technique de production in vitro de jeunes embryons équins pour la préservation du patrimoine génétique. Le développement de cette technique peut se faire en partie avec des ovocytes collectés sur des juments abattues dans des abattoirs commerciaux. Toutefois, les résultats obtenus avec des ovocytes collectés dans les abattoirs ou in vivo par ponction folliculaire sont parfois différents. Notre objectif étant de produire des embryons à partir de femelles de races menacées, nous devons mettre au point nos techniques sur des ovocytes collectés in vivo par ponction, sans abattage des animaux. Nous utiliserons des ovocytes collectés dans des abattoirs pour les premières mises au point, puis nous adapterons les techniques aux ovocytes collectés in vivo par ponction folliculaire. Les embryons équins seront transférés dans des juments receveuses car il n’existe pas actuellement de système in vitro permettant le développement embryonnaire au-delà de 6-7 jours.

Réduction

Depuis plusieurs années nous optimisons la technique de collecte d’ovocytes afin d’améliorer les rendements de collecte pour réduire le nombre de femelles utilisées.

Raffinement

Tous les animaux sont dans des groupes sociaux stables avec un enrichissement du milieu varié et renouvelé régulièrement ( morceaux de bois, brosses, cônes, sorties à l'herbes...). Pour les receveuses, les animaux seront placés pendant 5 jours dans un boxe aménagé de tapis, avec de la paille et équipé d'une caméra. Durant ces 5 jours, un suivi sera assuré deux fois par jours pour nettoyer la cicatrice, prendre la température et vérifier que l'animal se nourrit. Les animaux recevront 20ml d’antibiotiques (Depocilline) en intra-musculaire et un anti-inflammatoire non stéroïdien (flunixine meglumine, 5ml iv). Les expérimentateurs pourront injecter d'autres substances pour améliorer le confort de l'animal si nécessaire.

Choix des espèces

Notre objectif est de développer une technique de production in vitro de jeunes embryons équins. Nous devons donc prélever des gamètes équins, et transférer les embryons dans des femelles de la même espèce. Nous utiliserons des femelles adultes, pubères et cycliques pour collecter des ovocytes de bonne qualité, aptes à être fécondés, et pour disposer de femelles receveuses capables d’assumer le développement embryonnaire et la gestation.