Biologie du développement
- Autre recherche fondamentale
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Etude de l’effet d’expositions aux radiofréquences du téléphone portable sur la neurogenèse par la technique 5- bromo-2’-deoxyuridine
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
98 rats, dont 14 femelles gestantes et 84 ratons, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles gestantes sont exposées aux radiofréquences du téléphone portable de la gestation au sevrage, puis mères et descendants reçoivent une injection de BrdU et sont mis à mort deux heures après pour prélever le cerveau et mesurer la neurogenèse. Le porteur nomme les tests comportementaux imposés, réflexes néonataux, activité exploratoire en open-field et test de retournement, pour évaluer l'effet de l'exposition sur la maturation cérébrale. Sur le remplacement, il affirme que les approches in vitro et in silico ne peuvent pas répondre à la question sur un organisme en interaction avec son environnement et conclut à la nécessité du recours au rat.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de préciser l’impact d’expositions aux champs électromagnétiques (CEM) des télécommunications (comme le téléphone portable) sur la neurogenèse. Ce projet sera réalisé sur 98 rats Sprague-Dawley (14 femelles gestantes et 84 ratons, en considérant que 6 ratons/portée seront obtenus) répartis en deux groupes expérimentaux, exposés ou non aux CEM (cf. ANNEXE 1). Une procédure est considérée dans le cadre de ce projet.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des réponses aux questions scientifiques et aux préoccupations sociétales concernant les possibles effets neurobiologiques des expositions développementales aux champs électromagnétiques avec le minimum de rats pour le projet.
Procédures
Aucune intervention de type prélèvement sur animal vigile ou chirurgie n'est prévue. Deux heures avant leur mise à mort, les rats recevront une seule injection intrapéritonéale de BrdU (150 mg/kg pour les mères et 50 mg/kg pour les descendants à PND9, 21 et 44 dans un volume maximum injecté de 6 ml/kg pour les animaux traités à PND9 et de 10 ml/kg aux autres âges). Préalablement à leur sacrifice, le cas échéant (en cas d'atteinte de point limite nécessitant la mise à mort après l’âge de PND15), les animaux recevront une seule injection intrapéritonéale d’une dose létale de pentobarbital (EXAGON, 400 mg/kg, ou traitement équivalent recommandé par le vétérinaire référent). Préalablement à leur mise à mort, les rats seront sédatés par inhalation d’isoflurane. Au bout de quelques minutes, l'anesthésie profonde sera vérifiée et les rats seront mis à mort.
Impact sur les animaux
Nous n'attendons pas de nuisance ou d'effet indésirable sur les animaux suite à la réalisation de la procédure n°1 de ce projet. Néanmoins, des signes critiques et les actions correctives qui seront menées en conséquence sont envisagés afin d’être en mesure de pallier toute manifestation inopinée de souffrance des animaux hébergés dans notre animalerie même si sa cause n’est pas prévisible et est indépendante des actions de la procédure n°1.
Devenir
Tous les rats seront mis à mort aux temps de sacrifices définis pour effectuer des prélèvements biologiques post-mortem qui permettront de réaliser des analyses biochimiques et de biomarqueurs cérébraux.
Remplacement
Pour ce qui est du remplacement, les approches cliniques, in vitro et in silico, par leurs limitations éthiques et techniques, ne peuvent pas répondre au questionnement concernant l’impact des expositions aux CEM-RF sur le positionnement et la morphologie des nouveaux neurones sur un organisme en interaction sensorielle avec son environnement et doué de thermorégulation, nécessitant de fait le recours aux études in vivo.
Réduction
Au plan de la réduction, plusieurs paramètres biologiques seront évalués sur un même animal, permettant ainsi de minimiser le nombre de rats utilisés. Les coupes de cerveau qui seront réalisées ex vivo seront exploitées pour l’analyse de plusieurs marqueurs (marquage du BrdU, marqueurs neurotrophiques, de l’inflammation et du stress oxydant) fortement questionnés dans les effets in vivo des CEM. Les variables quantitatives (marqueurs ex vivo, poids, …), seront analysées par 4-ways ANOVA ou 3-ways ANOVA suivi d’un test post-hoc avec la correction de Bonferroni, en fonction de paramètres inter-sujet (sexe, niveau de champs électromagnétique, âge) et intra-sujet (le temps pour les variables mesurées plusieurs fois chez un même rat (poids, tranches de 5 minutes pour l’activité locomotrice,…)). Les variables de rang (mesure du délai de retournement dans le « surface righting » sur un maximum de 60 secondes, …) seront analysées par le test du log Rank.
Raffinement
Concernant le raffinement, chaque animal sera observé quotidiennement et pesé tous les 2 jours. Des feuilles d’observation permettront de consigner les signes anormaux concernant l’apparence, le comportement, les signes cliniques, etc. En période périnatale, une attention particulière sera portée au bien-être des mères et de leur portée et à la nidification. L’état de santé des animaux sera suivi à l’aide d’une grille de scores (cf. ANNEXE 2) qui indiquera l’action à mener de prise en charge de la douleur. De plus, les conditions d’hébergement des animaux seront enrichies pour favoriser leur bien-être. Pendant la période périnatale, les rates seront hébergées seules puis avec leur portée. A partir du sevrage, tous les rats seront hébergés par sexe par groupe à plusieurs par cage pour leur socialisation. Un fond sonore musical sera diffusé la journée pour leur permettre de s’habituer au bruit généré par les manipulations et ainsi limiter le stress pouvant être ressenti durant les expérimentations. Du matériau leur permettant de nidifier, et éventuellement des bâtons en bois à ronger, seront disposés dans leurs cages d’hébergement pour favoriser leur développement cognitif. Une sédation par inhalation d’isoflurane sera pratiquée préalablement à la mise à mort des animaux.
Choix des espèces
Le rat est un animal de référence pour les études de toxicologie. En particulier, ses systèmes neurobiologiques et physiologiques ont été largement étudiés en laboratoire. Il existe une documentation très complète dans le domaine, dans la littérature et les ouvrages spécialisés. L’UMR PériTox possède une expertise en recherche en toxicologie expérimentale. Ces recherches ont été effectuées majoritairement chez le rat. Dans un souci de comparer nos résultats avec les résultats obtenus précédemment concernant les effets des CEM sur les fonctions cérébrales, nous avons choisi la même espèce. De plus, le personnel qui sera en charge des expérimentations est formé et possède une expérience reconnue pour l’entretien et l’observation des rats. Les femelles gestantes arriveront à l’animalerie au jour gestationnel (G) 3 et seront exposées à partir de G8 aux CEM-RF jusqu’au sevrage de la descendance, au jour postnatal (PND) 21, soit approximativement durant 35 jours. Elles seront sacrifiées à PND21 pour évaluer les effets de l’exposition sur leur neurogenèse. Les effets de l’exposition sur la mise en place de la fonction cérébrale seront évalués sur la descendance au stade néonatal (réflexes néonataux évalués de PND3 à 10), au stade juvénile et à l’adolescence (activité exploratoire évaluée dans l’open-field respectivement entre PND17 et 19, et entre PND41 et 43). Les femelles gestantes recevront une injection de BrdU à PND21 et la descendance aux stades néonatal (PND9), juvénile (PND21) et adolescent (PND44), et seront mis à mort 2h après pour examiner la neurogenèse. Cette analyse permettra d’identifier le stade développemental le plus sensible aux expositions aux CEM-RF et les effets à court/long terme et transitoire/permanent sur la neurogenèse et la fonction cérébrale tout au long de la maturation cérébrale.
Evaluation de l’impact de la dépletion de la microglie durant le développement sur les fonctions cognitives à l’age adulte
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
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- Système nerveux
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après déplétion de la microglie par gavage des mères gestantes, elles subissent à l'âge adulte des sons intenses provoquant des sursauts, des chocs électriques plantaires pour un conditionnement pavlovien et un test de sensibilité à l'épilepsie pouvant déclencher des convulsions. Le porteur qualifie ces périodes de stress de courtes et indique faire enchaîner toute la batterie de tests aux mêmes animaux pour en réduire le nombre. Il affirme qu'aucune alternative in vitro ou in silico n'existe pour étudier ce rôle développemental.
Objectifs
Le développement des cellules de la microglie (une population spécifique du cerveau) durant le développement embryonnaire constitue une étape clé dans la mise en place des réseaux neuronaux mais aussi dans l'équilibre entre les différents types cellulaires qui semble prépondérant dans de nombreuses pathologies neurodégénératives chez l'Homme. Nous souhaitons dans le cadre de cette étude mettre en évidence les troubles comportementaux qui seraient susceptibles d'apparaitre chez des animaux ayant subi une déplétion de cette microglie durant leur développement. On constate en effet que la microglie se régénère lors du développement post-natal, mais que son absence durant le stade embryonnaire entraîne un impact durable au niveau cognitif. Pour cela, des Souris seront exposées durant leur développement (par gavage des souris gestantes), à un agent pharmacologique entrainant une disparition de la microglie durant une période définie du développement. Par la suite, ces Souris poursuivront leur développement et nous analyserons leurs réponses comportementales dans de multiples tests visant à déterminer les capacités cognitives.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mettre en évidence le rôle critique joué par la microglie durant le développement embryonnaire, sur les fonctions cognitives à l'âge adulte. De plus, nous obtiendrons des informations imporantes sur la chronologie des évenénements ayant lieu au cours de la mise en place de cette population durant le développement de l'embryon.
Procédures
Les animaux effectueront plusieurs procédures impliquant des sons d'intensité élevée mais d'une durée inférieure à 40 ms, afin de déterminer leurs réaction face à des stimulus acoustiques, un choc électrique plantaire d'intensité modérée et d'une durée inférieure à 50ms (afin de mettre en place un conditionnement de type pavlovien) ainsi qu'une évaluation de leur sensibilité à l'épilepsie pouvant mener à des convulsions musculaires. Aucun prélevement sanguin ne sera réalisé.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront durant ce projet de courtes périodes de stress (30 minutes environ) liées à l'exposition à des bruits entrainant des sursauts, ainsi qu'à un choc électrique plantaire visant à mettre en place un apprentissage de type pavlovien. En fin de protocole, lors de l'évaluation de la susceptibilité à l'épilepsie, il pourraient subir des contractions musculaires d'intensité modérée à forte durant une période de deux heures, sous surveillance d'un expérimentateur entrainé.
Devenir
Les animaux ayant suvi l'ensemble du protocole ne pourront pas être réutilisés pour d'autres projets.
Remplacement
Etant donné que ce protocole vise à déterminer le rôle d'une population de cellules durant le développement d'une organisme complexe sur le comportement adulte, aucune alternative (in vitro ou in silico) n'est actuellement possible
Réduction
Nos effectifs expérimentaux sont réduits à 10 animaux par groupe, ce nombre est suffisant pour obtenir une puissance statistique acceptable dans les procédures que nous allons utiliser, au regard des données précédemment générées. Par ailleurs, le même lot d'animaux effectuera l'ensemble de la batterie de tests afin de minimiser le nombre d'animaux employés tout en disposant de temps de récupération pour éviter un effet cumulatif du stress et une interaction des procédures entre elles.
Raffinement
Toutes les mesures possibles ont été mises en place pour améliorer les conditions de vie ainsi que réduire le stress occasionné par les procédures expérimentales. Ainsi, les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi avec eau et nourriture à disposition, lors des protocoles expérimentaux, les animaux sont placés 30 minutes avant le test dans la pièce expérimentale pour réduire le stress occasionné par le changement d'environnement de leur cage. Durant les procédures impliquant une anésthésie, un gel oculaire sera utilisé pour éviter le déssechement de la cornée. Les animaux seront maintenus en groupe sociaux durant l'ensemble du projet.
Choix des espèces
Nous disposons de bons modèles de déplétion de la microglie durant le développement embryonnaire dans ce modèle . Les animaux seront agés de 8 semaines lors de l'implantation de la puce et de 10 semaines au premier tests comportemental, cela constitue l'âge idéal pour étudire le comportement des animaux déjà suffisamment développés.
Modélisation des ribosomopathies chez le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
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- Système urogénital
1 140 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, environ 855 conservés comme reproducteurs et les autres tués faute de porter la modification génétique recherchée. Les adultes subissent une coupure de nageoire pour vérifier leur génotype, leurs embryons servant à modéliser des maladies génétiques humaines rares. Le porteur décrit l'imagerie sur embryon comme non invasive. Il affirme que la souris ou le xénope ne permettent pas de modéliser ces pathologies alors que le poisson zèbre le permet.
Objectifs
Notre projet vise à caractériser les mécanismes génétiques et physiologiques gouvernant le développement de ribosomopathies (pathologies génétiques humaines) en utilisant le poisson zèbre Danio Rerio comme organisme modèle. Afin de pouvoir étudier les cascades moléculaires et génétiques en action au cours de l'établissement de ces pathologies, il nous faut altérer ou visualiser l'activité de gènes d'intérêt et la synthèse des ribosomes dans des tissus cibles. Nous utilisons la transgénèse et la mutagenèse dirigée pour établir des lignées mutantes ou transgéniques stables. Nos recherches se focalisent les événements précoces de ces ribosomopathies qui interviennent avant 5 jours de développement embryonnaire. Nous génèrerons 11 Lignées pour ce projet : (A) 5 lignées transgéniques : 4 lignées transgéniques ciblant spécifiquement 4 tissus : Tg(crêtes neurales::CRE) ,Tg(sang::CRE), Tg(lignée germinale::CRE) et Tg(système neural::CRE) pour visualiser les étapes précoces de la mise en place des pathologies dans ces tissus, 1 lignée transgénique permettant de quantifier la synthèse des ribosomes in vivo : Tg(ribo:Tag) et (B) 6 lignées mutantes des génes humains et candidats impliqués dans les ribosomopathies: tsr2, rpsa, rpn1, hspa, et deux nouveaux génes (ribo1, ribo2) pour modéliser et analyser le rôle possible de ces gènes candidats dans le développement des ribosomopathies.
Bénéfices attendus
Le projet nous permettra d’établir des lignées transgéniques et mutantes qui nous servirons pour modéliser les ribosomopathies qui ne sont pas modélisables chez d'autres modèles vertébrés comme la souris ou le xénope. Ces outils seront alors largement accessibles à la communauté scientifique pour comprendre plus largement le rôle de ces gènes dans différents processus physiologiques.
Procédures
Afin de valider leur génotype les animaux subiront un coupure de la nageoire au stade adulte. Les animaux générés par la suite seront utilisés à des fins reproductives, seuls leurs embryons dans les phases de développement autonomes (avant 5 jours de développement) seront utilisés pour les expérimentations.
Impact sur les animaux
A ce jour, nos expériences n'indiquent pas d'effets indésirables pour les lignées transgéniques à l'état hétérozygote et homozygote. Enfin, le génotypage des adultes pourrait induire un stress qui sera surveillé attentivement.
Devenir
Idéalement, nous aimerions conserver la totalité des animaux mais tous les adultes ne seront pas porteurs de la mutation et nous choisirons les allèles mutants les plus facilement identifiables et les lignées transgéniques les plus robustes pour ne conserver en moyenne les 3/4 des animaux reproducteurs (1140 X3)/4 = 855 animaux. Les autres qui ne portent pas l'événement génétique requis seront mis à mort.
Remplacement
Nous développons actuellement des modèles théoriques mathématiques pour simuler numériquement les expérimentations et ne tester biologiquement que les expériences ayant un intérêt pré-validé.
Réduction
L'équipe s'intéresse uniquement à des processus embryonnaires. Par conséquent, les poissons adultes gardés au laboratoire sont consacrés uniquement à la reproduction et à l'observation ne sont soumis à aucune expérimentation. Le nombre d'individus hébergés correspond au nombre minimal nécessaire au maintien des lignées et à la production d'œufs nécessaires à notre expérimentation et observation. Nous prenons soin de faire évoluer nos protocoles expérimentaux afin de réduire le nombre d’individus hébergés dans l’animalerie. Notamment, l’amélioration récente de nos techniques de mutagénèse grâce au développement de protocoles utilisant le système CRISPR/Cas9, nous a permis de réduire drastiquement le nombre de fondateurs nécessaires à l’établissement de nouvelles lignées. Nous utilisons les individus hétérozygotes comme "contrôles équivalents" pour avoir dans un même croisement d'individus hétérozygotes tous les génotypes d'intérêt pour nos expérimentations. Enfin, nous pouvons générer des individus adultes porteurs de transgènes et de mutations pour réduire le nombre d'adultes utilisés dans nos expérimentations.
Raffinement
Tout est fait dans ce projet pour que nos adultes soient dans les meilleures conditions pour pouvoir se reproduire afin que nous obtenions nos précieux embryons. De plus, nous utilisons principalement des méthodes non invasives d'imagerie de l'embryon en temps réel sur du vivant pour modéliser les ribosomopathies.
Choix des espèces
Notre équipe s’intéresse à comprendre les mécanismes modélisant les ribosomopathies humaines affectant le développement cranio-facial et l’hématopoïèse. Une approche in vivo sur un animal vertébré est nécessaire pour comprendre ces processus dynamiques. Cependant, les modèles murins ne sont pas adaptés pour modéliser ces pathologies alors que le poisson zèbre le permet. Il présente de nombreux avantages dont la possibilité de procéder à de l'imagerie « in vivo » grâce à la transparence de ses embryons. Ce modèle, permet aisément et de façon non-invasive, le recourt à la transgénèse et la mutagénèse dirigée pour établir les lignées mutantes ou transgéniques stables nécessaires à la dissection des processus moléculaires impliqués. De plus, contrairement, aux autres modèles génétiques vertébrés, les poissons ont un développement embryonnaire externe permettant d'avoir accès à ses embryons facilement pour observer le développement précoce de ces pathologies (impossible chez un mammifère) et surtout sans sacrifier l'animal ni lui infliger de douleur. L'ensemble de nos processus développementaux d'intérêt et donc de nos expérimentations se déroulement entre le stade 1 cellule (oeuf) et 5 jours après la fécondation, stade auquel les larves de poissons zèbre ne sont pas encore autonomes. Les adultes sont utilisés uniquement à des fins reproductives et d'observation.
Rôle de la Mécanique dans l’auto-organisation embryonnaire
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
90 cailles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance légère, pour créer cinq lignées transgéniques sur cinq ans. Le porteur étudie les forces mécaniques qui façonnent l'embryon de vertébré, en exploitant le développement externe de l'œuf de caille. Il juge un phénotype dommageable improbable mais prévoit de surveiller les générations F1 et F2, une perte de poids de 20 % constituant un point limite pouvant entraîner la mise à mort. Il affirme que l'étude d'embryons vivants est une "exigence absolue" et retient la caille pour sa petite taille et son cycle court.
Objectifs
L’objectif du projet est de comprendre comment signaux mécaniques et moléculaires interagissent pour permettre l’auto-organisation d’un embryon de vertébré. Pour ce faire nous proposons de créer plusieurs lignées de cailles transgénique exprimant des gènes rapporteurs de manière à étudier les processus qui sous-tendent le potentiel hautement régulé et auto-organisant de l’embryon de vertébré et le rôle de la mécanique dans ce contexte. En particulier, nous avons pour but de : 1. Sonder les propriétés mécaniques (viscosité, élasticité) de l’embryon précoce et identifier les processus cellulaires sous-jacents. 2. Perturber l’état mécanique des tissus embryonnaires et mesurer l’impact de ces perturbations sur l’expression génique et le destin cellulaire. 3. Dériver un modèle théorique et prédictif pour l’autorganisation de l’embryon et la régulation embryonnaire.
Bénéfices attendus
L’embryon de caille par son accessibilité et son développement externe, se prête remarquablement aux études dynamiques (par vidéo-microscopie) et aux perturbations mécaniques. Nous anticipons des bénéfices sur des concepts fondamentaux concernant la coopération entre signaux moléculaires et mécaniques qui sous-tendent l’auto-organisation des embryons d’amniotes (i.e. reptiles, oiseaux et mammifères, dont l’humain) qui ne sont pas atteignables chez d’autres espèces telles que la souris en raison du développement intra-utérin qui limite l’accessibilité de l’embryon. Notamment sur la manière les forces mécaniques modulent l’activité des facteurs de croissance par des processus de mécano-transduction et de rétroaction sur la génétique de manière auto-organisant. Au-delà de l’avancement de la connaissance du développement embryonnaire, ce projet aura des implications sur la compréhension des processus cancéreux et de régénération qui impliquent également forces mécaniques et redirection de destin cellulaire.
Procédures
Observation et manipulation des poussins (aspect, poids, taille, .....) pour l'évaluation de phénotype dommageable (quelques minutes, quotidiennement).
Impact sur les animaux
Ce projet implique la création de 5 lignées de cailles transgéniques en 5 ans. Les modifications génétiques proposées pour ces lignées ne sont pas susceptibles d’engendrer de phénotype dommageable et ne comportent, à priori, pas de risque pour les cailles impliquées dans ce projet. Cependant la survenue d’effet délétère est possible et sera surveillée pendant les générations F1 et F2, comme demandé dans le document de travail sur les animaux transgéniques complémentant la directive 2010/63/EU.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort, car ils ne peuvent être ni réutilisés ni placés.
Remplacement
En raison de la nature des questions biologiques soulevées dans les études proposées, visant à comprendre les événements cellulaires et moléculaires qui sous-tendent la formation d’un embryon in vivo, l'utilisation d'embryons vivants est une exigence absolue et ne peut donc pas être remplacée par d'autres méthodes non-animales.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires pour la génération d’une ligné transgénique est : En génération F1 : 6 cailles transgéniques hétérozygotes. En génération F2 : 12 cailles transgéniques issus des croisements (F1xWT) qui seront menées jusqu’à éclosion dans le but d’obtenir 6 males qui seront croisés chacun avec 4 femelles sauvages. Une seule lignée montrant l’expression la plus forte sera gardée et utilisée pour la génération d’individus en génération F3. Les animaux F1 et F2 seront suivis pour vérifier que la modification génétqiue n’a pas créé de phénotype dommageable. Évènement hautement improbable mais possible. Si les animaux ne montrent aucun phénotype dommageable, la procédure est terminée, le simple l’élevage de caille génétiquement modifiées passé la génération F2 ne constituant pas une procédure en soi. Les cailles sont utilisées dans ce projet pour produire des œufs et des lignées transgéniques, et ne peuvent pas être réutilisées dans un autre objectif.
Raffinement
Comme Indiqué ci-dessus, l’apparition d’un phénotype dommageable n’est pas souhaitée et peu probable. Cependant et comme indiqué dans le document de travail sur les animaux transgéniques complémentant la directive 2010/63/EU, nous évaluerons l’apparition d’un phénotype dommageable chez les animaux génétiquement modifiés en évaluant : -L’apparence générale : la morphologie de l’animal sera évaluée. Par exemple, la présence de tous les membres, en bonne proportion, des yeux, du bec à l’éclosion. -La taille et la croissance des individus. Les animaux adultes (>8semaines) pèsent en moyenne 360g pour les femelles et 311 g pour les males. Un écart de poids de -20% serait indicateur de souffrance et constituerait un point limite. -Le plumage : Apparence anormale de la morphologie et de l’implantation des plumes, à distinguer des problèmes de picage. -Le comportement : la posture, l’activité et l’interaction avec l’environnement seront vérifiés, (ex. acquisition de la marche après éclosion, nourrissage et abreuvement normaux qui pourraient être évocateur de l’affaiblissement de l’animal). -La présence de signe clinique évidents indicateurs d’une souffrance (ex. boiterie) Un taux de mortalité anormal. Une évaluation jugée anormale de l’un de ces critères, par comparaison avec des animaux contrôles d’un même groupe, serait révélatrice d’un phénotype dommageable qui constituerait un point limite et entrainerait la mise à mort de l’animal et la fin de la procédure concernant cette lignée/insertion.
Choix des espèces
La caille japonaise (Coturnix japonica). Les embryons d’oiseaux par leur accessibilité et leur développement externe, se prêtent remarquablement aux études dynamiques (par vidéo-microscopie) et aux perturbations mécaniques contrairement aux mammifères dont le développement intra-utérin limite la réalisation de telles approches. Sa petite taille et son temps de génération très court font de la caille un modèle génétique idéal parmi les oiseaux. -La procédure d’injection de particule lentivirale s’effectue sur des œufs fécondés mais non incubés. A ce stade il est possible de cibler de manière efficace les cellules précurseurs des cellules reproductrices et donc d’obtenir une transmission germinale. -La procédure de génération de lignée (évaluation de la présence de phénotype dommageable) s’étend sur 2 générations de l’éclosion jusqu’à la transmission dans les cellules reproductrices.
Caractérisation des progéniteurs hématopoïétiques qui colonisent le thymus, chez les embryons de souris de laboratoire
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
1 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie subit une greffe de lobes thymiques sous la capsule du rein par chirurgie, d'autres une irradiation létale suivie d'une reconstitution du système sanguin, et le projet emploie aussi des embryons et des nouveau-nés. Le porteur indique des douleurs et un stress dans les jours suivant la chirurgie, une anémie et un possible passage de bactéries après irradiation, avec une perte de poids attendue pendant deux semaines. Il affirme qu'aucun système in vitro ne peut remplacer l'étude d'un système immunitaire complexe et retient la souris pour sa proximité avec l'humain.
Objectifs
Le thymus produit en permanence des lymphocytes T qui sont essentiels à la protection contre les agents pathogènes de l'environnement. Cette fonction repose sur la génération d'un répertoire diversifié de récepteurs d'antigènes qui devront être sélectionnés pour éviter l'auto-reconnaissance (tolérance). Les premières cellules hématopoïétiques qui colonisent le thymus présentent une capacité unique à générer des cellules inductrices du tissu lymphoïde (LTi) et des cellules T invariantes qui, ensemble, sont nécessaires au développement normal de l'architecture thymique. La fonction thymique est assurée par un ensemble de sous-ensembles de cellules épithéliales qui fournissent les conditions nécessaires au développement et à la sélection des lymphocytes T. En effet, le déclin de la production de cellules T au cours du vieillissement ou dans certaines conditions pathologiques résulte de la perte de fonction de ces cellules épithéliales. Nos résultats récents et nos données préliminaires ont montré que, pendant la vie embryonnaire, les cellules T invariantes et les LTi proviennent d'une vague transitoire unique de progéniteurs. Cependant, à l'heure actuelle, le programme de développement de ces progéniteurs hématopoïétiques embryonnaires reste largement inconnu et le rôle des cellules T invariantes et des LTi thymiques dans l'établissement du système immunitaire adulte et dans le maintien de la tolérance n'a pas été caractérisé à ce jour. Identifier l'origine des cellules qui façonnent l'architecture thymique est essentiel pour comprendre la fonction thymique normal et, par conséquent, pour développer des stratégies visant à inverser l'involution thymique. Les objectifs de ce projet sont les suivants : 1. Identifier les événements moléculaires spécifiques qui se produisent dans le temps et l'espace au cours du développement embryonnaire et qui conduisent à la génération de LTi et de cellules T invariantes, 2. Caractériser le rôle de ces cellules dans la maturation des cellules épithéliales thymiques et 3. Étudier leur rôle dans l'établissement et le maintien de la tolérance périphérique et leur implication dans l'involution thymique.
Bénéfices attendus
Le projet vise à comprendre les aspects fondamentaux de la biologie du thymus et en particulier, les propriétés moléculaires et fonctionnelles des sous-ensembles lymphoïdes qui assurent le développement normal de l'architecture thymique. Les connaissances acquises auront des impacts majeurs sur la santé publique : a) Meilleure compréhension de la tolérance immunitaire b) Amélioration des réponses immunitaires c) En raison de leur rôle important dans l'intégrité et l'homéostasie des tissus, la compréhension des voies de développement menant à la génération des premières cellules lymphoïdes pourrait offrir de nouvelles stratégies pour contrer le remodelage tissulaire négatif dans les maladies inflammatoires chroniques. d) L'augmentation sans précédent de l'espérance de vie observée au cours du siècle dernier a des implications cruciales pour les politiques et pratiques sociales, économiques et sanitaires. L'un des principaux facteurs affectant la santé des personnes âgées est le déclin des réponses immunitaires lié à l'âge, qui contribue à une incidence plus élevée du cancer. L'involution du thymus est un facteur important contribuant au déclin immunitaire associé à l'âge. La lenteur de la récupération des lymphocytes T après une greffe de moelle osseuse ou d'autres immunodéficiences acquises revêt une importance majeure. Ceci est également important chez les patients ayant subi une greffe de moelle osseuse, où la lente récupération des cellules T est principalement attribuée à l'involution des cellules épithéliales thymiques après le conditionnement et la chimiothérapie. Dans ce projet, nous allons étudier les premières interactions entre les thymocytes et les cellules épithéliales qui pourraient avoir un impact sur la dynamique des compartiments épithéliaux thymiques tout au long de la vie.
Procédures
Il y a deux types de procédures prévues qui peuvent générer une souffrance modérée. Le premier est une greffe de lobes thymiques sur la capsule du rein qui implique une chirurgie (20-30 minutes) et l’autre ces les effets de l’irradiation létale (10 minutes) en vue de reconstitution du système hématopoïétique (intervention durant 1 heure et 2 heures). Les souris nouveau-nées seront injectées avec des précurseurs hématopoïétiques à jour 0 ou 1 et gardées pendant 8 semaines (l’injection de nouveau nés prends 3-5 secondes et les nouveau-nés sont rendus à la mère en une heure maximum). Les animaux adultes reconstitués avec des cellules hématopoïétiques, puis traités avec FTY720 et 80 avec PBS contrôle, ou traités avec des anticorps (5-10 secondes par intervention).
Impact sur les animaux
Les souris qui sont transplantées avec des lobes thymiques sous la capsule du rein sont soumises à une chirurgie et des douleurs et du stress sont attendues dans les deux ou trois jours qui suivent la chirurgie. L’irradiation létale pour une reconstitution du système hématopoïétique engendre une anémie post-transplantation.. L’irradiation affecte aussi l’épithélium du système digestif et un passage de bactéries dans la circulation est possible. Malgré ces traitements il y a une période de deux semaines post-irradiation où on peut s’attendre à voir des effets sur le comportement et perte de poids chez les souris.
Devenir
Tous les animaux ayant subi des greffes, des reconstitutions ou des traitements seront mis à mort à la fin de l’expérience car ne peuvent pas être réutilisés, replacés ou adoptés.
Remplacement
Il n’y a pas d’alternatives de remplacement non-animales dans ce domaine. Le système immunitaire est hautement complexe et constitué de différents types cellulaires qui ensemble conditionnent l’état de santé ou de déficit immunitaire ou auto-immunité. Il n’y a donc aucun système in vitro qui puisse remplacer les expériences in vivo. Dans la même logique il faut donc effectuer des expériences dans des animaux vivants.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour le projet est basé sur un minimum de 4 expériences par groupe avec 6 souris par expérience en chaque groupe. Dès que possible les organes prélevés chez les souris seront partagés entre différents chercheurs pour limiter le nombre d’animaux utilisés. Les données seront analysées utilisant des tests T et ANOVA. Les mâles servant à générer les embryons et les souris nouveau-nées sont mutualisés entre les différentes procédures de ce projet voire d’autres projets quand cela est possible.
Raffinement
Les animaux soumis à des interventions chirurgicales seront surveillées trois fois par semaine, au minimum, des mesures d’analgésie seront aussi mises en place. Les souris seront hébergées dans des cages avec de l’enrichissement (igllos) et nous serons attentifs à toute amélioration possible des conditions d’hébergement. Les souris qui sont transplantées avec des lobes thymiques sous la capsule du rein sont soumises à une chirurgie et des douleurs et du stress sont attendues dans les deux ou trois jours qui suivent la chirurgie. Un traitement d’analgésie est prévu dans ces expériences. L’irradiation affecte aussi l’épithélium du système digestif et un passage de bactéries dans la circulation est possible. Un traitement antibiotique prévient l’effet néfaste de cette éventualité. Malgré ces traitements il y a une période de deux semaines post-irradiation où on peut s’attendre à voir des effets sur le comportement et perte de poids chez les souris. Elles seront donc surveillées de près pendant toute cette période et les souris atteignant les points limites définis seront mises à mort.
Choix des espèces
La souris comporte tous les composants-clés du système immunitaire inné et acquis, et de ce fait est un bon modèle pour l'étude des réponses immunitaires chez les mammifères. Le fonctionnement et les molécules du système immunitaire des souris sont bien caractérisés et largement comparables au système immunitaire humain. En conséquence, les résultats expérimentaux sont très probablement transférables aux humains. De plus, il existe un grand nombre de lignées de souris mutantes, knockout et transgéniques, qui permettent des études mécanistiques approfondies. En outre, les pathologies intestinales et la régulation homéostatique du nombre de cellules présentes chez les souris sont bien décrites. Les résultats des expériences que nous programmons fourniront des pistes importantes quant à la fonction des lymphocytes dans l’établissement du système immunitaire. Les souris seront des souris adultes de 6 à 8 semaines ; nous utiliserons des embryons de souris entre les jours 13 et les jours 18, seconde moitié de la gestation ; nous utiliserons aussi des nouveau-nés. L’étude des embryons et nouveau-nés est nécessaire pour comprendre les mécanismes qui gèrent l’établissement du système immunitaire.
Mise en place de l’organe sensoriel olfactif chez le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
400 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, environ trois quarts conservés comme reproducteurs et le reste tué faute de porter la mutation recherchée. Le porteur crée six lignées transgéniques et mutantes pour étudier la formation du système olfactif à partir des embryons, prélevés avant cinq jours de développement. Il indique que les formes homozygotes peuvent provoquer stérilité, stress et agressivité, et prévoit de ne maintenir que des adultes hétérozygotes pour éviter ces atteintes. Sur le remplacement, il décrit des modèles mathématiques en développement mais conclut qu'une approche in vivo sur un vertébré reste "nécessaire".
Objectifs
Notre projet vise à caractériser les mécanismes génétiques et morphométriques gouvernant la mise en place du système olfactif en utilisant le poisson zèbre Danio Rerio comme organisme modèle. Afin de pouvoir étudier les cascades moléculaires et génétiques en action au cours du développement de cette structure, il nous faut altérer ou visualiser l'activité de gènes d'intérêt. Nous utilisons la transgénèse et la mutagenèse dirigée pour établir des lignées mutantes ou transgéniques stables. Nos recherches se focalisent sur la mise en place précoce du système olfactif dont les évènements interviennent avant 5 jours de développement embryonnaire. Nous génèrerons 6 Lignées pour ce projet : A. 2 lignées transgéniques : Tg(fa2h::eGFP) et Tg(8.4neurog1::nls-EOS) pour visualiser les étapes précoces de la formation de notre structure d'intérêt et B. 4 lignées mutantes : pitx3 , f11r.1, fa2h et oclna pour analyser le rôle de ces gènes candidats dans la mise en place précoce du système olfactif.
Bénéfices attendus
Le projet nous permettra d’établir des lignées transgéniques et mutantes qui nous servirons pour mieux comprendre la mise en place de l’organe sensoriel olfactif. Ces outils seront alors largement accessibles à la communauté scientifique pour comprendre plus largement le rôle des molécules d’adhésion jonctionnelle, des enzymes et pour établir un modèle poisson zèbre de développement des neurones dopaminergiques (maladie de Parkinson et développement du cristallin).
Procédures
Les animaux générés par ce projet seront utilisés à des fins reproductives, seuls leurs embryons dans les phases de développement autonomes (avant 5 jours de développement) seront utilisés pour les expérimentations.
Impact sur les animaux
Nous ne prévoyons pas d'effets indésirables pour les lignées transgéniques et mutantes à l'état hétérozygote. Cependant, nous pouvons anticiper que pour les lignées mutantes le développement des placodes craniales antérieures (cristallin, adénohypophyse et olfaction) soit perturbé. Les données bibliographiques de mutants qui perturbent le développement de l'adénohypophyse, du cristallin et de l'olfaction peuvent indiquer des effets indésirables chez les adultes homozygotes : risques de stérilité, de stress et d’agressivité. Il est important de noter que chez le poisson zèbre, ces pathologies se développent lorsque la mutation est présente à l'état homozygote et que nous maintiendrons les lignées avec des adultes hétérozygotes dans ce projet.
Devenir
Idéalement, nous aimerions conserver la totalité des animaux mais tous les adultes ne seront pas porteurs de la mutation et nous choisirons les allèles mutants les plus facilement identifiables et les lignées transgéniques les plus robustes pour ne conserver en moyenne les 3/4 des animaux reproducteurs. Les autres qui ne portent pas l'évébement génétique requis seront mis à mort.
Remplacement
Nous développons actuellement des modèles théoriques mathématiques pour simuler numériquement les expérimentations et ne tester biologiquement que les expériences ayant un intérêt pré-validé.
Réduction
L'équipe s'intéresse uniquement à des processus embryonnaires. Par conséquent, les poissons adultes gardés au laboratoire sont consacrés uniquement à la reproduction et ne sont soumis à aucune expérimentation. Le nombre d'individus hébergés correspond au nombre minimal nécessaire au maintien des lignées et à la production d'œufs nécessaires à notre expérimentation. Nous prenons soin de faire évoluer nos protocoles expérimentaux afin de réduire le nombre d’individus hébergés dans l’animalerie. Notamment, l’amélioration récente de nos techniques de mutagénèse grâce au développement de protocoles utilisant le système CRIPR/Cas9, nous a permis de réduire drastiquement le nombre de fondateurs nécessaires à l’établissement de nouvelles lignées.
Raffinement
Tout est fait dans ce projet pour que nos adultes soient dans les meilleures conditions pour pouvoir se reproduire afin que nous obtenions nos précieux embryons. De plus, nous utilisons principalement dans notre projet des méthodes d'imagerie de l'embryon en temps réel sur du vivant pour comprendte la formation de l'organe sensoriel olfactif à l'aide de lignées transgéniques fluorescentes qui marquent le territoire olfactif et les différentes populations cellulaires qui le composent.
Choix des espèces
Notre équipe s’intéresse à comprendre les mécanismes génétiques et morphomètriques régissant la mise en place du système olfactif. La perturbation de ces processus peut conduire chez l’homme à de nombreuses pathologies allant de la stérilité à l’anosmie. L’utilisation d’une approche in vivo sur un animal vertébré, comme le poisson zèbre est donc nécessaire à la compréhension de ces processus dynamiques et complexes. Dans ce projet, nous générerons des poissons zèbres transgéniques ou mutants qui seront utilisés adultes à des fins reproductives.
Etude du rôle d’un facteur de synthèse des ribosomes dans le maintien de l’identité des cellules souches embryonnaires murines
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
16 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules souches embryonnaires leur sont injectées dans les testicules par chirurgie pour y former des tumeurs bénignes, analysées ensuite au microscope. Le porteur indique que l'ensemble du projet a jusqu'ici été mené sur cellules en culture, sans animaux, et que le recours à la souris vise à démontrer un résultat réclamé dans la phase de finalisation pour publication. Les souris sont mises à mort au plus tard huit semaines après l'injection ou dès l'atteinte des points limites.
Objectifs
Contexte. Les cellules souches embryonnaires (cellules ES) apparaissent au début de l’embryogénèse et sont à l’origine de la formation de tous les tissus qui constituent les embryons. Les cellules ES peuvent être cultivées en laboratoire indéfiniment, tout en conservant leurs 2 propriétés principales. 1) l’auto-renouvellement qui permet à une cellule ES de se diviser en 2 cellules filles identiques. 2) La pluripotence, c’est à dire la capacité à changer d’identité pour se transformer en toutes les cellules constituant les organes. Comprendre comment les cellules ES conservent leur identité ou en changent est donc essentiel pour différents champs d’application de la biologie et de la médecine car cela contribue aussi bien à améliorer la médecine de la reproduction qu’à mieux comprendre certaines pathologies humaines telles que le cancer. Hypothèse. Depuis 2018, une protéine a été identifiée pour son implication dans un mécanisme biologique essentiel qui aboutit à la fabrication des protéines, appelé traduction. Il a été établi que cette protéine est très exprimée dans les cellules ES et est essentielle pour qu’elles conservent leur capacité à se diviser à l’identique mais pas pour leur capacité à changer d’identité (pluripotence). Toutes les expériences ont été réalisées sur des cellules ES en culture et doivent maintenant être confirmées par des expériences in vivo qui miment le développement embryonnaire. Description du modèle. Toutes les expériences in vitro ont été réalisées sur des cellules ES de souris, aussi les tests in vivo doivent être réalisés chez la souris afin de limiter les biais d’analyse entre différentes espèces. Le test in vivo consiste à injecter des cellules ES dans les testicules de souris mâles adultes. Les cellules ES injectées vont former des tumeurs bénignes non disséminantes et constituées, non pas de cellules cancéreuses, mais de cellules ES qui auront changé d’identité. L’enjeu principal de ces tests est donc d’identifier les types cellulaires différenciés une fois la tumeur bénigne formée, grâce à des analyses au microscope des tumeurs collectées. Objectif. Le projet a pour finalité de déterminer si la perte de la protéine impliquée dans la traduction dans les cellules ES entraîne une modification de leur capacité à changer d’identité in vivo afin de confirmer les nombreuses observations qui ont été réalisées sur des cellules ES de souris in vitro.
Bénéfices attendus
L’étude des processus responsables du développement précoce des embryons chez l’homme et chez les mammifères contribue à l’amélioration de la prise en charge de l’infertilité (par ex., fécondation in vitro). Un des modèles biologiques les plus étudiés pour mieux comprendre ces processus sont les cellules souches embryonnaires (ou cellules ES). Les cellules ES présentent le gros avantage de pouvoir être cultivées en laboratoire tout en conservant leur capacité à former tous les tissus qu’on retrouve dans les embryons qui se développent. Pour améliorer nos connaissances de la biologie du développement des embryons, il est donc essentiel de décortiquer les mécanismes qui contrôlent l’activité des cellules ES et donc les mécanismes qui contrôlent l’expression des gènes dans ces cellules ES. De plus, ces mécanismes fondamentaux peuvent être conservés dans d’autres types de cellules souches à l’origine de pathologies humaines telles que le cancer. En conséquence, approfondir la connaissance des mécanismes moléculaires qui régissent l’identité des cellules ES présente un enjeu majeur aussi bien pour la recherche fondamentale en biologie, pour la médecine de reproduction et pour la cancérologie. Au cours d’une étude portant sur le rôle du mécanisme responsable de la synthèse des protéines dans les cellules ES chez la souris, et un tout nouveau facteur a été identifié comme jouant un rôle essentiel dans ce mécanisme. Grâce à des approches in vitro, c’est à dire, sur des cellules en culture en laboratoire, ce facteur a été montré comme essentiel pour préserver les propriétés des cellules souches. Ce facteur est présent dans d’autres types de cellules souches (cellules ES humaines, cellules souches adultes, cellules souches cancéreuses) et pourrait donc jouer un rôle important dans le développement des embryons humains et dans certains types de cancers tel que le cancer du colon où il est fortement exprimé.
Procédures
Les souris seront soumise à une unique procédure chirurgicale d'une durée de 10-15 min sous anesthésie générale et traitement entalgique pour éviter toute douleur.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables qui sont attendus pour les animaux sont ceux qui peuvent découler : i) de la procédure chirurgicale (inflammation, infection et douleurs localisées), ii) de la présence de sutures cutanées qui peuvent entrainer des blessures cutanées à postériori causées par l’animal lui-même par démangeaisons, iii) de douleurs et de modifications du comportement de la souris (perte de poids) liées à la procédure.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort après une anesthésie générale dès l'atteinte des points limites ou après une période maximale de 8 semaines après l'injection des cellules ES dans les testicules.
Remplacement
Jusqu’à présent, tout le projet a complètement été réalisé grâce à des expériences en laboratoire sur cellules ES de souris, donc sans faire appel à aucun modèle animal. Dans sa phase de finalisation pour publication, il nous est demandé de démontrer par d’autres approches que les cellules ES que nous étudions, maintiennent leur capacité à générer des embryons. Cela ne peut être réaliser sans le recours à des modèles animaux.
Réduction
Le nombre de souris utilisées sera réduit à 16 (2 groupes de 8 souris) pour les raisons suivantes : 1) Le choix des testicules comme site d’injection permet de doubler le potentiel de développement de tumeurs bénignes sans augmenter le nombre d’animaux. 2) Le résultat attendu de ce projet est l’observation qualitative de tissus adultes au sein des tumeurs bénignes mais nous ne recherchons d’effet statistique, permettant ainsi de réduire la taille des groupes d’animaux. Notre expérience antérieure nous permet de prédire que 2 souris sur 3 injectées avec des cellules ES développent des tumeurs bénignes dans les testicules. Ceci, combiné aux données de la littérature, nous permet de réduire le nombre de souris receveuses à 8 par condition pour obtenir un nombre suffisant de tératomes analysables et ne pas reproduire l'expérience inutilement.
Raffinement
Durant toute la procédure, et en particulier dès le réveil post-chirurgie, les souris seront observées régulièrement (2 à 3 fois par semaine) afin de détecter tout signe de souffrance qui conduirait à la mise à mort de ces souris. De plus, anesthésiques et analgésiques seront utilisés pendant l’expérimentation avant, pendant et après la procédure opératoire.
Choix des espèces
L’ensemble du projet est focalisé sur l’étude de la biologie des cellules souches embryonnaires de souris. Bien que nous ayons montré que le rôle de la protéine candidate est conservé dans les cellules souches embryonnaires humaines et dans les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) de souris, il nous apparaît donc plus opportun de réaliser les expériences de formation de tératomes chez la même espèce afin de récapituler au mieux les voies de signalisations qui vont induire la différenciation des cellules souches embryonnaires dans les tératomes. Toutes les expériences seront réalisées avec des souris adultes de 6 à 8 semaines, qui est l'âge habituellement utilisé pour l’induction de tératomes.
Modèles d’étude pour les pathologies infectieuses humaines : souris humanisées pour le système immunitaire et/ou le foie
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
5 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Greffées avec des cellules humaines, elles subissent une irradiation sublétale, des prélèvements de sang, des chirurgies puis une infection par des virus comme le VIH ou les hépatites B et C, pour étudier ces infections et tester des traitements. Le porteur indique que certaines souris présentent un poids réduit lié à une déficience hépatique et peuvent développer une dermatite, avec mise à mort si le score de souffrance atteint le point limite. Il présente ce modèle comme le "seul" permettant ces infections et comme une alternative au recours aux primates non-humains.
Objectifs
Ce projet utilise le seul modèle murin expérimental qui permet de suivre la progression in vivo des infections par des virus à tropisme restreint aux humains et aux primates non-humains. Dans ce projet, nous souhaitons étudier la physiopathologie induite par l’infection des virus de l’immunodéficience humaine (VIH), d’Epstein-Barr (EBV), de l’hépatite B (VHB), et de l’hépatite C (VHC) en suivant les réponses immunitaires, et évaluer l’impact des nouvelles approches antivirales ou vaccinales. Ce type d’expérimentation ne peut pas être mené chez l’hôte naturel de ces virus pathogènes (l’homme) et s’avère de plus en plus difficile à mettre en place chez des primates non-humains. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces virus, des modèles de souris humanisés pour le système immunitaire (souris HIS), ou pour le foie avec l'ajout d'hépatocytes humains (souris HUHEP), ont été développés au cours des deux dernières décennies. Comme premier modèle, nous avons généré des souris immunodéficientes (BRGS), par l’invalidation fonctionnelle des gènes codant pour certaines protéines. Les principaux mécanismes de rejet de greffe sont absents chez ces souris ce qui permet l’établissement d’une xénogreffe hématopoïétique humaine après injection de cellules souches hématopoïétiques humaines (HSC). Des études précédentes ont montré que les souris HIS étaient susceptibles aux infections par les virus HIV ou EBV, et modélisaient les réponses immunitaires humaines. Un second modèle murin immunodéficient porte en plus un gène urokinase plasminogen activateur (uPA) qui est toxique pour les hépatocytes dans le foie, ce qui induit une déficience hépatique. Ces souris sont greffées avec des hépatocytes humains adultes sains qui participent à la régénération du foie et constituent le modèle HUHEP. Des études précédentes ont montré que les hépatocytes humains pouvaient être infectées par les virus VHB et VHC ainsi que par le parasite de la malaria (Plasmodium falciparum) chez ces souris HUHEP. La combinaison des deux modèles ci-dessus, dite HIS-HUHEP permet une étude approfondie des interactions entre le système immunitaire et le foie dans le cadre d’infections hépatiques (VHB, VHC, P. falciparum). Celui-ci permet de décortiquer les mécanismes d’infection et de mieux comprendre la pathogénèse complexe induite par ces microbes invasifs.
Bénéfices attendus
Ces modèles animaux permettront de mieux caractériser les mécanismes d'infection et de réplication des virus (VIH, EBV, VHB, VHC), le rôle du système immunitaire dans l'évolution des pathologies, ainsi que de tester des nouvelles stratégies thérapeutiques et vaccinales. Bien que des traitements thérapeutiques existent pour les patients atteints de VIH, un vaccin thérapeutique permettrait de contrôler les infections de manière pérenne. Il n’existe pas de vaccin préventif pour le VIH et le VHC, ainsi des millions de nouvelles infections surviennent par an, ne permettant pas d’éliminer ces virus de la population globale. Bien qu’un vaccin sûr et efficace existe pour le VHB, plus de 260 millions de personnes sont actuellement infectées et seul 1% de ces patients ont accès aux traitement thérapeutiques, le VHB induit des hépatocarcinomes à mauvais pronostique. Ces traitements, comme celui pour le VIH, doivent être pris à vie, induisant un coût élevé pour la société et un risque de survenu d’échappement virologique. Ainsi, les recherches se poursuivent pour développer des vaccins, ou des traitements curatifs, pour ces pathologies. L’interaction entre la réponse immunitaire et le virus est essentiel dans la progression de la pathologie, comprendre ces mécanismes d’action est une clé de voute pour développer des nouveaux concepts de traitements à visé thérapeutiques, ou des vaccins. Or, les modèles animaux qui permettent d’étudier ces interactions sont rares étant donné que ces virus n’infectent que des cellules humaines ou de chimpanzés. Afin de modéliser ces questions, nous avons développé des modèles de souris greffées avec des cellules humaines qui sont susceptibles à ces virus, permettant d’étudier les réponses immunitaires antivirales humaines. L’ensemble de ces études participe à comprendre la physiopathologie induite par ces virus chez l’humain, et à développer des nouveaux traitements thérapeutiques et des stratégies vaccinales afin d’éliminer ces maladies.
Procédures
Les procédures expérimentales décrites prévoient les interventions suivantes : irradiation avec des doses sous-létales (une fois par vie, 1-3 minutes), prélèvements sanguins en retro-mandibulaire (chaque prélèvement dure quelques secondes et est réalisé tous les 15 jours au maximum), anesthésie et procédures chirurgicales (une fois par vie, environ une heure et demi par animal), infection par des virus (une fois par vie, chaque infection dure quelques secondes).
Impact sur les animaux
Le degré de gravité des procédures est considéré comme léger (injections et prélèvements) ou modéré (conséquences potentielles à long terme de l’irradiation sous létale ou chirurgie). Les animaux portant le transgène uPA ont un poids réduit (autour de 10% en dessous du poids normal) du à leur déficience hépatique qui entraîne des défauts métaboliques. Ce poids diminué n’affecte pas le comportement des animaux, n’entraîne pas de souffrances, ni de stress, d’après nos observations sur plusieurs années d’expérimentation. Les animaux humanisés pour le système immunitaire et exprimant le transgène TSLP peuvent développer une dermatite. Afin de soulager la dermatite, les animaux seront traités avec une solution antiseptique (bétadine) avec un anesthésiant locale (lidocaine) et ils pourront être hébergés sur une litière de cellulose plus adaptée aux peaux sensibles. Leur phénotype est suivi toutes les semaines selon les critères et les points limites suivants : 1. Apparence global de l’animal score 0 : normal score 1: poils ébouriffés, rougeur de peau ou perte de poils sur moins de 50% du corps, expression faciale modérée, animal en mouvement score 2: dos voûté, perte de poils sur plus de 50% du corps, expression faciale sévère, absence de mouvement, prostration. 2. Conditions corporelles (cachexie) score 0: BCS (Body Condition Scoring) 3: L’animal est bien conditionné. La colonne vertébrale est continue. Vertèbres palpables seulement avec une pression ferme. score 1: BCS 2: L’animal est sous-conditionné. Segmentation de la colonne vertébrale évidente. Les os du bassin dorsal sont facilement palpables. score 2: BCS 1 : L’animal est amaigri. Structure squelettique extrêmement visible et peu ou pas couverte par la chair. Vertèbres distinctement segmentées 3. Poids score 1: perte de plus de 10% du poids score 2: perte de plus de 20% du poids Le point limite est défini par la détection d’un score =2 Si un score > 0 est observé, les animaux auront une surveillance renforcée. Si un score = 2 est observé, les animaux seront mis à mort.
Devenir
A l’issu de la procédure expérimentale #1 les animaux seront mises en expériences suivant les procédures expérimentales # 2, 3, 4 et 6. A la fin de ces procédures expérimentales les animaux seront mis à mort pour être analysés afin de caractériser la physiopathologie et la réponse immunitaire induite par les virus VIH, VHB, VHC, EBV. A l’issu de la procédure expérimentale #5 les animaux seront mis en accouplement.
Remplacement
Ce projet nécessite un modèle expérimental soutenant l’ensemble des mécanismes de la physiopathologie induite par une/des infection(s) virale(s). Or, de nombreux exemples démontrent que les tests d’efficacité de thérapies antivirales in vitro ne se confirment pas systématiquement in vivo en phase clinique chez l’Homme du fait des dynamiques complexes mises en jeu dans l’organisme (cinétique de l’infection; distributions cellulaires ; bio-distribution des composés; réponse immunitaire). Historiquement, les modèles infectieux de choix restent le macaque pour le VIH (avec le virus simien apparenté VIS ou l’hybride SHIV) et le chimpanzé pour le VHC et le VHB. En proposant comme modèle alternatif la souris humanisée pour le système immunitaire et/ou le foie, nous appliquons de manière relative le principe de remplacement en écartant l’utilisation de primates non-humains, avec l’avantage supplémentaire d’utiliser un modèle expérimental directement adapté au pathogène humain natif. A ce titre, les souris HIS et HIS-HUHEP sont le seul modèle expérimental correspondant à ces critères (mis à part l’Homme lui-même, chez lequel il est éthiquement inacceptable de tester directement de nouvelles stratégies préventives ou thérapeutiques).
Réduction
Le plan d’étude bénéficie de nos connaissances antérieures obtenues avec des souris humanisées sur l’infection par le VIH et le VHB. De plus, nous utilisons un modèle de souris HIS qui est à la pointe du domaine, ce modèle est sans cesse optimisé pour une meilleure prise de la xénogreffe humaine, ce qui diminue la variabilité intrinsèque au modèle et réduit d’autant le nombre d’animaux requis par expérience. Il sera essentiel de compter un minimum de 10 animaux par groupe, du fait de cette variabilité intrinsèque, et d’inclure l’ensemble des groupes contrôles pour valider les conclusions de chaque étude. La planification des expériences en amont et la concertation entre les membres de l’équipe seront des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux.
Raffinement
Les cages d’hébergement sont enrichies avec un coton dentaire permettant une nidification, et avec des refuges en forme de dômes en cellulose dans les cages de croisements. Par ailleurs, le stress des animaux est largement diminué par l’utilisation d’analgésiques et d’antalgiques lors de la majorité des procédures. L’isoflurane par voie respiratoire présente l’avantage d’être un anesthésiant permettant des séquences d’endormissement courtes et répétées. Les soins post-opératoires tels que des pansements, du gel oculaire, une réhydratation par voie sous-cutanée, et une alimentation hydratante (DietGel) sont inclus dans nos protocoles expérimentaux.
Choix des espèces
La souris HIS est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale soutenant une infection productive par le VIH. La souris HUHEP greffée avec des hépatocytes humains est permissive aux infections hepatotropiques (VHB, VHC, P. falciparum). Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. Les souris humanisées pour le système immunitaire (HIS) sont générées par injection de cellules souches hématopoïétiques humaines CD34+ dans des souriceaux nouveau-nés (
Etablissement d’un modèle de glioblastomes (GBM) chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
808 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des souriceaux d'un jour sont anesthésiés, reçoivent une injection d'ADN dans un ventricule cérébral puis des chocs électriques d'électroporation, pour induire et étudier les premières étapes d'un glioblastome. Le porteur indique que l'électroporation peut provoquer stress de séparation, refroidissement et douleur modérée, et prévoit d'arrêter l'expérience quand les tumeurs atteignent 15 % du volume du cerveau. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle cellulaire capable de récapituler ces niches de cellules souches.
Objectifs
Les glioblastomes (GBM) représentent la forme la plus fréquente et aussi la plus agressive des tumeurs primaires du cerveau avec un pronostic de survie post-diagnostique très bas. L’objectif du projet est d’établir dans notre laboratoire un modèle murin de GBM qui permettra d’étudier les étapes précoces de progression de ces tumeurs. Récemment les cellules souches neurales localisées autour des ventricules latéraux du cerveau ont été identifiées comme les cellules qui sont à l’origine des GBM. En effet lorsque certains gènes sont mutés dans ces cellules souches, celles-ci sont en capacité de se transformer en cellules tumorales. Sur la base d’études publiées dans d’autres laboratoires, nous souhaitons effectuer des expériences pilotes pour mettre au point un modèle d’induction de GBM basé sur l’introduction de mutations dans ces cellules souches neurales. Grâce à une méthode d’électroporation mise au point au laboratoire, nous pouvons cibler spécifiquement ces cellules souches et y introduire des modifications génétiques. L’analyse de ces cellules ainsi modifiées sera effectuée à différents temps après l’induction des mutations et permettra de caractériser les évènements cellulaires et moléculaires qui interviennent pendant la période d’induction et de développement précoce des GBM.
Bénéfices attendus
Grâce à l'électroporation nous avons le moyen unique de pouvoir cibler les cellules qui sont à l’origine de la formation de GBM. La mise au point d’un nouveau modèle de glioblastome basé uniquement sur l’électroporation ouvre la possibilité d’étudier les étapes précoces du développement des GBM dans un contexte physiologique avec un niveau de résolution cellulaire et moléculaire qui n’existe pas à l’heure actuelle. Ainsi de nouveaux processus cellulaires et moléculaires intervenant au commencement de la tumorigenèse pourront être découverts.
Procédures
Nombre total d'animaux= 808. Tous les animaux de ce projet seront traités avec le même protocole. Pour l'étape d'électroporation, les souriceaux âgés de 1 jour seront anesthésiés, des solutions d'ADN seront injectés dans un ventricule latéral du cerveau grâce un capillaire très fin, puis des électrodes placées de part et d'autre de la tête de l'animal délivreront des chocs électriques. L’ensemble de ces actes ne dure que 30 secondes. Ils seront réveillés progressivement en les ramenant à une température de 37°C et replacés auprès de leur mère. Avant leur mise à mort, les animaux recevront une injection intrapéritonéale d’EdU ou de BrdU, composés qui permettent de suivre la prolifération des cellules, qui ne provoquent aucune douleur et qui ne sont pas délétères à l’animal. Les animaux seront euthanasiés à différents temps après l'électroporation. La mise à mort se fera après injection d'une surdose d'anesthésique.
Impact sur les animaux
Dans la procédure d'électroporation, certaines étapes peuvent potentiellement générer du stress lié à la séparation d’avec leur mère, au refroidissement utilisé pour l’anesthésie et à la douleur modéré de l’électroporation. Cependant avec le recul de plusieurs années d’utilisation et de maitrise des procédures d’électroporation, nous avons pu constater que les souriceaux ne présentent pas de signes de douleur ni d’anxiété au réveil et sont allaités par la mère très rapidement après leur retour dans la cage. Les autres effets indésirables attendus sont le développement de tumeurs qui sera évalué au cours du temps. Comme le but de notre étude est concentré sur les étapes précoces de l’établissement des tumeurs, nous ne souhaitons pas atteindre le stade où les tumeurs deviennent délétères pour l’animal. C’est pourquoi, nous suivrons un lot d’animaux pour déterminer le temps nécessaire à la survenue de tumeurs en analysant par histologie les cerveaux prélevés toutes les deux semaines jusqu'à un maximum de 16 semaines après l'électroporation. L’expérimentation sera arrêtée lorsque les tumeurs atteindront 15% du volume du cerveau. Ce stade de développement des tumeurs est suffisant pour notre étude et n’entraine pas de perte de poids chez l’animal ni de comportement anormal.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin d’analyser le devenir des cellules souches modifiées génétiquement et afin d’ évaluer si et comment des tumeurs se développent.
Remplacement
Le but de notre projet est d’étudier les mécanismes celluaires et moléculaires intervenant dans les phases précoces de développement des GBM dans le contexte écologique de l’avènement des tumeurs en ciblant les cellules souches neurales situées dans le cerveau antérieur et qui sont à l’origine de ces GBM. Malheureusement il n’existe pas de modèles cellulaires capables de récapituler ces niches cellulaires.
Réduction
Les procédures visent à limiter l’utilisation d'animaux tout en obtenant suffisamment de données. - Les animaux test et témoin seront issus d’une même portée - des méthodes statistiques adaptées aux petits échantillons seront utilisés pour pouvoir obtenir des données statistiques fiables tout en utilisant un nombre restreint d’animaux par expérience. - Le contrôle des paramètres environnementaux et du statut sanitaire et génétique des animaux limitera la variabilité des résultats expérimentaux. - Des expériences pilotes seront effectuées en début de protocole sur un nombre très réduit d’animaux pour établir la chronologie des évènements conduisant à des GBM et permettront ainsi de réduire ainsi la fenêtre d’étude aux étapes précoces de développement des tumeurs avant que celles-ci ne deviennent délétères.
Raffinement
- L’état sanitaire et environnemental des animaux est contrôlé quotidiennement. - Les cages sont enrichies avec des carrés de coton, des cylindres de carton et des dômes de nidification. - Les animaux sont hébergés en groupes sociaux. - Pour limiter l’anxiété lors des procédures expérimentales d’électroporation, les souriceaux sont maintenus au maximum en portée avec leur mère. - Une prémédication d’anti-douleur sera administrée en sous cutanée 30 minutes avant la mise à mort pour éviter toute souffrance ; les animaux seront euthanasiés après avoir reçu une surdose d’anesthésique. Pour limiter les effets trop délétères liés au développement de tumeurs cérébrales, une analyse histologique des cerveaux au cours du temps permettra de déterminer le stade de progression des tumeurs qui soit suffisant pour l'étude mais qui ne provoque pas de perte de poids ni de comportement anormal.
Choix des espèces
De façon générale, la souris est le modèle Mammifère le plus utilisé par la communauté scientifique pour établir des modèles de cancers in vivo permettant l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires des phases précoces de développement de cancer. Un modèle d'induction de GBM similaire au nôtre a déjà été décrit chez la souris et mime différentes caractéristiques cellulaires et moléculaires de la genèse et du développement des glioblastomes. Ce modèle est donc réalisable et pertinent. De plus, grâce à l'adaptation de notre protocole basée uniquement sur l’électroporation, nous pourrons, dans le futur, étudier les étapes d’induction et de développement précoce des GBM dans des contextes génétiques mutants existant uniquement chez la souris. Tous les animaux seront électroporés au stade nouveau-nés car c’est le stade où les cellules souches neurales qui bordent les ventricules latéraux, peuvent être modifiées génétiquement grâce à l’électroporation de plasmides. Des animaux seront euthanasiés à différents temps, à partir d’une semaine jusqu’à un maximum de 16 semaines après l’électroporation pour suivre l’évolution des cellules électroporées.
Etude du rôle d’Arhgef18 dans la biologie endothéliale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
420 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue. Certaines reçoivent dès la naissance trois injections dans l'estomac ou l'abdomen en trois jours, d'autres, adultes, dix injections abdominales de tamoxifène en deux semaines. Une partie subit ensuite une prise de sang derrière l'œil et des mesures de pression artérielle par brassard sur la queue, après deux semaines d'accoutumance. Le projet doit établir le rôle d'une protéine des vaisseaux, ARHGEF18, et renvoie au long terme les retombées annoncées, de nouveaux médicaments contre l'anévrisme intracrânien. Des souriceaux sont tués à six et à quatorze jours de vie pour l'analyse de leur rétine.
Objectifs
La physiologie vasculaire est fortement influencée par la circulation sanguine qui génère des contraintes mécaniques variables sur la paroi des vaisseaux. Les artères sont principalement soumises à un fort flux sanguin générant de fortes contraintes de cisaillement sur les cellules endothéliales tapissant l’intérieur des vaisseaux. Ces contraintes participent à la production de facteurs vaso-actifs et à la quiescence des cellules endothéliales. Une modification de ces contraintes ou une perte de sensibilité des cellules endothéliales impactent la fonction de ces dernières. Aujourd’hui il est reconnu que les contraintes de cisaillements participent à certains processus développementaux et leur modification ou mauvaise perception par les cellules endothéliales contribue à de nombreuses pathologies cardiovasculaires comme l’athérosclérose ou l’anévrisme intracrânien. Mieux comprendre comment les cellules endothéliales perçoivent ces forces contribue, à terme, à l’identification de nouveaux axes de recherche pour prévenir, détecter et traiter les maladies cardiovasculaires. Grâce au travail réalisé in vitro, nous avons identifié une protéine mécano-sensible, ARHGEF18, contrôlant différentes fonctions endothéliales : l’adhésion, la prolifération et l’inflammation. Maintenant que nous avons déterminé la pertinence d’ARHGEF18 in vitro, nous souhaitons comprendre son rôle dans un système intégré plus complexe. Cela nous permettra de valider son impact sur les fonctions identifiées in vitro et d’identifier sa contribution exacte dans la physiologie vasculaire.
Bénéfices attendus
La rupture d'un anévrisme intracrânien, responsable de ~36 000 cas d'hémorragie sous-arachnoïdienne dans la communauté européenne, est l'une des principales causes de mort subite chez les jeunes sujets "sains" (pic d'âge entre 50 et 60 ans) avec un impact socio-économique considérable. Actuellement, il n'existe pas d'outils diagnostiques permettant de prédire le devenir d'un anévrisme intracrânien chez un individu donné, ni de médicaments permettant de limiter ou de prévenir la croissance de l'anévrisme intracrânien et sa progression vers la rupture. Les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l'initiation, de la croissance et de la rupture d'un anévrisme intracrânien sont encore inconnus. Malheureusement, il n'y a que peu de laboratoires travaillant sur la physiopathologie de l'anévrisme intracrânien. Le projet pour lequel cette saisine est déposée contribuera à répondre au besoin urgent d'améliorer la prise en charge des personnes atteintes d'anévrisme intracrânien. En identifiant le rôle d’ARHGEF18 dans la réponse aux forces mécaniques des artères cérébrales, ce projet facilitera la découverte de cibles thérapeutiques pertinentes pour prévenir la progression de la maladie, diminuer le risque de rupture et optimiser l'évaluation du risque pronostique pour prévenir les hémorragies aiguës. Les résultats obtenus pourront donc avoir un impact spécifique à long terme en ouvrant de nouvelles voies pour le développement de nouveaux médicaments. Une des perspectives de ce projet est le développement de nouveaux modulateurs pharmacologiques ciblant ARHGEF18 ou les voies de signalisation associées. Les résultats générés auront également, à long terme, un impact sociétal. De nos jours, la rupture d'anévrisme intracrânien est redoutée parce qu'elle est une cause de mort subite, et parce qu'elle survient sans symptômes cliniques préalables. La plupart des diagnostics sont faits sur la base de découvertes fortuites suite à une IRM. Les patients diagnostiqués savent qu'ils ne disposent d'aucun traitement préventif et non invasif. Par conséquent, ces patients vivent avec un stress permanent. Faciliter le diagnostic et offrir une perspective de traitement pharmacologique à ces patients soulagera leur anxiété et leur détresse.
Procédures
Procédure 1: injection intra-gastrique ou intra-péritonéale chez le nouveau-né: 3 injections sur 3 jours. Chaque injection dure moins d'une minute par animal. Procédure 2: injection intra-péritonéale chez l'adulte: 5 injections/semaine sur 2 semaines (cad 1injection IP/jour/5j/2semaines, à raison d'une minute par injection et par souris). Procédure 3: prélèvement rétro-orbitaire chez l'adulte. Le prélèvement est réalisé une seule fois et ne dure pas plus de 5 minutes. Procédure 4: prise de pression artérielle systolique chez l'adulte (tail cuff). 2 semaines d'acclimatation + 3 mesures définitives. Chaque cycle de mesures dure en moyenne une vintaine de minutes.
Impact sur les animaux
Les procédures liées à ce projet sont réalisées en routine dans le laboratoire par du personnel qualifié. Nous n'attendons pas, à priori, de nuisances particulières. Toutefois, les risques potentiels sont: Injection de tamoxifen: les injections intrapéritoéales répétées (2x5jours) peuvent entrainer une irritation au site d'injection. C'est pourquoi une alternance Droite/Gauche est prévue, pour palier à ce problème. Prélèvement rétro-orbital: une douleur post-prélèvement peut survenir, c'est pourquoi un analgésique local à base de lidocaïne est appliqué après le prélèvement.
Devenir
Procédure 1: Lot 0: mis à mort après la fin d'entrainement Lot 1 : jusqu’à 6 jours de vie pour analyse de la rétine par immunofluorescence Lot 2 : jusqu’à 14 jours de vie pour analyse de la rétine par immunofluorescence Lot 3 : jusqu’à 10 semaines de vie pour prélèvement d'organes (culture cellulaire) Lot 4 : seront utilisés pour la procédure 3 et 4. Procédure 2: Lot 5 : jusqu’à 10 semaines de vie pour prélèvement d'organes (culture cellulaire). Lot 6 : seront utilisés pour la procédure 3 et 4 Procédure 3: Lot 4 et Lot 6 entièrement pour la procédure 4. Procédure 4: Mise à mort des Lots 4 et 6 pour prélèvement d'organes en vue d'analyse histologique.
Remplacement
Réutilisation : Les mêmes animaux serviront pour la prise de pression et le prélèvement sanguin. Il est impossible de réutiliser les animaux des groupes de prise de pression et de prise de sang pour l’isolation des cellules endothéliales car ces animaux seront trop vieux au moment de leur euthanasie et leur cerveau sera utilisé pour des marquages immunofluorescents. Réduction : Le modèle et les techniques seront mis en place par des personnes ayant déjà plusieurs années d’expérience ce qui permettra la réduction du nombre d’animaux utilisés. Aucune étape de mise au point n’est nécessaire pour les procédures décrites. Raffinement : Toutes les procédures seront réalisées avec les analgésiques adéquates dès que nécessaire.
Réduction
Réutilisation : Les mêmes animaux serviront pour la prise de pression et le prélèvement sanguin. Il est impossible de réutiliser les animaux des groupes de prise de pression et de prise de sang pour l’isolation des cellules endothéliales car ces animaux seront trop vieux au moment de leur euthanasie et leur cerveau sera utilisé pour des marquages immunofluorescents. Réduction : Le modèle et les techniques seront mis en place par des personnes ayant déjà plusieurs années d’expérience ce qui permettra la réduction du nombre d’animaux utilisés. Aucune étape de mise au point n’est nécessaire pour les procédures décrites.
Raffinement
Raffinement : Toutes les procédures seront réalisées avec les analgésiques adéquates dès que nécessaire.
Choix des espèces
Le modèle murin est le seul permettant la délétion inductible et tissu-spécifique de la protéine étudiée ainsi que la complexité nécessaire pour l’étude du rôle de la protéine sur le fonctionnement du système cardiovasculaire. Le but de cette saisine est d’établir le rôle d’ARHGEF18 dans le développement vasculaire et son homéostasie. Par conséquent, la recombinaison chez les animaux sera faite à deux stades : post-natal (procédure 1) ou à l’âge adulte (procédure 2). Pour la partie développementale, les animaux seront utilisés à P6 et P14. Pour la partie homéostasie vasculaire qui s’étudie à l’âge adulte, les souris seront utilisées entre 7 et 13 semaines (procédures 3 et 4).
Production de souris humanisées pour le système immunitaire : modèle d’étude pour l’immunobiologie, les pathologies humaines et l’évaluation de traitements.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Une souris qui montre une difficulté respiratoire dans les cinq à dix minutes suivant l'injection hydrodynamique est mise à mort. 3 260 souris profondément immunodéficientes vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : une irradiation, une injection de cellules souches sanguines humaines avant l'âge de neuf jours, l'injection hydrodynamique et jusqu'à huit prises de sang pour mesurer la part de cellules humaines dans leur sang. Le porteur cite parmi les effets une grande sensibilité aux infections, des dermatites et des tumeurs après l'irradiation. Les souris produites sont fournies aux laboratoires utilisateurs de la plateforme, 75 en moyenne par utilisateur et par an, pour être réutilisées dans d'autres projets.
Objectifs
L’étude in vivo de la physiopathologie de nombreux pathogènes humains ainsi que l’analyse de l’activité et de l’innocuité des traitements et vaccins contre ces pathogènes ne peut être réalisé chez l’Homme pour des raisons éthiques. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces pathogènes dans un modèle expérimental, des modèles de souris humanisées pour le système immunitaire (souris HIS) ont été développés au cours des deux dernières décennies. Ces souris HIS sont des modèles in vivo précliniques qui permettent d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…). Dans ce projet, nous proposons de produire des souris HIS qui seront par la suite utilisées par ou en collaboration avec des laboratoires de recherche dans le cadre de leurs projets de recherche sur les pathologies humaines et/ou de développement de nouveaux vaccins ou traitements.
Bénéfices attendus
Ces souris HIS générées dans ce projet permettront d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène de pathogènes humains mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…).
Procédures
- irradiation (1 par animal, durée : quelques minutes) - prélèvement sanguin (1 à 8 par animal, durée : quelques secondes, intervalle 2 à 4 semaines) - injection hydrodynamique (1 par animal, durée 7-8 secondes)
Impact sur les animaux
Immunodéficience : du fait de leur degré d’immunodéficience, ces animaux sont très sensibles aux infections. TSLP : Après irradiation les souris transgéniques pour TSLP peuvent développer avec l’âge des tumeurs d’origine murine. Après humanisation, ces souris peuvent développer des dermatites. L’apparition des signes cliniques est suivie régulièrement et des soins seront apportés en cas d’apparition de symptômes. Irradiation : de potentiels effets néfastes à long terme de l’irradiation, tels que le développement de tumeurs, pourraient apparaitre. Cependant, cette procédure est appliquée depuis de nombreuses années dans le laboratoire et il n’a été constaté des signes cliniques de ces effets néfastes que dans une minorité (5 mois). Injection Hydrodynamique : un risque de dyspnée peut arriver dans les 5-10 minutes après injection. Si une dyspnée est observée la souris sera mise à mort.
Devenir
Les animaux issus de la procédure 1 pourront être inclus dans la procédure 2. Certaines souris issues de la procédure 1 pourront également être incluses, à la demande des utilisateurs de la plateforme, dans d’autres procédures qui seront décrites dans une demande de projet ultérieure. Les souris issues de la procédure 2 pourront également être incluses, à la demande des utilisateurs de la plateforme, dans d’autres procédures qui seront décrites dans une demande de projet.
Remplacement
Les modèles in vitro ne permettent pas d’étudier la réponse du système immunitaire humain dans son ensemble, contre des tumeurs ou des pathogènes à tropisme exclusivement humain ni de prédire l’efficacité et l’innocuité de nouveaux vaccins ou traitements immunomodulateurs contre ces tumeurs ou pathogènes. Historiquement, le modèle de choix pour ces études est le primate non humain, le modèle de souris HIS est un modèle alternatif qui peut permettre de limiter le nombre d’études sur le primate non humain.
Réduction
Nous évaluons notre niveau de production de souris HIS à 380 souris la première année, 570 la deuxième année, 770 chaque année pour les 3 années suivantes, soit un total de 3260 souris sur 5 ans. Ces chiffres ont été calculés en tenant compte 1. du nombre d’opérateurs de la plateforme (facteur limitant la production la première année et qui passera de 2 à 4 FTE entre les années 1 et 3), 2. du nombre d’utilisateurs intéressés par les modèles développés par notre plateforme qui est estimé à 4 la première année, 6 la deuxième année et devrait se stabiliser à 8 par an à partir de la 3ème année. 3. du fait qu’environ 80% des animaux présenteront un niveau d’humanisation >10%, 4. du fait que la plateforme fournira en moyenne 75 souris humanisées par utilisateur et par an (15 pour étude pilote et 30 pour expérience principale, en comptant 1 étude pilote et 2 expériences principales /utilisateur/an).
Raffinement
La planification des expériences en amont et la concertation entre le personnel de la plateforme et les utilisateurs sont des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux. Par ailleurs, lorsque cela sera nécessaire, des études pilotes seront réalisées en amont des études principales. Enfin, l’état clinique (pelage, mouvement, activité, pâleur, signes de bagarres, apparition de tumeurs) des animaux sera suivi deux fois par semaine pour permettre la détection de signes de souffrance. En cas d’apparition de signes de souffrance, un analgésique pourra être administré aux souris. Si les signes de souffrance persistent, une mise à mort sera effectuée pour prévenir toute souffrance inutile.
Choix des espèces
La souris HIS est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale. Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. Les souris HIS sont générées par injection de cellules souches hématopoïétiques humaines CD34+isolées dans des souriceaux nouveau-nés (
Origine de Troubles du Spectre Autistique dans un modèle de rat : étude du métabolome et rôle du microbiote intestinal maternel.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
420 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie étant tuée pour prélever les cerveaux et 66 renvoyés vers l'élevage. Des rattes gestantes reçoivent une injection d'acide valproïque pour induire un modèle d'autisme, subissent une greffe de microbiote fécal et une échographie sous anesthésie, et leur descendance passe quatre tests comportementaux comme le labyrinthe en Y et l'enfouissement de billes. Le porteur indique que le valproïque provoque quelques minutes de pelage hérissé, prostration et flancs creusés, et que les tests génèrent un léger stress. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative pour modéliser les troubles du spectre autistique.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment différents facteurs de l’environnement vont avoir un impact sur le microbiote intestinal maternel, et de mieux comprendre comme la modification de microbiote sera liée à un développement cérébral anormal à l’origine des TSAs.
Bénéfices attendus
Mieux comprendre l'implication du microbiote intestinal maternel dans le développement des troubles du spectre de l'autisme chez le rat.
Procédures
Les rattes gestantes fournissant les fèces pour la greffe de microbiote fécal seront massées chaque jour pour la récolter de leur fèces fraiches (sortie du côlon). Les rattes gestantes ayant reçu une greffe de microbiote fécale ainsi que leurs ratons subiront une anesthésie et l'injection d'un produit de contraste pour échographie. Il y aura 4 tests comportementaux: - labyrinthe en Y : 5 min - scorage des stéréotypies motrices : 10 min - enfouissement de billes : 15 min - interaction sociale directe : 10 min
Impact sur les animaux
L'effet de l'injection de l'acide valproïque induit une légère souffrance. Différents symptômes sont observés pendant quelques minutes (pelage hérissé, prostration, et flancs creusés) et tout redevient normal au bout d'environ 10 min. Les tests comportementaux, de par le changement de l'environnement des ratons, peuvent générer un léger stress chez l'animmal, donc une contrainte pour ces derniers.
Devenir
Procédure 1: tous les animaux sont réutilisés car des prélèvements seront effectués à GD19. Procédure 2: tous les animaux sont réutilisés car ils sont concernés par la procédure 3. Procédure 4: tous les animaux sont réutilisés car ils sont concernés par la procédure 5. Procédure 5: tous les animaux sont réutilisés car des tests comportementaux seront réalisés avec les progénitures Procédure 3: mise à mort des animaux concernés par cette procédure et récupération des cerveaux pour des analyses immunihistochimiques.
Remplacement
Il n'existe pas de méthodes alternatives permettant de modéliser les Troubles du Spectre Autistique.
Réduction
Le nombre d'animaux est réduit au maximum tout en permettant de pouvoir observer des différences à un seuil significatif de 0,1 %.
Raffinement
Tout sera mis en oeuvre pour maximiser le bien-être des animaux pendant le protocole. Les animaux seront en cycle inversé pendant l'ensemble du protocole. Les mères seront en présence d'enrichissement Sizzle Nest, bâton en bois, papier absorbant et maison pour une nidification optimum. Les animaux seront observés 2 fois par jour. Toutes les stratégies d'analgésie et de soin seront mises en oeuvre pour réduire au maximum tout incofort qui pourrait être induit par ce modèle.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les espèces les plus adaptées pour pouvoir mener ces études, la taille de leur cerveau est compatible avec la résolution spatiale des caméras du microTEP. De plus, le modèle de rat exposés à l'acide valproïque pendant la gestation est l'un des plus couramment utilisé et décrit pour étudier les TSA. Dans ce projet, certains prélèvements sont réalisés au 19ème jours de gestation. Ce stade a été choisi pour avoir des échantillons prénataux dans le modèle à un stade permettant d’obtenir les quantités nécessaires notamment pour le liquide amniotique nécessaires aux analyses métabolomiques. Ce stade correspond chez l’homme à la fin du second trimestre de grossesse. D’autres prélèvements sont réalisés à 7 jours de vie postnatale. Ce stade correspond chez l’homme à la fin du dernier trimestre de grossesse. Les TSAs sont considérés comme un groupe d’affections prénatales, d’où l’objectif d’avoir des prélèvements à des stades correspondants au développement prénatal chez l’homme. L’étude comportementale et l’imagerie seront réalisées comme classiquement dans le modèle à l’adolescence.