Biologie du développement
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Une thérapie pharmacologique pour une maladie rénale génétique chez l’embryon de souris
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
35 souris femelles gestantes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue avec leurs embryons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque femelle reçoit quatre gavages en contention vigile pour tester des médicaments sur une maladie rénale génétique, puis est tuée pour prélever les embryons, eux-mêmes tués pour en prélever les reins. Le porteur affirme qu'aucune souffrance n'est attendue et que les composés ont déjà été testés sur cultures cellulaires. Il conclut qu'il est "indispensable" de tester l'effet des composés à la période de développement rénal de l'embryon.
Objectifs
Chez l’homme, la déficience génétique dans un gène qui code pour un facteur de transcription mène à une insuffisance rénale. A l’heure actuelle, pour cette maladie rare il n’y a pas de thérapie en dehors de la transplantation et la dialyse. Les patients qui souffrent de cette maladie génétique ont sont caractérisés par une activité insuffisante de la protéine codé par ce gène. Suite à nos études, nous avons identifié plusieurs médicaments (normalement utilisés pour d’autres pathologies) qui ont la capacité d’augmenter l’activité de ce gène dans des lignées cellulaires in vitro. L’objectif de notre projet de recherche est de vérifier l’efficacité de nos 3 meilleurs composés qui se sont caractérisés par une importante stimulation de l’activité de ce gène pour vérifier si ces médicaments améliorent les défauts rénaux liés à sa déficience dans un modèle murin de la maladie.
Bénéfices attendus
Nous nous attendons de pouvoir mesurer l’effet du traitement de ces médicaments sur le degré d’avancement du développement rénal sure des tissus prélevés. Ces mesures seront effectuées par 1) analyse d’image 2) Quantification du niveau d’expression des ARN messagers codants pour les gènes cibles principales de qui sont normalement réprimés 10 fois dans le rein entier en développement d’un embryons par rapport à un embryon contrôle.
Procédures
Nous allons traiter 35 femelles mères porteuse. Chaque souris sera soumise à 4 procédures de gavage (en état vigile en contention) d'un médicament (ou du placebo). Chaque procedure de gavage va durer moins de 3 minutes.
Impact sur les animaux
En dépit du retard développemental observé avant la naissance, la grande partie des souris muntants dans leurs vies post natale arrivent à développer une fonction rénale normale et par conséquence ne développent pas de souffrances. D’autre part, pour ce qui concerne les médicaments qu'on doit tester, des études récentes ont montré que ces composés, administrés par gavage à ces doses, ne provoquent pas de conséquences visible sur le bienêtre des animaux.
Devenir
Tous les animaux utilisé dans ce protocol seront mis à mort a la fin des procédures. En effet, le prelevement des embryons pendant leur développpemnt nécessite la mise à mort des mères porteuses. Le prelevement des reins embryonnaires pendant leur développpemnt nécessite la mise à mort des embryons.
Remplacement
Remplacement : La complexité du rein et de la maladie rénale nécessite l’utilisation d’un modèle animal. Mais les molécules à l'étude de ce protiocole ont préalablement été testées sur des cultures cellulaires ce qui nous permet d’envisager une gamme d’efficacité sans toxicité pour les animaux.
Réduction
Réduction : nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet.
Raffinement
Comme chez l’homme, les maladies rénales restent longtemps silencieuses et le modèle murin qu'on va adopter ne comporte pas de souffrance spécifiquement liée à la déficience rénale. En tout cas, les animaux seront mis à mort avant l’apparition de symptômes douloureux. Une surveillance quotidienne sera effectuée auprès des animaux afin de s’assurer de leur bien-être constant en se référant à une grille de points limites. Pour compléter cette surveillance les souris seront pesée chaque jour pendant le traitement. Si les souris depassent un niveau de score 1 pour l'évaluation de leur apparence physique ou de leur comportement (comme indiqué dans la description de la procédure expérimentale de l'état du bien-être des souris), on mettra en place l’administration d’un antalgique. En cas de dépassement du point limite, on choisira la mise à mort de l’animal. Les animaux bénéficieront d’un programme d’enrichissement, comme des carrés de cellulose, des bâtonnets de bois ou une maisonnette, défini par la cellule de l’établissement chargée de leur bien-être. Les animaux bénéficieront d’un programme d’enrichissement, comme des carrés de cellulose, des bâtonnets de bois ou une maisonnette, défini par la cellule de l’établissement chargée de leur bien-être.
Choix des espèces
Le developpement rénal chez la souris est un excellent modèle experimentale qui se rapproche à celui de l'homme. Le modèle murin étudié developpe spécifiquement un retard de developpement rénal à 14 jours après conception. Il est donc indispensable tester l'effet de nos composés à cette période.
Efficacité de la Léciréline pour induire l’ovulation chez la jument, et impact sur la survenue d’une gestation à 12 jours
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
40 juments vont être utilisées, puis rendues au troupeau expérimental de l'établissement, dans des procédures déclarées de gravité légère. Chacune subit un suivi gynécologique sur quatre cycles avec échographies transrectales quotidiennes, inséminations, injections d'induction de l'ovulation, collectes d'embryons par lavage utérin et biopsie utérine, pour tester une molécule (léciréline) déclenchant l'ovulation. Le porteur déclare "aucun" impact sur les animaux, alors que les actes répétés touchent l'appareil génital. Le bénéfice annoncé vise la filière d'élevage équin, et le porteur affirme que l'usage de juments de l'espèce de destination est "indispensable".
Objectifs
Tester l'efficacité de la léciréline (molécule analogue de la GNRH) pour l'induction de l'ovulation ainsi que son impact sur la survenue ou non d'une gestation chez la jument. Cette étude se propose de réaliser le suivi gynécologique de 40 juments durant 3 mois (avril, mai, juin), sur 4 ovulations chacunes. Chacune des juments devra subir deux inductions d'ovulation par une injection de Léciréline et deux inductions d'ovulation par une injection de gonadotrophine chorionique humaine (hCG), les ovulations 1 et 3 seront induites sur chaleur délenchée par un traitement lutéolytique (injection de Cloprosténol), tandis que les ovulations 2 et 4 seront induites sur retour en chaleur spontané. On pourra ainsi comparer l'efficacité de la léciréline à celle de la gonadotrophine chorionique humaine sur chaleurs spontanées et sur chaleurs déclenchées par un traitement lutéolytique (cloprosténol) sur 40 juments. Par ailleurs, l'impact de la molécule utilisée pour induire l'ovulation sur le taux de gestation sera évalué grâce à l'exploitation en insémination artificielle (semence fraîche) 24 heures après l'induction d'ovulation des deux cycles spontanés de chaque jument. Suite à des collectes d'embryons à 12 jours post ovulation, les effets de l'âge et de la parité de la jument sur l'embryon seront aussi déterminés.
Bénéfices attendus
Offrir à la filière élevage équin des données d'inocuité et d'efficacité d'une molécule légalement utilisable chez la jument pour l'induction de l'ovulation, selon le principe de la cascade. Améliorer les connaissances liées aux effets du vieillissement de la jument sur l'embryon
Procédures
- échographie ovarienne et utérine par voie transrectale (2 minutes par examen, examen quotidien à biquotidien du début des chaleurs au constat d'ovulation) - insémination artificielle par voie transcervicale (1 minute, 2 fois par jument) - injection intraveineuse d'induction de l'ovulation (5 secondes, 4 fois par jument) - injection intramusculaire de cloprosténol (3 secondes, 2 fois par jument) - collecte d'embryon par lavage utérin par voie transcervicale (15 minutes, 2 fois maximum) - prise de sang (10 secondes, 1 par collecte, 2 fois maximum) - biopsie utérine (5 minutes, 1 fois par jument ayant donné un embryon) - Lavage utérin pour réalisation de cytologies (en même temps que la collecte d'embryon pour les juments avec un diagnostic de gestation positif à 12 jours et 15 minutes, maximum 2 fois par jument pour celles n'ayant pas donné d'embryon).
Impact sur les animaux
Aucun
Devenir
Retour au sein du troupeau expérimental de l'établissement utilisateur
Remplacement
L'objectif étant de valider l'inocuité et l'efficacité de la léciréline chez la jument, cet essai clinique impose l'utilisation d'individus vivants de l'espèce de destination (cheval).
Réduction
Exploitation de 4 cycles oestraux sur chaque jument afin de réduire le nombre d'animaux impliqués. Chaque jument sera son propre témoin. Afin de réduire l'utilisation des animaux, une collecte d'embryon sera effectuée au cycle 2 et 4 si un diagnostic de gestation positif est obtenu à J12. Des tests statistiques unilatéraux seront utilisés pour tester l'hypothèse de non-infériorité clinique de la léciréline par rapport au traitement de référence (hCG) sur la survenue de l'ovulation et de la gestation. Après la vérification de la normalité des données, des modèles linéaires à effets mixtes seront effectués à l’aide du logiciel Rstudio pour analyser l’effet de l’âge et de la parité. Si les données ne sont pas normales, des tests de permutations seront effectués pour corriger la p-value.
Raffinement
Les juments utilisées pour ce protocole sont des animaux parfaitement habitués aux examens et manipulations qui leur seront imposés dans le cadre de notre étude (examen gynécologique, insémination artificielle, collecte d'embryon par lavage utérin, injection intramusculaire, injection intraveineuse, prise de sang). Elles resteront dans leur environnement habituel (en groupe) où elles seront manipulées par leurs soigneurs habituels. Les actes de suivi gynécologique seront exclusivement réalisés par un vétérinaire équin expérimenté en suivi de reproduction de la jument. Les actes d'insémination artificielle, de collecte d'embryon, de lavage utérin, de biopsie, d'injections intraveineuse et intramusculaire et de prise de sang seront exclusivement réalisés par des manipulateurs habilités (inséminateurs équins, chefs de centre ou vétérinaire).
Choix des espèces
Il s'agit d'un essai clinique chez la jument d'un médicament vétérinaire disposant d'une autorisation de mise sur le marché pour cette même indication chez la lapine et la vache. L'utilisation d'animaux femelles à maturité sexuelle, de l'espèce de destination est indispensable.
Recherche d’un traitement pour une maladie neurologique rare MCOPS12.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
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360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Porteuses ou non d'une mutation liée à une maladie neurologique rare, elles reçoivent quatre traitements par injection, gavage ou alimentation, suivis de tests comportementaux répétés, avant d'être tuées par dislocation cervicale ou perfusion intracardiaque. Le porteur affirme que le modèle murin "n'est pas remplaçable" et que la mutation "n'engendre aucune souffrance". Les doses testées sont décrites comme faibles, très en deçà de la dose létale.
Objectifs
Des mutations ponctuelles du recepteur à l’acide rétinoique beta (Rarb) sont à l’origine d’une maladie neurologique rare responsable de symptomes cognitifs et moteurs importants et progressifs. En effet, cette pathologie possède un caractère neurodeveloppemental ainsi qu’un caractère neurodégénératif (perte progressive de mobilité, perte de la coordination des membres), avec un pronostique vital ne dépassant pas l’adolescence. Des modèles murins de cette pathologie ont été générés et nous permettront d’étudier les mécanismes associés à ces mutations ponctuelles. Les souris mutantes présentent des symptomes moteurs similaires à ceux observés chez les souris porteuses d’une mutation invalidant complètement l’activité du récepteur. Nos études antérieures ont permis d’identifier le rôle du récepteur dans le dévelopement et dans l’homéostasie de striatum, la structure cérébrale impliquée dans le contrôle moteur et la cognition. Nous avons montré que pendant le développement embryonnaire RARb contrôle le développement d’une sous-population de neurones dans le striatum exprimant le récepteur à la dopamine 1 (Drd1+), alors que à l’âge adulte nous avons identifié son rôle dans la neuroprotection d’une sous population de neurones exprimant le récepteur à la dopamine 2 (Drd2+). Notre premier objectif est de normaliser les symptomes moteurs et cognitifs en modulant la signalisation dopaminergique de deux manières : - Par l’augmentation simultanée de l’activité de la signalisation par les neurones Drd1+ et Drd2+, à la suite de l’administration du traitement L-DOPA, un précuseur de la dopamine, utilisé pour le traitement de la maladie de Parkinson. - Par l’augmentation de l’activité dopaminergique liée aux neurones Drd2+ par l’administration de pramipexol. Notre deuxième objectif est d’utiliser des traitements précoces, déjà utilisés dans la maladie de Parkinson, afin de prévenir l’apparition des symptomes : - L’utilisation de la molécule cGP connue pour son implication dans le neurodégénrescence lorsque qu’elle est dérégulée. C’est un traitement qui est déjà utilisé dans la maladie de Parkinson pour favoriser la survie neuronale. - L’utilisation de rétinyl acetate permettra quant à elle la normalisation de la voie de l’acide rétinoïque qui est extrêmement importante pour le développments et les fonctions striatales.
Bénéfices attendus
Pour chacun des quatre traitements (pramipexol, L-DOPA, cGP et rétinyl acetate), nous testerons des doses faibles afin de normaliser la signalisation dopaminergique dans le striatum ou de prévenir l’apparition des premiers symptomes liés à la neurodégénérescence. Dans ce but, le pramipexol sera injecté (et comparé à des injections de salin (véhicule), qui permettra de contrôler les effets de l’injection) à une dose très faible de 0.2 mg/kg et à une dose faible de 2 mg/kg avant des tests comportementaux (5 differents). Ces traitements seront réalisés sur le même lot d’animaux à 1 semaine d’écart afin d’étudier l’effet dose réponse du traitement. En résumé, la procédure se déroulera comme suit : J 1 : Injection n°1 (0.2mg/kg) suivie des tests 1 (30min) et 2 (3 x 5min) J 4 : Injection n°2 (0.2mg/kg) suivie du test 3 (32h) J 7 : Injection n°3 (0.2mg/kg) suivie du test 4 (30min) J 9 : Injection n°4 (0.2mg/kg) suivie du test 5 (30min) Une semaine de battement entre les injections J 17 : Injection n°1 (2mg/kg) suivie des tests 1 (30min) et 2 (3 x 5min) J 20 : Injection n°2 (2mg/kg) suivie du test 3 (32h) J 23 : Injection n°3 (2mg/kg) suivie du test 4 (30min) J 26 : Injection n°4 (2mg/kg) suivie du test 5 (30min) Toutes les injections seront effectuées avec des aiguilles fines. Les molécules sont injectées à des doses pharmacologiques faibles. Ce dosage est couramment utilisé dans les tests comportementaux chez les souris sans poser de problème. Il est d'ailleurs très largement en deça à la dose létale murine de 168,8mg/kg par injection intra-veineuse. L’administration de L-DOPA se fera par gavage des animaux à une dose de 10mg/kg, qui se fera avant chaque test comportemental. Ces tests seront réalisés de la même manière et dans le même ordre que pour le pramipexol. Le traitement cGP se fera par l’eau des biberons à une dose de 3mg/kg pendant 8 semaines dès la deuxième semaine de vie des animaux. Le traitement se fera donc par l’intermédiaire des mamans qui allèteront les jeunes souris. A la suite du traitement, les cinq différents tests comportementaux se feront dans le même ordre et de la même manière que décrit pour les traitements au L-DOPA. Enfin, le traitement au rétinyl acetate se fera grâce à une supplémentation de la nourriture avec du rétinyl acetate (1.8mg/kg). Ce traitement sera effectué pendant 8 semaines dès la deuxième semaine de vie des animaux et sera suivi des mêmes tests comportementaux indiqués pour lestraitements au L-DOPA.
Procédures
Tous les traitements notifiés ci-dessous se feront sur 3 groupes distincts d’animaux porteurs, ou non, d’une mutation agés de 15 à 30 semaines pour les traitements au pramipexol et L-DOPA et agés de 6 à 10 semaines pour les traitements au cGP et rétinyl acetate. Dans un premier temps, un traitement au pramipexol (5 secondes par traitement, 12 animaux traités/groupe à 0.2 et 2 mg/kg) et d’un traitement contrôle (6 animaux traités au véhicule/groupe), soit un total de 54 mâles et 54 femelles = 108 animaux au total. Ce traitement sera suivi d’un test comportemental et sera réitéré avant chaque nouveau test comportemental (test 1 = 30min; test 2 = 3 x 5min; test 3 = 32h; test 4 = 30min; test 5 = 30min). Les tests comportementaux 1 et 2 feront suite à la même injection. Les souris changeront de groupe pramipexole-véhicule à chaque test selon un roulement et recevront donc au maximum 8 injections, dont 6 maximum de pramipexol. Dans un deuxième temps, un traitement au L-DOPA (15 secondes par traitement), admisnistré par gavage, (12 animaux traités/groupe) et d’un traitement avec de la solution saline (6 animaux traités au véhicule/groupe), soit un total de 54 mâles et 54 femelles = 108 animaux au total. Ce traitement sera suivi d’un test comportemental et sera réitéré avant chaque nouveau test comportemental (voir ci-dessus). Les souris changeront de groupe L-DOPA-véhicule à chaque test selon un roulement et recevront donc au maximum 4 traitements, dont 3 maximum de L-DOPA. Dans un troisème temps, un traitement au cGP administré dans l’eau des biberons pendant 6 à 10 semaines dès la deuxième semaine de vie des animaux (12 animaux traités/groupe) soit un total de 36 mâles et 36 femelles = 72 animaux. Ce traitement sera suivi par 5 tests comportementaux visant à évaluer la motricité et la cognition des animaux traités (identiques aux autres traitements). Dans un quatrième temps, un traitement au rétinyl acetate administré par l’intermédiaire de la nourriture pendant 6 à 10 semaines dès la deuxième semaine de vie des animaux (12 animaux traités/groupe) soit un total de 36 mâles et 36 femelles = 72 animaux. Ce traitement sera suivi par 5 tests comportementaux (identiques aux autres traitements). La moitié des animaux de chacun des quatre traitements = 180 animaux, sera ensuite euthanasiée par perfusion intracardiaque après anesthésie générale. Une vérification de la perte des reflexes au niveau des membres et palpébral est réalisée avant tout acte chirurgical.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables ne dépasseront pas la douleur occasionnée par l’introduction d’une aiguille dans l’abdomen de l’animal. En effet, les tests comportementaux moteurs effectués avant et après les traitements ne sont pas sujet à causer de la souffrance. Une légère modification de l’activité motrice et cognitive est à prévoir après les traitements, sans toutefois causer d’effets indésirables. Ces effets légers seront perceptibles jusqu’à deux heures après le traitement. De plus, la mutation n’engendre aucune souffrance chez les animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort de deux manières différentes : d’une part par dislocation cervicale qui permettent de prélever tous les organes nécéssaires pour les analyses moléculaires. D’autre part, une mise à mort par perfusion intracardiaque sera effectuée pour la réalisation de marquages immuno-histochimiques qui nécéssitent une fixation complète et homogène de l’échantillon prélévé, permise par le PFA4% administré de manière sistémique par voie intracardiaque.
Remplacement
Le modèle murin N’EST PAS REMPLAÇABLE et reste indispensable afin d’évaluer l’impact des mécanismes biologiques sur le comportement moteur ainsi que pour étudier les réseaux neuronaux dans leur ensemble. En effet, la complexité biologique des signalisations dopaminergique et rétinoïdiennes ne permet par de remplacer les animaux par des modèles mathématiques ou in vitro, parce qu’il ne reflettent pas la diversité des mécanismes biologiques observés in vivo.
Réduction
Afin de REDUIRE au maximum le nombre d’animaux utilisés : le nombre d'animaux utilisé (groupe de 12) correspond au nombre minimal d'animaux à inclure pour obtenir des données statistiquement exploitables selon les impératifs de réduction. Ces effectifs ont été déterminés d'après les données de la littérature et les procédures en vigueur à l'animalerie. Nous nous sommes basés sur des données obtenues chez des souris à la suite du test qui est le moins discriminant parmis les tests effectués ici, ainsi que sur des données comportementales obtenues à la suite d’injection de composés pharmacologiques provenant d’autres laboratoires. Une différence significative entre les groupes (de même sexe) sera recherchée par application d’un test statistique cohérent avec les analyses effectuées. De plus, les animaux traités avec le vehicule (contrôle de l’effet des traitements pramipexol et L-DOPA) seront reparti dans deux groupes de 6 animaux (et pas 12 comme pour les autres groupes). En effet la méthode de traitement ne devrait pas modifier le comportement de l’animal, ce qui permettra de regrouper les deux sous groupes lors des analyses.
Raffinement
En vue de RAFFINER les procédures, les animaux sont hébergés dans des conditions optimales et ils font l’objet d’un suivi adapté et de soins vétérinaires au besoin. Les expériences réalisées ici ne sont pas douloureuses. Elles consistent uniquement en des études comportementales, effectuées avec ou sans injection préalable de composés pharmacologiques. Les molécules pharmacologiques sont utilisées à des doses faibles permettant simplement de révéler des dysfonctionnements ou de limiter/supprimer le phénotype. Des plus, les points d’injections de promipexol seront alternés entre les côtés gauche et droit de l’abdomen de l’animal. Ils seront attentivement surveillés pendant les heures suivant l’injection afin d’éviter toute infection.
Choix des espèces
Pour étudier le rôle de les mutations du gène RARb (identifiée chez l’homme) dans la mise en place et la progression de la maladie MCOPS12, les performances comportementales et les fonctions du système dopaminergique, la souris est un modèle optimal du fait de la similitude des génomes murin et humain et de la disponibilité de différentes lignées porteuses de mutations géniques ciblées permettant de couvrir l’ensemble des processus physiopathologiques : neurodégénérescence et neurodéveloppement. Pour les tests programmés nous utiliserons dans la plupart des cas des animaux adultes d’entre 15 et 30 semaines afin d’oberver les changements de comportements des animaux à la suite des traitements et de diminuer l’hétérogénéité des résultats qui pourraient être apporté par l’augmentation de l’âge des souris. Pour les tests au cGP et au rétinyl acetate, les animaux seront testés entre 6 à 10 semaines pour évaluer l’effet des traitements directement après l’arret de ces derniers.
Impact du stress prenatal sur le développement des troubles anxieux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
371 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de l'anesthésie sans réveil à modéré. Des femelles gestantes sont soumises à un stress répété, trois séances de 45 minutes par jour pendant sept jours, pour induire chez leurs descendants un phénotype anxieux étudié par des tests comportementaux d'exploration. Le porteur indique ne pas pouvoir limiter ce stress puisqu'il est "le but recherché", et que tous les animaux sont ensuite tués pour analyser leur cerveau. Il décrit le modèle rongeur comme "incontournable", les bénéfices pour l'humain étant renvoyés au long terme.
Objectifs
Le projet a pour but d'étudier l'émergence des troubles anxieux dans un modèle de stress précoce. Nous avons précédemment montré que les souris soumises à un stress développemental in utero (stress prénatal) présentent à l'âge adulte de nombreux troubles comportementaux caractérisés notamment par un phénotype de type anxieux. Sur la base de ces résultats, notre objectif est de déterminer à quel moment du développement ces troubles se mettent en place et d'en étudier les substrats neuroanatomiques. En particulier, nous nous interessons aux neurones granulaires du gyrus denté dont nous avons montré par ailleurs qu'ils étaient impliqués dans les troubles anxieux. Nous testerons donc l'hypothèse que le stress prénatal modifie la genèse ou l'activité des ces neurones, et que ces modifications sont associées à une augmentation de l'anxiété.
Bénéfices attendus
Ces expériences fourniront des informations uniques sur l'émergence des troubles anxieux et sur les processus neuronaux impliqués. Elles permettront à moyen terme d'identifier des marqueurs biologiques précoces prédictifs d'une vulnérabilité comportementale ultérieure. La transposition à l'humain, à plus long terme, permettra la prise en charge des individus à risque.
Procédures
Trois groupes d'animaux sont à considérer: le premier est constitué de femelles dont le niveau d'anxiété sera évalué par deux tests comportementaux d'une durée de 10 min et 5 min, respectivement à 2 jours d'intervalle (n=173) et dont une partie sera soumise à un stress comportemental léger durant la gestation (n= 40 souris; stress divisé en 3 sessions quotidiennes de 45 min pendant 7 jours); le deuxième est constitué de leurs descendants qui seront soumis à des tests comportementaux basés sur l'exploration spontanée avant étude des structures cérébrales impliquées (n=168 souris: un lot subit 3 tests comportementaux de 10 min maximum à raison d'un test par jour pendant 3 jours et le deuxième lot subit 1 test de 10 min); le troisième est constitué des descendants servant de population témoin puisqu'ils ne subissent aucun test comportemental (n=60). Pour analyser les structures cérébrales, tous les descendants (groupe 2 et 3) subiront au jour postnatal P1 une injection intrapéritonéale d'un marqueur de division cellulaire.
Impact sur les animaux
Les femelles gestantes sont soumises à des stress répétés qui vont générer un état de léger stress chronique. Il ne nous est pas possible de limiter ce stress ou de compenser cet état puisqu'il est le but recherché, et qu'il a pour objectif de mimer la situation observée chez l'humain (le modèle a été établi pour comprendre les mécanismes impliqués dans les troubles comportementaux observés dans la population humaine soumise à des situations environnementales délétères durant la vie intra utérine). Les tests comportementaux qui seront effectués sur les descendants sont quant à eux non invasifs et basés sur le comportement exploratoire naturel de la souris. Nous n'attendons pas d'effet indésirable de leur mise en oeuvre.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis mort à l'issue des procédures pour une étude de l'impact du stress sur les structures cérébrales.
Remplacement
Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation de souris de laboratoire. Ce recours à l’animal peut se justifier pour plusieurs raisons : 1) les troubles anxieux que nous analysons sont des troubles du comportement; à ce titre, ils nécessitent une approche intégrée prenant en compte l'ensemble de l'organisme et ils ne peuvent pas être récapitulés sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire; 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux.
Réduction
Nous avons travaillé sur la réduction du nombre d'animaux sur 2 plans: 1) lorsque cela est possible (pas d'impact attendu sur les résultats obtenus), les souris seront utilisées dans plusieurs tests comportementaux afin de réduire le nombre total d'animaux nécessaires; 2) Un effectif de 14 souris par groupe représente un compromis rationnel, compte tenu de l’exigence éthique de réduction du nombre d’animaux et des contraintes expérimentales propres au projet. En effet, pour que nos expériences soient concluantes au plan statistique, compte tenu de la variabilité comportementale attendue chez les souris, il faut obtenir un effectif final minimum de 12 individus. Etant donné que le pourcentage de perte liée aux aléas expérimentaux est estimé à 20% en fin d’expérience, il nous faut démarrer l’expérience avec un groupe de 14 souris.
Raffinement
Dès leur arrivée les souris sont hébergées en cages transparentes munies d’enrichissement (carrés de coton et de cellulose permettant l'élaboration d'un nid et tunnels). Durant les sessions de stress, les souris sont observées et manipulées 3 fois par jour et pesées tous les 2 jours. Hors périodes de stress les femelles et leurs descendants sont observés quotidiennement par le personnel zootechnique (motricité et réactivité, aspect du pelage) et une pesée hebdomadaire est réalisée. Dans tous les cas, dès qu’un animal présent un signe de mal-être (pour les adultes: poil hérissé, prostration, plaie , perte de poids de plus de 15% par rapport à la pesée précédente; pour les jeunes: absence de poche de lait, corpulence anormale par rapport à la portée, couleur des muqueuses anormale, comportement aggressif de la mère), il sera isolé.
Choix des espèces
Le modèle d’étude employé doit permettre de reproduire un système biologique fonctionnel et complexe, dont les mécanismes ontogénétiques sont comparables à ceux qui régissent le développement des mêmes fonctions chez l’humain. Dans ce cadre, le modèle rongeur constitue un outil incontournable. Nous avons opté pour l'utilisation de souris dans un souci d'homogénéité de l'ensemble de nos expériences, ce qui permet une réduction du nombre d'animaux utilisés. Le but du projet étant d'étudier l'émergence des troubles anxieux au cours du développement, les souris seront étudiées à 3 stades de développement: période juvénile (entre 3 et 4 semaines) , période adolescente (entre 6 et 7 semaines), et âge adulte (entre 12 et 13 semaines).
Production d’embryons ovins porteurs d’anomalies génétiques
- Recherche appliquée
- Maladies animales
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- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
30 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Leur cycle est synchronisé par éponge vaginale et injections hormonales, puis elles sont inséminées et tuées huit jours après pour prélever leur utérus et récupérer les embryons, afin d'étudier trois mutations récessives qui réduisent la fertilité des élevages ovins laitiers. Le porteur présente les bénéfices d'abord comme "technico-économiques", limitant les pertes liées à la baisse de fertilité, puis évoque la santé des animaux. Il affirme qu'aucune alternative n'existe et que l'espèce ovine est étudiée pour elle-même.
Objectifs
La ségrégation de mutations récessives de l'ADN dans les populations d’élevages en sélection peut conduire à des anomalies génétiques lorsqu’elles se retrouvent à l’état homozygote (2 copies mutées) chez un individu. Ces anomalies peuvent être bégnines, affectant la couleur du pelage, la taille, ou l’absence de cornes par exemple, d’autres sont délétères. Ces mutations délétères peuvent affecter la survie de l’embryon au cours du développement précoce et/ou induire des avortements au cours de la gestation, impactant négativement les résultats de fertilité. Elles peuvent également donner lieu à de la mortalité des jeunes animaux (en périnatal ou avant le sevrage). Elles peuvent encore créer des altérations morphologiques handicapantes, ou de multiples syndromes affectant la santé et le bien-être. Il y a donc un enjeu socio-économique pour les filières d'élevage dans la découverte et le contrôle de la diffusion de ces mutations dans les populations en sélection de façon à limiter la procréation d’animaux homozygotes et ainsi limiter l'impact négatif sur la santé et le bien-être. Une étude préliminaire de génétique chez des ovins laitiers a permis de mettre en évidence trois de ces mutations nommées « m1 à m3 » qui affectent trois gènes importants pour le métabolisme et la multiplication cellulaire. Les données populationnelles chez ces moutons indiquent une fertilité réduite (baisse de réussite à l’insémination animale) lorsque deux animaux porteurs supposés de ces mutations sont accouplés, laissant penser à une action délétère de ces mutations sur le développement embryonnaire précoce. L’objectif de ce projet expérimental est d’étudier l’effet des mutations « m1 », « m2 » et « m3 » à l’état homozygote (m/m) chez le mouton pour expliquer le défaut de fertilité dans l’accouplement d’animaux hétérozygote m/+. Ainsi, la réalisation d’accouplements orientés entre individus porteurs hétérozygotes (m/+) pour ces mutations est une étape essentielle pour produire des embryons homozygotes m/m et établir si la période du développement embryonnaire précoce est affectée. Avec un déterminisme supposé récessif (les deux copies du même gène doivent être mutées pour observer un effet), il y a une chance sur quatre qu’un tel accouplement génère un embryon homozygote (m/m) atteint d’une anomalie.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de pouvoir objectiver le/les phénotype(s) affecté(s) par des mutations récessives supposées délétères découvertes chez les ovins laitiers. Les bénéfices attendus sont multiples. D’un point de vue scientifique et cognitif, la réalisation de ce projet permettra d’apporter à court terme des connaissances de biologie fondamentale sur le rôle et le fonctionnement des gènes touchés par les mutations « m1 », « m2 » et « m3 » dans le développement des embryons de mammifères. D’un point de vue appliqué, ce projet bénéficie du soutien de l’interprofession en génétique pour l’élevage ovin. Par une gestion adaptée des reproducteurs porteurs de ces mutations, les bénéfices attendus à moyen terme sont d’ordre technico-économique d’une part pour limiter les pertes économiques dues à la baisse de fertilité engendrée (entretien de brebis vides, coûts vétérinaires pour avortements, manque à gagner pour la production laitière et la vente d’agneaux) et d’autre part pour améliorer la santé et le bien-être des animaux (baisse de la mortinatalité et de l’apparition d’anomalies génétiques handicapantes directement imputables à ces mutations).
Procédures
Pour réaliser les inséminations animales chez la brebis en vue de la production d’embryons après une stimulation ovarienne, nous devons préalablement synchroniser le cycle reproductif de chaque brebis par l’introduction intravaginale (J0) d’une éponge imprégnée d’une hormone progestagène (une pose d'éponge dure 2min) que l'on retire 14 jours plus tard (J14, le retrait prend quelques secondes). La stimulation ovarienne est réalisée par l’injection intramusculaire d'hormones gonadotropes en 6 doses décroissantes, avec 12h d’intervalle entre chaque injection et sur 3 jours (entre J12 et J14, chaque injection dure quelques secondes). Puis, l'insémination par dépôt intra-vaginal de la semence est réalisée 55h après retrait de l’éponge (J16, l'insémination dure 2 minutes). Huit jours après l’IA (J24), les brebis ainsi inséminées seront euthanasiées pour le prélèvement post-mortem des utérus et la collecte et l'analyse des embryons présents dans les cornes utérines (l'injection létale dure quelques secondes).
Impact sur les animaux
Cette procédure (sans euthanasie) est classiquement utilisée pour produire des embryons en centre d’élevage agrée des entreprises de sélection ovine et n’induit pas d’effets indésirables récurrents connus. Néanmoins, la procédure nécessitera plusieurs contentions des brebis (pose de l’éponge, intravaginale, injections intramusculaires, insémination) qui peuvent générer du stress durant les quelques minutes (5 min maximum) que durent les contentions.
Devenir
La procédure expérimentale pour produire des embryons est de classe légère. Cependant, le projet scientifique dans lequel s'inscrit cette procédure expérimentale nécessite la récupération des embryons produits pour analyse génétique. Pour cela, les 30 brebis seront euthanasiées 8 jours après la dernière intervention de la procédure (insémination animale) pour la collecte post-mortem des utérus contenant les embryons.
Remplacement
La réalisation et le suivi d’accouplements orientés pour produire des embryons ovins du génotype désiré ne peuvent se faire que par l’utilisation d’animaux vivants. Aucune alternative existe.
Réduction
Nous souhaitons obtenir une vingtaine d’embryons homozygotes mutés pour chaque mutation. Le projet utilisera 30 brebis (10 brebis par mutation, 3 mutations étudiées) identifiées comme porteuses d’une de ces mutations récessives délétères pour obtenir le nombre d’embryon souhaité. Cette estimation prend en compte l’efficacité du traitement de superovulation (12 ovulations/brebis en moyenne), le taux de fécondation après insémination (80%) et le taux de récupération des embryons (85%). Ainsi, la réalisation d’accouplements à risque de 30 brebis permettra d’obtenir environ 240 embryons (=30*12*0,8*0,85). Parmi ces 240 embryons, un quart devrait être homozygote, soit une soixantaine. De ce fait, ce projet permettra d’obtenir environ 20 embryons homozygotes par mutation étudiée permettant l'observation d'une altération du développement embryonnaire précoce par comparaison aux 20 autres embryons non porteurs de la mutation (observation d'un écart de 5 embryons au stade blastocyste entre les deux groupes, avec une puissance de 88%). Sans l’utilisation de biotechnologies de la reproduction (stimulation ovarienne, insémination animale), le nombre de brebis nécessaire serait de 210 pour obtenir 240 embryons (1,5 ovulation/brebis en moyenne, 90% de fertilité en monte naturelle, 85% de récupération des embryons) avec la gestion d’au moins 5 béliers en 2 lots de lutte.
Raffinement
Les poses d’éponges intra-vaginales, injections intramusculaires et inséminations seront réalisées par du personnel animalier expérimenté et formé pour ce type de gestes. Grâce au suivi journalier, toute suspicion d’impact négatif sur la santé et le bien-être des animaux sera pris en compte par un traitement médicamenteux vétérinaire adaptée. Ce projet sera réalisé en condition d’élevage des ovins offrant une litière paillée, un accès à l'eau et à la nourriture sans restriction, et respectant le comportement grégaire de cette espèce.
Choix des espèces
Les mutations identifiées ne sont présentes que chez les ovins. Les conséquences technico-économiques des pertes embryonnaires affectant la fertilité ne concernent que l'espèce ovine. L'espèce ovine est donc étudiée pour elle-même. Pour réaliser les accouplements nécessaires, les brebis seront adultes et cyclées, aptes à la reproduction (2 à 7 ans).
Etude par manipulation génétique des plexus choroïdes et de leur fonction sur le cerveau
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
4 790 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des vecteurs viraux sont injectés dans leur cerveau par stéréotaxie, sur des embryons via une laparotomie de la mère, sur des nouveau-nés ou sur des adultes, avant des tests comportementaux non précisés puis la mise à mort par exsanguination. Le porteur indique que les chirurgies peuvent provoquer une douleur modérée et que les nouveau-nés atteignant un point limite sont mis à mort par décapitation avant quinze jours. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne rend compte de la complexité du tissu et que l'étude ne peut être menée qu'in vivo.
Objectifs
Depuis la découverte de la barrière hémato-encéphalique par Paul Erhlich à la fin du XIXe siècle, le cerveau a été considéré comme virtuellement séparé des autres organes et de la circulation sanguine. Pourtant, cette dernière décennie a vu l'émergence du concept selon lequel la fonction cérébrale est façonnée par divers facteurs biologiques, tels que le microbiote intestinal, les cellules et signaux immunitaires systémiques ou encore le cycle jour/nuit. Parallèlement, les zones barrières du cerveau, comme les méninges et les plexus choroïdes, ont été identifiées comme des interfaces de dialogue croisé actif entre la périphérie et le cerveau, plutôt que comme des tissus barrières inertes. Les plexus choroïdes constituent la barrière sang-fluide céphalorachidien, l'une des frontières séparant le cerveau de la périphérie. Ils sont situés dans chacun des quatre ventricules du cerveau et sont adjacents à des zones impliquées dans la neurogenèse. D'un point de vue structurel, les plexus choroïdes sont composés d'un réseau de capillaires sanguins fenêtrés entourés d'une monocouche de cellules épithéliales et peuplés entre les deux par une grande variété de cellules immunitaires. Les principaux rôles physiologiques des plexus choroïdes sont la production de liquide céphalorachidien, qui débarrasse le cerveau des déchets métaboliques et des agrégats de protéines, ainsi que la production et le passage contrôlé du sang au cerveau de diverses molécules de signalisation, notamment des hormones et des facteurs neurotrophiques. Les molécules sécrétées par les plexus choroïdes façonnent l'activité du cerveau, par exemple en modulant la neurogenèse et la fonction des cellules immunitaires microgliales localisées dans le cerveau, ce qui rend les plexus choroïdes cruciaux pour l'homéostasie du cerveau. Des travaux antérieurs et d’autres travaux préliminaires ont montré que le niveau d’expression de certains gènes exprimés par l’épithélium des plexus choroïdes varient en fonction de l’âge et notamment au cours du vieillissement, et en réponse aux variations environnementales telles que celles du microbiote et du cycle circadien. Notre but est de mieux comprendre comment ces facteurs influent sur la biologie des plexus choroïdes et la fonction du cerveau.
Bénéfices attendus
Cette analyse permettra l’identification des facteurs produits par les plexus choroïdes et potentiellement impliqués dans la modulation de l’activité neuronale en fonction de l’âge, depuis la naissance et au cours du vieillissement, en fonction des facteurs environnementaux que représentent les variations de la composition du microbiote et celles du cycle circadien. Cette étude devrait permettre une meilleure compréhension de la biologie de cette interface barrière que constitue les plexus choroïdes et qui reste encore très peu étudiée et d’identifier de nouveaux mécanismes via lesquels les plexus choroïdes modulent la fonction du cerveau. A terme, ce projet pourrait permettre la mise au point d’immunothérapie afin de mieux lutter notamment contre les maladies dégénératives associées au vieillissement.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie : - soit une laparotomie sur femelle gestante (durée de la procédure : 45 min à 1h), - soit une injection de vecteurs viraux dans le cerveau par stéréotaxie (durée de la procédure : incluse dans la durée de la laparotomie quand réalisée sur embryons, 5 à 10 min sur nouveau-nés, 30 min à 1h sur adulte). 12 jours (dans le cas des nouveau-nés injectés à la période embryonnaire) à 12 semaines (adultes) après chirurgie, les animaux seront mis à mort par exsanguination sous anesthésie générale et analgésie. Les animaux adultes auront été avant mise à mort (4 à 8 semaines après chirurgie) impliqués dans des tests de comportement non invasifs.
Impact sur les animaux
Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et sur tapis chauffant sur lesquels ils seront maintenus pendant leur réveil. Les chirurgies sur adultes peuvent entraîner une douleur modérée au cours de la cicatrisation qui sera prévenue par une injection de buprénorphine, 30 min avant chirurgie, 6h après, puis toutes les 12h pendant 48h en cas de douleur. De la lidocaïne sera appliquée sur les zones à inciser. De l’acétaminophène sera également ajouté après chirurgie dans l’eau de boisson pendant la cicatrisation soit 2-3 jours pour une stéréotaxie et 4-5 jours pour une laparotomie. Les signes de douleur plus importante qui pourraient provenir de complications seront surveillés en observant les signes suivants : prostration, altération de la qualité́ du poil (hirsute, terne) ou apathie. Si l’animal présente deux de ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les chirurgies sur embryons seront indirectement surveillées via le suivi des femelles gestantes : toute perte de sang vaginale qui pourrait attester de la mort d’un ou plusieurs embryon(s) sera surveillée et nous appliquerons les points limites définis précédemment. Les stéréotaxies sur nouveau-nés pourront entrainer une douleur légère qui sera prévenue par application de lidocaïne au niveau du site d’injection. Après chirurgie, l’acceptation des nouveau-nés par leur mère sera surveillée au travers des signes suivants synonymes d’abandon : isolement du reste de la portée, bleuissement de la peau associé à une hypothermie et absence visible de lait dans l’estomac. Si le nouveau-né présente ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les animaux en élevage et ceux qui auront récupérés de leur chirurgie seront régulièrement surveillés et nous suivrons les signes et points limites précédemment définis. Nous éviterons que les animaux soient isolés dans leur cage et nous ajouterons un abri dans la cage des portées, femelles gestantes et géniteurs en plus du papier/coton présent dans toutes les cages. La procédure 2 s’achève par l’injection par voie-intrapéritonéale de l’anesthésique et analgésique qui pourra générer un peu de stress à l’animal mais peu ou pas de douleur.
Devenir
Les animaux ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Les géniteurs qui n’auront pas subi de chirurgie (procédures 1 et 2) seront mis à mort par exposition croissante en CO2 après 6 mois de reproduction. Les femelles gestantes qui auront subi une laparotomie (procédure 1) seront mis à mort par exposition croissante en CO2 au moment de la séparation avec les nouveau-nés P6 ou P21. La mise à mort des souris auxquelles auront été injectés les vecteurs viraux (procédure 2) aura lieu par perfusion de PBS (exsanguination) sous anesthésie générale profonde et analgésie afin de prélever les tissus nettoyés du sang et à analyser post-mortem. Si un animal atteint les points limites définis, il sera mis à mort par exposition croissante en CO2 (jeunes de plus de 15 jours et adultes) ou par décapitation (nouveau-nés de moins de 15 jours).
Remplacement
Notre but est d’étudier comment les cellules situées au niveau des plexus choroïdes, agissent sur le cerveau, en condition physiologique, au cours du développement, du vieillissement et en réponse aux variations de composition du microbiote et du cycle circadien. Les plexus choroïdes sont un tissu composé d’un endothélium fenêtré, de cellules épithéliales, de cellules de type neuronal, de cellules mésenchymateuses et de cellules immunitaires. Les cellules immunitaires du système périphérique pourraient induire l’expression de facteurs produits par les cellules des plexus choroïdes qui pourraient eux-mêmes moduler l’activité neuronale du cerveau. Il n’existe aucun modèle in vitro ou ex vivo rendant compte de la complexité́ d’un organisme ou d’un tissu avec ses composantes endothéliale, épithéliale, neuronale, mésenchymateuse et immunitaire. De plus, nous étudions la physiologie des plexus choroïdes en fonction de l’âge et des variations des facteurs environnementaux tels que le microbiote et le cycle circadien, ce qui ne peut être étudié qu’in vivo.
Réduction
Nous souhaitons étudier les gènes des plexus choroïdes et du cerveau qui auront montré par une précédente approche transcriptomique des différences d’expression considérables en fonction des paramètres comparés. Les quantités d’animaux utilisées pour mener à bien notre projet sont établies en tenant compte de notre précédente expérience et de tests statistiques (test ANOVA, source SHADE). Les 4 plexus choroïdes d’un animal doivent être groupés pour pouvoir réaliser une analyse moléculaire ou transcriptomique sur ces petits tissus. Seuls 10 microlitres de liquide céphalo-rachidien peuvent être prélevés à partir du cerveau d’une souris, ce qui ne permet qu’un seul type d’analyse. Les analyses moléculaires du liquide céphalo-rachidien, des plexus choroïdes et des zones d’intérêt du cerveau pourront cependant être réalisées sur les mêmes animaux qui auront au préalable été impliqués dans des tests de comportement (adultes). Nous prévoyons pour chaque groupe, 4 animaux par analyse. Le sexe des animaux pouvant influer sur les phénotypes observés, des mâles et femelles seront inclus (ratio 1/1). Des triplicatas d’expérience seront réalisés pour permettre l’obtention de résultats solides. Selon le nombre de groupes comparés, avec une puissance de 80% et un risque alpha de 5% : - 3 groupes comparés (P6, P21 et adultes) : les effectifs proposés (36 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.07 (effets considérables à extrêmes). - 2 groupes comparés (adultes jeunes et âgés) : les effectifs proposés (24 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.65 (effets très forts à considérables). - 6 groupes comparés (4h cycle fixe et 2h cycle perturbé) : les effectifs proposés (72 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 0.85 (effets très forts à considérables). - 4 groupes comparés (P21 et adultes, conventionnels et axéniques) : les effectifs proposés (48 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 0.97 (effets considérables à extrêmes). Ces résultats nous permettront d’identifier les différences majeures dans la biologie des plexus choroïdes et sa fonction sur le cerveau en fonction de l’âge, du microbiote et du cycle circadien, tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et sur tapis chauffant sur lesquels ils seront maintenus pendant et quelques heures après leur réveil. Les chirurgies sur adultes peuvent entraîner une douleur modérée au cours de la cicatrisation qui sera prévenue par des administrations d’analgésiques (buprénorphine, 30 min avant chirurgie, 6h après, puis toutes les 12h pendant 48h en cas de douleur ; lidocaïne appliquée sur les zones à inciser ; de l’acétaminophène sera également ajouté après chirurgie dans l’eau de boisson pendant la cicatrisation soit 2-3 jours pour une stéréotaxie et 4-5 jours pour une laparotomie). Les signes de douleur plus importante qui pourraient provenir de complications seront surveillés en observant les signes suivants : prostration, altération de la qualité́ du poil (hirsute, terne) ou apathie. Si l’animal présente deux de ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les chirurgies sur embryons seront indirectement surveillées via le suivi des femelles gestantes : toute perte de sang vaginale qui pourrait attester de la mort d’un ou plusieurs embryon(s) sera surveillée et nous appliquerons les points limites définis précédemment. Les stéréotaxies sur nouveau-nés pourront entrainer une douleur légère qui sera prévenue par application de lidocaïne au niveau du site d’injection. Après chirurgie, l’acceptation des nouveau-nés par leur mère sera surveillée au travers des signes suivants synonymes d’abandon : isolement du reste de la portée, bleuissement de la peau associé à une hypothermie et absence visible de lait dans l’estomac. Si le nouveau-né présente ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les animaux en élevage et ceux qui auront récupérés de leur chirurgie seront régulièrement surveillés et nous suivrons les signes et points limites précédemment définis. Nous éviterons que les animaux soient isolés dans leur cage et nous ajouterons un abri dans la cage des portées, femelles gestantes et géniteurs en plus du papier/coton présent dans toutes les cages. La procédure 2 s’achève par l’injection par voie-intrapéritonéale de l’anesthésique et analgésique qui pourra générer un peu de stress à l’animal mais peu ou pas de douleur.
Choix des espèces
La souris est l'espèce la plus utilisée en laboratoire pour l’étude des fonctions cognitives et notamment des maladies dégénératives car de nombreuses lignées sont disponibles, invalidées pour de nombreux gènes d'intérêt et/ou génétiquement manipulable après injection de vecteurs viraux. Elle est facile à élever et ses grandes capacités de reproductions facilitent les études sur embryons et nouveau-nés. Il est aisé d’en manipuler le microbiote. La souris permet également l’analyse des capacités cognitives au cours d’expériences comportementales. L’ensemble de ces avantages permet, en utilisant ce modèle, de répondre rapidement aux questions scientifiques posées. Ce modèle permet de travailler avec la meilleure efficacité́ possible tout en offrant une représentation certes imparfaite mais néanmoins proche de la physiologie humaine. Le phénotype induit par les vecteurs viraux n’est analysable qu’au minimum 10 jours après injection. Afin d’étudier comment la biologie des plexus choroïdes et sa fonction sur le cerveau évoluent avec l’âge, nous injecterons les vecteurs viraux à des souris embryonnaires afin d’en étudier les effets chez les souris : (i) âgées de 6 jours, stade important avec la mise en place du système immunitaire et de nombreuses variations métaboliques en réponse à l’allaitement maternel, (ii) âgées de 21 jours qui correspond à la période du sevrage avec d’importantes variations métaboliques et du microbiote qui devient mature, (iii) adultes, âgées de 7 à 12 semaines, qui seront notre point de référence physiologique. De la même manière, nous étudierons les effets du microbiote en injectant les vecteurs viraux à des souris âgées de 3-4 jours afin d’en étudier les effets lorsqu’elles auront 21 jours ou qu’elles seront adultes et les effets du vieillissement en injectant les vecteurs viraux à des souris adultes jeunes de 7 à 12 semaines et âgées de 10 à 20 mois.
Effets de la stimulation non invasive sur le cervelet en développement, et dans des modeles de pathologie
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
2 700 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester une stimulation magnétique du cerveau après une hypoxie. Selon les procédures, elles subissent une privation d'oxygène de quarante minutes à six semaines, quatorze jours de stimulation magnétique et des tests comportementaux, sous sédation profonde. Le porteur décrit des inconforts transitoires liés à l'hypoxie, à la stimulation et aux injections, et affirme que le cervelet ne peut être étudié hors d'un système nerveux entier. La plupart des souris sont mises à mort pour prélever le cerveau, tandis que 180 femelles ayant servi de mères sont renvoyées à l'élevage pour être réutilisées.
Objectifs
Notre projet testera les effets neurologiques de la stimulation cérébrale non invasive pour améliorer les déficits fonctionnels. Ces connaissances permettront d'optimiser des protocoles de stimulation et trouver des traitements potentiels. Nous analyserons les effets de différents patrons de stimulation magnétique répétée à faible intensité (LIrTMS), qui modifient la plasticité neuronale et améliorent le comportement chez les animaux pathologiques. Les fonctions cérébrales seront évaluées avec des tests de comportement, et les modifications structurales et fonctionnelles chez les mêmes animaux pour minimiser le nombre d’animaux utilisé. Ce traitement peut changer la signalisation cellulaire, modifier des réseaux neuronaux, et provoquer une réparation post-lésionnelle dans le cerveau.
Bénéfices attendus
Nous cherchons des protocoles pour traiter une pathologie commune chez l’Homme, l’hypoxie cérébrale. Nous étudierons le cervelet parce qu’il est particulièrement sensible à l’hypoxie; sa structure, sa fonction et son développement sont très bien décrits; son dommage lors du développement est associé avec les maladies neurodéveloppementales; et il est touché par le vieillissement.
Procédures
4 interventions au maximum. Procédure 1 : 40 minutes d’hypoxie ; 10 minutes/jour x 14 jours simulation magnétique ; tests de comportement un maximum de 30 minutes/jour, un maximum de 12 jours ; analgésie et sédation profonde 1 fois, 15 minutes Procédure 2 : hypoxie 6h/jour x 10 jours ; 10 minutes/jour x 14 jours simulation magnétique ; tests de comportement un maximum de 30 minutes/jour, un maximum de 14 jours ; analgésie et sédation profonde 1 fois, 15 minutes Procédure 3 : hébergement en cages hypoxie pendant 6 semaines, hypoxie intermittente 6h/jour ; 10 minutes/jour x 14 jours simulation magnétique ; tests de comportement un maximum de 60 minutes dans 1 journée ; analgésie et sédation profonde 1 fois, 15 minutes
Impact sur les animaux
Les interventions individuellement induisent une douleur en deca de la douleur engendrée par une simple injection faite selon le bon pratique vétérinaire. La succession de ces interventions nous emmène à demander l’autorisation du projet avec degré de gravité modérée. Les effets indésirables possible sont : inconfort transitoire en début d’hypoxie ; inconfort lors de la stimulation; inconfort lors des tests de comportement ; inconfort lors de l’injection d’anesthésiants et analgésiants. La surveillance quotidienne permet de s’assurer du bien être des animaux et lorsqu’un point limite (comme décrit) est atteint, les responsables du projet sont avertis et prennent une décision sur le devenir de l’animal, en lien avec la structure du bien être animal, et le vétérinaire référent.
Devenir
Nos études sont designés pour obtenir un maximum d'information biologique et comportemental d'un nombre minimum de souris. La plupart des souris sujet à l'hypoxie et la stimulation non invasive est testé en comportement puis perfusé, et les cerveaux des autres sont prélévé pour les études moléculaires. 180 souris femelles, les mères des portées des nouveaux-nés impliqués, seront remis dans l’animalerie, pour qu’elles soient re-utilisées pour l’élevage et diminuer donc le nombre total d’animaux.
Remplacement
Comme toute structure du système nerveux central, les connexions complexes entre les neurones ne peuvent pas être entièrement remplacé par des méthodes de culture ni des modèles mathématiques. Les déficits de comportement dus à une mutation associée avec les troubles autistique, ou à la suite d'une hypoxie perinatale, et l'amélioration de ces déficits ne peuvent être étudiés hors contexte de l'ensemble du système nerveux et donc avec des animaux vivants.
Réduction
2700 animaux total seront impliqués dans cette étude de 4 années. Nous avons calculé le nombre d'animaux nécessaire pour les trois procédures, pour diminuer le nombre d'animaux utilisé. Les tests de comportement nécessitent normalement 10 animaux par groupe, et les études d'expression génique nécessitent 5 animaux par groupe.Un calcul de puissance a été fait pour déterminer ces nombres d'animaux.
Raffinement
Avant le début des interventions, nous habituons les animaux au contact humain en pratiquant du « handling » quotidien pendant une semaine ; ceci diminue leur peur et leur angoisse. Pendant la stimulation non invasive (LIrTMS) les animaux ne montrent aucun signe d’angoisse. Les animaux sont hébergés en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l’isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. Les points limites sont définis pour chaque procédure, en cas de dérèglement physiologique ou souffrance de l’animal. Tout acte invasive est fait uniquement après administration des médicaments analgésique ou anésthetiques adaptés.
Choix des espèces
La souris est très utilisée pour des expériences sur le système nerveux car cette espèce partage un nombre de propriétés biologiques avec l'Homme. Sa petite taille et l'existence des lignées de souris transgénique facilitent les aspects pratiques de l'expérimentation. Il existe de protocoles standardisés du comportement, ce qui permet de mieux comparer les résultats obtenus par différentes équipes de recherche. La majorité des animaux seront utilisés pendant les premier mois de développement postnatal, les âges clés pendant le développement du cerveau. Les ages ont été choisi pour être équivalentes au 1) le 3ème trimestre de gestation chez l’Homme ; 2) jeune adulte ; ou 3) adulte agé.
Effet d’une modification du gène auts2a sur les mécanismes moléculaires et comportementaux transmis à la descendance chez le médaka
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
160 médakas vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité légère. Les poissons, dont le gène auts2a est modifié par CRISPR, sont isolés huit heures pour des tests comportementaux d'apprentissage, puis tués par surdose d'anesthésique. Le porteur étudie la transmission à la descendance d'effets liés à ce gène qu'il dit impliqué dans plusieurs pathologies humaines dont l'autisme. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative à l'animal vivant pour observer des réponses comportementales issues d'une fécondation naturelle.
Objectifs
Des températures suboptimales lors de la période de reproduction ont montré une baisse de l’expression maternelle d’un gène, auts2a, impliqué dans de nombreuses neuropathologies humaines : Trouble du spectre autistique, schizophrénie, Retard mental, etc … . Ce projet vise à comprendre les mécanismes moléculaires des stades précoces du développement embryonnaire qui entrainent des modifications des phénotypes comportementaux chez une espèce de poisson modèle, le médaka (Oryzias latipes). Par une approche d’édition de génome (CRISPR/Cas9) nous réaliserons deux lignées de médaka n’exprimant pas la protéine auts2a, ce qui nous permettra de réaliser des phénotypages comportementaux et moléculaires.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les effets intergénérationnels de stress parentaux, par exemple thermiques liés au réchauffement climatique, sur les comportements adaptatifs de la descendance chez des poissons d'élevage. L'identification du rôle clé joué par le gène auts2 dans cette transmission chez un poisson modèle contribuera à renforcer les connaissances scientifiques sur la transmission maternelle et/ou paternelle de ce gène impliqué dans de nombreuses pathologies humaines.
Procédures
Les animaux seront isolés pendant 8h afin de s'habituer à un nouvel environnement (nous déterminerons ainsi leurs capacités d'apprentissage des caractéristiques nouvelles de cet environnement). Cet isolement entraîne un stress modéré pour le médaka puisque son activité de nage redevient régulière et le poisson remonte en surface (indicateur d'absence de stress) après moins d'une heure.
Impact sur les animaux
Les phénotypes entraînés par la mutation n’induisent pas de souffrance et ne sont donc pas dommageables pour l’animal (il s’agit essentiellement de modifications des réponses émotionnelles et cognitives bénignes).
Devenir
Mise à mort selon la réglementation en vigueur pour l'espèce (surdose d'anesthésie)
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation des animaux dans cette expérimentation car nous recherchons précisément des mécanismes intervenant pendant une fécondation naturelle perturbée par la modification ou l’absence d’une protéine impliquée dans le neurodéveloppement ainsi que les réponses comportementales des poissons (vivants donc) issus de cette fécondation.
Réduction
Concernant les tests comportementaux, nous comparerons 4 génotypes différents, avec un nombre équitable de femelles et de mâles par génotype, ce qui nécessite un minimum de 20 poissons (10 femelles et 10 mâles) par génotype pour réaliser des tests statistiques robustes.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans les conditions optimales de l’espèce (température, photopériode, qualité d’eau, densité). Les manipulations des animaux seront réalisées le plus rapidement possible pour limiter le stress. Pour les tests comportementaux, les conditions environnementales seront les mêmes qu’en condition d’élevage hormis un isolement obligatoire pour l’analyse du comportement. Il n’y aura aucune procédure douloureuse. A la fin des tests, ils seront euthanasiés selon la procédure de mise à mort réglementaire.
Choix des espèces
L’analyse de l’expression du transcriptome à différents stades de développement embryonnaire est rendue possible par les spécificités biologiques du médaka. En effet, Il produit une trentaine d’œufs de manière quotidienne, ce qui permet un grand échantillonnage. Son développement embryonnaire est plus lent que celui du zebrafish (9 jours contre 2 jours), ce qui permet une meilleure précision lors de l’étude et l’observation du développement des œufs (qui sont translucides). De plus, le médaka ne possède que le paralogue auts2a (comme l’homme) tandis que le zebrafish possède les paralogues auts2a et auts2b (dont on ne connaît pas la fonction). Les injections auront lieu sur des œufs au stade 1 cellule (15 minutes après leur fécondation) et seront issus de poissons matures de souche sauvage. Les études comportementales porteront sur des poissons âgés entre 3 et 5 mois. Avant 2 mois les médakas montrent une activité plus importante et une grande variabilité inter-individuelle et avant 3 mois leur phénotype adulte n’est pas atteint ce qui rend leur détection par le logiciel ethovision XT plus difficile (la couleur des médakas s’assombrissant avec le temps).
Etude de l’impact d’une séparation maternelle néonatale sur les propriétés électrophysiologiques des neurones relais du système nociceptif spinal et supraspinal
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Pour étudier comment une séparation précoce d'avec la mère, présentée comme un reflet de la prématurité humaine, modifie la perception de la douleur, 160 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever leurs tissus nerveux. La moitié des ratons est retirée de la cage maternelle trois heures par jour, du deuxième au douzième jour de vie, sous une lampe chauffante. Le porteur parle d'"épisodes de stress non douloureux", tout en décrivant chez les rats séparés une anxiété chronique et, d'après des travaux antérieurs, des "hypersensibilités douloureuses". Chaque mère est tuée après le sevrage, sans retour à l'élevage, parce que selon le porteur la séparation "altère le fonctionnement de son système nerveux" et accroît son anxiété.
Objectifs
Pendant très longtemps, la douleur du nouveau-né a été ignorée et négligée lors de sa prise en charge. Ce n’est qu’au début des années 90 que ce problème a commencé à être pris en compte en clinique humaine et de nombreux progrès restent à faire. Les nouveaux nés ressentent non seulement la douleur mais sont extrêmement sensibles aux stimulations aversives. Ceci est d’autant plus vrai pour les enfants nés prématurés (nés avant la 35ème semaine de grossesse) dont la prévalence mondiale était de 9.6 % en 2005. La prématurité conduit ces enfants à développer parfois des troubles moteurs et comportementaux et une hypersensibilité douloureuse pouvant perdurer à l’âge adulte. La séparation maternelle néonatale (SMN, 3h/jour du 2ème au 12ème jour post-natal) est un stress postnatal qui a été décrit comme un modèle reflétant la prématurité humaine. De nombreux travaux ont montré que les animaux exposés à ce stress postnatal présentaient des hypersensibilités douloureuses des troubles des comportements sociaux, une modification de la perception douloureuse au niveau de la moelle épinière ainsi que des déficits cognitifs. Dans ce contexte, nous cherchons à affiner notre compréhension de l’impact de la séparation maternelle néonatale sur le codage de l’information nociceptive par les structures nerveuses spinales et supraspinales. L’objectif est de caractériser les modifications fonctionnelles au niveau neuronal qui rend compte des symptômes observés.
Bénéfices attendus
L’ensemble de ces travaux nous permettra de mieux comprendre les phénomènes de sensibilisation nociceptive ainsi que des déficits cognitifs qui semblent se mettre en place durablement suite à des épisodes de stress non douloureux durant la période néonatale en utilisant le modèle de séparation maternelle néonatale. Nous répondrons à la question d'une origine d'un dysfonctionnement de communication nerveuse expliquant les symptômes qui façonne l’expérience douloureuse et augmente le risque de développer une neuropathologie chronique selon les études épidémiologiques sur le sujet.
Procédures
La moitié des animaux sera soumis au protocole de séparation maternelle néonatale : séparation des ratons de la cage de leur mère 3h/j du 2ème au 12ème jour post-natal.
Impact sur les animaux
La séparation maternelle neonatale chez le rat est un modèle classique de stress psycho-social et a donc des conséquences sur le comportement des animaux (expression de symptomes d'anxiété chronique et troubles de l'adaptation au stress). Les ratons sont placés sous une lampe rouge chauffante avant d’éviter tout risque d’hypothermie. Le protocole de SMN est également connu pour augmenter les comportements maternels après retours de ratons dans la cage de la mère. Après sevrage, la mère ne réintègrera pas le processus de reproduction mais sera euthanasiée puisque la séparation maternelle altère le fonctionnement de son système nerveux, ce qui induit au niveau comportemental une anxiété accrue.
Devenir
Les enregistrements electrphysiologiques nécassitant le prélèvement de tissus nerveux, tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Ce projet portant sur l’étude d’un système intégré et mature, il nous a été impossible de remplacer l’utilisation d’animaux par des tests in-vitro.
Réduction
Nous prévoyons un nombre d’animaux suffisant pour d’obtenir des résultats exploitables en termes statistiques. Le nombre d’animaux prend en compte les deux sites d’enregistrement nécessaires (moelle épinière et hippocampe) ainsi que les variabilités interindividuelles nécessitant un certain nombre d’animaux pour obtenir des résultats statistiquement significatifs lors des tests paramétriques.
Raffinement
Notre étude s'interesse à l'impact de l'environement sur les nouveaux-nés. Pour pouvoir comparer nos groupes d'animaux, il nous faut un environnement enrichi tout en étant le plus homogène possible. Ceci nous permets d'étudier uniquement l'impact de la séparation maternelle. Les animaux sont ainsi hébergés en cage collectives afin de préserver les interactions sociales avec leurs congénères et ont constamment à leur disposition de la frisure pour nid, un bâton à ronger et un tunnel. Ils sont placés en conditions de températures et hygrométrie contrôlées, en cycle jour/nuit de 12h/12h avec eau et nourriture ad libitum. Durant la séparation maternelle néonatale, les ratons sont placés sous une lampe rouge chauffante afin d'éviter toute hypothermie.
Choix des espèces
Nos précédentes études étant réalisées sur le rat, nous conserverons ce modèle qui est bien caractérisé sur le plan comportemental. Le modèle de séparation a déjà été bien décrit et caractérisé chez cette espèce, permettant ainsi de confirmer la robustesse des résultats obtenus. De plus le modèle chez le rat nous permet de modéliser l’état de développement d’un fœtus lors du 3e trimestre de gestation, puisqu’à la naissance le système nerveux du rat est au même niveau de maturation que celui du fœtus au début du 3e trimestre de gestation. Les évènements de maturation ayant lieu lors du 3e trimestre de gestation chez l’homme, correspondent à ceux qui ont lieu lors des 2 à 3 premières semaines de vie post natales chez le rat. Nous utiliserons des rats agés de 30 et 50 jours postnataux, une période qui correspond à la phase de maturité du système nociceptif. Les précédentes études portant sur l’hypersensibilités nociceptives des animaux séparés maternels chez le rat jeune et adulte, le projet continuera sur cette ligne en faisant des enregistrements électrophysiologiques in vitro chez des animaux à un stade de développement équivalent
Etude de la fonction lièe au microtubule de WDR47 dans le développement cortical
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 60 femelles gestantes subissent une laparotomie et l'électroporation de chaque embryon in utero par un capillaire de verre, et leurs souriceaux reçoivent des injections cérébrales et sous-cutanées avant d'être tués, certains par décapitation, pour étudier le rôle d'un gène dans le développement du cortex. Le porteur indique que la plaie abdominale peut s'infecter, entraînant l'euthanasie de la mère. Il affirme que la complexité de l'environnement cortical rend l'étude impossible in vitro.
Objectifs
Notre recherche est orientée vers l’étude de la physiopathologie des maladies neuro-développementales d’origine génétique. Un grand nombre de gènes y ont été reliés. Notre objectif est de comprendre les rôles de ces gènes dans les cellules du système nerveux central et les mécanismes physiopathologiques impliqués dans ces maladies. Nous avons identifié des mutations chez plusieurs patients (7 familles) avec des troubles du neurodéveloppement. Tous ont des anomalies de développement du corps calleux, jonction entre hémisphères droit et gauche, formée par les axones des neurones corticaux callosaux. Nous avons fait une étude fonctionnelle chez une souris qui porte une mutation qui nous permet d'invalider le gène étudié. Lorsque les neurones de cette souris n'ont pas ce gène (ni la protéine), leur développement n'est pas modifié, mais ils ont des difficulté à former des jonctions avec les neurones de l'autre hémisphère du cerveau. La partie du cerveau touchée s'appelle le corps calleux. La protéine que nous étudions étant impliquée dans la régulation de la dynamique du réseau de microtubules, nous voulons tester si son rôle sur les microtubules est déterminant pour la survie des neurones callosaux. Nous proposons ici de réaliser des expériences de sauvetage qui consistent à injecter un agent stabilisateur des microtubules, Epothilone B, disponible sur le marché. Les étapes majeures de la formation du corps calleux étant l’initiation (P2) et la phase terminale (P4) et l’invasion (P8) par les axones du cortex contralatéral et le branchement des axones à P21, nous prévoyons 4 stades d’étude.
Bénéfices attendus
Notre étude permettra de comprendre la fonction d’une protéine impliquée dans le neurodéveloppement et les mécanismes par lesquelles la déplétion de cette protéine conduit à des troubles du neurodéveloppement. Ce projet aura des retombées directes pour le patient. En effet, si les résultats sont ceux atendus, c’est-à-dire le sauvetage du phénotpe de neurodégénérescence par l’Epothilone B, ceci va ouvrir des perpectives de traitement pour les patients portant une mutation dans le gène étudié mais aussi toutes autres maladies lièes à des perturbations du réseau de microtubules.
Procédures
Les 60 femelles gestantes vont subir une chirurgie abdominale (laparotomie) et leur utérus va être exposé et transpercé par un capillaire en verre très fin à plusieurs reprises (une fois pour chaque embryon, durée 1 à 10 sec). Cette chirugie dure moins de 45 min. Elles seront par la suite placées dans des cages isolées avec leur portée jusquà la mise à mort des souriceaux. Les souriceaux vont subir une injection de 1 à 10 sec dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin au stade embryonnaire (E15.5). A leur naissance ils seront injectés en sous cutané avec une solution saline contenant ou non la molécule à tester une fois à P0 pour ceux étudiés à P2 et P4, une fois à P0 et une fois à P7 ceux étudiés à P8, une fois à P0, une fois à P7 et enfin une à P14 ceux étudiés à P21 . Chaque injection sous cutanée dure 1 à 5 sec. Les souriceaux étudiés à P2, P4 et P8 seront mis à mort par décapitation, ceux étudiés à P21 recevront une injetion intra-péritonéale d’anesthésique (5 sec) puis seront perfusés au PBS puis PFA sous anesthésie profonde
Impact sur les animaux
Les femelles gestantes vont subir une chirurgie abdominale (laparotomie) et leur utérus va être exposé et transpercé par un capillaire en verre très fin à plusieurs reprises (une fois pour chaque embryon, durée 1 à 10 sec).Elles seront par la suite placées dans des cages isolées. La plaie abdominale est susceptible de s'infecter, elle sera surveillée et la souris euthanasiée en cas d'infection. Les souriceaux vont subir une injectionde 1 à 10 sec dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin au stade embryonnaire (E15.5). A leur naissance ils seront injectés en sous cutané avec une solution saline contenant ou non la molécule à tester une fois à P0 pour ceux étudiés à P2 et P4, une fois à P0 et une fois à P7 ceux étudiés à P8, une fois à P0, une fois à P7 et enfin une à P14 ceux étudiés à P21 .Chaque injection sous cutanée dure 1 à 5 sec. Le site d'injection sera surveillé pour détecter tout signe d'infection. Les souriceaux étudiés à P2, P4 et P8 seront mis à mort par décapitation, ceux étudiés à P21 recevront une injetion intra-péritonéale d’anesthésique ( 5sec)puis seront perfusés au PBS puis PFA sous anesthésie profonde.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet. Après la PE1, les femelles gestantes sont herbergées jusqu’au sacrifice des nouveau-nés. Après la PE2, les nouveaux-nés sont herbergés entre 2 et 8 jours en ce qui concerne les stades P2, P4 et P8, puis sacrifiés par decapitation. Pour le stade P21, une perfusion intracardiaque, procédure classée sans réveil, est prévue.
Remplacement
L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement cortical qui ne peut pas être recréé par des approches in vitro. Le développement du cerveau est très bien caractérisé chez la souris, ce qui nous permet de déterminer efficacement les effets de l’altération du gène étudié sur le développement embryonnaire cortical. Il s’agit ici de réaliser des expériences de sauvetage du phénotype de neurodégénérescence que nous avons caractérisé précédemment dans le cadre d'un projet antérieur . Par ailleurs, de telles expériences ont été réalisées par un autre groupe français, justifiant la pertinence de notre approche et la faisabilité dans le modèle souris.
Réduction
La bonne maitrise de cette chirurgie acquise par l’équipe tout au long de ces dernière années permet d’avoir un temps de chirurgie de moins de 30 minutes et un bon taux de survie des embryons (70-80%) ce qui limite fortement le nombre de femelles gestantes manipulées. Nous garderons à l’esprit notre responsabilité de diminuer au maximum le nombre d’animaux expérimentés tout en atteignant la significativité statistique. Pour minimiser le nombre d’animaux utilisés, aucune nouvelle expérience ne sera effectuée avant qu’une analyse complète des précédentes ne soit réalisée. Nous envisageons d’utiliser le test statistique de Student afin d’évaluer la survie cellulaire et la santé des neurones invalidés pour le gène étudié entre condition contrôle et traitées Epothilone B en analysant la croissance axonale (36 animaux P2) le corps calleux (36 animaux P4) ; les branchements ipsilatéraux (36 animaux P8) et les branchements controlatéraux (36 animaux P21). Afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés et d’éviter le cannibalisme des souris de fond bl6, nous avons adapté nos croisements et croisons des mâles hétérozygotes bl6 avec des souris F1 hétérozygotes 129Sv/Fas (50% 129Sv/Pas – 50% C57bl6). Ce type de croisement est utilisé en routine pour ces expériences sur le corps calleux et a montré une baisse notable du cannibalisme.
Raffinement
Nous prendrons en compte avec la plus grande attention le bien être de nos animaux. L’élevage et la reproduction de nos animaux se font dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress pour l’animal. Durant l’expérimentation les femelles gestantes sont anesthésiées par voie gazeuse et leurs yeux sont protégés de la deshydrartation par de l’ocrygel. Nous limitons le temps de manipulation à 45 minutes sur l’animal anesthésié. Le réveil est immédiat une fois l’arrêt de l’isoflurane. Un anti-inflammatoire non-stéroïdien, la metacam, est injecté avant l’opération par voie sous-cutanée. La metacam est également ajoutée au biberon jusqu’à la mise bas (6mg/L dans l’eau de boisson). L’animal se réveille dans une cage chauffée à 37°C et est surveillé régulièrement. Nous vérifions que les animaux mangent et s’abreuvent normalement. Les jours suivants, les animaux sont surveillés deux fois par jour pour voir notamment si la plaie a besoin de soins et pour détecter d’éventuelles infections postchirurgicales ou autres complications. L’objectif est de prévenir toute douleur ou détresse. En cas d’infections importantes ou de douleur manifeste, les animaux sont euthanasiés immédiatement par dislocation cervicale et les embryons sortis de leur sac et décapités.
Choix des espèces
La technique d’électroporation dans le cerveau a été mise au point chez la souris. Cet animal de petite taille avec environ 8 embryons par animal rend cette méthode efficace. Les étapes du développement du cerveau sont très bien caractérisées chez la souris ce qui nous permet de voir les effets des mutations dans des gènes impliqués dans les maladies neuro-développementales chez l’homme. Femelles adultes gestantes de 15,5 jours, stade auquel les neurones d’intérêt (neurones callosaux) sont générés. L’electroporation des embryons à ce stade permettra d’invalider WDR47 uniquement dans ces neurones et de suivre leur développement grâce à un marqueur fluorescent. Etant donné que les étapes majeures de la formation du corps calleux sont la croissance des axones, le passage dans l’autre hémisphère et la phase terminale de l’invasion par les axones du cortex contralatéral à P2, P4 et à P8 respectivement et le branchement des axones à P21, nous prévoyons 4 stades afin d’évaluer comment le traitement EpothiloneB protège les neurones contre la perte de la fonction de WDR47
Synchronisation de la méiose chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
612 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent un gavage et une injection intrapéritonéale unique, puis sont mises à mort pour le prélèvement de leurs testicules, afin d'étudier la synchronisation de la méiose. Le porteur indique que la contention lors du gavage et l'introduction de la pipette peuvent générer stress, petites blessures et douleur. Il affirme que la souris est le seul mammifère permettant cette étude génétique et reconnaît qu'un modèle organoïde en développement ne peut pas encore la remplacer.
Objectifs
Notre projet a pour but de mieux comprendre la division cellulaire de cellules germinales appelée méiose. En effet, cette division est une étape indispensable de la production d’ovocytes et de spermatozoïdes. Son bon fonctionnement est essentiel pour transmettre le matériel génétique à la génération suivante. De manière intéressante, lors de la première étape de la méiose, les chromosomes subissent de nombreuses cassures de la double hélice de l’ADN (CDB) qui doivent être réparées. Cette étape est nécessaire pour le bon fonctionnement de la méiose. Plus précisément, notre projet a pour but d’étudier le lien entre le mécanisme de recombinaison homologue, initié par la formation de ces cassures double brin de l’ADN, et les mécanismes de contrôle de la structure du chromosome lors de la de la méiose. Nous avons identifié plusieurs protéines nécessaires à la formation des CDB en méiose. Notre premier objectif est de déterminer les sites de fixation à l’ADN de ces protéines, à l’échelle du génome entier. Dans un second temps, nous souhaitons déterminer si les protéines contrôlant l’organisation structurale des chromosomes méiotiques, sont aussi impliquées dans le contrôle de la fixation des protéines nécessaires à la formation des cassures double brin de l'ADN et d'évaluer les dépendances génétiques. Ce projet nécessite le développement d’approche de biochimie, biologie moléculaire, génomique et microscopie à haute résolution. Le protocole proposé permettra d’enrichir in vivo les cellules dans lesquelles les protéines que nous étudions sont présentes afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires par expérience. Le protocole sera utilisé sur des souris portant des mutations dans les gènes qui codent pour les protéines impliquées dans la recombinaison en méiose ainsi que sur des souris portant des mutations dans les gènes qui codent pour des protéines qui contrôlent la structure du chromosome méiotique.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de comprendre comment les protéines impliquées dans la formation des cassures double brin de l'ADN sont régulées par la structure des chromosomes et comment ces protéines peuvent à leur tour influencer la structure des chromosomes méiotiques. Cette régulation est une étape cruciale dans le bon déroulement de la transmission du matériel génétique intacte aux générations suivantes et permets d'éviter la transmission de matériel endommagé qui mène à des maladies génétiques, telles que la trisomie 21 ou à l'infertilité.
Procédures
Les animaux seront soumis à un Gavage et une injection unique intrapéritonéale .
Impact sur les animaux
Les modifications génétiques que nous étudions ne causent aucun phénotype dommageable en dehors de l’infertilité des animaux. Néanmoins la procédure expérimentale peut affecter leur bienêtre: La contention lors du gavage par pipette, peut générer du stress. De plus, l’introduction de la pointe de la pipette peut générer des petites blessures et donc engendrer de la douleur. L’injection intrapéritonéale peut générer de la douleur au point d’injection et du stress lié à la contention. Pour limiter ces effets indésirables, les animaux seront manipulés par du personnel expérimenté, le temps de manipulation sera réduit à minima, les points limites seront déterminés au préalable et respectés scrupuleusement.
Devenir
Les animaux devront être mis à mort pour le prélèvement de leurs testicules synchronisés
Remplacement
Notre projet propose l'utilisation de souris. Ce sont les seuls mammifères sur lesquels nous pouvons développer ces recherches. Le processus fondamental de la méiose est étudié dans d’autres espèces (invertébrés, plantes, unicellulaires) mais ces processus se sont différenciés au cours de l’évolution. Chez les mammifères, seule la souris permet d’approfondir l’étude de fonction de gènes par la génétique et la transgénèse. Il reste à noter qu’actuellement, dans le cadre d’une collaboration internationale, et avec un soutien financier fort, nous nous efforçons de mettre au point un modèle in vitro qui permettra de reproduire certaines étapes de la méiose, grâce à la mise en place d’organoïdes. A terme ce modèle nous permettra de tester le phénotype de certaines mutations dans le cadre d’expériences pilotes et évitera donc à générer des animaux inutilement. Pour l’instant, ce modèle n’est pas encore suffisamment au point pour y avoir recours et même au point, et il ne permettra pas non plus se substituer complètement à l’utilisation du modèle souris, car pour un grand nombre d’expériences le matériel généré par le modèle in vitro ne sera pas suffisamment important.
Réduction
L'optimisation des croisements pour réduire au maximum le nombre d’animaux élevés sera de rigueur. Les différentes expérimentation se feront doublon ou triplicate avec une analyse statistique appropriée
Raffinement
Tout au long de la procédure, les animaux seront observés. Des signes apparents, comportementaux et physiologiques de douleurs observés chez les animaux impliqués dans ce protocole expérimental seront rapportés dans le cahier d’expérimentation. Lors du gavage par voie orale les animaux seront pesées tous les jours, l’utilisation de grille de score et de points limites permettra de déterminer si un animal doit sortir de l’expérimentation et être ou mis à mort
Choix des espèces
Notre projet propose l'utilisation de souris. Ce sont les seuls mammifères sur lesquels nous pouvons développer ces recherches. En effet le processus fondamental de la méiose est étudié dans d’autres espèces (invertébrés, plantes, unicellulaires), mais ces processus se sont différenciés au cours de l’évolution. Pour l'instant, seule la souris permet d’approfondir l’étude de fonction de gènes par la génétique et la transgénèse chez le mammifère. Le protocole proposé permettra d’augmenter le nombre de cellules d’intérêt par expérience. Bien que dans le cadre d'une collaboration internationale nous nous efforçons de mettre au point un modèle organoïde pour les étapes précoces de la gamétogenèse, à l'heure actuelle, le recours aux animaux reste indispensable mais le protocole de la synchronisation de la méiose ici proposé permettra d’augmenter le nombre de cellules d’intérêt par expérience et ainsi drastiquement (allant jusqu'à un facteur 5) diminuer le nombre d'animaux utilisés.
Respir’Ante: Etude de l’alvéolisation chez la souris en cas de retard de croissance intra-utérin induit par un régime hypoprotidique per gestationnel.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système respiratoire
568 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant du léger au modéré. Les mères gestantes reçoivent un régime appauvri en protéines pendant toute la gestation pour provoquer un retard de croissance, et une partie des souriceaux subit une injection intrapéritonéale quotidienne pendant dix jours avant d'être tués pour prélever leurs poumons entiers, d'autres étant anesthésiés puis curarisés pour explorer leur fonction respiratoire. Le porteur affirme que ce régime est le modèle le moins invasif et que l'étude d'un organe aussi complexe que le poumon ne permet pas pour le moment de méthode de remplacement. Les retombées annoncées, un traitement des troubles de l'alvéolisation chez les nouveau-nés prématurés humains, sont renvoyées au moyen terme.
Objectifs
Le retard de croissance intra-utérin (RCIU) est une adaptation à un environnement intra-utérin défavorable et a comme conséquence des altérations permanentes du métabolisme, de la croissance et du développement notamment pulmonaire et cérébral. Les conséquences du RCIU sont nombreuses et durables dans le temps. Le RCIU chez l'Homme multiplie par 6 la probabilité d'avoir une alvéolisation pulmonaire anormale chez le nouveau-né prématuré. L'alvéole pulmonaire forme une niche de cellules en interaction et en communication. Les principales cellules participant à la croissance alvéolaire sont les pneumocytes de type 2 et les lipofibroblastes. Ces cellules sont régulées par des gènes jouant un rôle sur le métabolisme lipidique notamment le gène du Peroxisome Proliferative Activated Receptor (PPAR). Cette voie est modifiée en cas de RCIU. Le seul modèle chez l'animal reproduisant un RCIU et des troubles de l'alvéolisation est le régime hypoprotidique (Low Protein Diet (LPD)) pendant la gestation. Ce projet a pour but i) d'étudier les conséquences du régime LPD sur le développement pulmonaire de souris en étudiant la morphométrie et la fonction respiratoire ii) de mieux caractériser les différents types cellulaires dans le poumon et leur répartition grâce à la technique du Single Cell RNA seq et iii) de proposer des traitements innovants pour favoriser la croissance et la régénération alvéolaire grâce à des analogues de la voie PPAR ou SREBP (Sterol Response Element Binding Protein) en se basant sur une culture cellulaire en 3D créant in vitro un poumon aussi appelé organoïde alvéolaire.
Bénéfices attendus
Ce projet améliorera la compréhension des anomalies de l'alvéolisation liées au retard de croissance intra-utérin et permettra d'aboutir à moyen terme à un traitement des troubles de l'alvéolisation chez les nouveau-nés prématurés humains.
Procédures
Les souris femelles adultes gestantes seront soumises à un régime hypoprotidique (Low Protein Diet (LPD)) pendant toute la durée de la gestation (21jours) Une partie des souriceaux (n=32 sera anesthésiée puis curarisée pour explorer leur fonction respiratoire (âge aux eplorations fonctionnelles: 21 à 60 jours, durée des explorations: 1 jour). Une partie des souriceaux (n=288) recevra du premier jour de vie au 10ème, une injection intrapéritonéale médicamenteuse de 100µL maximum (injections une fois par jour pendant 10 jours) . Les animaux seront mis à mort ensuite pour analyser leurs poumons entiers en utilisant des organoïdes alvéolaires. Le reste des animaux (n= 200) sera anesthésiée avant mise à mort pour analyse de poumons selon les différentes techniques proposées (ScRNAseq, morphométrie ou organoïdes alvéolaires) (Mise à mort au 120ème jour de vie maximum sans procédure durant leur vivant).
Impact sur les animaux
Le régime Low Protein Diet a déjà été administré chez les rates gestantes sans complication observée pour elles-mêmes ou leurs petits. Le nombre de ratons par portée était identique à celui obtenu en cas d'utilisation d'un régime contrôle. Les animaux naissent avec un retard de croissance. Ils ne présentent pas de malformation associée. Le taux de mortalité lié à ce régime est nul in utero ou après la naissance. Les injections médicamenteuses par voie intra-péritonéale sont couramment utilisées et n'induisent pas d'effet indésirable particulier pour les molécules étudiées en dehors de la douleur induite par l'injection elle-même. En cas de souffrance (blessure, absence de prise de poids ou perte de poids supérieure à 10%), les souriceaux seront mis à mort.
Devenir
Les souris gestantes seront gardées en vie à la fin de la procédure 1 (régime) pendant au moins 3 semaines. Les souriceaux recevant les injections (procédure 3) seront gardés en vie au maximum jusqu'à J120. Les souriceaux de la procédure 2 (EFR) seront mis à mort à la fin de celle -ci. Les animaux seront mis mort à la fin de chaque procédure afin de procéder au prélèvement de l'ensemble des poumons.
Remplacement
La principale cause de RCIU chez l’Homme est la prééclampsie. Il s’agit d’une pathologie exclusivement humaine. Plusieurs modèles de RCIU ont donc été mis au point chez l’animal. Le modèle de RCIU reproduisant au mieux les lésions observées chez l’Homme et le moins invasif pour l’animal est le régime Low Protein Diet (LPD). Notre première étude l'a démontré chez le rat où nous avons montré la ressemblance entre les lésions pulmonaires et cérébrales observées chez le rat et les RCIU humains. Les modèles animaux nous permettent de mieux définir les organes et types cellulaires touchés et nous précisent donc les cibles moléculaires intéressantes pour des thérapeutiques éventuelles. L'étude de l’effet d'une molécule sur un organe aussi complexe que le poumon ne nous permet pas d'utiliser pour le moment de méthodes de remplacement.
Réduction
Les souris gestantes seront exposées pendant toute la gestation à un modèle de restriction protidique LPD ou à un régime contrôle. Les souriceaux issus de ces souris seront étudiés dans les différentes expériences. Les animaux issus d'une même portée seront tous étudiés pour les différentes techniques choisies. Les animaux seront mis à mort à J4, J7, J10, J21, J60 ou J120 de vie pour étude des modifications fonctionnelles et cellulaires. Le nombre de souris et de groupes expérimentaux ont été limités au strict nécessaire. La quantité de 6 à 8 animaux / groupe est la quantité adéquate pour chacune de nos analyses statistiques lors de nos études morphométriques, immunohistochimiques et moléculaires précédentes (qPCR, Western blot etc...). Une fois les données relevées, les tests statistiques prévus sont le Mann - Whitney test pour la comparaison des 2 groupes entre eux : comparaison de la masse des souriceaux (en g), etc... Le test utilisé pour la comparaison de 4 groupes après tests ex vivo sera un Two-way ANOVA (pour tester l'effet du régime et l'effet du traitement, ainsi que la combinaison des deux).
Raffinement
Afin de respecter la règle des 3R (raffiner, réduire, remplacer) dans notre projet, les animaux seront particulièrement suivis par le personnel qualifié de l'animalerie, avec une attention particulière à l'aspect, la mesure du poids et de la quantité de nourriture ingérée (femelles gestantes) et à l'aspect et la mesure quotidienne du poids pour les souriceaux. Les souris seront hébergées dans des portoirs ventilés avec un environnement enrichi. Les souris auront à leur disposition de la boisson et de la nourriture, des huttes en carton, des balles de coton, des feuilles de papier pour jouer et des baguettes de bois à ronger. Lors des études précédentes, la tolérance du régime était bonne. Aucune sur-mortalité n’avait été enregistrée précédemment et aucune malformation n’a été détectée. En cas de mal être : blessure, poids trop faible (si le poids est de 20% en dessous de la moyenne de la portée), déshydratation, les souriceaux seront euthanasiés. Pour les mères adultes une attention particulière sera portée sur la quantité de nourriture mangée et sur le suivi de leur poids. En cas de perte de plus de 20 % de poids, la souris gestante sera sortie de l'expérimentation et euthanasiée (CO2).
Choix des espèces
La souris est un animal très utilisé dans la recherche translationnelle et son développement pulmonaire et cérébral est proche de celui de l'homme. Notre première étude a montré de résultats reproductibles chez le rat et nous souhaitons le confirmer chez la souris et aller plus loin dans les analyses moléculaires. En effet, les possibilités d’analyse avec des anticorps sont plus importantes chez la souris et la mise au point de KO est plus développée chez la souris que chez le rat.