Système gastrointestinal

Dix injections en deux semaines, puis une chirurgie intestinale de soixante minutes sous anesthésie générale avec prélèvement de sang : 320 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes anesthésiées puis tuées pour prélever sang et tissus. Le projet compare des lignées exprimant ou non un gène intestinal, pour décrire la réponse immunitaire contre les parasites du tube digestif, avec l'espoir affiché d'en tirer une cible thérapeutique contre les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. Le porteur annonce des résultats "prometteurs" avant d'avoir commencé. Il résume par ailleurs les nuisances subies par les animaux à un stress et à une douleur ponctuelle liée à l'aiguille, sans compter la chirurgie intestinale qu'il décrit lui-même.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de comprendre comment un gène spécifiquement exprimé dans certaines cellules de l’intestin peut influencer la mise en place d’une réponse immunitaire contre les parasites du tube digestifs. Grace à des lignées de souris exprimant ou non ce gène, nous serons en mesure de définir son rôle, et ainsi comprendre comment se met en place la réponse antiparasitaire.

Bénéfices attendus

Nous attendons des résultats prometteurs, permettant de comprendre les mécanismes fondamentaux de la mise en place de la réponse contre les parasites intestinaux, ces derniers touchant une grande partie de la population mondiale. Au-delà de l’aspect infectieux, nos données pourraient aussi être exploitées dans le cadre de la lutte contre les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, en validant, le cas échéant, notre gène d’intérêt comme cible thérapeutique potentielle.

Procédures

Les animaux recevront 10 injections de substances sur 2 semaines (l’injection durant moins d’une minute), une chirurgie intestinale et un prélèvement sanguin sous anesthésie générale et traitement antidouleur (d’une durée de 60 min).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis aux nuisances suivantes : stress et une douleur ponctuelle (aiguille) lors des phases d’administration de substances et anesthésie générale.

Devenir

Les individus seront anesthésiés et euthanasiés pour prélèvements sanguins et tissulaires, qui seront ensuite analysés.

Remplacement

Les questions posées dans le cadre de ce projet (interactions entre types cellulaires et agents infectieux) impliquent l’utilisation de modèles murins reflétant au mieux la physiologie d’un point de vue intégrée. La réponse aux questions soulevées dans ce projet ne peut en aucun cas être abordée par un seul modèle de substitution.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu dans le cadre de ce projet a été défini en nous appuyant sur les données précédemment obtenues, afin de nous permettre d’obtenir des données interprétables. Notre stratégie pour réduire le nombre d’animaux consistera à engager de petits groupes d’individus, nous permettant de valider ou d’invalider nos hypothèses de travail le plus rapidement possible. Si une de nos pistes de travail ne s’avère plus pertinente, les expériences associées seront abandonnées, réduisant de fait le nombre d’animaux engagés en procédures.

Raffinement

Notre stratégie expérimentale consiste en un suivi des individus engagés dès le début des phases d’expériences, sous le contrôle des zootechniciens et de la cellule du bien-être animal. Les animaux seront élevés dans un milieu enrichi, en respectant les groupes sociaux, et seront traités avec des anesthésiques et des analgésiques lors des phases de chirurgie et de prélèvement sanguin. De plus, nous avons définis des points limites, basés sur une grille de score, permettant d’anticiper et d’arrêter les expériences au besoin.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour notre projet, puisque disposant d’un système digestif et immunitaire présentant de nombreuses similitudes avec l’homme. Les animaux seront étudiés entre 6 et 24 semaines d'âge, dès lors que le système digestif est mature.

3 552 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un carcinogène par injection puis trois cycles d'une molécule dans l'eau de boisson pour déclencher des tumeurs de l'intestin et du colon, six injections d'anticorps, un gavage de glucose suivi de cinq prises de sang en deux heures, et pour une partie d'entre elles seize semaines de régime gras. Le porteur écrit que la compréhension de ces mécanismes "pourrait conduire" à de nouvelles approches thérapeutiques, alors que les tumeurs poussent sans pouvoir être mesurées du vivant de l'animal. Une perte de plus de 20 % du poids initial déclenche la mise à mort, et le volume des tumeurs n'est mesuré qu'après.

Objectifs

La lutte contre les cancers gastro-intestinaux est un enjeu majeur de santé publique. Malgré certaines améliorations en matière de dépistage et thérapie, l'incidence, la prévalence et la mortalité des cancers du colon restent élevées dans les pays développés. En particulier, le pronostic des patients atteints de cancer colorectal (CCR) métastatique reste mauvais, avec un taux de survie de 10 pourcents à 5 ans, en raison de l'inefficacité des traitements actuels. Il est donc urgent de développer des traitements plus efficaces pour les patients atteints de cette maladie. Dans le CCR, un rôle clé des réponses immunitaires a été démontré dans la croissance de la tumeur et ce rôle est notamment influencée par les macrophages, des cellules immunitaires innées. Ce projet propose de s’appuyer sur l’étude de tumeurs colorectales murines afin (1) de caractériser les différentes populations de macrophages présentes dans la tumeur et en périphérie, (2) de déterminer le rôle fonctionnel de ces macrophages dans la réponse anti-tumorale et (3) d’étudier l’impact de différents traitements et conditions sur cette réponse. Notamment, nous nous intéresserons à l’influence de l’obésité (induite à l’aide de régimes alimentaires spéciaux) et l’influence d'un traitement sur la réponse innée dans le CCR. L’obésité est connue comme étant un facteur de risque de développement du CCR et reprogramme les macrophages intestinaux vers un phénotype pro-tumoral. Nous chercherons donc à caractériser l’impact de l’obésité sur l’efficacité d'un traitement via l’action des macrophages. Ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur l’implication des cellules myéloïdes dans les cancers primaires de l’intestin pour ainsi contribuer à long terme à améliorer la prise en charge et/ou le diagnostic des patients en clinique.

Bénéfices attendus

En 2023, en France métropolitaine, l'incidence du cancer colorectal était de plus de 47 000 nouveaux cas par an. Même si la mortalité (taux standardisé) par cancer colorectal est en baisse depuis les années 1990, celui-ci demeure la deuxième cause de décès par cancer tous sexes confondus. Nous proposons ici de caractériser au niveau moléculaire et cellulaire le mécanisme de surveillance immunitaire des cellules myéloïdes dans un modèle tumoral de cancer colorectal ainsi que de déterminer l’influence de l'obésité et d'un traitement sur cette réponse immunitaire innée. Ainsi, nous obtiendrons une compréhension intégrée du système immunitaire intestinal et colonique dans des conditions normales et pathologiques. La compréhension des mécanismes qui régulent les premières phases de l'immunité innée lors de la progression tumorale pourrait conduire à de nouvelles approches thérapeutiques pour prévenir ou améliorer l'espérance de vie des patients.

Procédures

Les souris seront soumises à : 1. un régime alimentaire riche en gras (animal vigil, tous les jours pendant 16 semaines), 2. un traitement pour induire des tumeurs intestinales et colorectales consistant en une injection intra-péritonéale (une fois par animal vigil, durée de quelques secondes) suivi de 3 cycles d’une semaine d’administration de traitement dans l’eau de boisson (chaque cycle est suivi d'au moins une semaine de repos sans traitement), 3. des traitements par injection d’anticorps en intra-péritonéal (6 fois par animal vigil, durée de quelques secondes), 4. un gavage oral de glucose (une fois par animal vigil, durée de quelques secondes) accompagné de prélèvements sanguins sur animal vigil (5 petits prélèvements successifs sur une période de 2 heures, durée de quelques secondes par prélèvement) afin d’évaluer la capacité à réguler la glycémie après 4 semaines de régime gras, 5. des injections intrapéritonéales de molécule permettant l’induction des modèles génétiquement modifiés (animal vigil, durée de quelques secondes par injection, 2-3 injections par semaine pendant un maximum de 16 semaines), 6. un gavage oral d'un agent permettant l’induction des modèles génétiquement modifiés (5 fois par animal vigil, durée de quelques secondes), 7. une euthanasie par une méthode réglementaire (durée de quelques secondes). Tous les prélèvements tissulaires se feront suite à l’euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

Notre projet propose d’étudier les cellules myéloïdes infiltrant la tumeur et nécessite donc d’induire le développement de tumeurs chez les souris via des modèles induits chimiquement (par deux molécules de traitement) ou via l’utilisation du modèle murin génétique. La première molécule est un carcinogène connu et son administration promeut le développement de tumeurs. L’administration de la seconde molécule peut lui entraîner une perte de poids. La localisation des tumeurs pourrait impacter la mobilité des animaux, leur alimentation, leur pelage et leur comportement. Dans le phénotype du modèle murin génétique, les effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont majoritairement liés à l'apparition spontanée de tumeurs intestinales. Les animaux vont alors subir le développement d'une ou plusieurs tumeurs pouvant amener à la dégradation de la condition physique, du stress, des douleurs. Les injections de molécules par voie intra-péritonéale pourront induire une douleur de courte durée aux animaux. Les gavages pourront induire une irritation de courte durée de l'œsophage. Les manipulations des animaux pourront également induire un stress de courte durée. Par ailleurs, dans le cadre de ce projet, certaines souris seront soumises à un régime enrichi en graisses. Ce régime entraîne une prise de poids qui sera étroitement surveillée tout au long de l’étude pouvant altérer la mobilité. Pour les explorations métaboliques, certaines procédures telles que la mise à jeun des animaux pendant quelques heures, le gavage de glucose et les prélèvements sanguins peuvent entraîner des périodes de stress et d’inconfort temporaires pour les animaux.

Devenir

Afin de répondre aux questions et enjeux scientifiques soulevés au cours de notre projet expérimental, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et impliquent donc l'euthanasie de l'ensemble des animaux.

Remplacement

Actuellement, il n’existe pas de substitut non animal capable de reproduire avec précision les mécanismes complexes impliqués dans la genèse du cancer colorectal (CCR) et les réponses immunitaires associées. Parmi les différentes espèces, la souris s’avère être la plus appropriée pour étudier cette pathologie. De plus, l’utilisation du modèle murin est nécessaire pour explorer la pathologie au sein d’un organisme complet, ce qui ne peut être fidèlement reproduit en se basant uniquement sur des cultures de cellules isolées.

Réduction

En prenant en considération les publications antérieures, notre expérience dans le domaine et en utilisant une méthodologie de calcul de la taille des échantillons basée sur un test de puissance, notre estimation est de 12 souris par groupe. Le nombre de souris nécessaires à l’expérimentation a été déterminé en tenant compte d’une réduction maximale du nombre d’individus tout en garantissant une significativité statistique des résultats. Lorsque cela sera possible et afin de limiter le nombre total de souris utilisées, nous essaierons de mettre en commun des souris contrôles pour l’étude de différents modèles murins. Le nombre total d’animaux prévu est de 3552 souris.

Raffinement

Le bien-être animal sera une priorité constante tout au long du projet afin de minimiser la douleur et le stress. Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées et de taille réglementaire contenant des éléments d’enrichissement (lanières de papier kraft et bâton en bois). La température et l’hygrométrie seront contrôlées et monitorées, le cycle jour-nuit sera réglé de manière automatique. Le change de la litière et de la nourriture se fera une fois par semaine minimum. Une période d’acclimatation d’une semaine précédera les expérimentations. L’accès à l’eau et à la nourriture sera mis à disposition ad libitum. Une vérification visuelle quotidienne de l’état général des souris est effectuée par le personnel animalier. Tout signe d’inconfort, de détresse ou de comportement anormal (agressivité subite, inactivité, vocalisation, mutilation, isolement, diminution de l’appétit) ainsi que toute modification physique (pelage ébouriffé, dos courbé, perte excessive de poils) sera étroitement surveillée et entraînera un isolement si nécessaire. Les critères absolus d’inconfort (état de choc, léthargie, inconscience, immobilité, forte hypothermie, difficultés respiratoires), qui ne sont pas censés être déclenchés par la procédure utilisée, mèneront à l’euthanasie immédiate de l’animal conformément aux directives éthiques. Une grille de suivi sera mise en place avec une pesée hebdomadaire des animaux et deux pesées lors de chaque de cycle de traitement. Une perte de poids de plus de 20 pourcents du poids initial à l’initiation du traitement des animaux sera considérée comme point limite. Dans le cadre de la tumorigenèse intestinale, la tumeur ne pourra pas être mesurée au cours de l’expérimentation mais le volume tumoral sera mesuré après l'euthanasie afin de contrôler la pousse tumorale.

Choix des espèces

L'objectif de ce projet est d'explorer le rôle des macrophages dans la pathogénèse et l’évolution du cancer colorectal (CCR) ainsi que d’identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents. La souris a été sélectionnée comme modèle expérimental en raison de sa capacité à reproduire de manière précise les mécanismes impliqués dans le développement du CCR. Plus particulièrement, elle est capable d’intégrer les réponses immunitaires observées chez les êtres humains. En outre, la souris est un modèle bien établi pour l’étude du CCR et permet également d’utiliser un certain nombre de lignées transgéniques générées au préalable. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 à 12 semaines à leur entrée dans les procédures. Nos études requièrent que les animaux aient un métabolisme et un système immunitaire matures.

Une substance ajoutée à l'eau de boisson provoque chez elles une inflammation de l'intestin : 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le porteur table sur une régénération complète de l'épithélium intestinal en trois jours et sur une expérience arrêtée une semaine après l'administration, et n'attend donc ni perte de poids ni effet prolongé. Le poids, la consistance des selles, la diarrhée et la présence de sang sont pourtant surveillés deux fois par jour au titre des points limites. La mise à mort sert à prélever organes et sang, avec l'annonce qu'un maximum d'analyses sera tiré des échantillons récoltés.

Objectifs

Cette étude est la continuité d’un autre projet : Il vise à déterminer l'importance d’un processus appelé "SUMO" pour "Small Ubiquitin-like Modifier" dans la régénération de l'épithélium intestinal après lésions. Dans un contexte pathologique où des lésions mal réparées de l’épithélium conduisent à des maladies intestinales chroniques, telles que la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique, ce projet participera également dans le futur à contribuer à l’avancée des recherches pour l’élaboration de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de mieux déterminer le rôle de la molécule appelée SUMO dans la régénération intestinale. En effet, on sait que les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) sont dues à des lésions de la paroi intestinale qui ne sont pas réparées efficacement et qui conduisent ainsi à une inflammation chronique de l’intestin. Mais les mécanismes exacts à l’origine de ces maladies sont encore mal compris et les traitements actuels, qui soignent uniquement les symptômes, ne permettent pas de guérir réellement les patients. Comme il a déjà été montré que SUMO agit sur le maintien de l’identité cellulaire et que sa diminution favorise la plasticité des cellules, notre étude nous permettra de valider également du processus appelé « SUMOylation » comme un mécanisme important impliqué dans la régénération intestinale. Cette étape permettra in fine l’élaboration de nouvelles thérapies ciblant des patients atteints de MICI.

Procédures

Les animaux seront soumis à un traitement par le DSS dans l’eau de boisson .

Impact sur les animaux

Pour l’étude de la régénération intestinales, nous induisons des lésions intestinales en administrant un produit dans l’eau de boisson des souris. Le mode d’administration par l’eau de boisson n’induit pas de douleurs au moment de l’ingestion. Le produit entrainera ensuite une inflammation de l’intestin qui peut occasionner des effets indésirables de nature modérée. Il est possible que les animaux puissent souffrir d'une légère colite, dérivée de la perte transitoire de la capacité d'absorption de l’intestin. Cependant, l'épithélium intestinal a la capacité de se régénérer complètement en seulement 3 jours à la suite d’une blessure, de telle sorte que les animaux ne subiront pas d'effets indésirables sur une durée prolongée. De plus, les animaux étant maintenus en expérience seulement une semaine au maximum après l’administration du produit, nous n’attendons donc pas de perte de poids des animaux ni d’effets secondaires additionnels durant cette courte période.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour pouvoir prélever les organes et sang nécessaires à nos analyses et évaluation de l’inflammation. Un maximum d’analyses sera effectué à partir des échantillons récoltés.

Remplacement

Il n'existe pas et il ne peut y avoir d'alternatives non animales dans l'étude du processus de régénération de l'épithélium intestinal, car il s'agit d'un processus auquel participent une multitude d'organes et de types de cellules, ainsi que le microbiote lui-même, présent à l'intérieur de la lumière de l'intestin, qui joue un rôle clé. Pour cette étude, des animaux vivants sont nécessaires car le maintien de l'ensemble du microenvironnement intestinal est essentiel, afin d'établir le rôle de chaque élément dans le dit processus.

Réduction

Les animaux auront le même fond génétique pour limiter les variations entre les lignées. - Le plus grand nombre d'analyses possible sera effectué sur chaque animal, afin d'éviter d'en utiliser inutilement. - Chaque expérience sera réalisée 3 fois de manière indépendante les unes des autres pour assurer la reproductibilité des expériences. Cependant, si les deux premières expériences génèrent des résultats identiques, la troisième ne sera pas effectuée. -La deuxième procédure ne sera faite que si la première confirme un rôle du processus appelé « SUMOylation » dans la régénération intestinale. - Les analyses statistiques seront effectuées en prenant en compte la structure des données (cages et répétitions principalement) en utilisant des modèles statistiques à effets mixtes. Les animaux contrôles seront comparés aux animaux traités par groupes de 10 (5 mâles + 5 femelles), ce qui permettra de mettre en évidence les effets attendus (d~1, effets importants) avec suffisamment de puissance (80%). - La deuxième répétition d'une expérience ne sera réalisée que si les effets néfastes sur l'animal sont minimes. En cas de découverte d'effets secondaires sévères au cours d’une expérience, le traitement sera interrompu. Les animaux ne peuvent pas être réutilisés car ils seront mis à mort au cours du processus.

Raffinement

Les symptômes attendus sont ceux de la colite. Tout au long de l’étude, les animaux seront donc surveillés tous les jours deux fois par jour pour les points limites spécifiques dans le cas de la colite (poids corporel, consistance des selles, présence de sang dans les selles et diarrhée). Afin de minimiser la douleur liée à la colite, -Du gel hydrique sera mis à disposition dans la cage pour éviter la déshydratation et faciliter le rétablissement des animaux.

Choix des espèces

La souris de laboratoire est l’espèce indispensable dans la réalisation de ce projet. Il s'agit tout d’abord d'un mammifère, dont le système digestif est essentiellement composé des mêmes structures et des mêmes types de cellules que ceux de l’Homme. L’étude de la régénération intestinale dans cette espèce est donc tout appropriée. De plus, la création de lignées génétiquement modifiées est un processus établi et relativement facile à mettre en place. Elle génère ainsi des modèles spécifiques pour étudier par exemple des types cellulaires donnés, ici cellules épithéliales intestinales et cellules souches, nous permettant ainsi de répondre à plusieurs questions. Les souris sont également faciles à entretenir et à manipuler et se reproduisent relativement rapidement. Toutes ces caractéristiques font de la souris de laboratoire un modèle idéal pour nos besoins. De jeunes souris adultes (entre 8 et 12 semaines) seront utilisées car il est nécessaire que le développement et la maturation de l'animal soient terminés, afin qu'ils n'interfèrent en aucune façon dans l'obtention de résultats, et avec un âge inférieur ou égal à 12 semaines de sorte que, de la même manière, le processus de vieillissement n’interfère pas.

Gavées quatre jours avec des antibiotiques puis vingt-huit jours avec des probiotiques, 384 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour l'analyse de leur tube digestif. L'objet du projet est de dérégler leur microbiote intestinal avec une dose légère d'antibiotique, puis de tester quels régimes, prébiotiques ou probiotiques le rétablissent. Le porteur reconnaît que la contention et le gavage constituent des nuisances, avec un risque de fausse route entraînant la mise à mort immédiate de l'animal, et propose comme raffinement des "caresses avant le gavage". Il affirme qu'aucun effet indésirable n'est attendu "selon plusieurs études" qu'il ne cite pas, et indique administrer les antibiotiques dans l'eau de boisson au détriment de la précision des quantités ingérées.

Objectifs

L’objectif de ce projet consiste à perturber l’équilibre du microbiote intestinal en utilisant un traitement antibiotique léger. Plusieurs régimes sont ensuite testés pour évaluer leur capacité à rétablir ou non l'équilibre intestinal. Ces régimes sont constitués de macronutriments (protéines, lipides, glucides), de probiotiques (microorganismes bénéfiques pour l’organisme) ou prébiotiques (substances non digestives favorables au développement de la flore intestinale).

Bénéfices attendus

Expertiser l'impact d'une dose légère d'antibiotique sur l'homéostasie intestinale. Voir l'impact de certains produits (macronutriments, prébiotiques et probiotiques) sur le microbiote intestinal. Trouver des méthodes alternatives pour améliorer l'homéostasie intestinale par des régimes riches en macronutriments,, prébiotiques ou probiotiques.

Procédures

1)Gavage qui dure 4 jours pour les antibiotiques. (20 secondes par souris) 2) Gavage de probiotiques 28 jours. (20 seconde par gavage par souris) 3)Prelevement de féces une fois par semaine. (Maximum 15 minutes par prelevement) 4) Prise du poids une fois par semaine. (15 seconde paar souris) 5) Prise d'urine une seule fois à la fin du porotocole. (Maximum 15 minutes par prelevement)

Impact sur les animaux

Le modèle avec une dose légère d'antibiotique ne génère pas de diarrhée. Aucun effet indésirable n'est attendu selon plusieurs études. Par ailleurs, bien que réalisée par du personnel compétent, la préhension et la contention ainsi que le geste de gavage constituent des nuisances pour les animaux. Le stress, l'introduction accidentelle de liquide ainsi que la perte de poids sont des complications physiologiques et psychologiques que les manipulateurs vont essayer d'éviter.

Devenir

384 souris seront mises à mort pour analyser l'impact des modifications de la flore intestinale sur le tube dijestif.

Remplacement

Une grande étude in vivo est réalisée en amont de ce modèle. L'impact de 240 souches probiotiques, prébiotiques et macronutriment (lipides) a été réalisé in vitro sur des cellules de l'intestin. Seuls les produits avec un fort impact sont retenus pour la phase in vivo. Présélectionner les produits in vitro est une étape très importante vu le nombre de produits qui ne vont pas être sélectionnés pour la phase in vivo. Cependant, l'impact des antibiotiques passe essentiellement par le microbiote intestinal et seul le modèle animal peut offrir la possibilité de perturber le microbiote intestinal ainsi que les effets de cette perturbation sur l'homéostasie intestinale..

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre de souris utilisables pendant la partie in vivo, un grand travail in vitro estréalisé en amont. Les macronutriments, prébiotiques et probiotiques ne présentent que 10 % des produits testés in vitro 90 % des produit testé ne passeront pas à l'étape in vivo. Concernant la partie biostatistique et pour avoir des résultats statiquement interprétables au niveau de l’étude de la flore intestinale, les groupes seront composés de 8 animaux.

Raffinement

Le choix du modèle animal implique automatiquement la prise en compte des mesures de raffinement liées au nombre de souris par cage qui respectera le confort animal. Dans ce modèle le nombre de souris programmé est de 8 souris par cage en portoir ventilé. L’enrichissement des cages et l’entretien des animaux en présence de professionnels et scientifiques expérimentés est la première préoccupation des meneurs de ce projet. Le suivi quotidien des animaux 7 jours sur 7 permettra d’améliorer leurs conditions de vie en captivité en diminuant les sources de stress. Mettre en place une surveillance constante des animaux pendant les procédures expérimentales, pour détecter rapidement tout signe de détresse ou de malaise. Pré-entraîner les animaux à des procédures non douloureuses pour réduire le stress lors des manipulations ultérieures. Utiliser des méthodes de renforcement positif telque les caresses avant le gavage pour faciliter la coopération des animaux. Afin d’éviter de faire subir 2 gavages par jour aux animaux, l’administration des antibiotiques se fera par l’intermédiaire de l’eau de boisson. Cette option prend en compte le bien-être des animaux au détriment de la précision des quantités ingérées. Établir des critères clairs définissant les points limites à ne pas dépasser en termes de détresse, de douleur ou desouffrance animale. Mettre en place des protocoles pour arrêter immédiatement toute procédure en cas de dépassement des points limites, les critéres d'arret par rapport à la souffrance seront les suivants: •score supérieur ou égal à 10 selon critères de jugement •comportement de l’animal : animal isolé par rapport au milieu extérieur, posture inhabituelle, piloérection. •fèces ; décoloration et/ou présence de sang. Au cas ou le gavage abime la trachée ou fait fausse route l'animal est immediatement mis à mort. En cas de souffrance l'utilisation d'analgésique est envisagable.

Choix des espèces

Le protocole sera réalisé avec des souris, car c'est le modèle expérimental le plus utilisé pour l'étude de la santé intestinale et du microbiote. Les modèles murins ont été particulièrement utiles pour mieux comprendre certaines fonctions du microbiote des mammifères, et nous considérons donc qu'ils sont adaptés à nos recherches. Le debut des traitement à 6 semaines coincide avec le debut de maturation de la flore intestinale. Avant la prise des antibiotiques la flore intestinale presentera un indice de diversité trés élevé, l'impact des antibiotiques sur la flore intestinale sera plus important.

Toutes tuées en fin de procédure pour que soient prélevés les segments de leur tube digestif, 280 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont suivies pendant près de six semaines, reçoivent jusqu'à vingt gavages oro-gastriques pour être infectées par Clostridioides difficile puis réinfectées et traitées aux antibiotiques deux fois par jour pendant huit jours, subissent deux injections dans l'abdomen et deux prélèvements de sang par la joue sous anesthésie. L'infection provoque des diarrhées et une perte de poids que le porteur qualifie de légère à modérée et spontanément résolutive en deux à trois jours. Le recours exclusif à des femelles est justifié non par la biologie de l'infection mais par la "nécessité" de cohérence avec les essais antérieurs de l'équipe.

Objectifs

Clostridioides difficile est une bactérie capable de coloniser le microbiote digestif après sa perturbation par des antibiotiques (ATB). Une fois implanté dans le tube digestif, cette bactérie va provoquer une diarrhée sous l’action des toxines qu’elle produit. Les infections à C. difficile (ICD) sont caractérisées par un taux important de récidive (25% des cas), parfois multiples et particulièrement invalidantes pour les patients malgré un traitement antibiotique bien conduit. A ce jour, les déterminants conduisant à la récidive sont encore mal connus. Plusieurs hypothèses non exclusives ont été avancées pour expliquer leur survenue notamment 1) la persistance de la perturbation du microbiote induite initialement par les antibiotiques, voire la perturbation additionnelle induite par les antibiotiques utilisés dans le traitement des ICD ; 2) une réponse immune non efficace pour neutraliser l’action des toxines produites par la bactérie ; 3) la persistance de la bactérie sous sa forme sporulée (forme de résistance non sensible à l’action des antibiotiques) ou sa survie dans des niches écologiques digestives non accessibles aux antibiotiques. L'utilisation d'animaux dans le cadre de ce projet a pour objectif de mieux comprendre le processus de colonisation digestive et les déterminants favorisant une disparaition complète de la bactérie du tube digestif ou au contraire la récidive et notamment la rechute à partir de bactéries persistantes dans le tractus digestif sous une forme ou dans une niche écologique particulière à identifier

Bénéfices attendus

Les données qui seront obtenues au cours de ce projet permettront de mieux comprendre le mode de survie de C. difficile au sein du tractus digestif (forme et localisation) permettant la récidive de l'infection et d'identifier des espèces bactériennes associées à la colonisation et à la décolonisation digestive de C. difficile. Elle permettra également de préciser la cinétique de mise en place d'une réponse immune efficace avec la prodcution d'anticorps neutralisant l'action des toxines et son rôle dans le processus de protection de l'hôte contre l'action des toxines produites par la bactérie. Ces données sont essentielles pour identifier et construire les bases de nouvelles stratégies de prévention de traitement des ICD complémentaires aux antibiotiques et limiter le risque de récidive que ce soit par l'utilisation de probiotiques de nouvelles génération et/ou de stratégies d'immunisation notamment la vaccination.

Procédures

Les animaux seront suivis tous les jours longitudinalement pendant près de 6 semaines. Au cours de cette période, ils seront soumis à 2 injections intrapéritonéales sous anesthésie locale du point d’injection (durée de l'IP 30 secondes à 1 minute), à des gavages oro-gastriques (de 1 à 20 selon les procédures) pour l’infection et la réinfection et l'administration biquotidienne des traitements antibiotiques pendant 8 jours (durée du gavage 30 secondes à 1 minute). Il sera également réalisé des prélèvements quotidiens de selles, à 2 prélèvements de sang par voie submandibulaire sous anesthésie générale (durée 2 à 3 minutes).

Impact sur les animaux

Le poinçonnage aux oreilles peut provoquer une douleur légère de courte durée. Les piqures d’aiguille pour les injections intrapéritonéales peuvent provoquer une douleur légère de courte durée. Les gavages orogastriques des animaux pour d’une part pour provoquer une infection digestive et d’autre part pour l’administration par voie orale des antibiotiques du traitement de l’infection peuvent provoquer un stress durant le geste dont la durée est courte. L’infection digestive par C. difficile peut provoquer chez les animaux infectés des signes digestifs de type diarrhée, avec perte de poids légère à modérée liée à une déshydratation légère. Ces signes seront spontanément résolutifs après 2 à 3 jours et l’infection dans ce modèle n’est ni sévère, ni mortelle. Au cours de l’infection, les animaux seront suivis quotidiennement : observation clinique, pesée, recueil des selles et changement de litières. Cette surveillance quotidienne n’occasionne aucune douleur mais peut également provoquer une angoisse légère dans la mesure où elle nécessite de manipuler l’animal. Au cours de ces essais, un prélèvement de sang sera réalisé par voie sous mandibulaire susceptible de provoquer une douleur légère et de courte durée liée à l’incision et un stress du à la manipulation de l’animal mais minimisée par l’anesthésie préalable des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure expérimentale car le prélèvement de différents segments du tube digestif permettra d’identifier le site de persistance de la bactérie dans le tube digestif potentiellement à l’origine des récidives des ICD.

Remplacement

Le recours à l'animal est indispensable pour étudier les différents facteurs impliqués dans le processus de colonisation et décolonisation digestive de C. difficile. Aucun modèle in vitro, ex vivo ou in silico n'est capable de reproduire la complexité du processus infectieux dans son intégralité (réponse immune et perturbation du microbiote digestif). Pour les études portant sur le microbiote, les essais de colonisation chez l'animal restent une étape incontournable pour étudier son rôle, car même les expériences sur modèles cellulaires en trois dimensions ou en biofermenteurs modélisant le tube digestif ne permettent pas de reproduire idéalement le processus infectieux global.

Réduction

La méthodologie de ce projet a été construite sur la base des données déjà collectées au sein de notre équipe et celles de la littérature. Cette expérience acquise nous a ainsi permis de nous focaliser sur les points d’intérêt importants de suivi des animaux et de ne pas démultiplier inutilement les temps de suivi. De plus, une planification statistique rigoureuse a permis de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés au nombre de 280, tout en préservant la validité statistique des résultats de l'étude. L’étude de la rechute, à distance du premier épisode, est intégrée dans l’essai de suivi cinétique de la colonisation et de disparaition digestive lors de ce premier épisode afin de limiter le nombre d’essai et d’animaux nécessaires. Enfin, les groupes contrôles des animaux ont été mutualisés aussi souvent que possible.

Raffinement

Les animaux seront hébergés avec suffisamment d'espace, par groupe de 4 par cage avec un tunnel de carton et du papier pour construction de nids comme enrichissement. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer qu'ils subissent le minimum de stress possible. Les litières seront changées quotidiennement pendant la période d’infection et les animaux auront un accès direct et illimité à l'eau de boisson et à la nourriture. Du gel hydrique sera mis dans les cages afin de faciliter la réhydratation des animaux pendant toute la période des signes cliniques de diarrhées. La procédure d'expérimentation sera pratiquée en utilisant des anesthésiques permettant de limiter la souffrance des animaux qui bénéficieront d'une procédure d'euthanasie anticipée avec une sortie d'étude prématurée en cas d'atteinte des points limites éthiquement non acceptables.

Choix des espèces

Le modèle d’infection chez la souris est maintenant établi et classiquement utilisé dans les protocoles d’étude de la colonisation et d’infection digestive par C. difficile par toutes les équipes de recherche travaillant sur ce sujet. Ce modèle se rapproche de l'histoire naturelle de l’ICD non compliquée observée chez l'Homme. Les souris seront manipulées à l'âge de 6 ou 8 semaines. Ce choix est motivé par la nécessité de travailler à la fois sur des animaux ayant atteint l'âge adulte et qui répondent au modèle de colonisation et d'infection par C. difficile déjà décrit par notre équipe et d’autres équipes. Enfin, le choix d’animaux femelles est également motivé par la nécessité de cohérence et d'homogénéité avec nos essais précédents sur la même thématique.

Isolés deux heures par jour dès l'âge de quatorze jours, puis séparés un par un après le sevrage, 80 porcelets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avant d'être tués pour prélever leurs tissus intestinaux et leurs muscles. Ils subissent un prélèvement de fèces et deux prises de sang, chaque contention étant limitée à cinq minutes. L'objet du projet est de mesurer la digestibilité de la crème de pois, un coproduit de l'industrie alimentaire aujourd'hui mal valorisé, et son effet sur la croissance des porcelets au sevrage. Le porc est ici à la fois l'animal utilisé et le destinataire annoncé des résultats, le porteur présentant le projet comme un moyen de limiter les diarrhées et l'usage d'antibiotiques en élevage.

Objectifs

En production porcine, le sevrage est une période critique pour le porcelet car à cette période il subit de nombreux stress (séparation avec la mère, mélange avec d’autres portées, changement d’alimentation…). Cela entraîne des désordres digestifs avec notamment des incidences de diarrhées élevées. L’alimentation est un levier majeur pour améliorer cette étape clé du développement. La crème de pois est un coproduit de l’industrie alimentaire, riche en fibres facilement métabolisables et en protéines. De par sa composition et sa texture (entre la phase liquide et solide), la crème de pois pourrait être un aliment intéressant pour améliorer la santé digestive et pour favoriser la transition alimentaire des porcelets lors du sevrage. Dans ce contexte, le projet vise à décrire la digestibilité d’un coproduit du pois (la crème de pois) à étudier l’influence de l’ajout de ce coproduit sur la santé digestive des porcelets au sevrage (absorption des protéines, intégrité de la barrière intestinale), sur leurs performances zootechniques et leur développement musculaire. L’objectif est d’assurer une meilleure transition alimentaire au sevrage pour limiter les problèmes de santé digestive, d’améliorer la croissance des porcelets, et de diminuer/supprimer l’utilisation d’antibiotiques.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des connaissances sur la digestion d’un coproduit de pois, qui présente une texture (entre liquide et solide) et une composition (riche en fibres et protéines) pouvant être bénéfiques aux porcelets. Le projet permettra effectivement de déterminer les effets positifs sur la santé digestive (intégrité de la barrière intestinale) et la croissance musculaire des porcelets. Cette expérimentation apportera de nouvelles connaissances sur les différents liens entre les protéines issues de la digestion de la crème de pois et le développement des muscles squelettiques chez le porc. Ce projet permettra également d’optimiser l’utilisation d’un coproduit qui n’est pas totalement valorisé à l’heure actuelle, ainsi limiter les déchets et promouvoir une circularité des systèmes alimentaires. Pour une perspective à long terme, ce projet fournira des pistes pour adapter au mieux les régimes des porcelets, réduire les problèmes digestifs au sevrage et ainsi limiter voire supprimer l’utilisation d’antibiotiques en élevage. De plus ce projet fournira des données (activité enzymatique, pH) qui serviront à mettre au point un modèle de digestion in vitro spécifique au porcelet. Cela permettra par la suite de privilégier l’utilisation de ce modèle in vitro plutôt que celle d’animaux.

Procédures

Les interventions prévues pour les porcelets sont : un prélèvement de fèces, et 2 prélèvements de sang. Ces interventions nécessitent une immobilisation de l’animal qui est limitée à 5 min. La durée de la prise de sang est limitée à 2 min.

Impact sur les animaux

Quotidiennement, les porcelets seront isolés par groupe de 2 pendant 2 h, à partir de 14 jours de vie, pour accéder à leur régime. De même en post-sevrage, les porcs seront isolés individuellement pour obtenir un suivi précis de l’ingéré. L’isolement d’un groupe ou d’un porc en individuel peut être source de stress. Des prélèvements de sang (1 ou 2 selon la procédure) et de fèces (1) seront effectués sur les porcelets. Ces prélèvements ne sont pas douloureux, mais nécessitent une contention qui peut être stressante pour les porcelets.

Devenir

La mise à mort des porcelets est nécessaire lors des procédures 1 et 2, pour permettre le prélèvement d’organes (tissus intestinaux et muscles).

Remplacement

Les modèles in vitro de digestion sont limités dans leur capacité à reproduire la physiologie complexe du tractus gastro-intestinal et ses nombreuses interactions. A l’heure actuelle, aucun modèle ne permet de reproduire la sécrétion d’hormones digestives, et les mécanismes de régulations suite à l’ingestion d’un aliment. De plus ces modèles ne permettent pas d’étudier plusieurs organes en même temps en réponse à un traitement (exemple : alimentation). L’objectif du projet étant d’étudier les interactions digestives des nutriments et la réponse physiologique qui en découle, il nécessite d’être réalisé sur des animaux vivants pour explorer ces deux domaines de recherche conjointement.

Réduction

Le nombre de porcelets prévus pour ce projet est de 80 au maximum. Il correspond à 20 porcelets par régimes alimentaires (une étude pilote avec 4 porcelets par régime et 2 répétitions de 8 porcelets par régime pour l’expérimentation finale). Ce nombre d’animaux est suffisant pour observer un effet significatif sur la digestibilité des protéines entre la crème de pois et le contrôle. Le nombre d’animaux a été déterminée grâce à des essais préliminaires réalisés pour ce projet sur la digestibilité in vitro des protéines des différents régimes. Ces essais ont été réalisés suivant le modèle de digestion in vitro utilisé pour le porc en croissance

Raffinement

Le bien-être des animaux sera évalué tout au long de l’expérience. Les régimes expérimentaux (crème de pois et contrôles) seront adaptés pour couvrir les besoins nutritionnels des porcelets tout au long de leur développement (quantité, composition en minéraux, protéines…). Tous les porcelets seront surveillés quotidiennement avec des grilles d’évaluation de bien-être, afin de prévenir toute souffrance. Les grilles seront collectives pour la période précédant le sevrage et individuelle en post-sevrage. Les procédures seront réalisées par un personnel expérimenté, en respectant les durées de contentions (5 min) et de prélèvements (2 min). Le comportement des animaux sera également suivi par caméra surveillance pour veiller au bien-être des porcelets et leur alimentation.

Choix des espèces

Le projet sera mené sur des porcelets jusqu’à leur sevrage et une partie en post-sevrage. Le porc est l’espèce cible du projet qui consiste à déterminer la digestibilité de la crème de pois et d’étudier le lien avec la santé digestive et les performances musculaires des porcs sur le long terme. Les connaissances serviront pour améliorer la transition alimentaire au sevrage du porcelet et limiter les incidences de diarrhées en élevage.abba