Système gastrointestinal
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Etude de l’expression d’un gène impliqué dans la régulation de l’autophagie après induction d’une inflammation
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
864 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une injection unique de composé pro-inflammatoire, dès le huitième jour de vie pour une partie d'entre elles, ce qui suppose de les séparer de leur mère, et certaines subissent une chirurgie sous anesthésie sans jamais se réveiller. État fébrile passager, hypothermie légère et baisse de mobilité sont attendus. Le lien annoncé avec les troubles du spectre autistique reste lointain, le porteur renvoyant à de futurs tests précliniques l'évaluation de molécules modulant l'autophagie, et il affirme sur le remplacement que l'étude du comportement "ne peut se faire autrement" qu'in vivo.
Objectifs
Les troubles du développement sont en augmentation constante, avec un nombre de cas estimé par exemple pour les troubles du spectre autistique (TSA) à 1 enfant sur 44 aux Etats-Unis pour l'année 2018 et 1 enfant sur 89 en Europe. Les troubles du spectre autistique se caractérisent notamment par une perturbation du comportement social. Parmi les causes récemment décrites dans la littérature scientifique, l’hypothèse d’un défaut d’un processus cellulaire appelé autophagie, au sein des cellules du cerveau, lors du développement chez l’enfant, est émise. Des études récentes ont ainsi démontré, chez l’homme et chez l’animal, un rôle de la dérégulation de ce mécanisme dans la survenue de comportements de type autistique. L’autophagie est le moyen par lequel les cellules éliminent des composés d’origine environnementale. Un défaut dans ce mécanisme d’élimination apparaît alors crucial dans le cadre de l’apparition de troubles du développement, reconnus comme étant le résultat d’une combinaison « gènes x environnement ». Par ailleurs, la complexité des troubles neurodéveloppementaux suggère l’implication de combinaison de type « gènes x environnement ». La littérature scientifique indique ainsi qu’une exposition à des composants environnementaux, notamment pro-inflammatoires, à des stades précoces du développement du cerveau, est impliquée dans la survenue de troubles du développement. Parmi les facteurs environnementaux potentiellement à risque, nous étudions les conséquences d’une stimulation inflammatoire auquel l’individu serait exposé dans les premières semaines de vie, par la mise en place d’un protocole pro-inflammatoire classiquement décrit dans la littérature. Dans ce contexte, notre projet vise alors à étudier entre autres l’expression d’un gène impliqué dans la régulation de l’autophagie et de l’inflammation. Notre projet est complémentaire du travail en cours et permettra d’obtenir des données originales.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à court terme la compréhension du rôle de l’autophagie en combinaison avec une exposition précoce à des composés pro-inflammatoires dans le développement du système nerveux central et dans la survenue de troubles du neurodéveloppement, en constante augmentation dans la population générale (les troubles du spectre autistique concernent 1 enfant sur 36 aux USA en 2020, 1/44 en 2018, 1/69 en 2012). A plus long terme, ce projet servira de point de départ à des tests précliniques visant à déterminer l’efficacité de molécules pharmacologiques modulant l’autophagie pour atténuer la survenue de ces troubles.
Procédures
Une injection unique de composé pro-inflammatoire (durée du geste d’environ 10 secondes). Une chirurgie sans réveil (sous anesthésie et analgésie) de moins de 5 minutes sera réalisée sur une partie des animaux du projet.
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables de stress et de légère hypothermie sont attendus, en lien notamment avec la séparation mère-petits lors des injections, la réalisation de contention, l’induction d’un état fébrile passager suite aux injections. L’injection de l’agent inflammatoire est classiquement utilisée pour induire un état inflammatoire, au-delà de la légère douleur provoquée par l’aiguille. Elle est donc susceptible d’entrainer un état fébrile passager chez l’animal. La manifestation d’une gêne peut se traduire par un animal moins mobile. Une détresse respiratoire et une hypothermie sont possibles lors de l’anesthésie liée à la chirurgie sans réveil.
Devenir
L’ensemble des 864 animaux sera euthanasié en fin de projet afin de prélever les tissus d’intérêt pour traitement par biologie molécule ou histologie.
Remplacement
L’étude de l’effet d’un défaut de l’autophagie combiné à une perturbation inflammatoire précoce, sur le comportement de l’individu ne peut se faire autrement que par des explorations fonctionnelles menées in vivo. Ainsi, même si nous ne pouvons pas remplacer les études prévues sur ce modèle in vivo, nous veillerons à réduire le nombre d’animaux et raffiner notre protocole.
Réduction
Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 864 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée de souris. De même, les animaux femelles et mâles générés sont utilisés. D'une manière générale, nous avons conçu les lots pour que soit généré le nombre optimal d’animaux compatible avec la réalisation des analyses des prélèvements. Enfin, nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque procédure, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les échantillons prélevés seront envoyés à différentes équipes dans le cadre de collaborations. Les données obtenues seront ultérieurement étudiées statistiquement de manière classique. Par ailleurs, pour chacune des approches expérimentales, ce travail servira de base pour de futurs travaux intégrant une exposition précoce à un facteur environnemental afin de calculer le nombre juste d’animaux requis pour comparer d’une manière statistique et robuste les conditions mutantes à la condition contrôle avec une excellente reproductibilité.
Raffinement
Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Les animaux sont surveillés plusieurs fois par semaine et à la suite de tout signal d’alerte une grille de suivi est mise en place. Comme défini dans l'agrément de notre établissement, les paramètres environnementaux contrôlés comprennent une humidité de 50 plus ou moins 20 pour cent, une température constante (20-24 degrés celsius). L’éclairage est circadien (8h-20h) pour respecter le rythme biologique des animaux. Les souris sont hébergées en groupe sociaux et disposent de matériel de nidification (Sizzle square et/ou coton) et d’une maison rouge. Des observations du bien-être sont réalisées quotidiennement. Les jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. En cas de troubles moteur ou comportements aberrants, les animaux feront l’objet d’une surveillance accrue pendant 12h, à l’aide d’une grille de suivi Si l’état général de l’animal atteint les points limites (douleur manifeste, dégradation de l’état de la fourrure et manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture), les animaux seront euthanasiés immédiatement. Le stress induit par la séparation au moment de l’injection des animaux au 8ème ou 20ème jour de vie est minimisé en réduisant au maximum le temps de séparation avec la mère. Les données de la littérature indiquent que l’injection intrapéritonéale de molécules pro-inflammatoires n’induit pas de trouble majeur évident chez la souris. Les injections sont susceptibles d’entrainer un état fébrile passager chez l’animal. La manifestation d’une gêne peut se traduire par un animal moins mobile. Les animaux seront particulièrement observés après les injections. Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
L’obtention d’un modèle génétique pertinent visant à étudier un facteur génétique est souvent complexe et long à mettre en œuvre pour de nombreuses espèces. Néanmoins le modèle qui nous intéresse existe depuis 2001 chez la souris. Par ailleurs, de nombreux outils ont été conçus et sont disponible pour étudier le comportement, les paramètres physiologiques et biologiques chez la souris et nous maitrisons l’utilisation des outils à disposition. Ce modèle animal fait partie des animaux les plus étudiés et caractérisés aux différentes échelles de la biologie. Par ailleurs, les modèles génétiques murins de déficience autophagique sont pertinents dans l’étude des troubles du neurodéveloppement. Plusieurs stades de développement seront analysés pour comprendre les conséquences de la réponse inflammatoire précoce sur l’expression du gène et sur d’autres marqueurs inflammatoires. Plusieurs stades de développement, seront étudiés : néonatal (injection à 8 jours de vie), jeune (injection à 20 jours de vie), adolescent (injection à 34 jours de vie) et adulte (injection à 89 jours de vie).
Modélisation des maladies inflammatoires de l’intestin au TNBS chez les rongeurs et évaluation prophylactique et thérapeutique de molécules thérapeutiques.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Cinquante études sur cinq ans, commandées par des laboratoires académiques, des biotechs et des industriels du médicament : 1 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, pour faire tourner un modèle de maladie inflammatoire de l'intestin. L'inflammation est déclenchée par une administration intra-rectale de TNBS dilué dans l'éthanol sous anesthésie, suivie de gavages, de prélèvements de sang et d'endoscopies par sonde caméra. Une partie des souris est immunodéficiente et porte un système immunitaire humanisé. Le porteur classe l'ensemble en souffrance modérée tout en décrivant une diarrhée pouvant être sévère, une déshydratation, une anémie, une prostration et une perforation de l'intestin.
Objectifs
La maladie inflammatoire chronique des intestins (MICI) est une pathologie caractérisée par une inflammation de la paroi du tube digestif entrainant une dégradation significative de la qualité de vie des patients. Les MICI les plus courantes sont la colite ulcéreuse (ou rectocolite hémorragique) et la maladie de Crohn. A l’heure actuelle, les mécanismes d’apparition de cette pathologie sont peu connus et aucun traitement curatif n’est disponible sur le marché. L’objectif de ce projet est de développer un modèle d’étude fiable des MICI pour permettre d’en accroitre la compréhension et d’évaluer les propriétés immunitaires, thérapeutiques et toxicologiques de molécules issues de laboratoires académiques, biotechnologiques et pharmaceutiques.
Bénéfices attendus
Les MICI sont des maladies inflammatoires. En basant notre modèle sur des souris ayant un système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier les MICI et des potentiels traitements avec davantage de spécificité pour l’espèce cible de ces recherches : l’Homme.
Procédures
Administration intra-rectale sous anesthésie générale, durée de l'intervention 4 à 5 minutes. Administration des composés à visées thérapeutiques par voie enterale (gavage ou incorporation dans l'eau de boisson) ou parentérale (intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire ou sous-cutanée). Leur nombre est à déterminer, leurs durées seront de 10 à 15 secondes chacune. Prélèvements sanguins pour le suivi de la pathologie et des effets des traitements selon un schéma établis par le vétérinaire et le comité de bien-être. Chaque prélèvement aura une durée de 15 à 30 secondes, environ. Insertion de sonde caméra intrarectale sous anesthésie pour analyse des intestins, 3 à 4 minutes par analyse.
Impact sur les animaux
Les MICI se caractérisent par une diarrhée pouvant être sévère et entrainer une perte de poids, une déshydratation, des coliques ou une une anémie. Des nuisances peuvent également être induites par l'injection intra-rectale de TNBS solubilisé dans l'éthanol ainsi que par les prélèvements sanguins, l'administration des composés de recherche et les effets potentiellement toxiques de ces composés à visées thérapeutiques dans un contexte préclinique ainsi que par l'endoscopie. Ces nuisances et effets indésirables peuvent se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer, une perforation de l'intestin.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure.
Remplacement
Il n’est à l’heure actuelle pas possible de recréer in vitro un modèle étudiant les interactions complexes qui peuvent exister entre le système immunitaire et un système digestif fonctionnel qui permettrait de reproduire les MICI tout en objectivant les effets thérapeutiques et toxicologiques de composés médicamenteux destinés à leurs traitements. Les modèles murins constituent donc une approche scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et à la mise à disposition de thérapies innovantes pour les patients.
Réduction
Un total de 1500 animaux est demandé pour la réalisation de ce projet sur une durée de 5 ans, permettant de réaliser 50 études afin de mettre en place le modèle et de réaliser les premières études précliniques. Chaque étude comprendra un minimum de 4 groupes (contrôle négatif, contrôlé positif, plusieurs doses ou traitements à comparer) avec 5 à 10 animaux par groupe afin d’obtenir des résultats fiables malgré la variabilité intrinsèque liée au modèle. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques adaptés aux effets attendus de la série et sur base des données historiques collectées.
Raffinement
En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 6 heures par semaine. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Les souris seront hébergées dans une atmosphère contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès le premier geste invasif. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est de 200µL pour un prélèvement unique, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue pour tout prélèvement unique à partir de 8mL/kg. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Lorsqu’un animal rentre en salle d’euthanasie, il doit être immédiatement euthanasié. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction des scores cliniques et de la perte de poids. Les administrations intra-rectales seront réalisées sous anesthésie générale à l'isoflurane et le volume d'injection ne pourra dépasser 200 μL. L’endoscopie sera réalisée sous anesthésie.
Choix des espèces
Le séquençage complet du génome de la souris a démontré la proximité phylogénétique des souris et des hommes : 90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes orthologues produisent des effets différents entre souris et homme, le remplacement dans le génome du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. Ainsi, les souris SCID (Severe Combined ImmunoDeficiency), leurs dérivées et leurs analogues, toutes immunodéficientes, ont permis le développement des modèles humanisés. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures au niveau de leur système immunitaire. Pour les souris humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang.
Mise en place d’une décompensation spontanée de la cirrhose et d’un modèle d’ACLF suite à une induction de la cirrhose par un agent hépatotoxique et d’un désordre métabolique.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Jusqu'à 44 administrations d'un produit toxique pour le foie, deux fois par semaine pendant 22 semaines, par gavage ou par injection dans l'abdomen : c'est ce que subissent des rats arrivés au laboratoire à quatre semaines, pour reproduire une cirrhose puis sa décompensation aiguë. 8 140 rats sont concernés, dont 4 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et tous sont tués à l'issue. Le porteur annonce des animaux en état de choc et en détresse cardio-respiratoire dans les heures qui suivent l'induction, écarte l'analgésie au motif qu'elle introduirait un biais, et écrit viser une gravité "jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique". Dans les études de survie, le délai jusqu'à la mort compte comme donnée, et c'est l'atteinte du point d'arrêt anticipé qui vaut déclaration de la mort de l'animal.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un programme de recherche destiné à identifier de nouvelles molécules permettant de traiter la cirrhose à stade très avancé ou une ACLF (acronyme d’Acute on Chronique liver Failure ou décompensation aiguë de la cirrhose) La cirrhose se définit par l'accumulation excessive de fibrose conduisant à la dégénérescence du foie.
Bénéfices attendus
Le pronostic des patients cirrhotiques est variable en fonction de la cause et de son contrôle et de la présence de décompensations. L’ascite réfractaire survient chez 5-10 % des patients cirrhotiques, avec un taux de mortalité de plus de 50 % à 2 ans. Souvent, elle s’associe à d’autres complications comme l’infection spontanée du liquide d’ascite. Lors de la phase terminale de cette décompensation et suivant la qualité de vie du patient, l’espérance de survie en dehors d’une transplantation hépatique n’est que de quelques mois. Dans le cadre de l’ACLF, il est nécessaire de prendre en charge les patients pour des défaillances multiples et de préserver le capitale hépatocitaire des patients. La perte de fonctionnalité du foie durant cette période conduit à un décès du patient de façon précoce. Les traitements actuels sont purement symptomatiques et ne visent qu’à limiter les risques liés à l’hypertension portale, les surinfections, les risques d’hémorragie ou au contraire de thrombose et sont proposés au cas par cas, ce de manière à préserver les chances d’éligibilité à la transplantation. Les solutions thérapeutiques que nous espérons développer visent à agir sur les différents mécanismes conduisant à une réfractarité de l’ascite, la perméabilité de la paroi intestinale et les productions d’ammoniaque à l’origine de l’encéphalopathie pour la décompensation traditionnelle. Elles visent à agir sur les différentes voies à l’origine de la défaillance multiple (inflammation, immunitaire, métabolique et vasculaire) dans le cadre de l’ACLF.
Procédures
Période d’induction : Décompensation spontanée selon les procédures : Jusqu’à 44 administrations par gavage ou par administration intrapéritonéale de composé chimique hépatotoxique, à raison de 2 fois par semaines pendant 22 semaines (15 secondes) ou jusqu’à 44 administrations par administration intrapéritonéale de composé chimique hépatotoxique à raison de 2 fois par semaines pendant 22 semaines (15 secondes). Sur les procédures de caractérisation de chacun des agents inducteurs (procédure 1 et 2), les animaux pourront subir jusqu’à 6 prélèvements de sang à la veine sublinguale intermédiaire (1 minute) sous anesthésie (3minutes). En dehors de ces deux procédures, les animaux subiront un prélèvement de sang intermédiaire à la veine sublinguale intermédiaire (1 minute) sous anesthésie (3minutes). Pour les études de type ACLF, les animaux subiront une administration intrapéritonéale, par voie intraveineuse ou par gavage des agents inducteurs (15 secondes). Pour les études avec test de composés, en dehors de la phase d’induction de la cirrhose et de l’ACLF, les animaux pourront subir jusqu’à 10 administrations par gavage, voie intrapéritonéale ou intraveineuse (15 secondes). Dans certains cas, les 4 administrations avec un volume plus important en intrapéritonéale se fera sous anesthésie (durée 1 minute), avec 4 drainages du dialysat à raison d’une fois par jour (15 minutes) sous anesthésie générale. L’administration intraveineuse pourra être faite par infusion lente à l'aide d'un perfuseur (durée 120 minutes).
Impact sur les animaux
L’induction de la fibrose n’induit pas de douleur mais un inconfort et un stress passager lié à la contention nécessaire pour le gavage ou l’administration intrapéritonéale des agents, l’habituation au geste estompe rapidement ce stress. La gêne est présente mais pas accompagnée d’une analgésie chez l’humain. Les animaux présentant de l’ascite semblent présenter des signes de gêne de posture lorsque celle-ci est abondante sans pour autant présenter des signes de douleurs (grimace scale). L’administration massive d’alcool produisent les effets d’une ivresse importante (perte d’équilibre, ataxie). L’ACLF est un épisode grave chez le patient dont le pronostic vital est engagé. Le modèle animal présente, par voie de conséquence, lors de l’induction de l’ACLF des signes d’inconfort manifestes. L’administration unique ou répétée des agents inflammatoires ont des effets notoires sur les animaux dans les heures qui suivent les inductions. On s’attend à observer des animaux en état de choc et de détresse cardio-respiratoire, avec des épisodes de troubles de la régulation de la température corporelle. Les effets cités sont observés de manière plus ou moins prononcée, ces signes constituent les critères d’atteinte des points limites. Certains animaux présenteront ces symptômes à des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé. Dans les situations d’études de survie où le délai jusqu’à la mort est une donnée clé de la procédure, le recours au point d’arrêt anticipé sera appliqué et c’est à ce moment précis que sera déclarée la mort de l’animal. Pour évaluer les effets de nos composés, nous nous fixons comme objectif de reproduire une gravité qui sera jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique et conservant toute pertinence scientifique.
Devenir
L'intégralité des animaux sera mis à mort à l'issue des procédure afin de pouvoir étudier les biomarqueurs circulant, histologique ou transcriptionnelle permettant de caractériser la pathologie et l'efficacité d'une molécule.
Remplacement
La possibilité de disposer d’un modèle animal qui permet d’évaluer les effets des nouveaux composés sur tous les aspects d'une pathologie présente chez l’homme constitue une étape clé dans la lutte contre ces maladies et font de nos modèles des outils translationnels très pertinents. Bien qu'une première phase de sélection des meilleurs composés soit effectuée sur des modèles acellulaires ou cellulaires, contribuant ainsi à l’utilisation de méthodes alternatives visant à remplacer partiellement l’utilisation des animaux comme nous le rappelle la règle des 3R’s, l’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste cependant nécessaire. Les pathologies étudiées étant multi-organes, le recours à l'emploi d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et « global », capable de métaboliser les principes actifs donc de déceler les effets secondaires, capable d'activer toutes les voies de signalisation qui participent à la caractérisation de ce modèle. Son remplacement à ce stade du projet scientifique (phase pré clinique) n'est pas envisageable dans un système biologique isolé ou cellulaire qui quel que soit sa nature ne pourra apporter tous les enseignements issus de l'expérimentation in vivo.
Réduction
La stratégie de réduction consiste à ne réaliser que les essais avec les composés les plus prometteurs ayant satisfait aux étapes de sélection préliminaires in vitro. La réduction du nombre d'animaux est motivée par la longueur/lourdeur des procédures expérimentales, cela nous a conduit lors d'essais pilotes ou préliminaires de cibler le juste nombre d'individus nécessaires à l'obtention de résultats pertinents. Les paramètres que nous étudions in vivo (bio marqueurs, induction/répression de gènes, effets histologiques etc) doivent être relevant. Ces études pilotes nous permettront de caractériser et d’écarter les paramètres dont la pertinence serait trop faible pour être statistiquement décelable qu'avec des effectifs trop importants. Nous disposons de données expérimentales ou publiées dans la littérature sur les paramètres biologiques ou biomarqueurs les plus pertinents et "robustes". La connaissance de la variance de ces biomarqueurs permet de définir un effectif théorique à l'aide d’un test statistique qui associe variance et probabilité d'atteinte d'un seuil de significativité. Cette approche statistique permet d'affiner les effectifs et de réduire donc les nombres d'animaux qui seraient surévalués et non nécessaires à l'obtention d'un résultat biologique relevant. Une priorité sur le développement sera accès par rapport à la prépondérance observée chez l’homme : infection (LPS), consommation excessive d’alcool et/ou intoxication médicamenteuse (APAP), le développement des autres agents précipitants sera envisagé qu'au cas où ceux-ci ne donneraient pas les résultats escomptés. Dans le cas d’administrations de composés par voie veineuse en aigue ou en répétés, peuvent se présenter des difficultés techniques et nous oblige parfois à augmenter les effectifs de façon à combler les pertes.
Raffinement
Les rats sont hébergés par paire, l’enrichissement du milieu est systématisé par l’apport de dispositifs permettant aux animaux de rongeur (blocs ou billes des bois), un apport de coton compressé permet de maintenir l’instinct de création du nid, des tunnels en polycarbonate transparent teintés en rouge sont placés dans les cages pour apporter un espace simulant la dissimulation et favorisant le maintien de l’instinct grégaire des rats. Nous avons opté pour la pose de cathéters qui offrent un accès à l’aide d’un bouton métallique bouché par un obturateur aimanté qui présente l’avantage de pouvoir faire cohabiter les animaux dans une même cage sans crainte d’arrachage du cathéter par les congénères, cela constitue une amélioration significative du bien-être des animaux. L'établissement de points limites dans ce modèle expérimental de défaillance hépatique nous permet d'écarter tout individu susceptible de subir un inconfort trop important ou de la douleur. Bien conscient que nous développons dans ce projet des modèles sévères, nous nous efforçons d'avoir recours à des moyens analgésiques adaptés et non confondants. La pathologie et les mécanismes qui la déclenchent sont en partie connus, l'emballement inflammatoire en est une composante, le recours à des moyens de lutte contre la douleur peut introduire un biais expérimental ; une étape de validation s’impose pour chaque situation.
Choix des espèces
Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour dans le cadre de la cirrhose du foie de valider l’efficacité d’une nouvelle molécule dans le traitement de cette pathologie ou celles qui lui sont associées. Le génome des rongeurs et celui de l'homme ont 90% d’homologie, cela en fait un modèle de choix dans les études pharmacologiques. Le choix de l'espèce rat a été fait en se basant sur la littérature scientifique et sur nos connaissances des caractéristiques des molécules à tester. Pour les études menées sur les rats avec une présensibilisation au phénobarbital et induction au composé hépatotoxique, nous utiliserons des animaux de 4 semaines à l'arrivée (75-100 gr) âge préconisé dans la littérature, c’est en effet lorsque les rats ont atteint un poids de 100gr environ que l'effet du phénobarbital est le plus efficace. L'ensemble des autres études (sans présensibilisation au phénobarbital) sera réalisé sur de jeunes adultes, à savoir 6 à 7 semaines (250 à 300 g) à l'arrivée. Les traitements induits aux animaux affectent essentiellement la fonction hépatique et produisent des modifications métaboliques. Il est nécessaire de les appliquer sur un organisme développé, qui puisse mettre en place des mécanismes de réparation et de défense. L’animal au stade de jeune adulte qui a un système immunitaire compétent (microbiote bien établi) et des mécanismes de réponse à des stress inflammatoires correspond au stade de vie requis pour développer notre modèle expérimental.
Rôle du récepteur minéralocorticoïde dans la fibrose intestinale chez la Souris
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Tester si un médicament de l'hypertension déjà sur le marché freine la fibrose intestinale suppose ici d'infliger des colites chroniques à 924 souris, dont 374 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Une semaine d'antibiotiques vide leur microbiote, puis sept jours de gavage quotidien le remplacent par un autre, avant l'administration d'un agent chimique dans l'eau de boisson une semaine sur trois, ou par injection dans le rectum. Les protocoles durent 42 à 59 jours et provoquent, selon le porteur, une hypersensibilité viscérale sévère et une perte de poids, sans qu'aucun analgésique soit administré : il affirme que les quatre molécules disponibles interféreraient toutes avec l'inflammation étudiée. Les souris dont le score dépasse 3 sont mises à mort par surdosage d'anesthésiques.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) regroupent principalement la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique. Ces maladies se caractérisent par la répétition de poussées inflammatoires, entrecoupées de phases de rémission. Une complication fréquente des MICI est la fibrose intestinale. Celle-ci se caractérise par une paroi intestinale plus épaisse en raison d’une réparation excessive. Cela peut conduire à un rétrécissement de la lumière intestinale. Aujourd’hui, aucun traitement spécifique ne permet de prévenir ou d’inhiber le développement de la fibrose intestinale, ce qui conduit les patients à des interventions chirurgicales, d’où l’importance de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour prévenir ou inhiber la fibrose intestinale. Nous avons décidé de cibler le récepteur minéralocorticoïde (RM). Ce récepteur est impliqué dans la régulation de la pression artérielle. Or, la suractivation de ce récepteur est impliquée dans le développement de fibroses extra-intestinales. Par exemple, cibler le RM permet de diminuer la fibrose cardiaque induite dans un modèle murin d’hypertension artérielle. Ainsi, nous évaluerons l’effet de l’antagonisme du RM sur le développement de la fibrose intestinale dans des modèles murins de colite. De plus, le RM exprimé au niveau des macrophages joue un rôle dans le mécanisme du développement de fibrose dans différents contextes extra-intestinaux, d’où l’importance d’évaluer spécifiquement l’implication du RM exprimé au niveau myéloïde dans le développement de la fibrose intestinale.
Bénéfices attendus
Même si des progrès thérapeutiques notables ont été réalisés dans le traitement des MICI, il n’existe pas de traitement préventif ou thérapeutique contre le développement de la fibrose intestinale. Comme les antagonistes du RM ne sont pas contre-indiqués chez les patients atteints de MICI, nous pourrions repositionner les antagonistes du RM déjà disponibles sur le marché dans un nouveau champ thérapeutique. De plus, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents sur l’implication du RM dans le développement de la fibrose intestinale et en particulier le rôle du microbiote intestinal.
Procédures
Transfert de microbiote intestinal et induction de la fibrose intestinale. Les souris seront déplétées de leur microbiote par traitement antibiotique dans l’eau de boisson d’une durée d’une semaine. Puis, le transfert de microbiote intestinal se fera par gavage quotidien pendant 7 jours consécutifs et chaque gavage dure environ 1 min par souris. Les protocoles de colite chronique induite chimiquement se feront respectivement soit par administration de l’agent chimique dans l’eau de boisson, soit par une injection intra-rectale sous anesthésie/analgésie. L’administration de l’agent chimique dans l’eau de boisson dure 1 semaine et est répétée 3 fois au cours du protocole expérimental. L’injection rectale dure environ 1min. Les protocoles d’induction de fibrose sont de 59 jours et 42 jours respectivement. La composition corporelle est mesurée par EchoMRI les premiers et derniers jours de protocole de façon non invasive et la procédure dure environ 1 minute par souris. Dans le cadre de certaines procédures, des inhibiteurs pharmacologiques seront administrés dans l’alimentation des souris pendant toute la durée du protocole expérimental.
Impact sur les animaux
Les modèles de colites peuvent entrainer une hypersensibilité viscérale (modérée pour la colite aigue aux doses testées et sévère pour les modèles de colite chronique induite chimiquement) et une perte de poids corporelle chez la Souris
Devenir
A la fin du protocole, l’ensemble des animaux seront mis à mort afin de pouvoir évaluer différents paramètres physiologiques et marqueurs biologiques et collecter un maximum d’informations à partir de ces séries expérimentales.
Remplacement
Avant d’être testés in vivo, nos hypothèses de travail sont validées dans des modèles cellulaires comme des lignées de fibroblastes intestinaux humains ou des lignées de macrophages en conditions de fibrose. Cependant, ces modèles in vitro ne permettent pas de rendre compte de la complexité physiologique de la réponse fibrotique ou inflammatoire in vivo. Les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales.
Réduction
Ce projet s’efforce de réduire le nombre de souris au strict nécessaire pour que l’étude soit concluante et en collectant le maximum d’observations au cours d’une même expérience : (i) données nutritionnelles (composition corporelle, poids des animaux), (ii) inflammation, (iii) fibrose intestinale, (iv) fonction de barrière intestinale et (v) microbiote intestinal. Le nombre d’animaux nécessaires a été évalué selon la sensibilité et la spécificité des procédures utilisées, en fonction de l’expérience acquise lors de nos précédentes études, d’études pilotes pour valider les doses d’agents chimique et des données de la littérature. Pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, plusieurs approches combinées ont été prévues : des modèles de colites intestinales induites chimiquement par deux agents différents à des concentrations faibles mais efficaces d’après la littérature. Nous avons fait le choix d’utiliser une dose faible d’inducteur chimique pour limiter au maximum la mortalité, permettant ainsi d’optimiser le bien-être des animaux et de réduire le nombre d’animaux utilisés. - L’utilisation d’espèces d’animaux utilisés à des fins scientifique, caractérisés par une faible variation génétique permet de limiter la variabilité de la réponse biologique et par conséquent le nombre d’animaux. - L’effectif de chaque groupe a été déterminé par une approche statistique en prenant comme critère principal le score histologique. - Nous avons fait le choix de tester l’antagonisme pharmacologique ou génétique du RM uniquement sur les animaux colitiques et par conséquent de limiter les groupes contrôles au strict minimum. Les données obtenues chez des animaux contrôles seront réutilisées autant que possible. Par exemple, des échantillons de colon sont préservés dans le laboratoire et indiqués dans la base de données communes à notre Unité et peuvent ainsi être réutilisés au cours d’un autre protocole par nous ou une personne de l’Unité.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des cages standards (4-5 souris/cage), avec enrichissement. Une période d’acclimatation d’une semaine après réception des souris sera réalisée avant le début des procédures. - Les conditions de soins et les méthodes utilisées viseront à réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée des procédures, afin de déceler tout éventuel signe de souffrance. Une grille d’évaluation des point limites pour le bien-être animal sera utilisée . Un animal présentant un état de mal être ou de souffrance sera exclu de l'étude et mis à mort en fonction de son score et de la discussion avec les membres de la cellule SBEA. Pour limiter la douleur des animaux avec colite induite chimiquement, l’usage est de ne pas utiliser d’analgésique en raison de leur interaction potentielle avec le processus inflammatoire. Il existe 4 analgésiques potentiels utilisés dans l’inflammation intestinale, qui présentent tous un risque d’interférence avec notre modèle selon la littérature scientifique. Nous ne pourrons donc pas utiliser ces analgésiques dans nos procédures expérimentales. En cas d’atteinte des points limites (score >3), les souris seront mises à mort par surdosage d’anesthésiants.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est le mammifère non primate le plus proche (phylogénétiquement) de l’Homme. La souris est l’animal le plus couramment utilisé pour modéliser la colite expérimentale et les modèles génétiques d’invalidation du récepteur minéralocorticoïde ne sont disponibles que chez la Souris. Cette souche n’est pas résistante à l’induction de colite chronique par le DSS et le TNBS comme d’autres souches de souris et permet ainsi de réduire le nombre d'animaux utilisés. La lignée de souris a été utilisée par notre laboratoire pour la mise en place des techniques de greffe de microbiote intestinal et de déplétion du microbiote endogène des animaux greffés par antibiothérapie.
Effet d’un traitement périnatal à base de substances bioactives sur l’homéostasie intestinale dans un modèle d’IBS non inflammatoire
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Séparés de leur mère trois heures par jour entre le deuxième et le quatorzième jour de vie, gavés chaque jour pendant cette séparation, 720 souriceaux entrent dans un protocole impliquant un niveau de souffrance sévère. Leurs fèces sont collectées à trois, quatre, six, huit et dix semaines. Devenus adultes, ils reçoivent un gavage de molécule fluorescente, une ponction sanguine à la veine saphène, puis une distension colorectale poussée jusqu'à 80 mmHg pour mesurer leur sensibilité viscérale, avant d'être tués pour prélèvement de l'intestin et du cerveau. Le porteur affirme que la séparation maternelle pratiquée dans ses conditions "n'entraîne aucune autre nuisance" que l'hypersensibilité colique recherchée, tout en rappelant que d'autres protocoles de séparation néonatale font apparaître anxiété et dépression.
Objectifs
Les facteurs psychologiques occupent une place importante dans l’étiologie du syndrome de l’intestin irritable (SII). Il a été montré une forte association entre SII et anxiété, dépression ou encore somatisation. Les douleurs viscérales sont la forme la plus fréquente de douleur signalée en clinique. Il est maintenant reconnu que les douleurs viscérales peuvent être associées à des atteintes cognitivo-comportementales. La comorbidité entre les troubles psychologiques et viscéraux mène à une condition plus incapacitante que l’un ou l’autre seul, ce qui a un impact important sur la qualité de vie et la contribution à une charge économique importante. Bien qu’ils partagent des facteurs psychologiques et biologiques communs, y compris des voies neurales et des neurotransmetteurs similaires, le lien entre la douleur viscérale et les troubles psychologiques n’est pas bien compris. Les évènements stressants peuvent induire d’une part une exacerbation de la douleur et d’autre part induire de l’analgésie. Les troubles psychologiques liés au stress, y compris la dépression et l’anxiété, comptent parmi les affections médicales les plus invalidantes et les plus répandues. Ces troubles sont souvent concomitants avec diverses autres maladies systémiques et somatiques, allant des maladies cardio-vasculaires aux altérations de la fonction du tractus gastro-intestinal. Malgré l’association bien établie entre le stress et les troubles psychiatriques, des études pour une meilleure compréhension des processus complexes par lesquels le stress induit des changements pathologiques, augmentant la vulnérabilité à la maladie, sont en cours. Il a également été démontré que les facteurs de stress physiques et psychologiques augmentent la perception de la douleur viscérale. Ainsi, les interventions psychologiques et pharmacologiques qui favorisent la perception du stress améliorent les symptômes de douleur viscérale. Enfin, le stress, particulièrement pendant les phases de développements juvéniles, joue un rôle prépondérant dans le SII associé à de l’HSVC. Dans les modèles animaux, des études ont montré que les événements indésirables au début de la vie, comme la séparation de la mère (neonatal maternal separation - NMS), sont des facteurs de risque pour le développement d’une HSVC chronique à l’âge adulte.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet étant de mieux comprendre les mécanismes associés au SII, notamment ceux mises en jeu pendant la petite enfance et la maturation du tractus digestif, afin de développer de nouveaux outils pharmacologiques, le premier bénéfice attendu serait la caractérisation de cette physiopathologie et l’identification de nouvelles cibles pharmacologiques. Dans un second temps, la validation pré-clinique des effets bénéfiques de nouvelles molécules bioactives agissant sur les nouvelles cibles identifiées nous permettrait d’envisager une étude clinique. L’objectif à plus long terme serait donc de mettre en place cette étude clinique qui ferait intervenir des patients atteints de SII afin de tester les potentiels outils pharmacologiques développés au laboratoire. Cette étude permettrait d’ouvrir le champ des perspectives thérapeutiques visant à traiter les symptômes associés au SII et, in fine, à soulager les patients SII douloureux. Le bénéfice à long terme serait ainsi une meilleure prise en charge des douleurs et des comorbidités psychologiques chez le patient, qui reste actuellement extrêmement limitée.
Procédures
Entre l’âge de 2 et 14 jours, les souriceaux subiront une séparation de leur mère de 3h par jour entre 9h00 et 12h00. Durant cette période de séparation, les souriceaux recevront aussi par gavage des substances bioactives contenues dans des vésicules extracellulaires et préparées à partir de lait maternel humain dans un volume de 20µL. Il sera effectué une collection des feces à l'âge de 3, 4, 6, 8 et 10 semaines. A l'âge adulte de 8-10 semaines, un prélèvement sanguin faisant suite à un gavage d’une molécule fluorescente sera réalisé par ponction dans la veine saphène. Enfin, les souris subiront une distension colorectale afin d'évaluer leur sensibilité colique puis seront mis à mort afin de réaliser différents prélèvements intestinaux et cérébraux
Impact sur les animaux
Le gavage entraîne un stress physique léger de courte durée. De plus, en cas d’échec, le gavage en période péri-natale (quotidien entre l’âge de 2 jours et de 14 jours) peut être accompagné de signes pouvant inclure une incapacité à respirer, une respiration haletante significative ou une langue tirée pendant une longue durée. Concernant le gavage à l’âge adulte, celui-ci peut entrainer une certaine agitation, pouvant ainsi créer des fausses routes. Pour cette raison, une fois l’acte de gavage terminée, l’animal est observé pendant 1 min afin de s’assurer de tout risque de fausse route. Les prélèvements de sang au niveau de la veine saphène entraînent un stress physique léger de courte durée suivie occasionnellement d’une très légère perte de poids qui retourne à la normal en moins de 24h. La séparation des nouveaux nés réalisée dans nos conditions expérimentales entraîne une augmentation de la sensibilité colique (but du modèle) mais n’entraîne aucune autre nuisance chez l'animal, comme par exemple une perte de poids ou le développement d'un comportement anxio-dépressif. Cependant, il a été décrit dans d’autres protocoles de séparation des nouveaux nés, l’apparition de certains stress psychologiques comme de l’anxiété ou de la dépression. La distension colorectale entraîne de l’inconfort intestinale le temps des 20 secondes correspondant au test de mesure de la sensibilité colique, en particulier pour les fortes distensions de pression correspondant à 60 et 80 mmHg, mais une fois celle-ci terminée, l’animal présente un comportement de retour à la normal. Au final, un seul des gestes techniques est sévère en lui-même et de courte durée comme mentionné ci-dessus mais il est répété toutes les 5min pendant 20min, l'animal restant en semi-contention durant tout ce temps. C'est l'accumulation de tout ça, le jeune âge et la durée de la procédure qui nous incite à considérer cela comme sévère.
Devenir
A l'issu de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements d'organes nécessaire pour les analyses fonctionnelles (biologie moléculaire et histologie).
Remplacement
Il apparait indispensable de travailler sur des animaux afin de pouvoir étudier l’impact d’un stress néonatal sur les variations de l’homéostasie intestinal. L’utilisation de différents modèles cellulaires in vitro pour répondre aux objectifs de ce projet n’est donc pas envisageable.
Réduction
Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Les tests statistiques seront réalisés grâce au programme d'analyse statistique et les principales analyses, notamment de suivi du poids, seront effectuées.
Raffinement
Afin de réduire une éventuelle souffrance, les animaux seront surveillés quotidiennement (week-end et jours fériés compris) voir deux ou trois fois par jour si l’état le nécessite par l'expérimentateur mais aussi par le personnel de l'animalerie. La douleur sera abrégée sans délai via l’administration d’antalgique dérivé de la morphine, ou si un animal présente une trop forte douleur, un comportement stéréotypé ou anormal, une posture anormale ou une réduction de poids significative sur 3 jours, celui-ci sera euthanasié par le personnel de l’unité de stabulation animale. Les personnes qui manipuleront et observeront les souris sont expérimentées. Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à l’espèce et qui respectent leur bien-être : densité animale, température, hygrométrie contrôlées, présence d’enrichissement, eau et nourriture à volonté. Les animaux seront habitués aux expérimentateurs et aux manipulations.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle expérimental est appuyé par sa pertinence pour l’étude des pathologies intestinales in vivo (Gkouskou et al., 2014) ainsi que par la disponibilité de lignées d’animaux génétiquement modifiés et l’existence de nombreux outils d’analyse (anticorps, kit ELISA…) développés pour cette espèce. Les souris subiront un stress néonatal de PND2 à PND14 puis seront utilisées au stade adulte (8-10 semaines). En effet, l’utilisation des animaux à ce stade de développement permet de limiter les biais liés à des différences pouvant se développer au cours de la vie de l’animal. La réduction de la variabilité inter-individus permet ainsi de réduire le nombre d’animaux à expérimenter.
Impact des maladies hépatiques sur la fonction de barriere de la muqueuse intestinale
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Une perte de poids supérieure à 20 pour cent, une posture prostrée, un léchage anormal ou des poils hérissés déclenchent l'arrêt immédiat de l'expérience et la mise à mort de la souris concernée. 3 264 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Deux modèles de colite provoquent douleurs abdominales, sang dans les selles, diarrhées et perte d'appétit, tandis que la cholestase hépatique est induite par un composé mêlé aux croquettes ou par deux injections intrapéritonéales par semaine pendant huit semaines. Le porteur écrit renoncer aux analgésiques et aux anti-inflammatoires, qui "risquent d'interférer" avec le cours de l'expérimentation, et s'en remet aux seuls critères d'arrêt.
Objectifs
La cholangite sclérosante primitive (CSP) est une maladie chronique du foie dans laquelle des fibroses et une inflammation chronique prennent place suite à la formation de sténoses biliaires multifocales. 70% des patients atteints de CSP souffrent également de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) dont notamment la rectocolite hémorragique (RCH). Cette coexistence chez le patient de ces maladies pouvant mener à un cholangiocarcinome (CCA) ou à un cancer colorectal pour lesquels les taux de survies sont faibles. Notre projet se concentre sur la compréhension des mécanismes impliqués dans le développement de la CSP et des MICI. Laquelle de ces deux pathologies se développent en 1er ? et est-ce que l'apparition de l'une favorise le développement de l’autre ? Ainsi, les objectifs du projet visent à étudier l'impact de la mise en place d'une CSP sur la fonction de barrière de la muqueuse intestinale et la susceptibilité de cette dernière à développer une inflammation. Réciproquement, l'utilisation de modèles murins de MICI favorise-t-il le développement de la CSP. En fonction des résultats obtenus, nous focaliseront l'étude des mécanismes impliqués sur le microbiote la perméabilité et les acides biliaires.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet permettra de comprendre comment la CSP et les MICI se développent. Dans un premier temps, ce projet permettra de définir l'impact de la CSP sur la fonction de barrière de la muqueuse intestinale et sur la susceptibilité de la muqueuse intestinale à l'inflammation. Il permettra également de définir l'impact d'un contexte de susceptibilité génétique aux MICI dans le développement de la CSP (sévérité) ainsi que les conséquences de cette CSP sur la fonction de barrière de la muqueuse intestinale et sur la susceptibilité de la muqueuse intestinale à l'inflammation. Dans un deuxième temps, ce projet permettra de définir l'impact d'une inflammation intestinale sur le développement de la CSP. Ce projet permettra donc de définir les liens de causalités entre le développement de la CSP et des MICI ainsi qu'une meilleure compréhension des mécanismes impliqués. Une meilleure compréhension de ces maladies permettra alors une meilleure prise en charge thérapeutique.
Procédures
Pour le 1er modèle de CSP, aucune intervention sur les souris est prévue puisque le composé chimique est inclus dans les croquettes. Pour le 2-ème modèle de CSP, 2 injections (1 minute par injection et par souris) intra-péritonéales par semaine pendant 8 semaines seront nécessaire. Pour le 1er modèle d'inflammation colique, aucune intervention sur les souris est prévue puisque le composé chimique est inclu l'eau de boisson. Pour le 2ème modèle inflammatoire, 1 injection sous-cutanée (2 minutes) et une injection intra-rectale (2 minutes par souris). Pour les 2 procédures de CSP (procédures 1 et 2), les prélévements suivants sont prévus: - prélevements de selles une fois par semaine pendant la duré de la procédure; -1 prélèvement sanguin sera réalisé une fois par semaine, les deux dernières semaines de la procédure (1 minute par souris). En post-mortem, des prélèvements de foie, de contenu luminal, de duodénum, d'iléon et de colon post-mortem seront réalisés. Pour les 2 procédures d'inflammation coliques (procédures 3 et 4), la sévérité de l'inflammation sera determinée chaque jour en mesurant la perte de poids et les scores d'activité de la maladie (1 minute/ souris). En post-mortem, les scores macroscopiques inflammatoires seront déterminés (longueur et épaisseur du colon, taille de l'oedeme et des adhérences mésentériques) et des prélèvements tissulaires seront réalisés
Impact sur les animaux
Avec le régime supplémenté ou avec le modèle d'injection, l'induction du processus de cholestase hépatique est asymptomatique et sans douleur. Seuls les animaux traités par injection intrapéritonéale ressentiront potentiellement une douleur légère et de courte durée. Par contre, pour les deux modèles de colites, des douleurs inflammatoires transitoires seront ressenties par les animaux. Les nuisances liées aux modèles DSS ou Oxazolone sont les suivantes : pertes de poids, douleurs abdominales, sang dans les selles, diarrhées, perte d’appétit et souris prostrées.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés. Les organes seront prélevés et utilisés pour des analyses ultérieures en laboratoire
Remplacement
Le développement de la cholangite sclérosante primaire (CSP) et des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) chez l’Homme est un processus long et complexe mettant en jeu de nombreux facteurs génétiques et environnementaux. Les modèles murins génétiquement modifiés miment les pathologies humaines et sont la seule solution actuelle pour obtenir des données avec une relevance physiologique correcte. Pour atteindre les objectifs de nos études, il est nécessaire d'utiliser des modèles in vivo capables de tenir compte de nombreuses voies physiologiques intégrées. Actuellement, il n'existe pas de méthodes alternatives à ces études in vivo. L'espèce animale utilisée dans ce projet (souris) offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant plusieurs pathologies humaines comme en témoignent les nombreuses références bibliographiques (CSP et MICI). De plus, notre projet de recherche est basé sur l'utilisation des animaux génétiquement modifiés qui nécessitent d’utiliser des animaux contrôles sauvages. Aucune autre espèce d'animaux n'est disponible. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d'outils précieux (anticorps, primers) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués.
Réduction
Le nombre de souris utilisé dans chaque expérience a été calculé à minima en tenant compte de la variance biologique des résultats obtenus. Les données obtenues dans les différents groupes seront comparées à l'aide d'un test statistique approprié. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tous les échantillons prélevés sont stockés à - 80°C et dans une banque de données. Ils peuvent être réutilisés ou servir de témoins dans des expériences ultérieures.
Raffinement
Les souris sont hébergées par 5 dans des cages de portoirs ventilés d’une surface au sol de 500 cm2, à 20-24°C et 30-50% d’hygrométrie, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Elles ont une maison en plastique et des fibres de carton comme enrichissement. Les animaux ont au minimum une semaine d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Des analgésiques, des antalgiques ou des anti-inflammatoires risquent d'interférer avec le cours de notre expérimentation. Néanmoins, nous avons mis en place des critères d'arrêt par rapport à la souffrance potentielle des souris durant l'expérimentation. Les souris sont contrôlées tous les jours, voire deux fois par jour. Les critères suivants sont pris en compte : - perte de poids est supérieure à 20% du poids initial - activité extrême (grattage ou léchage anormal) - posture prostrée - aspect (amaigrissement, déshydratation, poils hérissés, salissures et écoulements) - absence de toilettage et diminution de l'appétit - anomalies de la respiration (rythme et mouvements) - hypo ou hyperthermie. Si l'un de ces critères est atteint, l'expérimentation est immédiatement arrêtée et les souris sont euthanasiées. Un suivi quotidien est assuré par les membres de la SBEA (Structure en Charge du Bien-Etre Animal).
Choix des espèces
L'espèce animale utilisée dans ce projet (souris) offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant plusieurs pathologies humaines comme en témoignent les nombreuses références bibliographiques (Cholangite sclérosante primaire (CSP et les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI)). Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l'utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. De plus, notre projet de recherche est basé sur l'utilisation des animaux génétiquement modifiés qui nécessitent d’utiliser des animaux contrôles sauvages. Aucune autre espèce animale n'est disponible. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d'outils précieux (anticorps, primers..) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Enfin, les procédures de CSP et de MICI utilisées dans ce projet ont été validées que chez la souris. Souris jeunes et adultes (de 4 et 8 semaines). A cet âge, aucune des lignées étudiées ne présentent de phénotype. Pour les procédures (impact des modèles de CSP sur la fonction de barrière intestinale et la susceptibilité à l'inflammation) nous utiliserons des souris âgées de 4 semaines. Ces souris seront traitées avec les deux procédures expérimentales permettant d'induire une CSP. Puis, certains lots de souris seront traités ou non avec l'une des deux procédures expérimentales permettant d'induire une inflammation intestinale. Pour les procédures (impact de la colite sur la sensibilité à la CSP) nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines. Ces lots de souris seront traités ou non avec les deux procédures expérimentales permettant d'induire une inflammation. Puis, certains lots de souris seront traités ou non avec l'une des deux procédures expérimentale permettant d'induire une CSP.
Etude de la qualité nutritionnelle de régimes alimentaires et leurs potentiels effets sur la santé humaine dans un modèle de mini-porcs
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Trois heures de chirurgie pour implanter des cathéters permanents, une sonde débitmétrique et une canule dans l'iléon ou l'estomac, puis six journées de prélèvements de sept heures avec dix prises de sang simultanées sur deux cathéters, soit 54 millilitres par journée : 64 mini-porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet teste la digestibilité de régimes végétalisés et l'effet d'un probiotique sur l'assimilation des nutriments, en vue de recommandations pour l'alimentation humaine. Chaque animal reste hébergé seul dans une case aux parois transparentes, et le porteur ramène les douleurs abdominales postopératoires à quelques jours suivis d'une gêne qu'il qualifie de mineure. Tous sont tués à la fin des essais, pour récupérer le matériel implanté et prélever des muscles.
Objectifs
Notre unité de recherche aborde la nutrition de manière intégrée, depuis la qualité des aliments et des régimes alimentaires jusqu’à leurs effets sur la santé dans le cadre d’une transition vers une alimentation plus durable. Le projet s’inscrit totalement dans cette thématique puisqu’il a pour objectif de tester la qualité nutritionnelle de régimes alimentaires végétalisés en évaluant la digestibilité des macro et micro-nutriments qu’ils contiennent. Une optimisation de cette digestibilité permettra ainsi d’améliorer la qualité de l’alimentation et ses effets sur la santé. Nos pistes pour élaborer une stratégie nutritionnelle efficace sont 1) de tester des repas complets avec un apport optimisé à la fois en protéines de qualité et en fibres mais aussi avec un apport limité en facteurs antinutritionnels et 2) d’améliorer l’utilisation des nutriments par l’hôte à l’aide d’une stratégie d’amélioration du microbiote intestinal via l’apport d’un probiotique. Ce projet mettra en oeuvre un modèle de mini-porcs.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est l’élaboration de stratégies nutritionnelles adaptées à des situations physio-pathologiques. Le projet devrait donner à la fois des indications quant à la biodisponibilité des macro et micro-nutriments de régimes optimisés et des pistes sur leurs effets sur la santé de l’hôte. L’objectif principal est de trouver une matrice alimentaire qui soit la plus digestible possible permettant ainsi de contre-carrer un état physio-pathologique tel que l’insulino-résistance ou la résistance anabolique post-prandiale observée lors du vieillissement.
Procédures
Chaque animal subira une seule demi-journée (3h) d’intervention chirurgicale pour la pose de cathéters permanents, de sonde débit-métrique et de canule iléale et/ou gastrique (1h de préparation pré-opératoire, et 2 h entre l’incision cutanée et le réveil de l’animal). Une période de récupération de 15 jours sera observée , entre la chirurgie et la première journée de prélèvements. Chaque animal participera au final à 6 cinétiques post-prandiales d’une durée de 7h suivie d’une période de récupération de 7 jours minimum entre chaque cinétique. Lors d’une journée de prélèvement, les animaux recevront le matin comme seul aliment un des régimes à tester. Des prélèvements de sang seront réalisés simultanément dans les 2 cathéters avant et après le repas selon la cinétique de 10 prélèvements sanguins en simultanés sur chaque vaisseau pour chaque animal, étalés sur une journée de 9 heures. Pour chacune des journées de prélèvements, 2.7 ml de sang seront prélevés sur chaque cathéter à chaque point de cinétqiue. Le volume total prélevé sera de 54 ml par cinétique (moins de 5% du volume sanguin de l'animal).
Impact sur les animaux
Des douleurs abdominales peuvent être ressenties par l’animal suite à l’intervention chirurgicale. Elles peuvent se manifester dans les premiers jours suivant l’opération, mais après cette période de récupération, elles restent mineures.
Devenir
En fin d'expérimentation les animaux seront euthanasiés, afin de récupérer le matériel implanté et d'effectuer des prélèvements d'organes pour l'évaluation de l'effet des régimes sur la santé musculaire des animaux.
Remplacement
La biodisponibilité des nutriments fait intervenir de nombreux processus biologiques coordonnés et régulés, qui à ce jour ne peuvent pas être reproduits in vitro.
Réduction
L'effectif prévu dans le schéma expérimental (8 animaux maximum inclus dans le schéma expérimental de la procédure 1 et 6 animaux par lot dans la procédure 2) est réduit à son minimum en tenant compte de la variabilité du principal paramètre mesuré (apparition des acides aminés dans le sang), estimée à partir de nos précédentes études sur la biodisponibilité des nutriments réalisées avec un design expérimental similaire. Cette variabilité est liée non seulement de la variabilité interindividuelle des animaux, mais aussi à la qualité des prélèvements effectuées et à la précision des données obtenues par l’analyse biochimique. Ces aspects sont parfaitement maitrisés par les expérimentateurs du projet qui ont une longue expérience dans le domaine. Le fait d’utiliser un schéma expérimental en carré latin permet de diminuer significativement le nombre d’animaux utilisés (chaque animal étant son propre témoin). L'équipe de recherche impliquée dans le projet a une longue expérience sur l'utilisation d'animaux porteurs de canules digestives et de cathéters sanguins, ce qui permet de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés dans le projet, et de prévenir les processus douloureux. L’analyse statistique des données cinétiques (concentrations artérielles en acides aminés, flux de matière sèche et d’azote dans l’intestin chez le porc), sera réalisée avec l’animal comme variable aléatoire, et le temps, le repas et l’interaction temps x repas, comme facteurs. Pour les données représentant la valeur moyenne d’une variable (par exemple la digestibilité) une analyse de variance classique sera réalisée (repas, animal, semaine de prélèvement, comme effets principaux).
Raffinement
L’approche développée sera peu invasive, et peu traumatisante pour l’animal. La douleur imposée aux animaux pendant l’expérimentation est liée à l’acte chirurgical lequel se déroule sous anesthésie général avec monitoring des constantes vitales. Les animaux recevront pendant 6 jours un traitement analgésique et spamolytique, mais après cette période de récupération, elles restent mineures. Pendant la période de récupération, les animaux sont surveillés régulièrement (visite toutes les 2 h pendant la journée). L'évaluation de la gêne et de la douleur est faite par observation du comportement des animaux : reprise de l'alimentation, du transit intestinal, posture, vocalises, réactivité et la température corporelle. Pendant toute la durée de la période d'expérimentation, les animaux seront hébergés dans des cages, individuelles, au sol de taille réglementaire avec des copeaux de bois comme litière leur permettant de réaliser une activité de fouissage, et avec des parois latérales en plexiglass pour que les animaux puissent se voir et interagir entre eux. Leur environnement est enrichi à l’aide d’une chaîne en métal fixée sur les parois et de ballons. La pièce est à température régulée. Les animaux ont libre accès à l'eau.
Choix des espèces
Le porc présente un certain nombre de similitudes anatomiques et physiologiques avec l'homme. C’est la raison pour laquelle il est fréquemment utilisé comme modèle pour les études de nutrition. Le mini-porc permet de travailler sur des adultes (à stabilité pondérale) d'une taille compatible avec l'expérimentation animale. Il présente de plus l'avantage d'avoir un système digestif très proche de celui de l'Homme et d'accepter de manger tous types d'aliments. Ce modèle animal est reconnu par la communauté scientifique comme pertinent pour des études sur la digestibilité d'aliments avec un tranférabilité facilité à des études de la physiologie humaine. La procédure expérimentale est réalisée sur des animaux en fin de croissance (âge>10 mois), afin de bénéficier d'une stabilité pondérale pendant la totalité de la période d'expérimentation.
Compréhension de la relation entre le mucus intestinal et le système myentérique dans la prévention par les acides gras oméga3 de l’hyperperméabilité intestinale induite par l’obésité alimentaire chez la souris fat-1 mâle et femelle
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Les souris utilisées portent une modification génétique qui enrichit tous leurs tissus en acides gras oméga3, à un niveau que le porteur décrit comme inatteignable par l'alimentation. 232 souris vont être utilisées, 72 d'entre elles anesthésiées puis tuées sans reprise de conscience, les 160 autres soumises à des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent un régime hyperlipidique pendant huit semaines, restent isolées en cage individuelle sur toute cette durée, subissent des gavages, un prélèvement submandibulaire sous anesthésie et une série de prises de sang à la queue toutes les quinze à trente minutes lors du test de tolérance au glucose. Toutes sont tuées par ponction intracardiaque à la fin de la huitième semaine, pour prélever sang et colon.
Objectifs
L’obésité alimentaire contribue à perturber la fonction barrière de l’intestin en détériorant la quantité et la qualité de la flore intestinale. En tant qu’aliments thérapeutiques, les lipides dits en oméga3 (particulièrement présents dans les poissons ou certaines huiles alimentaires) sont connus notamment pour améliorer cette fonction barrière. Dans ce contexte, nous étudions l’impact des lipides dits en oméga3 en particulier sur l’intégrité de la couche de protection qui tapisse l’intestin et la contribution de la flore intestinale. Nous avons montré précédemment que des souris mâles aux tissus riches en lipides en oméga3 sont protégées de l’obésité alimentaire, de l’altération de la perméabilité intestinale et du passage de molécules issues de bactéries de la flore intestinale dans le sang, molécules qui sont capables de provoquer une inflammation chronique de faible intensité. Chez la souris mâle, cette protection est transmissible à d’autres souris par la transplantation de la flore intestinale de souris aux tissus riches en lipides en oméga3. Chez la souris, un excès de lipides alimentaires ne provoque pas les mêmes troubles métaboliques chez les mâles et les femelles. Le poids corporel et l’assimilation du sucre sont moins altérés chez les femelles. Il s’avère donc nécessaire, de comparer chez des souris mâles et femelles aux tissus riches en lipides en oméga3 ou non comment l’obésité alimentaire et ses perturbations au niveau intestinal vont s’installer et si la flore intestinale est impliquée. L’obésité alimentaire entraîne également une modification du système nerveux intestinal. Cette modification pourrait également affecter l’intégrité de la flore intestinale et de la couche de protection qui le tapisse. Le système nerveux intestinal constitue donc une nouvelle cible d’étude, en particulier dans la compréhension des phénomènes contribuant à la mise en place des modifications de la perméabilité intestinale conduisant à une inflammation chronique de faible intensité. Ainsi, dans le contexte de lutte contre l’obésité, les objectifs de ce projet sont de comprendre le rôle des lipides dits en oméga3, chez la souris mâle et femelle dont les tissus sont riches en ces lipides, dans la protection contre l’inflammation chronique de faible intensité et de comprendre le rôle du système nerveux intestinal, de la couche de protection qui le tapisse et de la flore intestinale, différents éléments de la perméabilité intestinale.
Bénéfices attendus
L’obésité induit une altération de la perméabilité intestinale entrainant un passage de molécules de la flore intestinale dans la circulation sanguine, qui est en partie responsable d’une inflammation générale légère et chronique. L’étude de l’impact des lipides oméga3 est une piste privilégiée d’amélioration. Cependant, les études nutritionnelles, chez l’homme ou le rongeur, présentent de nombreux biais rendant les données peu concluantes. Les souris aux tissus riches en lipides oméga3 représentent donc une alternative de choix dans l’étude de l’impact de ces lipides sur les maladies associées à l’obésité alimentaire, bénéfice que nous avons déjà montré sur la prise de poids ou le diabète. Nous avons également récemment montré, chez la souris mâle, que le seul transfert de la flore de souris aux tissus riches en lipides oméga3 à des souris WT les protègent efficacement de ces pathologies mais également des altérations de la perméabilité intestinale et de la couche de protection qui le tapisse. Bien qu’il existe des différences entre sexes dans le développement des troubles métaboliques dus à l’obésité, aucune étude n’a encore exploré cet aspect chez la souris femelle afin de comprendre les différences observées. L’obésité alimentaire entraîne également une modification du système nerveux intestinal. Cette modification pourrait également affecter l’intégrité de la flore intestinale et de la couche de protection qui le tapisse. Le système nerveux intestinal constitue donc une nouvelle cible d’étude afin de comprendre les phénomènes contribuant à la mise en place des modifications de la perméabilité intestinale conduisant à une inflammation chronique de faible intensité. Ce projet a maintenant pour but, dans un contexte d’inflammation chronique due à l’obésité, de comprendre le rôle des lipides oméga3, chez le mâle et la femelle, dans l’amélioration de la fonction barrière de l’intestin et sur la structuration de la couche qui le tapisse l’intestin et sur le système nerveux intestinal. Il est également important de déterminer la contribution de la flore intestinale. En effet, ce projet pourrait permettre l’identification de bactéries favorables, éventuelles futures cibles probiotiques, essentielles au bon fonctionnement de la barrière intestinale lors de l’obésité.
Procédures
Les animaux seront manipulés de façon hebdomadaire afin d’évaluer leur poids. De plus, - Au début du régime, les animaux seront placés en cages individuelles avec couvercle filtrant ou collectives - Aux semaines 1 et 8 des fèces seront collectés (3 à 4 crottes sur une durée d’une dizaine de minutes) - Prélèvement de sang à la semaine 7 d’expérimentation, 4 heures après le gavage avec une solution de Dextran-FITC niveau de la région submandibulaire afin de mesurer la perméabilité intestinale. Chaque prélèvement sanguin sera réalisé en une vingtaine de seconde. - Prélèvement de sang, 4 heures après le gavage avec une solution de glucose, à la semaine 8 d’expérimentation. Le prélèvement est réalisé au niveau de la partie terminale de la queue de la souris aux temps 0, 15, 30, 60, 90, 120 minutes après le gavage au glucose pour mesurer la glycémie (chaque prélèvement sanguin sera réalisé en une vingtaine de seconde). - Un prélèvement terminal sera effectué à la fin de la semaine 8 via une ponction intracardiaque nécessitant une à deux minutes par animal.
Impact sur les animaux
Afin d’éviter la dominance d’un des congénères pouvant limiter l’accès à la nourriture et empêcher le brassage de microbiote entre les animaux, les souris seront placées en cage individuelle munie d’un couvercle filtrant pour la durée de l’étude nutritionnelle (8 semaines). L’obésité provoquée par un régime hyperlipidique peut être source de difficultés pour les animaux rendant le toilettage ou l’accès à l’eau de boisson difficile. Le prélèvement d’une goutte de sang au niveau de la partie terminale de la queue (à l’aide d’une aiguille 26G) pour la mesure de la glycémie lors du test de tolérance au glucose), le prélèvement submandibulaire après anesthésie à l’isoflurane et les gavages oro-gastriques (pour les instillations de microbiote) sont des gestes pour lesquelles peu ou pas de douleur est attendue puisqu’ils seront réalisés par un personnel maitrisant très bien ces gestes techniques et les animaux seront observés plusieurs fois dans la journée (en cas de fausse route l'animal montre des signes de souffrance assez rapidement). Tous les animaux de l’étude seront suivis par un personnel compétent selon les modalités mise en place par la Structure chargée du Bien-être Animal de la plateforme de Zootechnie. Nous leur donnerons comme enrichissement de milieu dans toutes les cages des carrés de coton pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Une observation générale quotidienne des animaux sera effectuée et une observation et manipulation individuelle hebdomadaire sera réalisée à l'occasion de la pesée et de l'entretien des animaux. Ainsi, si une souris est en souffrance nous pourrons agir rapidement.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue du projet afin de réaliser des prélèvements de différents tissus (sang, colon)
Remplacement
Un modèle de souris transgénique dont les tissus sont intrinsèquement riches en lipides en oméga3 est un modèle précieux car cette souris possède un niveau d’enrichissement dans ses tissus qui n’existe dans aucun autre modèle murin et qui est non atteignable par des stratégies alimentaires. D’une part, l’ubiquitisme de l’enrichissement tissulaire en lipides en oméga3 et d’autre part les taux tissulaires obtenus rendent impossible le remplacement de ce modèle de souris par des modèles in vitro. De plus, le protocole décrit vise à étudier le système nerveux intestinal lors de l’altération par un régime riche en lipides de la fonction barrière de l’intestin en relation avec la formation de la couche qui le tapisse (mucus). Il est impossible de complètement modéliser ce processus et ces interactions à travers des approches in vitro. En effet, si la co-culture de cellules entériques gliales et de lignées cellulaires coliques secrétant de mucus pourrait être envisagée, un tel modèle ne permettrait pas de reproduire in vitro la complexité des interactions entre le système nerveux intestinal et les cellules qui secrètent le mucus, mucus qui apparait bicouche avec une structuration très organisée in vivo. Cette structuration très organisée représente un enjeu essentiel pour le maintien de la perméabilité intestinale et le dialogue entre le système nerveux intestinal, le mucus et la flore microbienne qui y vit. Cette étude est par ailleurs menée dans un contexte d’obésité alimentaire. Ce contexte est difficile à modéliser en raison de la complexité des impacts métaboliques observés et de la diversité des approches de régimes utilisés. Cet aspect ne peut donc également pas s’affranchir de l’utilisation d’animaux. Enfin, aucune étude n’a encore exploré chez la souris femelle cet aspect bien qu’il ait été montré des différences entre les sexes dans le développement des troubles métaboliques induits par un régime obésogène. Cette étude est donc unique dans l’approche de l’étude de l’impact des lipides en oméga3 sur le système nerveux intestinal et le mucus intestinal dans un contexte d’obésité alimentaire et de ses pathologies associées.
Réduction
Les effectifs ont été optimisés sur la base des coefficients de variabilité reportés dans la littérature et les différences attendues entre les différents groupes pour les paramètres clés de l’étude. Lors de la conception des protocoles expérimentaux nous avons déterminé le nombre de 12 et 8 animaux par groupe nécessaire et suffisant à l'obtention de résultats statistiquement exploitables. Afin de réduire le nombre d’animaux intégrables dans le protocole, en amont de la production des animaux, les souris WT sont croisées entre et elles et les souris Fat-1 homozygotes entre elles générant des descendants tous intégrables dans le protocole et ceux sans génotypage.
Raffinement
En raison de la nuisance et de la souffrance modérée induite par l’isolement en cage individuelle durant toute la durée de l’expérimentation (8 semaines), une attention particulière sera apportée à l’enrichissement du milieu . Toutes les souris auront accès à des enrichissements de milieu dans chaque cage, constitués de carré de coton et/ou papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Une attention particulière sera également portée à la surveillance de la prise de nourriture et aux comportements liés au stress. Les souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée en secteur conventionnel et intégration dans le projet. A la suite des interventions (OGTT, instillations de microbiote par gavage ou gavage avec le Dextran-FITC) chaque animal sera examiné. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée.
Choix des espèces
La détermination de l’impact d’un régime obésogène sur la perméabilité intestinale et la relation entre microbiote/mucus est primordiale à notre étude. Cet aspect ne peut s’affranchir de l’utilisation d’animaux afin de mimer au mieux un contexte d’inflammation bas grade. Bien que relativement éloignée de l’Homme, l’espèce murine est l’espèce animale de référence dans ce domaine de recherche et la plus utilisée en recherche préclinique avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. Le modèle de souris transgénique fat-1 est un modèle précieux qui rend cette étude unique dans l’approche de l’impact des lipides en oméga3 sur la prévention de l’hyperperméabilité intestinale induite par un régime obésogène. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 12 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids supérieur à 20g. En effet, nous nous intéressons à l’obésité et aux conséquences métaboliques associées développées par les jeunes adultes car il a été montré que l’augmentation en France de l’obésité touche toutes les tranches d’âge mais que la fréquence semble plus élevée dans les tranches 25-34 et 35-44 (de l’ordre de 8% par an). De telles données sur le jeune adulte ont été également confirmées aux Etats-Unis et récemment en France. De plus, les études précédentes mettant en évidence la transmission de la résistance partielle de l’induction de l’obésité alimentaire par le microbiote de souris fat-1 à des souris WT au laboratoire a porté sur l’animal jeune adulte. Nous souhaitons pouvoir inscrire ces nouvelles expérimentations dans notre objectif thématique plus global.
Elevage de souris transgéniques utilisées pour l’étude de l’impact des cellules immunitaires sur le foie
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Baguées à l'oreille, amputées d'un bout de queue pour lire leur ADN, sexées et séparées de leur mère à trois ou quatre semaines, 1 090 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans ce projet d'élevage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles retenues passent en accouplement vers six semaines, les autres entrent en expérience à partir de dix semaines. Le porteur affirme que les souris porteuses de la mutation ne développent aucune maladie et ne diffèrent pas des autres, l'élevage servant à alimenter des projets sur les maladies des petits vaisseaux du foie. Celles qui ne portent pas les bonnes modifications de gènes sont tuées dès réception du génotype, les reproductrices deux mois après leur dernière portée, et celles gardées en réserve passé 20 semaines pour les femelles et 30 pour les mâles.
Objectifs
Notre projet est d'étudier le rôle de certaines cellules de défense de l'organisme dans le développement des maladies des petits vaisseaux du foie. Nous allons pour cela utiliser des souris possédant une mutation à l'origine d'une diminution de leurs cellules de défense de l'organisme. Pour ce projet, nous avons tout d'abord besoin d’identifier ces souris (par une bague à l’oreille) et d'étudier l'ADN de ces souris (prélèvement d'un petit bout de leur queue) pour s'assurer de la présence de la mutation qui permet la diminution des cellules de défense avant de pouvoir réaliser des accouplements des souris ou de réaliser des expérimentations.
Bénéfices attendus
Le projet va permettre l'élevage des lignées de souris nécessaires pour étudier la maladie des petits vaisseaux du foie qui est encore largement incomprise. Améliorer sa compréhension est très important à la fois pour : 1/ prévoir quels patients risquent de développer cette maladie, quelle sévérité attendre et donc prévoir un suivi plus approprié. 2/ trouver de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Ce projet consiste en l’élevage de souris génétiquement modifiées. Pour s’assurer que les souris ont bien la mutation d’intérêt, nous réaliserons le prélèvement d’un petit bout de queue à 3-4 semaines dans la vie de la souris. Ce geste nécessitera le maintien de l’animal pendant une trentaine de secondes. Ce petit bout de queue permettra d’obtenir l’ADN de la souris et ainsi de s’assurer de la présence de la mutation génétique d’intérêt. Les souris nées des accouplements seront sexées (identification et séparation des mâles et des femelles) et sevrées (séparation d’avec leur mère) à l’âge de 3-4 semaines.
Impact sur les animaux
Lors du prélèvement du petit bout de queue, une contention de courte durée est nécessaire, pouvant entrainer un stress et une légère douleur à la queue, de très courte durée. Un léger saignement est également possible. Les animaux qui ont la mutation d’intérêt ne développent pas spontanément de maladie particulière et ne sont pas différents des animaux non mutés.
Devenir
Les souris produites au cours de ce projet seront soit incluses dans d’autres protocoles expérimentaux, soit utilisées ou stockées pour générer de nouveaux accouplements. Les souris ne présentant pas les bonnes modifications de gènes seront immédiatement euthanasiées. Les souris utilisées pour des accouplements seront euthanasiées lorsqu'elles n'auront plus donné de portées depuis 2 mois. Les souris stockées pour de futurs accouplements seront euthanasiées lorsqu’elles seront âgées de plus de 20 semaines pour les femelles et de plus de 30 semaines pour les mâles (souris trop âgées pour être utilisées en accouplement).
Remplacement
Les pathologies du foie sont des pathologies complexes sous l'influence de nombreux facteurs notamment environnementaux. Cette pluralité des facteurs de risque et d’interactions à l'origine du développement de la maladie des petits vaisseaux du foie, rend particulièrement difficile l’étude chez l’humain. Grâce au modèle des souris nous nous affranchirons ainsi de nombreux facteurs environnementaux à l’origine du développement de la maladie des petits vaisseaux et pourrons étudier l’effet d’un seul facteur.
Réduction
Nous adapterons l’élevage au besoin de souris pour réalisation des expériences permettant l’étude de l’effet d’une variation du nombre de cellules de défenses sur le développement de la maladie des petits vaisseaux du foie. Nous connaissons bien l’ensemble de ces lignées de souris génétiquement modifiées (nombre et taille des portées), ce qui permet de gérer les élevages de façon raisonnée.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d’abord, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, afin d’éviter qu’elles soient contaminées par des agents pathogènes. Elles sont maintenues en groupe dans un environnement enrichi (présence de tunnels, coton pour faire des nids et buchettes en bois à ronger). Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux sera réalisé afin de détecter des signes de mal-être, en s’appuyant sur l’évaluation visuelle de différents paramètres (comportement, apparence physique, blessures).
Choix des espèces
Le modèle de souris permet d’utiliser des souris génétiquement modifiées. Les techniques pour modifier le génome, développées chez les souris et les nombreux outils actuellement adaptés à la souris en font un modèle de choix pour l’étude. Enfin la maladie des petits vaisseaux du foie étant une maladie multifactorielle, la proximité génétique de la souris par rapport à l’homme nous permettra de nous affranchir en partie de certaines variables occasionnées par d’autres espèces. Le sevrage, le sexage, l’identification (mise de la bague à l’oreille) et l’analyse de l’ADN des souris pour rechercher la mutation d’intérêt seront réalisés entre 3 et 4 semaines de vie. Nous choisissons cet âge pour déterminer tôt les souris portant la mutation qui pourront être utilisées pour une mise en accouplement (vers 6 semaines de vie) ou une utilisation dans les expériences prévues à partir de 10 semaines de vie.
Impact d’une exposition alimentaire aux pesticides sur un modèle murin génétiquement prédisposé à la MASLD
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Une perte de poids supérieure à 20 % vaut le score maximal sur la grille de suivi et retire la souris de l'expérimentation. 112 souris, dont le récepteur CAR a été rendu non fonctionnel, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes seront tuées après un prélèvement de sang aux veines porte et cave. Elles mangent pendant soixante semaines une nourriture additionnée de glyphosate ou d'un mélange de boscalid et de lambda-cyhalothrine, subissent une glycémie à jeun tous les deux mois, deux prélèvements de sang à la joue, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline avec sept mesures sur deux heures chacun, un gavage qui peut irriter l'œsophage et 23 heures seules en cage à métabolisme. Le porteur revendique des données indépendantes sur le pesticide le plus utilisé et le plus controversé au monde, sur des paramètres que les études toxicologiques réglementaires explorent peu.
Objectifs
La maladie du foie associée à un dysfonctionnement métabolique (MASLD) et les maladies chroniques inflammatoires de l’intestin (MICI) sont en constante augmentation. Outre les facteurs génétiques et le mode de vie (sédentarité, alimentation), l’exposition aux pesticides peut être un facteur de risque au développement de ces pathologies. Des études montrent que le microbiote intestinal est aussi impliqué. Le glyphosate est l’herbicide le plus utilisé dans le monde et on le retrouve dans les aliments. Il agit sur une enzyme présente chez les champignons, les végétaux et certaines bactéries du microbiote intestinal avec comme conséquence un blocage de la synthèse des protéines. L’exposition au glyphosate change la composition du microbiote et modifie l’expression de gènes du foie parmi lesquels le récepteur nucléaire CAR (Constitutive Androstane Receptor). Le boscalid (fongicide) et le λ-cyhalothrine (insecticide) sont également retrouvés dans l’alimentation. Des résultats préliminaires obtenus sur une lignée de cellules de foie montrent qu’un mélange de boscalid et de λ-cyhalothrine agit sur le récepteur CAR. Par ailleurs, ce récepteur CAR est impliqué dans le développement des MASLD, associées à des perturbations du microbiote intestinal et à une inflammation intestinale. Dans ce projet nous voulons tester l’hypothèse que ces pesticides seuls ou en mélange, dans un contexte où les capacités de détoxification de l’organisme sont altérées via l’inactivation du récepteur CAR, favorisent le développement de la MASLD et des MICI. Nous étudierons donc l’impact d’une exposition alimentaire chronique au glyphosate et à un mélange boscalid/ lambda-cyhalothrine en utilisant des souris mâles et femelles dont le gène CAR a été inactivé.
Bénéfices attendus
Avec ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur l’impact de l’exposition alimentaire au glyphosate et à un mélange de pesticides dans un contexte de prédisposition génétique à la maladie du foie associée à un dysfonctionnement métabolique et à l’inflammation intestinale. Le projet fournira des données indépendantes sur le pesticide le plus utilisé et le plus controversé au monde mais également sur l’effet d’un mélange de pesticides retrouvés dans l’alimentation. Il permettra d’étudier aussi certains paramètres peu explorés dans les études toxicologiques réglementaires, à savoir les effets sur le microbiote intestinal et l'inflammation intestinale.
Procédures
Ces souris seront nourries pendant 60 semaines (14 mois) avec un régime standard, et exposées via l’alimentation au glyphosate ou au mélange du Boscalid/Lambda-Cyhalothrine à des doses toxicologiques de référence (dose journalière admissible ou dose sans effet nocif observable). Tous les 2 mois, la glycémie à jeun sera réalisée par dosage du glucose dans une goutte de sang prélevée à la veine de la queue, ainsi qu’un dosage de lipocaline (marqueur de l’inflammation intestinale) en récupérant les fécès des animaux. Durant les 60 semaines, du sang sera prélevé à la joue (maximum 100 μl/prélèvement), à deux moments, afin de doser des marqueurs de dommages hépatiques. Les souris subiront également : - un test de tolérance au glucose, qui sera administré par gavage (moins d'1 minute par animal) et à la suite duquel la glycémie sera mesurée à intervalle régulier sur 2h (7 fois) comme décrit précédemment. - un test de tolérance à l’insuline par une injection intrapéritonéale avec une seringue adaptée (insuline), suivi d’une mesure de glycémie à intervalle régulier sur 2h (7fois), comme décrit précédemment. - un test de perméabilité intestinale qui nécessitera un gavage oral avec une sonde de gavage adaptée (moins d'1 minute par animal), suivi de deux prélèvement d’1 goutte de sang (10µl) à la queue - enfin, afin de récupérer les urines et fèces, les animaux seront placés en cages à métabolisme 1 fois au cours de l’expérimentation durant 23 h maximum. Selon les résultats obtenus, les animaux recevront un régime enrichi en gras et en sucre (Western Diet) pendant les 8 dernières semaines ou seront exposés au Dextran Sulfate Sodium dans l’eau de boisson destiné à provoquer une inflammation intestinale. A la fin de l’essai, un prélèvement de sang à la veine porte et la veine cave sous analgésie et anesthésie générale sera réalisé.
Impact sur les animaux
Le prélèvement sanguin à la veine maxillaire et le gavage oral de glucose et l’injection intrapéritonéale d’insuline peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention, une douleur possible au point d’injection. De plus, le prélèvement à la joue peut induire un épanchement au niveau de la joue chez les individus et le gavage oral au glucose peut induire une irritation de l’œsophage. L’hébergement isolé (1 animal/cage) lors des récoltes d’urine en cages métaboliques peut entraîner un stress de l’animal. Le challenge au Dextran Sulfate Sodium, visant à provoquer une inflammation intestinale de faible intensité pourrait entraîner une baisse de poids et une colite plus importante chez les animaux exposés aux pesticides comparés aux animaux contrôles. Le régime Western Diet induit une obésité chez les animaux, ainsi que des perturbations métaboliques généralement associées à l'obésité : intolérance au glucose (diabète), accumulation de triglycérides dans le foie, augmentation de la perméabilité intestinale, sans souffrance visible des animaux, ni changement drastique de leur comportement.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérimentation suite aux prélèvements de sang à la veine porte et cave (entrée et sortie du sang dans le foie), et différents organes seront récupérés pour réaliser les analyses et répondre à la question scientifique.
Remplacement
L'utilisation d'animaux de laboratoire est nécessaire car le projet étudie des phénomènes biologiques (voies métaboliques) qui font intervenir différents tissus (foie, intestin, tissu adipeux) agissant en synergie via un dialogue inter-organe. De plus, afin d'étudier l'interaction entre l'alimentation et le microbiote intestinal, ainsi que les voies métaboliques impliquées dans l'axe intestin-foie, l'utilisation de souris de laboratoire est appropriée avec notamment la possibilité d'utiliser des animaux génétiquement modifiés. Enfin, actuellement, il est impossible de mimer ce dialogue complexe entre les différents compartiments et organes par l'utilisation de méthodes alternatives (modèles cellulaires).
Réduction
Nous avons soigneusement conçu les expériences pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs. Un nombre suffisant de souris sera utilisé dans toutes les expériences afin d'observer des effets biologiquement pertinents et statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé par un test statistique et basé sur nos résultats préliminaires. Le nombre idéal d’animaux par lots est donc de 12.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages de 4 animaux dont le milieu d'élevage est enrichi d'un abri en inox permettant aux souris de s'isoler de leurs congénères si besoin. Afin de limiter le stress, les animaux sont manipulés régulièrement et habitués à la contention. Afin d'évaluer la souffrance, la détresse et l'inconfort des animaux, des points limites gradés seront mis en place basés sur l'évaluation de 4 aspects de l'état de l'animal : (i) variation du poids de l'animal (et variations connexes au niveau de l'ingestion d'aliment et d'eau) ; (ii) apparence physique externe ; (iii) changement dans les comportements non provoqués et (iv) réponses comportementales aux stimuli externes. Pour chaque catégorie, un système d'évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) sera proposé. L'indice cumulatif obtenu en ajoutant les valeurs de chacun de ces aspects indiquera chez l'animal une déviation croissante par rapport à la normale qui peut être interprétée comme étant une indication de souffrance et/ou de détresse croissante. Ainsi, si un animal présente un score de 3 ou plus après évaluation de ces 5 critères, le critère d'arrêt sera atteint, l'animal sera retiré de l'expérimentation. Par exemple, une perte de poids supérieure à 20% entrainera un score de 3 pour cet aspect de l’état de l’animal, et constituera un critère d’arrêt. Ce score sera calculé sur chaque animal, de façon hebdomadaire. Lors du séjour en cage à métabolisme, les animaux bénéficieront d'un abri inox et les contacst olfactif et visuel avec leurs congénères seront maintenus.
Choix des espèces
Le modèle murin est largement utilisé dans la recherche concernant le métabolisme. De plus, nous souhaitons étudier le rôle du récepteur CAR dans la toxicité des pesticides grâce à un modèle murin dont le gène CAR est non fonctionnel. Ce modèle existe uniquement chez la souris. Nous utiliserons des souris âgées de 4 semaines (au sevrage). En effet, c’est au moment du sevrage que le microbiote intestinal de l’animal se met en place avec le changement d’alimentation. Les animaux recevront donc les régimes expérimentaux dès le sevrage et jusqu’à l’âge de 64 semaines. De plus, nous utiliserons des souris mâles et femelles car il existe chez l'homme des différences entre sexes dans le développement des maladies hépatiques mais également dans l'expression du récepteur CAR.
Etude du microenvironnement immunitaire des tumeurs épithéliales
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système urogénital
Endormies au masque, implantées une fois avec des cellules tumorales sous la peau, dans le péritoine ou dans la bouche, puis attrapées trois fois par semaine pour le suivi, 2 520 souris vont être utilisées dans ce projet sur le microenvironnement immunitaire des tumeurs. Suivent douze injections de substrat pour l'imagerie par bioluminescence, trois injections d'immunothérapie et deux administrations nasales d'un vaccin expérimental. 1 376 souris relèvent d'un niveau de souffrance léger, 1 144 d'un niveau modéré. Toutes seront tuées pour prélever les tumeurs et un grand nombre d'organes associés, le porteur indiquant que 70 % des expériences s'arrêtent au dixième jour, avant les premiers signes de douleur.
Objectifs
Notre projet a pour but de comprendre les mécanismes liés aux cellules immunitaires se trouvant à l’intérieur des tumeurs et en particulier aux lymphocytes qui sont les cellules immunitaires tueuses de tumeurs. A l'intérieur des tumeurs, la capacité tueuse des lymphocytes est inhibée par l'expression de molécules, appelées "checkpoints", à la surface des lymphocytes. Nous cherchons à comprendre les mécanismes menant à l'expression des "checkpoints" sur les lymphocytes. Nous cherchons à tester dans nos modèles précliniques l’efficacité de traitements bloqueurs de chekpoints (dont certains sont déjà utilisés en clinique) ainsi que d’un vaccin anti-cancer et comprendre ce que leur utilisation déclenche dans l’organisme. Nous planifions d’utiliser des modèles précliniques tumoraux permettant d’étudier 1) le développement des tumeurs primaires localisées sous la peau des souris (modèle classique d'oncologie préclinique), 2) le développement des tumeurs primaires localisées en orthotopique (c’est-à-dire dans l’organe duquel les cellules tumorales sont issues, comme par exemple intra-oral pour les tumeurs de cancers oraux).
Bénéfices attendus
En utilisant ces modèles précliniques de cancer, nous pourrons mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires caractéristiques des lymphocytes "tueurs de tumeurs". Nous comprendrons comment les tumeurs contournent leur activité cytotoxique en induisant l'expression des checkpoints. Pour cela, nous avons besoin que les tumeurs évoluent dans leur environnement de prédilection, à savoir dans leur organe d'origine. D'où l'utilisation des modèles d'implantations orhtotopiques, qui nous permettent de positionner les cellules tumorales dans leurs organes d'origine. Ainsi, en ciblant, de façon appropriée à chaque type tumoral, les checkpoints exprimés par les lymphocytes, et en développant des vaccins permettant d'activer ces mêmes lymphocytes, nous pourrons proposer une amélioration des stratégies thérapeutiques déjà en place. Cela pourrait permettre, à terme, de faire évoluer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de cancers oraux, du col de l'utérus, des ovaires.
Procédures
Les animaux sont soumis: 1) à des procédures d'implantations de cellules tumorales (implantation sous-cutanée (SC), implantation orthotopique intra-péritonéale (IP), implantation intra-orale (IO), 2) à des procédures d'injection intra-péritonéale de composants de type: anesthésiant, substrat de l'enzyme exprimée par les cellules tumorales, immunothérapies (anticorps inhibiteurs de checkpoints), et 3) à une procédure d'administration intra-nasale de vaccin - Les procédures d’implantation de cellules tumorales ne seront effectuées qu'1 seule fois par animal, chacune dure environ 5 min par animal. - Les procédures d’ injection d'anesthésiant IP seront effectuées 2 fois par animal (1 fois à l'implantation du cancer), elles durent 2 min par animal. L’injection de substrat sera effectuée 12 fois par animal (à chaque mesure lors du suivi par caméra bioluminescente), sur souris déjà anesthésiée et dure 2 min par animal. 2): l'immunothérapie sera injectée 3 fois par animal, elle dure 2 min par animal. – L’administration du vaccin sera effectuée 2 fois par animal, sur animal anesthésié, elle prendra 5 min par animal.
Impact sur les animaux
L’injection des tumeurs requiert une intervention modérée et nécessite une contention (indolore) puis un positionnement sur les masques pour induction d’endormissement. L’injection des lignées tumorales dans les différents organes nécessite de piquer avec une aiguille de très faible diamètre, et n’aura lieu qu’une seule fois, sur des animaux endormis, évitant ainsi douleur ou stress. Pour l’injection des traitements, les animaux recevront maximum 3 doses, au début du développement de leur tumeur avec une préhension des souris à chaque fois (temps limité à moins de 30sec) et une piqûre avec une aiguille de très faible diamètre (douleur légère et de courte durée). Pour les mesures de suivi de développement tumoral, les animaux seront régulièrement attrapés (3x/semaine, induisant un léger stress). Nous veillerons à ce que le même expérimentateur suive et traite les souris, afin de créer au maximum une habituation, limitant le stress lié à la contention et à l’injection.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, le développement des tumeurs sera suivi chez les animaux et les animaux seront mis à mort pour prélèvements. Les tumeurs, ainsi qu'un grand nombre d'organes/de compartiments associés aux tumeurs, seront prélevés juste après l'euthanasie.
Remplacement
Notre étude vise à explorer les mécanismes immunitaires dans les tumeurs épithéliales de plusieurs origines afin de développer des immunothérapies (anticorps et vaccin) et de comprendre la résistance des tumeurs aux immunothérapies actuelles. Le modèle d’étude doit nécessairement refléter la complexité multi-cellulaire d'une tumeur avec son microenvironnement. Nous ne pouvons pas in vitro (ni dans des organoïdes, ni dans une flasque de culture in vitro) reconstituer un microenvironnement complet autour des cellules tumorales, qui contiendrait un réseau complexe multicellulaire et reflèterait la réalité d’une tumeur chez un patient.
Réduction
Afin de Réduire le nombre d’animaux en expérimentation, une étude complète de la littérature actuelle concernant notre projet a été effectuée pour de ne pas reproduire des résultats d’expériences déjà effectuées sur des animaux. Par ailleurs, nous utiliserons des tests statistiques afin de valider nos résultats, standardiser et limiter le nombre d’expériences à effectuer à 2, réduisant ainsi le nombre d’animaux. Nous désignons également nos manips afin d'obtenir un maximum d'informations par animal testé, ce qui évite l'utilisation d'animaux supplémentaires. Le groupe témoin sera utilisé pour comparaison avec plusieurs lots d’animaux afin de diminuer l’utilisation inutile d’animaux.
Raffinement
Pour optimiser le raffinement, notre long recul (>18ans) sur ces modèles permettra un suivi et une évaluation au plus juste de l’inconfort et de l’éventuelle apparition de souffrance. En effet, 70% des expériences seront arrêtées à J10, bien avant les 1ers signes de douleur. Dans les 30% d’expériences de suivi longitudinal, aucune nécessité de maintenir les animaux en souffrance, ainsi les animaux seront euthanasiés avant d’atteindre le point limite. Les procédures seront réalisées par des expérimentateurs formés à l’expérimentation animale et au bien-être animal. Ces procédures seront réalisées sous anesthésie, pour éviter le stress et la douleur. La préhension des animaux se fera en dirigeant doucement sur notre main posée en coupelle dans la cage, avant de la poser sur une grille et d’effectuer la contention. Puis une fois endormis, les animaux seront posés sur un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. Du gel oculaire sera déposé sur leurs yeux pour éviter le dessèchement. Une attention particulière sera portée à la récupération post-implantation des tumeurs : les cages ne seront enclenchées sur les portoirs ventilés qu’une fois les animaux bien réveillés afin d’éviter une baisse de température liée à la ventilation dans les cages. Egalement en post-opératoire, les souris recevront une alimentation enrichie dans des contenants déposés au sol afin qu’elles n’aient pas à se redresser pour se nourrir. Les conditions d’hébergement se feront selon les recommandations européennes, dans des cages collectives. Des objets appropriés (tubes cartons, lanières papier kraft, papier absorbant.) seront placés dans les cages afin d’améliorer le bien-être des animaux, de diminuer leur stress, de faciliter leur thermorégulation et de leur donner la possibilité de satisfaire leur instinct de nidification. L’angoisse et la souffrance seront évaluées par des observations quotidiennes comportementales et physiologiques des souris. Même si les points limites ne devraient pas être atteints pour nos procédures, nous veillerons à éviter toute souffrance ou détresse chez les animaux. Dès les 1ers signes anticipant l’apparition du point limite, la décision d’euthanasier l’animal sera prise et aucun animal ne sera maintenu en souffrance.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies comme modèle d’étude selon plusieurs critères : -La litérature scientifique, définissant le système immunitaire murin comme pertinent pour étudier et comprendre le système immunitaire humain. -leur petite taille qui facilite la manipulation en particulier pour le suivi de croissance tumorale avec l’imagerie in vivo (où plusieurs souris peuvent être placées en même temps dans l’appareil d’imagerie). -la biodisponibilité des souris transgéniques permettant d’étudier des mécanismes immunitaires en détail. Les souris adultes peuvent être utilisées pour le projet (à partir de 6 à 8 semaines). En effet, nous nous intéressons à la pathologie du cancer épithélial humain chez l’adulte.
Physiopathologie et approches thérapeutiques de l’Ileus post-opératoire
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Toute souris dont le score clinique dépasse 8 est mise à mort. 3 348 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une manipulation de l'intestin de dix minutes sous anesthésie pour provoquer un iléus, l'insertion d'une bille dans le colon, des gavages au charbon, six heures d'isolement en cage individuelle et, pour certaines, l'administration pendant trois jours du microbiote fécal de patients opérés. Le porteur annonce en retour des durées d'hospitalisation raccourcies et la fin d'une mortalité liée à cette complication chirurgicale, pour laquelle aucun traitement médicamenteux n'est connu à ce jour.
Objectifs
L'ileus post opératoire est une complication survenant après une chirurgie abdominale induisant un ralentissement voire un arrêt du transit intestinal. L'objectif de ce projet est d'identifier de nouvelles voies physiopathologiques de l'ileus post-opératoire et d'évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques en utilisant un modèle murin.
Bénéfices attendus
Il n'existe pas de traitement médicamenteux connu à ce jour malgré l'incidence élevée de l'ileus post opératoire chez les patients. Le bénéfice de ce projet est d'identifier et de valider des molécules thérapeutiques permettant la résolution de l'iléus. Cela permettra de réduire la durée d’hospitalisation et éviter a mortalité des patients liés à cette complication chirurgicale.
Procédures
Une manipulation intestinale durant 10 minutes permettant d’induire l’ileus post opératoire chez la souris va être réalisée sous anesthésie générale et analgésie. Les molécules thérapeutiques candidates vont être administrées avant ou après la chirurgie. Afin d’évaluer l’efficacité de celles-ci, la vitesse de transit des différentes portions du tractus digestif (intestin grêle et colon) va être relevée ainsi que la vitesse du transit total grâce à l’administration per os d’une solution de charbon qui va permettre de relever le temps d’apparition d’une selle noire (entre 2 et 3 heures – temps limité à 6 heures pour l’animal). La vitesse du transit dans le colon sera mesurée grâce à l’insertion intra-colique d’une bille (dont la taille est équivalente à une fécès de souris) à l’aide de vaseline et sous anesthésie. Le temps d’expulsion de la bille sera le reflet de la vitesse du transit colique (autour de 2 minutes – temps limité à 15 minutes pour l’animal). La vitesse du transit de l’intestin grêle sera ensuite mesurée 24 heures après la chirurgie grâce à l’administration per os d’une solution de charbon qui permet de visualiser à l’œil nu l’avancement du charbon dans l’intestin grêle post mortem (20 minutes après le gavage). La perméabilité intestinale va être également étudiée grâce à l’administration d’une molécule fluorescente qui est retrouvée dans le sang en quantité proportionnelle à la perméabilité intestinale. Ainsi 4h après l’administration de la molécule, du sang va être prélevé sous anesthésie. L’influence du microbiote intestinal sur l’induction de l’ileus va être étudié en administrant le microbiote fécal pendant 3 jours provenant de patient ayant développé un ileus post opératoire avant de réaliser une manipulation intestinale de la souris.
Impact sur les animaux
inconfort abdominal (constipation, ballonements, gaz) induit par la manipulation intestinale stress induit par la mise à jeun, possibles douleurs post-chirurgicales, l’isolement pendant 6 h dans une cage individuelle lors de la mesure de la motricité colique et les administrations.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux sont euthanasiés dans le but de prelever les tissus en vue d'analyse histologique, moléculaire, contractile et microbiologique.
Remplacement
Les méthodes alternatives permettant l’étude de l'ileus post-opératoire et notamment de la motilité intestinale sont inexistantes. En effet les modèles in vitro actuels ne permettent pas de reconstituer l'environnement et les intéractions complexes entre les différents acteurs menant à l'ileus post opératoire. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques. Cependant les approches in vitro sont indispensables en amont pour valider l’efficacité des molécules candidates.
Réduction
Les datas générées grâce à l'apafis précédent nous ont permis d’utiliser l'application EDA développée par le NC3R afin de déterminer le nombre d'animaux par groupe requis pour obtenir une analyse stastique fiable et appropriée. Les rongeurs utilisés sont consanguins et du même âge pour obtenir des résultats robustes. Lors du sacrifice, les organes ou parties d’organes non requis pour l’expérience en cours sont conservés pour d’autres utilisations éventuelles, constituant une bio-banque accessible à l’équipe ou aux collaborateurs, prévenant l’utilisation d’autres animaux. Une recherche bibliographique approfondie a été réalisée en amont pour sélectionner des procédures à degré de sévérité légère réalisables après la chirugie ne nécessitant pas l’euthanasie de l’animal. Cela nous permet de réaliser une cinétique du transit intestinal sans euthanasie d’un groupe d’animaux à chaque temps.
Raffinement
Les souris seront mises par groupe afin d’établir une hierarchie et des contacts visuels, olfactifs, auditifs et tactiles. La surface au sol nécessaire par animal sera respectée. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. L’environnement des souris est enrichi avec a minima un igloo et du materiel de nidification tel que des serpentins et du sopalin. Le change de la litière est réalisé 1 fois tous les 15 jours. Les animaux ont au minimum une semaine d’acclimatation avant que le protocole ne débute. L’état des animaux vérifié quotidiennement, deux fois après la chirurgie. La fréquence de surveillance est augmenté si le score total >2. Lors de la chirurgie, un tapis chauffant est systématiquement utilisé, les animaux sont sous anesthésie profonde surveillée et un agent analgésique est administré en période pré et post opératoire. En complément du tapis chauffant, des chaufferettes sont disposées de part et d'autre de l'animal afin d'éviter l'hypothermie. Lorsque les animaux sont réveillés ils sont remis dans leur cage avec du coton pour améliorer leur confort. Les expérimentateurs réalisant les procédures sont tous dotés du diplôme de chirurgie et appliquent les bonnes pratiques pour le suivi des compétences. L’application stricte des points limites définis au préalable sera réalisée. Tout animal présentant un aspect inhabituel : prostration, hypothermie, perte de poids (proportionelle au temps post chirurgie) fera l'objet d'une attention accrue et bénéficiera de soins appropriés. Une grille de scoring a été générée et adaptée aux types de procédures. Si le score total >8 alors l'animal sera euthanasié pour éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
La souris présente certains intérêts décisifs justifiant leur utilisation comme modèle dans ce type de projet : la physiologie digestive de la souris est très proche de celle de l'Homme et la manipulation intestinale qui a lieu lors d’une chirurgie de patient humain peut être reproduite à l’identique chez la souris.