Système gastrointestinal
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Quinobiote, échange de quinones au sein du microbiote intestinal
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
12 souris vont être utilisées pour un unique gavage de trente secondes, et toutes seront tuées ensuite pour le prélèvement de leurs organes et de leurs tissus. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger, l'inconfort déclaré se limitant au gavage. Ces souris portent une flore intestinale simplifiée à douze espèces bactériennes, construite en laboratoire, ce qui permet de chercher si l'une de ces bactéries fabrique sa quinone à partir d'un précurseur fourni par une autre. Le porteur écrit qu'"à terme, il pourrait être envisageable" de moduler le microbiote intestinal humain grâce à cet apport de précurseurs, un bénéfice reporté au conditionnel là où le gavage et la mise à mort sont, eux, programmés.
Objectifs
Les troubles intestinaux sont fréquents chez l'Homme et résultent souvent d’un déséquilibre de la flore intestinale. Une meilleure compréhension des facteurs régissant l’équilibre des communautés bactériennes qui colonisent l’intestin pourrait permettre de proposer des approches pour traiter ces troubles. Un des facteurs de stabilité de la flore intestinal est l’échange de molécules entre bactéries, mais peu de cas ont été caractérisés dans l’intestin à ce jour. L’objectif du projet est de caractériser un nouvel échange de molécule, un précurseur de la ménaquinone (MK) qui joue un rôle clé dans la bioénergétique des bactéries et pourrait donc fortement impacter l’équilibre du microbiote. Les résultats de nos analyses bioinformatiques démontrent que de nombreuses espèces du microbiote intestinale (dont Bifidobacterium animalis, un probiotique commensal reconnu) possèdent uniquement les gènes de la fin de la voie de biosynthèse de la MK, ce qui suggère que ces espèces dépendent d’autres bactéries dites « donneuses » pour obtenir un précurseur afin de synthétiser leur MK. Des expériences nous ont permis de prouver que B. animalis est capable de synthétiser sa MK uniquement lorsqu’un précurseur (le DHNA) est ajouté au milieu de culture ou lorsque B. animalis est co-cultivé avec une espèce donneuse (Enterococcus faecalis). L’objectif du projet est maintenant de valider dans un contexte physiologique in vivo que B. animalis est capable de synthétiser sa MK à partir du précurseur fournit par le microbiote intestinal. Pour cela, nous proposons d’utiliser une souris (nommée oligoMM12) porteuse d’une flore intestinale simplifiée (composée de 12 espèces bactériennes dont B. animalis et E. faecalis). La détection de la MK de B. animalis dans les échantillons du microbiote intestinal d’oMM12 nous permettra de confirmer que l’échange de précurseur de quinones est effectif au sein du microbiote intestinal. Ce résultat servira de base à des études ultérieures visant à définir si l’échange de précurseurs de quinones est un facteur important de l’équilibre du microbiote intestinal, notamment pour les espèces bactériennes possédant une voie partielle de synthèse de MK.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension des facteurs qui régissent l’équilibre des communautés bactériennes qui colonisent notre intestin pourrait permettre de proposer des approches pour traiter certains troubles intestinaux et les maladies liées. En utilisant une souris porteuse d’une flore intestinale simplifiée, nous pouvons identifier les quinones synthétisées par chaque espèce bactérienne présente et ainsi mettre en évidence la synthèse d’une quinone par Bifidobacterium animalis grâce à un échange de précurseur (DHNA) avec des espèces donneuses du microbiote intestinal. Ce résultat permettra de confirmer que l’échange de précurseur de quinones est effectif au sein du microbiote intestinal et posera les bases d’études ultérieures visant à établir l’importance de ces échanges de précurseurs de quinones pour l’équilibre du microbiote intestinal. A terme, il pourrait être envisageable de concevoir une modulation du microbiote intestinal grâce à l’apport de précurseurs de quinones.
Procédures
Chaque souris sera soumise à un unique gavage oral sous contention durant maximum 30 secondes.
Impact sur les animaux
Au cours de nos expériences les animaux pourront subir un inconfort suite au gavage. Ces effets indésirables sont de sévérité légère et de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de réaliser les prélèvements d’organes et de tissus nécessaires aux analyses requises pour atteindre les objectifs fixés.
Remplacement
Des premiers résultats en culture cellulaire ont permis d’identifier un composé bactérien qui concoure au maintien de la bactérie d’intérêt. Les analyses sur fèces et intestins isolés permettent de déterminer les conditions optimales de multiplication des bactéries probiotiques. Nous voulons maintenant vérifier si ce composé est présent au sein du microbiote intestinal et s’il est mobilisable par la bactérie d’intérêt, B. animalis. A ce stade de la recherche, aucun modèle in vitro ne permet d'atteindre les objectifs fixés. La colonisation bactérienne de l'intestin ne peut être obtenue et analysable que dans un organisme entier. Pour atteindre les objectifs, nous devons travailler avec un système digestif complet et vivant ; la souris est un modèle approprié et bien validé puisque nous disposons de souris avec une flore intestinale simplifiée et contrôlée, adaptée à nos objectifs.
Réduction
En analysant les prélèvements provenant de 3 souris adultes mâles et 3 femelles, nous avons pu obtenir les données de référence nécessaires pour ce modèle. Ces données montrent la présence des quinones synthétisées par les espèces de la communauté à l’exception d’une quinone. Nous testerons donc nos conditions expérimentales sur des groupes de même effectif et sexe ratio : 1 groupe contrôle et un groupe traité. En outre, le projet scientifique global utilise des produits biologiques fournis de façon mutualisée pour différents projets de recherche (organes, tissus).
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé et observés régulièrement afin d'anticiper l'apparition des points limites fixés. Les gestes expérimentaux (gavage oral, prélèvement de fèces) sont réalisés règlementairement et dans un cadre optimal pour limiter au maximum les risques. Les gavages seront réalisés à l’aide d’une sonde flexible non irritante pour l’œsophage. Le projet est mis en œuvre dans l’animalerie qui maîtrise parfaitement les conditions d’hébergement spécifique à la population de souris : hébergement sous confinement sanitaire approprié en séparant les souris traitées des contrôles non traités.
Choix des espèces
Afin de confirmer l’échange de précurseurs de quinones entre espèces bactériennes du microbiote intestinal, nous devons utiliser un mammifère vivant possédant une flore intestinale simplifiée contenant notre bactérie d’intérêt. Ce modèle n’existe que chez la souris et est adapté à nos objectifs. La souris nous permettra d’obtenir des résultats comparables aux données de référence préalablement obtenues. Nous retenons des souris adultes d’au moins 8 semaines, avec un système digestif mature et une flore intestinale stabilisée pour éviter toute interférence avec un autre phénomène de maturation ou d’adaptation microbiologique en cours. Les données de référence ont été obtenus sur des prélèvements provenant de cette catégorie de souris.
Evaluation de l’efficacité de l’ORFADIN pour le traitement du cancer pancréatique avec des métastases
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Greffées de cellules tumorales dans la rate au cours d'une chirurgie de vingt-cinq minutes, puis suivies par imagerie sous anesthésie, 191 souris vont être utilisées, dont 161 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie reçoit trois injections de chimiothérapie par semaine pendant deux semaines. L'objet est d'évaluer un médicament commercialisé depuis 2001 pour une maladie héréditaire du foie, l'ORFADIN, contre le cancer du pancréas métastatique, les résultats devant être intégrés à un brevet protégeant cette nouvelle indication. Le porteur indique que l'usage d'anti-inflammatoires et de morphiniques est "proscrit" dans ce protocole parce qu'ils modifient le métabolisme tumoral, la seule réponse prévue à la douleur étant alors la mise à mort de l'animal, par dislocation cervicale.
Objectifs
L'ORFADIN est un médicament utilisé en clinique depuis 2001 pour le traitement d’une maladie héréditaire du foie engendrée par la dégradation incomplète de la tyrosine, un acide aminé apporté par les protéines alimentaires. Des travaux de l’équipe montrent que la voie de dégradation de la tyrosine par les cellules métastatiques est exacerbée et qu’elle est essentielle à leur survie et à leur expansion (in vitro). Le but de ce projet est d’évaluer l’efficacité de l’inhibition de la dégradation de la tyrosine par l’ORFADIN et/ou de l’apport de tyrosine par l’alimentation (i.e. régime déficient en tyrosine) dans le traitement du cancer du pancréas avec des métastases. Ce projet comportera 3 objectifs : Obj. 1 : Evaluer l’efficacité de l'ORFADIN associé ou non à la chimiothérapie, le FOLFIRINOX (abréviation FFX utilisée dans la suite de la saisine) dans le traitement des métastases du foie : - administré seul l’ORFADIN prolonge-t-il l’effet de la chimiothérapie sur les métastases, - combiné à la chimiothérapie est-il plus efficace que la chimiothérapie, - si ce schéma thérapeutique est poursuivi par l’administration d’ORFADIN, maintient-on l'effet anti-métastatique du traitement combiné ? - combiné à un régime sans tyrosine, le traitement combiné ORFADIN+chimiothérapie est-il plus efficace ? Obj. 2 : Evaluer l’efficacité de l'ORFADIN associé ou non au FFX dans le traitement des tumeurs primaires pancréatiques. Les 3 questions posées dans l’objectif 1 seront adressées afin d’évaluer l'efficacité des différents schémas thérapeutiques sur la progression/régression de la tumeur pancréatique. Obj. 3 : Etude de la toxicité de l'ORFADIN. Les modèles expérimentaux utilisés seront des souris développant des métastases du foie (Obj.1 et 3) et des souris développant des tumeurs pancréatiques (Obj. 2 et 3).
Bénéfices attendus
Cette étude pré-clinique a pour but de confirmer l’efficacité de l'ORFADIN associé ou non au FFX dans le traitement des cancers pancréatiques avec des métastases et d’évaluer la toxicité de ce traitement combiné. Les résultats obtenus permettront seront inclus dans le brevet visant à protéger l’utilisation de l’ORFADIN pour le traitement du cancer pancréatique avec des métastases. Elle permettra également de proposer un essai clinique aux patients atteints de cancer pancréatique avec des métastases, qui sont actuellement inéligibles à la chirurgie, seul traitement curatif disponible en clinique.
Procédures
Les souris de la procédure 1 seront soumises à une procédure chirurgicale de greffes de cellules tumorales dans la rate, une seule procédure chirurgicale par souris sera effectuée. Cette procédure chirurgicale durera 25 min max. (temps d'endormissement, chirurgie et réveil de l'animal). Les souris traitées au FOLFIRINOX recevront 3 injections par semaine de cette combinaison de chimiothérapie et ce pendant 2 semaines. La durée de ce geste est de 1-2 min. Le suivi de l’évolution des métastases du foie par de l’imagerie en bioluminescence a une durée estimée par animal de 15 min (temps d'endormissement, imagerie et réveil de l'animal).
Impact sur les animaux
Les nuisances subies par les animaux sont pour la procédure 1 : avant l’acte chirurgical : contention et injections sous-cutanées d’antalgique et d’anesthésique local qui peuvent générer un léger stress ; au cours de l’acte chirurgical : l’anesthésie gazeuse peut engendrer une hypothermie et une détresse respiratoire si elle est mal contrôlée ; en post-chirurgie : des complications post-opératoires (rupture des points de sutures, infection de la plaie) peuvent survenir et engendrer de la douleur qui doit être rapidement prise en charge ; les animaux devront être isolés de leurs congénères ce qui génère un stress. Pour les procédures 1 et 2, les nuisances au cours du développement de la tumeur primaire et des métastases sont les suivantes : douleur, perte de poids, mobilité réduite, apparences et/ou comportements anormaux, celles-ci sont grâce à notre expertise du modèle rapidement détectées et en fonction du score déterminé, la procédure adaptée sera mise en œuvre.
Devenir
Afin d'évaluer la prise métastatique au sein du foie et la régression de la tumeur primaire en fonction des traitements administrés aux animaux, ceux ci seront euthanasiés par dislocation cervicale et autopsiés.
Remplacement
Le recours à des animaux est absolument indispensable pour mener à bien ce projet qui vise à inhiber le dialogue entre les cellules cancéreuses des métastases de foie et les cellules du foie avoisinantes. Ceci, en utilisant un médicament déjà sur le marché pour une autre indication thérapeutique que le cancer du pancréas, et à évaluer son effet anti-cancéreux sur la tumeur du pancréas et sur les métastases du foie, et sa toxicité sur les organes sains. Ce projet fait suite à des expériences de culture de cellules de métastases de foie cultivées avec des cellules de foie validant la pertinence d’inhiber le dialogue entre ces deux types cellulaires pour limiter l’expansion des métastases. Ainsi, il est à présent nécessaire de démontrer au sein d’un hôte vigile, porteur de métastases et avec des fonctions du foie non-altérées, qu’un médicament associé ou non à un régime alimentaire spécifique, combiné à la chimiothérapie de référence des patients, permettrait de réduire la progression des métastases sans entrainer d’importants effets secondaires, qui ne peuvent être appréhendés que sur des modèles animaux de cancer pancréatique avec des métastases.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention d’un effet anti-tumoral significatif de chaque traitement par rapport aux animaux non-traités a été défini en utilisant le test statistique d’analyse de la variance suivi de comparaisons multiples. La diminution attendue de l’incidence/taille des tumeurs primaires/métastases et les différences inter-individuelles ont été estimées sur la base de données bibliographiques et de résultats antérieurs de l’équipe. Ainsi, pour la procédure 1, le nombre d’animaux nécessaire est de 13/groupe alors que pour la procédure 2, il est de 10/groupe.
Raffinement
Les personnes compétentes (formations en expérimentation animale + chirurgie) réaliseront les injections d’antalgiques pré et post-opératoires et de l’anesthésique local avant l’incision, l’incision et l’injection des cellules tumorales dans la rate. Ceci afin d’éviter toutes complications post-opératoires et limiter ainsi le nombre d’animaux à opérer. Une grille de points limites sera quotidiennement remplie pour chaque modèle : souris avec une tumeur pancréatique ou des métastases dans le foie, et des mesures adéquates seront prises : euthanasie directe si nécessaire car l’utilisation d’anti-inflammatoires non stéroïdien ou de dérivé morphinique pour limiter la douleur est proscrite dans le cadre de ce protocole. En effet, les données bibliographiques montrent que leur administration altère le métabolisme tumoral, limite la croissance tumorale et/ou potentialise l’action de la chimiothérapie. Un enrichissement matériel de l’environnement des animaux (cocon, nid, maisonnette, etc…) est mis en place dans toutes les cages afin que les souris expriment un répertoire diversifié de comportements normaux.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris, modèle d'étude de référence dans le domaine du cancer pancréatique et dont les caractéristiques morphologiques et génétiques des tumeurs récapitulent fidèlement la maladie chez l’homme. De plus, cette espèce se caractérise par de nombreux avantages, notamment leur développement rapide, une descendance nombreuse et une facilité d’entretien et d’élevage. Les souris développant des tumeurs pancréatiques seront traitées ou non dès l’âge de 6 semaines pour une durée de 4 semaines. Elles seront euthanasiées au stade de jeune adulte (environ 10 semaines après la naissance), stade à partir duquel les tumeurs prélevées sont dites de haut grade, comme la majorité des tumeurs pancréatiques diagnostiquée chez les patients. Ce dernier argument est requis pour notre étude qui vise à améliorer à terme l’efficacité des traitements des tumeurs pancréatiques à fort potentiel métastatique . L'implantation des cellules tumorales dans la rate des souris saines, seront réalisées chez des souris âgées de 5 semaines, puis traitées ou non pendant 4 semaines, la semaine suivant l'implantation. Elles auront un âge similaire aux souris avec tumeur pancréatique lorsque les traitements débuteront, à ce stade, l’impact du métabolisme sur la progression métastatique ne sera pas impacté par une prise de poids ou tout autre facteur lié au vieillissement de l’animal. Elles seront euthanasiées au même âge que les souris avec des tumeurs pancréatiques.
Effet de différents microbiotes sur la physiopathologie de l’infection par Eimeria tenella chez le poulet.
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Pour trouver un moyen de limiter les pertes économiques que la coccidiose fait subir à l'aviculture, plus de 1,5 milliard d'euros par an dans le monde selon le porteur, 60 poulets vont être utilisés, tous tués à l'issue. Quarante subissent des procédures d'un niveau de souffrance léger, vingt un niveau modéré. Chaque animal reçoit deux administrations orales sous contention, l'une d'un microbiote, l'autre du parasite Eimeria tenella. La dose de parasite est calibrée pour rester en dessous du point limite, défini par la perte de poids, les plumes ébouriffées, la prostration, les yeux mi-clos et la diarrhée, et les poulets de chair retenus sont de type conventionnel pour rester au plus près des conditions des élevages industriels.
Objectifs
Les coccidioses représentent le premier fléau parasitaire de l’aviculture conduisant à d'importantes pertes économiques (>1,5 milliards d’euros/an dans le monde). Ces maladies sont provoquées par des parasites, Eimeria. La prophylaxie repose sur l’utilisation d’anticoccidiens et sur la vaccination. Le coût élevé des vaccins, l’apparition de résistances aux anticoccidiens et la demande des consommateurs pour limiter l’utilisation des anticoccidiens et des antibiotiques nécessitent le développement de nouveaux moyens de lutte plus naturels. Dans cet objectif, notre ambition est d'utiliser la modulation du microbiote pour atténuer la sévérité de la pathologie liée à l'infection par Eimeria. Comme nous l’avons décrit précédemment, nos résultats mettent en évidence un rôle du microbiote et/ou ses métabolites sur la physiopathologie de l’infection par E. tenella incluant le développement du parasite E. tenella et sur la réponse inflammatoire associée à l’infection. La nature des bactéries et/ou leur métabolites impliqués dans cet effet restent encore à déterminer. Dans ce projet, nous comparerons des microbiotes présentant une complexité et une diversité plus ou moins forte (microbiote de jeune, d’adulte, enrichi en bactéries probiotiques dès l’éclosion) sur la physiopathologie de l’infection par E. tenella. Nous évaluerons l'effet de ces différentes compositions microbiennes caecales sur le développement des parasites, la formation de lésions et la réponse inflammatoire. Ensuite, les corrélations entre la composition du microbiote, des métabolites caecaux et des paramètres d'infection seront déterminées pour détecter les taxons et les métabolites qui peuvent être enrichis ou appauvris dans le cas d'infections plus ou moins sévères. Ce projet fournira des indications pour le développement d'un microbiote limitant les conséquences négatives de l'infection.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de ce projet, le bénéfice attendu est que les animaux supplémentés résistent mieux à l’infection (effet anticoccidien) et présentent par conséquent de meilleures performances zootechniques, moins de lésions, moins d’inflammation, moins développement parasitaire. Si la supplémentation du microbiote ne présente pas d’effet, les animaux supplémentés présenteront des charges parasitaires et des paramètres lésionnels similaires à ceux du groupe contrôle.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux administrations orales : une de microbiote et une du parasite Eimeria. De plus, la contention peut engendrer du stress pour les animaux. Chaque intervention dure environ 30 secondes à 1 minute.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à une administration orale du parasite Eimeria à des doses qui ne causent pas de morbidité importante et qui n’induisent pas des signes cliniques proches du point limite, le point limite se définissant par la perte de poids, les plumes ébourriffées, prostration, yeux mi-clos, diarrhées. Une perte de poids pourra être observée chez les animaux infectés non supplémentés sans atteindre le point limite ni des signes cliniques sévères. De plus, la contention peut engendrer du stress pour les animaux.
Devenir
A la fin de l'expérimentation, l'euthanasie des animaux est prévue pour des prélévements des caeca et mesures de différents paramètres (parasitaire, inflammatoire, microbiote, métabolites)
Remplacement
L’étude de l’influence du microbiote sur la physiopathologie de l’infection par E. tenella nécessitent des expérimentations in vivo pour lesquelles des analyses des paramètres zootechniques, parasitaires, inflammatoires, biochimiques, et du microbiote intestinal seront réalisées.
Réduction
Les effectifs sont basés sur les études du laboratoire et de la littérature portant sur les scores lésionnels lors de supplémentations et pour lesquelles il faut en moyenne 20 animaux / groupe avec trois groupes pour avoir une différence significative. Ces effectifs sont suffisants pour les analyses microbiotes.
Raffinement
Hébergement : Les poulets disposeront d’un enrichissement social et comportemental (dans les box : petites rondelles en inox suspendues ou du bolduc suspendues ce qui permet aux animaux de piquer dedans et des perchoirs qui apporte un enrichissement qui fait partie du comportement naturel). Limitation des nuisances sur le bien-être animal : Evaluation de l’état de santé des animaux deux fois par jour par le personnel de la plateforme expérimentale. Les animaux seront soumis à une administration orale du parasite Eimeria à des doses qui ne causent pas de morbidité importante et qui n’induisent pas des signes cliniques proches du point limite, le point limite se définissant par la perte de poids, les plumes ébourriffées, prostration, yeux mi-clos, diarrhées.
Choix des espèces
Le poulet est l’espèce hôte chez laquelle se multiplient les parasites Eimeria. Des poulets de chair mâles et femelles de type conventionnel seront utilisés dans l’étude pour être dans les conditions les plus proches de celles des élevages industriels, et auront un statut sanitaire exempt d'organismes pathogènes spécifiés. L'éclosion constituant une fenêtre unique pour l'implantation de bactéries et l'amélioration précoce des fonctions intestinales, l'implantation de bactéries pour améliorer précocement les fonctionnalités de l'intestin sera réalisée juste après l’éclosion (1er jour d’âge). Une coccidiose expérimentale sera ensuite induite à environ 2 semaines d’âge afin de reproduire expérimentalement la fenêtre d’infection de la coccidiose aviaire.
Effets métaboliques et cognitifs des variations d’apport en tryptophane et des fibres alimentaires dans l’alimentation (Multisite 1/2).
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
650 rats vont être utilisés, chacun logé seul en cage pour que sa consommation alimentaire soit mesurée, quatre jours par semaine pendant six semaines, avec deux heures de retrouvailles quotidiennes ou un week-end en binôme. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et tous sont tués à l'issue. Jeûne de quinze heures, privation d'eau de six heures, sept passages au maximum dans des tests d'activité locomotrice, d'anxiété et d'apprentissage, jusqu'à cinq prises de sang, quarante-huit heures en cage de collecte d'urines et de fèces, et pour quarante rates deux traites manuelles sous anesthésie après trois heures de séparation de leurs petits. L'enjeu déclaré est d'évaluer les effets de la végétalisation de l'alimentation humaine sur le métabolisme et le comportement, les résultats devant alimenter une collection de données utile aux pouvoirs publics.
Objectifs
La période néonatale est critique pour le développement du cerveau et des perturbations pendant cette période peuvent avoir des répercussions profondes sur les fonctions cérébrales tout au long de la vie. Les molécules produites par le microbiote intestinal pourraient participer au contrôle de la maturation cérébrale durant cette période et notamment les métabolites bactériens, produits à partir du tryptophane, un acide aminé apporté par l’alimentation. Les enfants nés par césarienne présentent un microbiote moins diversifié que les enfants nés par les voies naturelles. Les enfants nés par césarienne présentent également plus de troubles et déficiences du système nerveux central, et une plus faible production de dérivés du tryptophane. Or parmi les métabolites bactériens, certains ont des effets dans le cerveau (par ex, neuroprotecteur et médiateur). En outre, la biodisponibilité du tryptophane et la production des métabolites bactériens peuvent moduler le poids corporel et la santé métabolique chez le rongeur. Le projet vise ainsi à évaluer l’impact des modifications du métabolisme bactérien du tryptophane, notamment via l’alimentation, sur la santé métabolique et comportementale. L’alimentation conditionne en effet le métabolisme du tryptophane par le microbiote de plusieurs manières. La présence du tryptophane dans le colon dépend de la quantité et de la digestibilité des protéines ingérées et son utilisation dépend de la présence d’autres substrats nutritifs, par exemple ceux apportés par les fibres. La végétalisation de l’alimentation, peut entrainer une diminution d’apport en tryptophane et une augmentation d’apport en fibres et donc conduire à des variations du métabolisme du tryptophane par le microbiote intestinal. Ainsi l’objectif de nos travaux est d’évaluer l’impact de la végétalisation du régime sur la biodisponibilité du tryptophane et la production des métabolites bactériens par le microbiote et d’en caractériser les effets comportementaux, métaboliques et neurophysiologiques chez le rat à 2 stades de son développement : la période post-natale avant sevrage et le jeune en croissance.
Bénéfices attendus
Le projet produit des connaissances scientifiques originales en comparant les effets de régimes de protéines animales riches en tryptophane à ceux de protéines végétales pauvres en tryptophane sur le comportement alimentaire, émotionnel et cognitif et sur le métabolisme de jeunes adultes et sur la transmission de ces effets de la mère aux premiers petits issus de la reproduction. Plusieurs variables sont mesurées chez chaque animal. Ces expérimentations fourniront des opportunités uniques pour évaluer l’impact de la végétalisation du régime sur l’utilisation du tryptophane par le microbiote intestinal, sa métabolisation en métabolites bactériens et la répercussion éventuelle sur la santé métabolique et cérébrale des jeunes rats (pré- et post-sevrage). De telles informations sont essentielles pour mieux estimer les conséquences de la végétalisation de l’alimentation sur la santé. Les résultats participent à la construction d’une collection de données utiles aux pouvoirs publics dans le cadre de leur politique de santé humaine.
Procédures
Ce projet se déroulera sur 2 sites : L’ensemble du projet sera réalisé sur le site 1 et quelques mesures seront réalisées sur le site 2. La dépense énergétique de 100 animaux sera mesurée 1 fois pour chaque rat grâce à des cages mesurant les échanges respiratoires durant 72h sur le site 2. La composition en masse grasse de 100 rats sera évaluée par un appareil d’imagerie sur animaux vigiles sur le site 2 pendant 10 minutes par rat. Sur le site 1, les 200 rats seront hébergés en cages individuelles pour la mesure de la consommation alimentaire durant toute la durée de la période expérimentale, avec remise en cage par binôme durant le week-end ou 2 heures par jours 5 jours/semaine. Les 50 rates gestantes seront placées en cages individuelles pendant toute la période de gestation pour les mesures de consommation alimentaire et seront avec leurs petits pendant la période de lactation. Des tests de de choix alimentaire et hydrique (1h) seront réalisés deux fois à une semaine d’intervalle, après une période de mise à jeun ou de privation hydrique. Des tests comportementaux seront réalisés pour évaluer leur activité locomotrice, leur anxiété, et leur capacité d'apprentissage, 7 fois au maximum (= nombre de passages dans les différents tests). Des prélèvements des urines et fèces seront réalisés durant 48h sur 100 rats dans des cages spécialement conçues à cet effet. Des prises de sang seront effectuées 5 fois maximum à une semaine d’intervalle pour 100 rats ou 1 fois pour 100 rats pendant 5 minutes. Le lait de 40 rates sera prélevé 2 fois pendant 15 minutes. Une injection d’un traceur permettant d’évaluer la synthèse protéique sera réalisée avant la mise à mort de 100 rats 1 fois pendant 2 minutes au moment de la mise à mort.
Impact sur les animaux
Durant l’expérimentation, les rats seront hébergés en cages individuelles pour les mesures de la consommation. L’hébergement individuel (4 jours par semaine durant 6 semaines avec remise en cage par binôme durant le week-end ; ou hébergement individuel et remise en cage collective 2 heures par jours 5 jours/semaine) peut induire un stress modéré et empêcher le rat d’exprimer ses comportements sociaux. La mise à jeun (durant 15 heures maximum) et la privation d’eau (6 heures maximum) lors des tests de préférences alimentaires et de choix de biberons, peuvent représenter un stress léger pour les rats. Les tests comportementaux peuvent représenter un stress léger, dû à la nouveauté de l’environnement et à l’éclairage vif qui fait partie du principe de ces tests. La dépense énergétique sur 24h sera mesurée 1 à 2 fois pour chaque rat pendant 3jours. En outre, la collecte des fèces et des urines d’un rat sera réalisée 1 à 2 fois par rat pendant 48h. La prise de de sang peut provoquer un stress modéré lié à la contention et une petite douleur de courte durée. Les mères seront séparées de leurs petits 3h avant la traite (deux traites en tout dans la procédure), anesthésiées par voie gazeuse, puis l’hormone déclenchant la production de lait leur sera injectée et la traite sera faite manuellement. Après le réveil total de l’anesthésie, la mère sera remise avec sa portée (au maximum 3h30 de séparation). Une injection de traceur sera réalisée 30 minutes avant la mise à mort pour 100 rats, dans la veine caudale, sous anesthésie gazeuse dans le but de mesurer la synthèse protéique. Les organes et contenu digestif seront prélevés.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de l’expérimentation pour la collecte des contenus de l’intestin et de différents organes associés (foie, muscle, tissu adipeux), ainsi que du sang et du cerveau.
Remplacement
L’objectif du projet est d’étudier l’impact de la teneur en tryptophane du régime sur la santé cérébrale et métabolique des jeunes rats adultes et des ratons issus de la première génération Plusieurs variables sont mesurées chez chaque animal, notamment la croissance, la consommation alimentaire, le comportement, la digestibilité des protéines, le métabolisme des protéines, la physiologie digestive, l’utilisation du tryptophane par le microbiote, la formation des métabolites bactériens et des marqueurs de l’activité cérébrale. Cette approche globale nécessite d’utiliser des modèles animaux, permettant de faire varier l’alimentation à l’échelle du repas ou du régime, de prendre en compte les adaptations de l’organisme et l’effet de l’âge. Aucun modèle in vitro ou in silico n’est à même aujourd’hui d’intégrer l’ensemble de ces paramètres dans un système complexe permettant de modéliser l’ensemble des interactions entre l’alimentation, l’intestin, le cerveau et les organes associés.
Réduction
A partir de données obtenues d'une précédente étude, l'effectif minimal requis a été estimé pour mettre en évidence l’effet du régime sur les différents paramètres mesurés. Ainsi, 10 animaux par groupe et par sexe est le nombre minimal de rats pour pallier à la variabilité interindividuelle tout en préservant une puissance statistique correcte. Le nombre d’animaux nécessaire est de 650 rats. Pour les études au cours de la croissance : 5 régimes x 20 rats (10 mâles et 10 femelles) x 2 études = 200 rats. Pour l’étude sur les mères au cours de la gestation et de la lactation, 450 rats sont nécessaires : 8 petits + leur mère x 10 mères par régime x 5 régime.
Raffinement
Pour limiter l'impact de l'hébergement individuel, les rats seront placés dans des cages en plexiglas transparentes qui permettent les interactions visuelles. Les rats demeureront dans la même pièce que leurs congénères, avec lesquels ils restent en contact olfactif, visuel et auditif (vocalises). Les cages seront enrichies au moyen de tunnel, d’une tasse renversée, de support, de gamelle vide ou de billes. Une rotation des objets d’enrichissement est prévue afin de minimiser l’habituation des animaux à ces objets. Un enrichissement social est également prévu. Les rats seront regroupés dans des cages collectives durant 2h/jour tous les jours de la semaine ou durant les week-ends. Ces périodes de regroupement permettront aux animaux d’exprimer leur comportement d’exploration et d’interaction sociale. Les prises de sang seront réalisées par un manipulateur expérimenté. De plus, l’animal est habitué à l’emmaillotage dans un tissu, un geste utilisé pour des pesées régulières, afin de limiter le stress induit par ce même emmaillotage lors des prises de sang. Le transport des animaux sur le site 2 sera réalisé en voiture pour réduire la durée du stress provoqué par le transport 3 jours avant d’effectuer les mesures de dépense énergétique. De plus, un enrichissement social est prévu pour le transport : les animaux seront placés avec les animaux avec lesquels ils sont habituellement regroupés dans les boîtes de transport. De l’eau en gelée et de la nourriture seront à disposition dans la boîte. La mise à mort sera réalisée chez des animaux préalablement anesthésiés. Pour les prélèvements de lait, les mères seront séparées de leur petits le temps de la traite. Après réveil, la mère sera remise en cage avec ses petits. La réaction de chaque mère sera surveillée pour s’assurer que la réintégration se passe au mieux après la traite. La manipulation quotidienne des animaux permettra de faciliter cette réintégration. Pendant la traite, la cage contenant les ratons de la mère sera placée sur un tapis chauffant pour maintenir les petits au chaud. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permettra de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Enfin, des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures.
Choix des espèces
Comme l’être humain, le rat a un régime alimentaire très diversifié, il est omnivore. De plus l’anatomie et la physiologie de son système digestif présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. A tel point que l’Organisation des Nations Unies pour l’Alimentation et l’Agriculture (Food and Agriculture Organisation of the United Nations, FAO) recommande les études chez l’humain, le porc ou le rat pour évaluer la digestibilité des protéines. Notre projet s’inscrit complètement dans ce cadre. Des rats mâles et femelles prépubères (0-4 semaines) et en croissance (jeunes adultes, 5-9 semaines) sont inclus car nous étudions l’effet des régimes sur la première génération et la croissance.
Etude préclinique de transplants de microbiotes fécaux humains : tests d’efficacité d’implantation de différentes formulations de transplants chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Des formulations de transplants de microbiote fécal humain, mises au point par un partenaire industriel, sont testées sur 120 souris dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit un gavage puis cinq prélèvements de fèces, obtenus en le maintenant jusqu'à cinq minutes dans un pot en plastique. Toutes sont tuées à l'issue pour le prélèvement des organes et des analyses histologiques. Le porteur détaille son calcul, quatre à six souris par groupe suffiraient selon la littérature, il en prévoit huit, puis ajoute par précaution un groupe entier de huit animaux par série en cas de contamination accidentelle, ce qui porte l'effectif à 120.
Objectifs
Le partenaire industriel de ce projet développe des thérapies de restauration du microbiote à écosystème complet pour des patients atteints de cancer. Il cherche à traiter les dysbioses (déséquilibre des relations entre le microbiote et l’organisme) modérées à sévères afin d’améliorer les chances de survie. Pour cela, il a déjà conçu plusieurs produits et voudrait développer d’autres formulations afin de cibler une plus large gamme de pathologies. Il souhaite également tester plusieurs méthodes de conservation de produits déjà existants. L’objectif de ce projet est de tester plusieurs produits en les inoculant à des souris pour étudier (i) l’efficacité de l’implantation de ces microbiotes complexes humains, (ii) les répercussions sur l’organisme.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront d’améliorer les performances des thérapies de restauration du microbiote chez les patients atteints de cancer ou d’autres pathologies. En améliorant le traitement des dysbioses dont ils souffrent, leurs chances de survie pourront être augmentées.
Procédures
Les 120 animaux (nombre maximum) subiront un seul gavage (durée < 1min), ainsi que 5 prélèvements de fèces à plusieurs jours d’intervalle, pour une durée de 5 minutes chacun, le temps que les souris émettent spontanément des fèces.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront un stress lors des gavages et lors des prélèvements de fèces (5 minutes de séjour au plus dans un grand pot en plastique transparent).
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem : collecte des organes et analyses histologiques, moléculaires et biochimiques.
Remplacement
Actuellement, aucun autre modèle que l’animal n’existe pour caractériser l’implantation de microbiote complexe dans le tractus intestinal et en évaluer les effets sur différents organes.
Réduction
Les nombreuses analyses de composition du microbiote intestinal par biologie moléculaire publiées dans la littérature scientifique indiquent qu’un nombre réduit de souris par groupe et par sexe, de l’ordre de 4-6, est suffisant. Dans notre projet, nous utiliserons 8 souris/groupe (4 mâles et 4 femelles), ce qui conduit à 32 souris/série. Cependant, nous ajoutons par précaution un groupe de 8 animaux à chaque série, en cas de contamination accidentelle d’un groupe par d’autres micro-organismes que ceux étudiés (ce groupe serait alors à refaire). Cette précaution porte l’effectif à 40 souris/série, soit 120 souris au total (nombre maximal). Les résultats seront analysés à l’aide de tests statistiques.
Raffinement
L’expérience commencera après une semaine d’acclimatation aux nouveaux groupes sociaux et aux nouvelles conditions environnementales (passage des élevages des fournisseurs à l’animalerie d’expérimentation, constitution des groupes étudiés). Il y aura une observation quotidienne des animaux depuis l’extérieur des cages, une observation individuelle et une pesée hebdomadaire à l’occasion des prélèvements fécaux, ainsi qu’une observation accrue dans les heures qui suivront les inoculations orales. Dans la semaine qui précède ces inoculations, les souris seront prises en main quotidiennement pour les habituer à être manipulées et ainsi diminuer le stress le jour de l’inoculation. Les animaux seront hébergés dans des cages standards par groupe de 4 souris du même sexe. Du papier absorbant ou des nids de papier kraft à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter et des tunnels en plastique pour se cacher seront ajoutés dans les cages. En cas d’accident ou de maladie, les points limites définis pour cette étude seront appliqués.
Choix des espèces
La souris est un modèle établi pour la recherche sur le microbiote intestinal avec une pertinence démontrée pour la situation humaine. Nous utiliserons des souris jeunes adultes âgées de 6 à 8 semaines car les produits étudiés sont pour l’instant destinés à des adultes, il est donc logique d’utiliser des animaux adultes pendant la phase d’étude préclinique.
Effets métaboliques et cognitifs des variations d’apport en tryptophane et des fibres alimentaires dans l’alimentation (Multisite 2/2).
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Tués à la fin de l'expérimentation pour prélever contenu intestinal, foie, muscle, tissu adipeux, sang et cerveau, 650 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 450 mères et petits. 200 rats vivent en cage individuelle pendant six semaines pour la mesure de la consommation alimentaire, avec deux heures de regroupement par jour, et passent jusqu'à sept tests d'activité locomotrice, d'anxiété et d'apprentissage, après des jeûnes de 15 heures et des privations d'eau de 6 heures. Quarante rates sont anesthésiées, séparées de leur portée pendant trois heures et traites à la main après injection d'une hormone, l'opération étant répétée une seconde fois. Le porteur justifie le choix de l'espèce par une recommandation de la FAO citant l'être humain, le porc ou le rat pour évaluer la digestibilité des protéines, l'enjeu déclaré étant l'effet de la végétalisation de l'alimentation.
Objectifs
La période néonatale est critique pour le développement du cerveau et des perturbations pendant cette période peuvent avoir des répercussions profondes sur les fonctions cérébrales tout au long de la vie. Les molécules produites par le microbiote intestinal pourraient participer au contrôle de la maturation cérébrale durant cette période et notamment les métabolites bactériens, produits à partir du tryptophane, un acide aminé apporté par l’alimentation. Les enfants nés par césarienne présentent un microbiote moins diversifié que les enfants nés par les voies naturelles. Les enfants nés par césarienne présentent également plus de troubles et déficiences du système nerveux central, et une plus faible production de dérivés du tryptophane. Or parmi les métabolites bactériens, certains ont des effets dans le cerveau (par ex, neuroprotecteur et médiateur). En outre, la biodisponibilité du tryptophane et la production des métabolites bactériens peuvent moduler le poids corporel et la santé métabolique chez le rongeur. Le projet vise ainsi à évaluer l’impact des modifications du métabolisme bactérien du tryptophane, notamment via l’alimentation, sur la santé métabolique et comportementale. L’alimentation conditionne en effet le métabolisme du tryptophane par le microbiote de plusieurs manières. La présence du tryptophane dans le colon dépend de la quantité et de la digestibilité des protéines ingérées et son utilisation dépend de la présence d’autres substrats nutritifs, par exemple ceux apportés par les fibres. La végétalisation de l’alimentation, peut entrainer une diminution d’apport en tryptophane et une augmentation d’apport en fibres et donc conduire à des variations du métabolisme du tryptophane par le microbiote intestinal. Ainsi l’objectif de nos travaux est d’évaluer l’impact de la végétalisation du régime sur la biodisponibilité du tryptophane et la production des métabolites bactériens par le microbiote et d’en caractériser les effets comportementaux, métaboliques et neurophysiologiques chez le rat à 2 stades de son développement : la période post-natale avant sevrage et le jeune en croissance.
Bénéfices attendus
Le projet produit des connaissances scientifiques originales en comparant les effets de régimes de protéines animales riches en tryptophane à ceux de protéines végétales pauvres en tryptophane sur le comportement alimentaire, émotionnel et cognitif et sur le métabolisme de jeunes adultes et sur la transmission de ces effets de la mère aux premiers petits issus de la reproduction. Plusieurs variables sont mesurées chez chaque animal. Ces expérimentations fourniront des opportunités uniques pour évaluer l’impact de la végétalisation du régime sur l’utilisation du tryptophane par le microbiote intestinal, sa métabolisation en métabolites bactériens et la répercussion éventuelle sur la santé métabolique et cérébrale des jeunes rats (pré- et post-sevrage). De telles informations sont essentielles pour mieux estimer les conséquences de la végétalisation de l’alimentation sur la santé. Les résultats participent à la construction d’une collection de données utiles aux pouvoirs publics dans le cadre de leur politique de santé humaine.
Procédures
Ce projet se déroulera sur 2 sites : L’ensemble du projet sera réalisé sur le site 1 et quelques mesures seront réalisées sur le site 2. La dépense énergétique de 100 animaux sera mesurée 1 fois pour chaque rat grâce à des cages mesurant les échanges respiratoires durant 72h sur le site 2. La composition en masse grasse de 100 rats sera évaluée par un appareil d’imagerie sur animaux vigiles sur le site 2 pendant 10 minutes par rat. Sur le site 1, les 200 rats seront hébergés en cages individuelles pour la mesure de la consommation alimentaire durant toute la durée de la période expérimentale, avec remise en cage par binôme durant le week-end ou 2 heures par jours 5 jours/semaine. Les 50 rates gestantes seront placées en cages individuelles pendant toute la période de gestation pour les mesures de consommation alimentaire et seront avec leurs petits pendant la période de lactation. Des tests de de choix alimentaire et hydrique (1h) seront réalisés deux fois à une semaine d’intervalle, après une période de mise à jeun ou de privation hydrique. Des tests comportementaux seront réalisés pour évaluer leur activité locomotrice, leur anxiété, et leur capacité d'apprentissage, 7 fois au maximum (= nombre de passages dans les différents tests). Des prélèvements des urines et fèces seront réalisés durant 48h sur 100 rats dans des cages spécialement conçues à cet effet. Des prises de sang seront effectuées 5 fois maximum à une semaine d’intervalle pour 100 rats ou 1 fois pour 100 rats pendant 5 minutes. Le lait de 40 rates sera prélevé 2 fois pendant 15 minutes. Une injection d’un traceur permettant d’évaluer la synthèse protéique sera réalisée avant la mise à mort de 100 rats 1 fois pendant 2 minutes au moment de la mise à mort.
Impact sur les animaux
Durant l’expérimentation, les rats seront hébergés en cages individuelles pour les mesures de la consommation. L’hébergement individuel (4 jours par semaine durant 6 semaines avec remise en cage par binôme durant le week-end ; ou hébergement individuel et remise en cage collective 2 heures par jours 5 jours/semaine) peut induire un stress modéré et empêcher le rat d’exprimer ses comportements sociaux. La mise à jeun (durant 15 heures maximum) et la privation d’eau (6 heures maximum) lors des tests de préférences alimentaires et de choix de biberons, peuvent représenter un stress léger pour les rats. Les tests comportementaux peuvent représenter un stress léger, dû à la nouveauté de l’environnement et à l’éclairage vif qui fait partie du principe de ces tests. La dépense énergétique sur 24h sera mesurée 1 à 2 fois pour chaque rat pendant 3jours. En outre, la collecte des fèces et des urines d’un rat sera réalisée 1 à 2 fois par rat pendant 48h. La prise de de sang peut provoquer un stress modéré lié à la contention et une petite douleur de courte durée. Les mères seront séparées de leurs petits 3h avant la traite (deux traites en tout dans la procédure), anesthésiées par voie gazeuse, puis l’hormone déclenchant la production de lait leur sera injectée et la traite sera faite manuellement. Après le réveil total de l’anesthésie, la mère sera remise avec sa portée (au maximum 3h30 de séparation). Une injection de traceur sera réalisée 30 minutes avant la mise à mort pour 100 rats, dans la veine caudale, sous anesthésie gazeuse dans le but de mesurer la synthèse protéique. Les organes et contenu digestif seront prélevés.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de l’expérimentation pour la collecte des contenus de l’intestin et de différents organes associés (foie, muscle, tissu adipeux), ainsi que du sang et du cerveau.
Remplacement
L’objectif du projet est d’étudier l’impact de la teneur en tryptophane du régime sur la santé cérébrale et métabolique des jeunes rats adultes et des ratons issus de la première génération Plusieurs variables sont mesurées chez chaque animal, notamment la croissance, la consommation alimentaire, le comportement, la digestibilité des protéines, le métabolisme des protéines, la physiologie digestive, l’utilisation du tryptophane par le microbiote, la formation des métabolites bactériens et des marqueurs de l’activité cérébrale. Cette approche globale nécessite d’utiliser des modèles animaux, permettant de faire varier l’alimentation à l’échelle du repas ou du régime, de prendre en compte les adaptations de l’organisme et l’effet de l’âge. Aucun modèle in vitro ou in silico n’est à même aujourd’hui d’intégrer l’ensemble de ces paramètres dans un système complexe permettant de modéliser l’ensemble des interactions entre l’alimentation, l’intestin, le cerveau et les organes associés.
Réduction
A partir de données obtenues d'une précédente étude, l'effectif minimal requis a été estimé pour mettre en évidence l’effet du régime sur les différents paramètres mesurés. Ainsi, 10 animaux par groupe et par sexe est le nombre minimal de rats pour pallier à la variabilité interindividuelle tout en préservant une puissance statistique correcte. Le nombre d’animaux nécessaire est de 650 rats. Pour les études au cours de la croissance : 5 régimes x 20 rats (10 mâles et 10 femelles) x 2 études = 200 rats. Pour l’étude sur les mères au cours de la gestation et de la lactation, 450 rats sont nécessaires : 8 petits + leur mère x 10 mères par régime x 5 régime.
Raffinement
Pour limiter l'impact de l'hébergement individuel, les rats seront placés dans des cages en plexiglas transparentes qui permettent les interactions visuelles. Les rats demeureront dans la même pièce que leurs congénères, avec lesquels ils restent en contact olfactif, visuel et auditif (vocalises). Les cages seront enrichies au moyen de tunnel, d’une tasse renversée, de support, de gamelle vide ou de billes. Une rotation des objets d’enrichissement est prévue afin de minimiser l’habituation des animaux à ces objets. Un enrichissement social est également prévu. Les rats seront regroupés dans des cages collectives durant 2h/jour tous les jours de la semaine ou durant les week-ends. Ces périodes de regroupement permettront aux animaux d’exprimer leur comportement d’exploration et d’interaction sociale. Les prises de sang seront réalisées par un manipulateur expérimenté. De plus, l’animal est habitué à l’emmaillotage dans un tissu, un geste utilisé pour des pesées régulières, afin de limiter le stress induit par ce même emmaillotage lors des prises de sang. Le transport des animaux sur le site 2 sera réalisé en voiture pour réduire la durée du stress provoqué par le transport 3 jours avant d’effectuer les mesures de dépense énergétique. De plus, un enrichissement social est prévu pour le transport : les animaux seront placés avec les animaux avec lesquels ils sont habituellement regroupés dans les boîtes de transport. De l’eau en gelée et de la nourriture seront à disposition dans la boîte. La mise à mort sera réalisée chez des animaux préalablement anesthésiés. Pour les prélèvements de lait, les mères seront séparées de leur petits le temps de la traite. Après réveil, la mère sera remise en cage avec ses petits. La réaction de chaque mère sera surveillée pour s’assurer que la réintégration se passe au mieux après la traite. La manipulation quotidienne des animaux permettra de faciliter cette réintégration. Pendant la traite, la cage contenant les ratons de la mère sera placée sur un tapis chauffant pour maintenir les petits au chaud. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permettra de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Enfin, des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures.
Choix des espèces
Comme l’être humain, le rat a un régime alimentaire très diversifié, il est omnivore. De plus l’anatomie et la physiologie de son système digestif présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. A tel point que l’Organisation des Nations Unies pour l’Alimentation et l’Agriculture (Food and Agriculture Organisation of the United Nations, FAO) recommande les études chez l’humain, le porc ou le rat pour évaluer la digestibilité des protéines. Notre projet s’inscrit complètement dans ce cadre. Des rats mâles et femelles prépubères (0-4 semaines) et en croissance (jeunes adultes, 5-9 semaines) sont inclus car nous étudions l’effet des régimes sur la première génération et la croissance.
Caractérisation du rôle de régulateurs de l’intégrité génomique et du microenvironnement hépatique dans des modèles murins de stéatose-stéatohépatite et de cancer du foie.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Nourries pendant 6 à 12 mois de régimes enrichis en gras et en sucre, les souris de ce projet doivent développer une stéatose ou une stéatohépatite, et des tumeurs du foie sont attendues. 3168 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements post-mortem. Une partie reçoit sous anesthésie une injection intraveineuse qui fait exprimer un gène, une autre passe une échographie du foie sous anesthésie tous les quinze jours, 8 à 12 fois en moyenne, une autre encore subit une chirurgie terminale, et le porteur annonce une prise de poids importante qui peut modifier leur mobilité et leur comportement. L'injection est intraveineuse selon la liste des procédures, sous-cutanée selon celle des effets attendus, qui évoque l'aiguille passant "au travers de la peau et du péritoine".
Objectifs
Chaque année, plus de 900 000 personnes sont diagnostiquées avec un cancer du foie et environ 800 000 personnes succombent à la maladie, ce qui en fait la troisième cause de décès par cancer dans le monde. En raison de l’épidémie mondiale de diabète et d’obésité, l’incidence de ce cancer ne cesse d’augmenter et malheureusement les options thérapeutiques restent limitées. Ce projet de recherche vise à définir le rôle d’acteurs clés dans le contrôle de l’intégrité génomique mais également du microenvironnement immunitaire hépatique lors du développement de maladies métaboliques telles que la stéatose et la stéatohépatite, qui peuvent conduire au cancer du foie ou carcinome hépatocellulaire.
Bénéfices attendus
Les stratégies thérapeutiques mises en jeu dans la lutte contre le cancer du foie sont à l’heure actuelle très limitées et souffrent d’un manque de compréhension (1) des mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans le contrôle du potentiel prolifératif des hépatocytes (cellules majoritaires du foie) et (2) du rôle du microenvironnement immunitaire, lors du développement de ce cancer, notamment dans un contexte de perturbations métaboliques. Les résultats de ce projet devraient nous permettre de mieux caractériser le rôle de ces différents mécanismes et acteurs dans la maladie, de développer de nouveaux outils diagnosticet pronostic dans la prise en charge du cancer du foie et conduire également dans un futur proche à l’émergence de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Une partie des animaux recevra une injection intraveineuse unique sous anesthésie générale permettant l’expression d’un gène d’intérêt (1 fois, 5 minutes/animal). Tous les animaux seront soumis à différents régimes alimentaires modifiés (enrichi en gras, sucre, etc.) permettant de reproduire la pathologie étudiée pour une durée de 6 à 12 mois selon les régimes. Une partie de ces animaux sera suivie par échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10 minutes tous les 15 jours (8 à 12 échographies en moyenne par souris). Une autre partie de ces animaux sera impliquée dans une chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie (15 minutes par animal). L’ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet nous procéderons à une injection sous-cutané et un certain inconfort ou stress, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine) pourra être ressenti par les animaux. Par ailleurs, du fait des différents régimes alimentaires auxquels seront soumis les animaux, une prise de poids importante est attendue, pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Enfin, du fait d’un développement tumoral attendu au niveau du foie, les animaux pourraient être sujets à une altération de leur état général.
Devenir
Pour ce projet de recherche, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglementaire) de l’ensemble des animaux (3168).
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence ici le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires induisant la séquence stéatose/stéatohépatite/carcinome hépatocellulaire. Par ailleurs, le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire mais aussi l’environnement métabolique et les autres organes pathologiques, notamment lors de la stéatose non alcoolique du foie. L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permettrait donc pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité.
Réduction
3168 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.
Raffinement
L'ensemble de ce projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal. Les animaux provenant de l’extérieur seront acclimatés une semaine au sein de l’animalerie. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Le milieu est enrichi avec plusieurs enrichissements. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur une plaque chauffante. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l’euthanasie anticipée de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.
Choix des espèces
Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour déterminer les mécanismes moléculaires conduisant au carcinome hépatocellulaire. Nous avons choisi la souris, car en plus de partager plus de 90 pourcents de gènes communs avec l’homme, il existe pour cette espèce des modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont de jeunes adultes (6 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans la séquence stéatose/stéatohépatite.
Evaluation de l’efficacité d’un composé actif administré par voie orale à 2 doses sur le traitement de la colite ulcérative chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Mis à jeun douze heures puis anesthésiés quarante minutes le temps qu'on leur introduise dans le colon une substance qui l'ulcère, 32 rats subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, huit autres servant de témoins avec un produit neutre. Les 40 rats sont tués à la fin pour prélever le colon et son contenu. Le porteur annonce un inconfort et une douleur "notoires", une perte de poids, une posture prostrée, une fourrure hérissée, des yeux moins ouverts, et écrit qu'aucun antidouleur ne sera administré parce qu'il interférerait avec les résultats. L'étude compare deux doses d'un composé anti-inflammatoire à un placebo et à un traitement de référence, dans l'espoir d'un essai clinique chez l'humain.
Objectifs
La colite ulcéreuse ou rectocolite hémorragique (RCH) fait partie des deux principales maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) avec la maladie de Crohn, et affecte l'extrémité distale du tube digestif, côlon et rectum. La colite ulcéreuse se classe parmi les maladies inflammatoires parce qu'elle occasionne une inflammation, des plaies, des saignements et une déstructuration sur les parois internes du côlon. L’inflammation s’accompagne de la formation d’ulcères pouvant saigner et produire du mucus ou du pus. Les personnes atteintes de colite ulcéreuse doivent être attentives au risque d’anémie car lorsque la maladie est grave, les pertes de sang peuvent être abondantes, pertes que l’on peut compenser grâce à des suppléments en fer. Des facteurs génétiques et environnementaux influenceraient l’apparition de cette maladie. Le stress et les intolérances alimentaires peuvent déclencher les symptômes chez certaines personnes, mais ces facteurs ne seraient pas à l’origine de la maladie. Des complications liées à l’usage à long terme de certains médicaments peuvent survenir (ostéoporose, cataracte, hypertension, diabète...), médicaments qui peuvent aussi augmenter le risque d’infection. L’objectif de cette étude est d’évaluer l’efficacité d’un composé actif ayant des propriétés anti-inflammatoires et antidouleur, administré par voie orale à 2 doses, chez des rats soumis à l’induction d’une ulcération colique. Les effets observés seront comparés à ceux obtenus chez des rats traités avec un placebo ou avec un traitement anti-inflammatoire intestinal de référence. A l’issue de l’étude, les rats seront euthanasiés et le colon et la matière fécale qu’il contient seront prélevés pour la réalisation d’analyses biologiques.
Bénéfices attendus
La réalisation de cette étude va permettre d’évaluer les effets d’un composé actif à 2 doses différentes chez le rat soumis à l’induction d’une ulcération colique expérimentale, et de comparer ces effets avec un placebo et un traitement anti-inflammatoire intestinal de référence utilisé pour le traitement de la colite ulcéreuse. Les données des différents paramètres suivis au cours de l’expérimentation, poids corporel, prises alimentaire et hydrique, ainsi que les données comportementales relévées quotidiennement concernant l’activité, la posture, l’aspect de la fourrure et l’ouverture des yeux dans la cage d’habitation, l’évaluation comportementale effectuée à la fin de l’expérimentation pour mesurer l’activité exploratoire, et les analyses biologiques qui seront effectuées sur le colon et la matière fécale prélevés en fin d’expérimentation, permettront d’appréhender les effets bénéfiques ou non de traitements avec ce composé actif sur ses activités anti-inflammatoire intestinale et antidouleur chez le rat. Cela permettrait d’envisager la réalisation d’une étude clinique chez l’Homme avec ce composé actif, et à terme de proposer une nouvelle thérapie pour le traitement de la colite ulcéreuse.
Procédures
Les 40 rats nécessaires à la réalisation de ce projet seront placés à jeun pendant 12 heures avant l’induction de l’ulcération colique. L’ulcération colique sera induite par administration dans le colon d’une substance permettant l’induction de cette pathologie. Elle sera effectuée sur 32 des 40 rats placés sous anesthésie générale et nécessitera environ 40 minutes pour être réalisée. Les 8 autres rats ne subiront pas l’induction de l’ulcération colique mais ils seront également placés sous anesthésie générale pendant 40 minutes environ et recevront une administration de substance neutre dans le colon. Après induction de l’ulcération colique, un traitement par voie orale avec les composés à évaluer sera effectué quotidiennement pendant 6 jours sur les animaux vigiles, geste effectué en moins d’1 minute par une personne expérimentée. Un test comportemental sera effectué à la fin de l’expérimentation pour évaluer la douleur ressentie par les animaux. Chaque rat sera placé pendant 5 minutes dans un dispositif expérimental permettant d’évaluer plusieurs paramètres comportementaux.
Impact sur les animaux
La mise à jeun des animaux la veille au soir de l’induction de l’ulcération colique, pendant une durée de 12 heures, nécessaire pour que l’ensemble des animaux soient dans les mêmes conditions physiologiques et que leur colon soit vide de matière fécale, va induire une légère perte de poids des animaux. L’induction de l’ulcération colique va quant à elle induire un inconfort des animaux et une douleur ressentie notoires, se traduisant par une perte de poids modérée liée à une diminution de la prise alimentaire, voire également de la prise hydrique, et des modifications du comportement des animaux avec une activité moindre, une posture plus prostrée, une fourrure plus hérissée et des yeux moins ouverts, ainsi qu’avec une diminution de l’activité exploratoire. Le traitement avec le composé actif à évaluer devrait limiter cet inconfort et cette douleur ressentie et donc les effets sur les différents paramètres mesurés, tout comme le traitement anti-inflammatoire intestinal de référence comme nous l’avons démontré dans de précédentes études. L’évaluation comportementale effectuée à la fin de l’expérimentation par la mise en place des animaux individuellement dans un dispositif expérimental pendant 5 minutes, va engendrer un stress modéré des animaux par l’isolement et la perte des interactions sociales entre congénères durant ce laps de temps.
Devenir
A l’issue de l’unique procédure expérimentale, les 40 rats seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement de du colon et de la matière fécale contenue dans celui-ci pour la réalisation d’un ensemble d’analyses.
Remplacement
Des études préliminaires effectuées in vitro sur des cultures de cellules intestinales ont permis de sélectionner le composé actif ayant démontré les effets anti-inflammatoires les plus probants. Nous souhaitons donc maintenant confirmer ces effets anti-inflammatoires dans un modèle bien caractérisé de colite ulcérative. Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant d’évaluer les effets de substances sur l’inflammation intestinale qui est un processus complexe impliquant le système digestif, le système immunitaire et le microbiote intestinal, et sur l’évaluation comportementale. Cela ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé à partir des résultats d’études précédemment menées par notre laboratoire sur ce modèle expérimental de colite ulcérative ayant montré des effets "forts" de traitements sur l’inflammation intestinale générée, l’évolution pondérale et les paramètres comportementaux évalués dans un test comportemental spécifique à la fin de la période de traitement. Nous utiliserons ainsi 8 animaux par groupe expérimental. A l’issue des expérimentations, une analyse statistique de l’ensemble des données générées sera réalisée.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles. Les rats seront placés à 2 par cage dans des cages transparentes avec des briques d’Aspen et du papier kraft comme enrichissement, et ils auront accès à la nourritue et à l’eau ad libitum. Une attention toute particulière sera portée aux animaux après l’induction de la colite ulcérative, lors de la réalisation des traitements et la réalisation de l’évaluation comportementale. Les animaux seront observés plusieurs fois par jour tout au long de l’expérimentation par du personnel qualifié, week-end et jours fériés inclus. Un suivi quotidien de leur poids et de leurs consommations alimentaire et hydrique sera effectué tout au long de l’expérimentation, de même qu’une observation spécifique de leur comportement dans leur cage pour évaluer le niveau de douleur ressentie au travers de l’observation de leur activité, de leur posture, de l’état de leur fourrure et de l’ouverture de leurs yeux. Cela permettra ainsi d’évaluer l’effet antidouleur du composé actif testé sur la pathologie induite et de la comparer à celui des autres groupes de traitement. L’évaluation de la douleur ressentie se fera également par la réalisation d’un test comportemental 24 heures après le dernier traitement oral et juste avant leur euthanasie, pour évaluer l’activité exploratoire des animaux au travers de différents paramètres. Le but de cette étude étant d’évaluer les effets anti-inflammatoires du composé actif qui sera testé, il ne sera pas possible d’administrer de traitement antidouleur qui interférerait avec les résultats de l’étude et leur interprétation. Cependant, la surveillance de points limites définis permettra d’isoler voire d’exclure éventuellement des animaux avec une prise en charge en conformité avec les recommandations éthiques.
Choix des espèces
Le rat est un modèle très utilisé pour les études dans le domaine de l’inflammation et notamment le modèle d’ulcération colique induit par le TNBS qui est reconnu par la Communauté Scientifique Internationale. C'est donc l’espèce animale la plus appropriée pour ce type d’étude. Les animaux seront de jeunes rats âgés de 8-9 semaines et d’un poids de 225-250 g à l’arrivée au laboratoire et de 9-10 semaines et d’un poids de 250-275 g pour la réalisation des expérimentations, correpondant à l’âge et au poids de rats que nous utilisons pour la réalisation d’expérimentations sur ce modèle de colite ulcérative.
Consommation de fer héminique issu des produits carnés : conséquences sur la physiologie et la sensibilité du côlon chez la souris adulte et sa descendance en comparaison d’un apport en citrate de fer.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
548 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 264 opérées une heure sous anesthésie générale pour l'implantation d'électrodes sur les muscles abdominaux, puis hébergées seules dès le réveil. Sur ces souris maintenues éveillées, une pression est appliquée dans le côlon pendant dix secondes et répétée par paliers croissants pendant qu'on compte leurs contractions abdominales, stimulus que le porteur qualifie lui-même de douloureux. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger pour 284 animaux et modéré pour 264, d'autres souris passant 23 heures en cage à métabolisme, d'autres étant mises à reproduire pour étudier l'effet du régime maternel sur la descendance. L'objet est de savoir si le fer héminique de la viande rouge, de la charcuterie ou d'un substitut végétal à base de léghémoglobine de soja aggrave la sensibilité du côlon, les retombées annoncées pour les patients atteints du syndrome de l'intestin irritable se limitant à des recommandations nutritionnelles à préciser.
Objectifs
Le syndrome de l’intestin irritable est une pathologie intestinale chronique répandue (5-10% de la population), altérant la qualité de vie des patients par l’inconfort digestif et les douleurs abdominales générées. C’est également une cause majeure de consultations médicales dans le monde occidental. Le diagnostic pour ces patients repose en partie sur l’évaluation de leur sensibilité viscérale, qui se trouve exacerbée en réponse à l’application d’une pression appliquée sur la paroi du côlon par rapport à la sensibilité perçue par une personne saine. Bien que les causes de ce syndrome restent peu comprises, il est établi que la composition du régime alimentaire influence fortement l’aggravation des symptômes. Les viandes rouges et charcuteries ne sont actuellement pas connues comme des aliments associés à l’exacerbation des symptômes de sensibilité viscérale chez ces patients, mais une étude chez la souris montre que la consommation d’un régime riche en fer héminique engendre une sensibilité viscérale accrue en réponse à un stimulus douloureux. Dans ce contexte, ce projet a pour objectif de répondre à 3 questions : 1- La sensibilité accrue induite est-elle équivalente quelle que soit la forme du fer héminique consommé ? La sensibilité viscérale induite sera mesurée chez des souris chez lesquelles le fer héminique du régime sera apporté sous forme (i) purifiée, (ii) d’hémoglobine ou (iii) de viande. 2- La mise sur le marché d’une préparation à base de léghémoglobine de soja, à savoir une molécule de la même famille que l'hémoglobine de la viande, mais d'origine strictement végétale, est envisagée en Europe pour produire des substituts de viande. Au regard de la proximité de ces deux molécules, ce produit destiné à végétaliser davantage nos régimes est-il susceptible d’engendrer des effets sur la physiologie et la sensibilité du côlon ? 3- Sur le plan nutritionnel pendant la gestation et la lactation, un apport suffisant en fer, même héminique, est crucial. Une consommation maternelle excessive en produits carnés riches en fer héminique (environ 20% des femmes) est-elle susceptible de prédisposer sa descendance à des troubles digestifs tels qu’une sensibilité viscérale augmentée ?
Bénéfices attendus
En termes de santé publique, ces études permettront de mettre en lumière un nouveau facteur alimentaire à prendre en compte dans le régime des patients atteints du syndrome de l’intestin irritable, à savoir la consommation de viandes rouges et charcuteries, ou encore la consommation de substituts de viandes préparés à base de léghémoglobine. Ces données contribueront par ailleurs à préciser les bénéfices/risques et les recommandations nutritionnelles en fer au sein de la population générale, et chez la femme enceinte et allaitante, pour qui durant ces périodes, l’apport en fer est essentiel.
Procédures
Sur les 548 souris nécessaires à la réalisation de ce projet, 152 d’entre elles seront dédiées à la reproduction pour une exposition nutritionnelle périnatale. 228 souris nourries avec un régime dont la source de fer consommée (ou celle consommée par leur mère) sera contrôlée, seront placées chacune 23 heures en cage à métabolisme en fin d’étude. 264 souris nourries en parallèle avec ces mêmes régimes seront soumises à une chirurgie sous anesthésie générale (analgésiques/myorelaxants) à raison de 1h maximum par intervention pour placer un dispositif de mesure des contractions abdominales. Pour la mesure de sensibilité viscérale, le nombre de contractions sera compté en réponse à l’application d’une pression intra-colique pendant 10 secondes et répétée 4 fois par palier croissant.
Impact sur les animaux
Des groupes de souris, dont la source du fer consommé (ou consommé par leur mère selon la fenêtre d’exposition concernée) sera contrôlée, seront placés 23 heures en cage à métabolisme en fin d’étude. Le stress modéré induit par la stabulation sur grille et l’isolement transitoire, pourrait modifier la mesure de la sensibilité viscérale, c’est pourquoi ces groupes de souris seront uniquement destinés à la collecte des échantillons fécaux et urinaires. En parallèle, pour la mesure de la sensibilité viscérale, les souris exposées à ces différentes sources de fer seront soumises à une chirurgie sous anesthésie générale (analgésiques/myorelaxants) à raison de 1h par intervention pour implanter le dispositif de mesure sur les muscles abdominaux, ce qui suppose un inconfort lors de la phase de réveil, de récupération et lors des contentions effectuées pour l'administration des traitements post-opératoires (injections sous cutanées) et la vérification des points de suture. La préservation de ce dispositif implique un hébergement en cage individuelle à partir du réveil, et donc un stress lié à un isolement transitoire. La mesure de sensibilité viscérale requière que la souris reste vigile. Le stimulus douloureux ressenti résultera d’une augmentation de la pression intra-colique appliquée pendant 10 secondes à 5 reprises par palier espacés chacun de 10 minutes. Cette mesure est donc associée à un inconfort, un stress et une mobilité réduite de la souris.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les souris seront mises à mort et divers prélèvements seront effectués post-mortem pour des analyses histologiques et biochimiques ultérieures.
Remplacement
Les modèles cellulaires ont montré que des molécules formées dans le côlon lors de la consommation d’un régime riche en produit carné, pouvaient induire une cytotoxicité différente selon que la cellule exposée soit saine ou pré-tumorale. Cependant, aucune étude in vitro ou ex-vivo à ce stade du projet nous permet d’évaluer les conséquences d’un régime sur la physiologie digestive et plus particulièrement sur la sensibilité viscérale, que ce soit chez la souris adulte ou chez sa descendance. Seule une approche in vivo nous permettra de prendre en compte la complexité des répercussions de cette exposition directe ou indirecte à ces contaminants d’origine alimentaire néoformés dans le contenu du côlon. La mesure de la sensibilité viscérale en réponse à l’application d’une pression intra-colique reste par ailleurs la méthode employée chez les patients pour fiabiliser le diagnostic du syndrome de l’intestin irritable.
Réduction
Les études antérieures associées à ce projet nous ont permis d’améliorer la procédure de sensibilité viscérale sur le plan technique (expérience de l’expérimentateur) et du bien-être de l’animal. Ces améliorations ont permis de diminuer le nombre d’animaux requis pour aboutir à des résultats significatifs et fiables : de 15 souris initialement par groupe, 12 souris par groupe sont aujourd’hui considérées comme nécessaire. Ce nombre sera réduit à 6 pour les lots parallèles destinés aux prélèvements fécaux et urinaires. Par ailleurs, le nombre minimum requis de souris utilisées pour la reproduction afin d'étudier l’impact des régimes maternels sur la santé digestive de la descendance est calculé au plus juste selon une convention établie dans le cadre des études développementales (concept du DoHAD). Malgré tout, cette phase d’élevage occasionne parfois des individus surnuméraires : les femelles restées non gestantes, les mâles après la phase de reproduction ainsi que les nouveaux nés surnuméraires. Ils serviront de témoin d’exposition pour la collecte d’échantillons, préservant ainsi les femelles gestantes et leur descendance d’un cumul d’interventions. Une saisine a déjà été anticipée en parallèle pour réaffecter ces souris surnuméraires à d’autres mesures complémentaires comme la mesure de la motricité intestinale. La reproductibilité et fiabilité des résultats sera assurée par une répétition indépendante des expérimentations. Une analyse statistique univariée par facteur sera réalisée et des approches multivariées couplées à des analyses de corrélations permettront d'exploiter au maximum l'ensemble des données qui seront générées.
Raffinement
Pour assurer une fiabilité des résultats tout en limitant le nombre d’animaux utilisés, une attention particulière est accordée au bien-être des souris et de leurs conditions d’hébergement : des manipulations douces d’habituation lors des pesées hebdomadaires seront effectuées, et pour minimiser le stress lié aux périodes d’hébergement en cage individuelle, les cages transparentes seront alignées et laissées sans couvercle filtrant pour maximiser les échanges visuels, olfactifs et auditifs. Des planches de fibre de coton déchiquetables (nestlets) leur seront distribuées pour satisfaire leur besoin de nidification et d’exercice, facilitant leur thermorégulation au sein du nid et celle de leur portée dans le cas de l’étude périnatale. Des buchettes en peuplier disposées sur la litière (ou sur la grille en cage à métabolisme) leur permettront de satisfaire le besoin de ronger. Une observation des souris à l’occasion notamment de la distribution quotidienne des régimes permettra de détecter à temps toute anomalie éventuelle et de minimiser la durée de toute souffrance constatée par des soins appropriés. Toutes les mesures susceptibles de réduire la douleur sans affecter l’objectif scientifique seront mises en application (anesthésie, prise en charge de la douleur post opératoire, tapis chauffant, hébergement transitoire en armoire chauffée en période post-opératoire, réhydratation).
Choix des espèces
La souris est un modèle courant pour la mesure de la sensibilité viscérale. Nous avons retenu une souche pour laquelle nous avons une grande expérience et une bonne base de connaissance à propos de sa physiologie digestive (barrière intestinale, système immunitaire, microbiote et sensibilité viscérale), comme de son comportement face aux produits d’anesthésie. En outre, le modèle choisi présente l’avantage d’être particulièrement sociable, la souche de souris choisie ne nécéssite pas en effet de contention pour la manipuler, et les femelles portent une grande attention envers leur descendance, ce qui limite le cannibalisme. Quelle que soit l’étude considérée, la mesure de la sensibilité viscérale requiert un tractus digestif mature. Des animaux adultes âgés de 9-11 semaines seront donc utilisés. En amont et pour permettre d’avoir des phases d’exposition aux différents régimes, nous réceptionnerons donc des souris âgées de 6 semaines pour les études chez l’adulte et des souris en âge de procréer (7-8 semaines) pour l’étude dédiée à une exposition maternelle pendant la gestation et la lactation.
Implication des peptides bioactifs issus de protéines agroalimentaires sur le métabolisme énergétique et glucidique, l’hypertension et le stress oxydatif
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Une partie des 768 rats utilisés est génétiquement hypertendue, retenue pour éviter d'avoir à provoquer l'hypertension par un produit chimique. Tous sont tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère : un gavage oro-gastrique par jour pendant trois semaines, six prélèvements sanguins par incision de la queue lors des tests de tolérance au glucose, quatre jours en cage métabolique isolée, jusqu'à vingt minutes de contention par mesure de pression artérielle. Le porteur reconnaît que la répétition des gavages peut irriter ou léser l'œsophage et que l'isolement, jusqu'à dix-neuf semaines, induit du stress, tout en qualifiant les cages métaboliques d'"indispensables". L'enjeu déclaré est de confirmer chez le rat des effets de protéines agroalimentaires déjà observés in vitro, et la mise à mort sert à prélever le plasma, la muqueuse intestinale, le cœur, les reins, le foie et les poumons.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont : - D’étudier l’effet des protéines issues de l’agro-alimentaire (différentes sources : végétales, animales, poissons) sur le métabolisme énergétique, le métabolisme glucidique intestinal (effet des protéines seules ou couplées à un inhibiteur de l'absorption du glucose), la prise alimentaire, la sécrétion de certaines hormones impliquées dans le métabolisme énergétique ainsi que certains marqueurs de l’oxydation. - De comprendre les mécanismes impliqués dans la digestion des protéines en relation avec la régulation de la prise alimentaire. - D'étudier l'effet des protéines issues de l'agro-alimentaire (différentes sources : végétales, animales, poissons) sur la tension artérielle ainsi que sur le dosage de certaines enzymes impliquées dans l'hypertension artérielle.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont une confirmation des résultats déjà obtenus in vitro. Cela démontrerait l'effet bénéfique des protéines alimentaires sur la santé, plus particulièrement dans la prévention contre le diabète de type 2, l'hypertension et l'obésité et donc de prévenir ces pathologies en utilisant une alimentation adaptée voire personnalisée.
Procédures
- La mesure de l’effet des protéines sur la régulation de la glycémie est réalisée en donnant les protéines (avec ou sans inhibiteur de l’absorption du glucose), puis 30 min après, du glucose par gavage oro-gastrique à l’aide d’une sonde de gavage. Pendant cette procédure, des prélèvements sanguins sont réalisé sur animaux vigiles au niveau de la queue avant (à min) et après 15, 30, 60 et 90 et 120 min après avoir donné le glucose (soit 6 prélèvements). - Des prélèvements sanguins sont réalisé sur animaux vigiles au niveau de la queue avant et après gavage oro-gastrique de protéines afin de mesurer les niveaux plasmatiques de certaines hormones intervenant dans la régulation de la prise alimentaire (0 ; 30 et 60 min après ingestion des protéines, soit 3 prélèvements), de la tension artérielle (0 min et 4 h après ingestion des protéines, soit 2 prélèvements). - La mesure de la prise alimentaire en utilisant des cages métaboliques pendant 4 jours maximum (un jour d’acclimatation et 3 jours de test avec un gavage oro-gastrique par jour). Les cages métaboliques permettent la mesure en continue de la prise alimentaire, de la prise de boisson et de la dépense énergétique. - Afin de mesurer l’effets des protéines sur la régulation de la prise alimentaire sur du long-terme, les animaux reçoivent les protéines 1 fois par jour par gavage oro-gastrique pendant 3 semaines. - La mesure de la pression artérielle est mesurée de la même façon que chez l’Homme. Pour cela, les animaux sont placés dans des cages de contentions pour limiter leurs mouvements et la mesure est réalisée au niveau de la queue du rat. Cinq mesures de la pression artérielle est prises avant gavage et après gavage (2,4 et 6h). Les animaux sont replacés dans leur cage d’hébergement après chaque mesure. - Afin de mesurer l’effets des protéines sur la régulation de la pression artérielle sur du long-terme, les animaux reçoivent les protéines 1 fois par jour par gavage oro-gastrique pendant 3 semaines. En fin d’expérimentation, les animaux reçoivent les protéines par gavage oro-gastrique et sont mise à mort après anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
- L’incision de la queue lors des prélèvements de sang entraîne une douleur légère de courte durée et sans réitération au cours de la procédure de test oral de tolérance au glucose, il est donc préférable à l’utilisation répétée de l’aiguille pour le prélèvement dans la queue. - L’isolement des animaux sur le long terme (19 semaines maximum), ainsi que la contention répétée pour les prélèvements de sang (moins de 5 minutes par prélèvement de sang), pour la pression artérielle (20 minutes par mesure de la pression artérielle) ou pour les gavages (moins de 5 minutes) induit de l’inconfort et du stress chez les animaux mais il est nécessaire à l’obtention d’une réponse individuelle. - Le gavage oro-gastrique en tant que tel n’entraîne pas de douleur mais la répétition des gavages peut entraîner des lésions ou une irritation au niveau de l’œsophage, en particulier dans les procédures où les animaux reçoivent un gavage journalier pendant 3 semaines. - L’utilisation des cages métaboliques ou l’animal est isolé pour la mesure de la prise alimentaire, de boisson et la dépense énergétique sur 4 jours induit un stress chez l’animal car il change de pièce sur plusieurs jours, avec un accès à la nourriture différent (mangeoire plus petite et suspendue pouvant entraîner une difficulté pour se nourrir). L’utilisation de ces cages est cependant indispensable pour la mise en évidence d’un effet individuel sur la prise alimentaire. - La mesure de la pression artérielle n’entraîne pas de douleur mais peut entraîner une gêne de courte durée (le temps de la mesure) au niveau de la queue car plusieurs mesures sont réalisées pour chaque temps (0 ;2 ;4 et 6h, donc 4 mesures espacées sur la même journée). - En fonction des protéines, il est possible que le gavage atteigne le volume maximal pouvant être donné aux animaux, ce qui est un inconfort supplémentaire pour l’animal de courte durée.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort afin de récupérer le plasma pour des dosages hormonaux en lien avec la régulation de la prise alimentaire, l’oxydation ou en lien avec la régulation de l’hypertension artérielle. De plus, certains tissus tels que la muqueuse intestinale pour les modifications dans l’expression des gènes induites par les protéines, le cœur, les reins, le foie, les poumons afin de mesurer les marqueurs de l’hypertension artérielle, seront prélevés.
Remplacement
L’objectif de cette expérimentation est de tester l'effet hypoglycémiant, satiétogène, antioxydant et antihypertenseur de protéines agro-alimentaires d'origines variables. Pour cela, des rats seront gavés avec ces différentes protéines et les effets observés seront comparés aux effets chez des rats gavés par une solution sans protéine (eau ou solution isocalorique). Un test in vitro sur une lignée intestinale et des tests biochimiques sont utilisés au laboratoire en parallèle afin de minimiser l’utilisation des animaux mais ces tests, basés sur un dosage hormonal ou enzymatique, ne permettent pas de mettre en évidence l’effet des protéines sur la prise alimentaire. De plus, ces tests in vitro ne permettent pas de prendre en compte le système complexe du corps (interactions intestin-cerveau- pour la régulation de la prise alimentaire, interactions reins-poumons-cœur pour la régulation de la tension artérielle) A cette étape l’utilisation des animaux est indispensable.
Réduction
Des études in vitro au laboratoire ont préalablement été réalisées afin de sélectionner les protéines à tester, ce qui permet de réduire le nombre de groupe par étude et donc le nombre d’animaux. Le principe de réduction a été appliqué et le nombre réduit à 8 animaux par groupe, ce qui est un minimum pour les analyses statistiques, compte tenu des possibilités de problème individuel de croissance sur les animaux. Les animaux peuvent recevoir différentes protéines pour une même procédure après un temps de repos suffisant. Ce qui permet de réduire le nombre d'animaux utilisés mais également de sélectionner les protéines ou les doses données. Enfin, après mise à mort, le plasma et les organes collectés sont divisés et placés dans différents tubes pour réaliser différents tests sur un même individu. De cette façon, le nombre d’animaux est également réduit.
Raffinement
Dans la mesure du possible, les animaux sont automatiquement placés par deux dans les cages d'hébergement afin d'éviter le stress d'isolement de l'animal. Pour les procédures de mesure de la prise alimentaire en cages métaboliques et de prise alimentaire sur le long terme, les animaux sont placés individuellement par cage dès leur arrivée afin de diminuer le stress d’isolement avant le début de l’expérimentation. Cependant, les cages sont placées de telle sorte que les animaux arrivent à se voir entre eux (pas de cage isolée sur le portoir). De plus, toutes les cages contiennent de l'enrichissement (tunnel rouge, litière mais également des rondins de bois pour les animaux qui ne sont pas dans les procédures de prise alimentaire). Afin de diminuer le stress induit par les différentes procédures, les animaux sont entraînés avant le début des expérimentations, au gavage, aux cages métaboliques, à la contention, à la mesure de la pression artérielle. De plus, le choix de travailler sur des animaux génétiquement hypertendus pour mesurer l’effet des protéines sur la pression artérielle, permet de ne pas induire l’hypertension chimiquement, ce qui entre dans le principe de raffinement. Tous les animaux mais en particulier les animaux hypertendus sont surveillés tous les jours et après chaque gavage (dans l’heure qui suit le gavage mais surtout 24h après le gavage). Les périodes de mise à jeun des animaux sont toujours réalisées dans la période de repos (lumières allumées) des animaux lorsque les animaux mangent peu. Ceci permet de diminuer le stress que la privation de nourriture peut engendrer.
Choix des espèces
Le choix du rat est lié à l’abondance de bibliographie sur de telles études mais ce modèle est également préféré à la souris compte tenu du volume de sang pouvant être prélevé, permettant de doser toutes les hormones d’intérêt et de réduire le nombre d’animaux. Des rats mâles sont choisis plutôt que des femelles afin de limiter les effets des cycles hormonaux. Le modèle de rats hypertendus a été sélectionné car il permet d'étudier l'effet des protéines sur un modèle hypertendu sans induction chimique de l’hypertension. Des rats âgés de 12 semaines seront utilisés dans le protocole. A ce stade les rats sont adultes et leur poids est stabilisé. Le facteur croissance n’impactera pas la prise alimentaire. Des rats hypertendus âgés de 16 semaines seront utilisés dans le protocole. A ce stade, ces rats seront tous hypertendus au début de l'expérimentation.
Mieux comprendre la physiopathologie de la dénutrition sévère et son dimorphisme sexuel lors d’interventions probiotiques et vaccinales
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Sevrées à 21 jours puis nourries quatre à huit semaines avec un régime carencé en macronutriments et en micronutriments, des souris juvéniles reçoivent ensuite par gavage des probiotiques, une souche vaccinale, puis une souche bactérienne virulente qui provoque une infection intestinale. 1 140 souris vont être utilisées, 480 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 660 dans des procédures d'un niveau sévère, avec six prélèvements sanguins caudaux par animal. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Le porteur écrit pourtant que son modèle "ne présente pas de signe manifeste de souffrance hors un retard de croissance", tout en reconnaissant que la combinaison de la dénutrition et de l'infection peut faire souffrir les souris non vaccinées.
Objectifs
Près d'une personne sur trois dans le monde souffre de malnutrition. L'apparition précoce de la malnutrition a des conséquences désastreuses plus tard dans la vie. Au moment du sevrage, un changement du microbiote intestinal (flore intestinale) se produit et induit une réaction immunitaire qui protège des pathologies futures liées au système immunitaire. La malnutrition entrave ce processus, entraînant une plus grande sensibilité aux maladies non transmissibles, aux infections et une diminution de l'efficacité vaccinale. Développer de manière durable des thérapies nutritionnelles pour contrer la dénutrition est une priorité sanitaire mondiale notamment chez les enfants souffrant de dénutrition sévère aigüe (Severe Acute Malnutrition, SAM). La guérison de la SAM nécessite la prise en compte simultanée des paramètres de croissance, immunitaires et du microbiote intestinal. De par sa complexité, le modèle animal reste incontournable. Récemment, nous avons développé un modèle de SAM chez la souris mâle juvénile qui récapitule fidèlement les principales caractéristiques de la SAM observés chez les enfants. La prépondérance des différences entre les hommes et les femmes dans la malnutrition plaide en faveur de l'inclusion des deux sexes dans la recherche, et lors de la conception de thérapies. Dans notre modèle murin de la SAM, nous avons démontré que le microbiote intestinal et l'immunité intestinale ne sont pas restaurés lors d’une intervention nutritionnelle et ce malgré un retour de croissance. Il faut donc étudier comment restaurer l’ensemble de ces paramètres simultanément. Les probiotiques sont des microorganismes vivants et non pathogènes qui, lorsqu'ils sont administrés en quantités suffisantes, confèrent un bénéfice pour la santé de l'hôte. Certaines souches ont démontré leur capacité à limiter les retards de croissance et les infections intestinales. Dans ce projet nous étudierons donc 1/ le dimorphisme sexuel de la SAM, 2/ l’impact de la SAM sur l’efficacité vaccinale vis-à-vis d’une infection à Salmonella enterica Typhimurium, 3/ la capacité de probiotiques à améliorer la SAM et 4/ la capacité de probiotiques à améliorer l’efficacité vaccinale vis-à-vis d’une infection intestinale.
Bénéfices attendus
Bénéfices à court terme : ce projet permettra l'identification des mécanismes à l'origine des différences entre les mâles et les femelles dans la dénutrition ainsi que la caractérisation de ses effets lors d’interventions vaccinales et probiotiques. Ce projet permettra non seulement de disséquer la pathogénie de la dénutrition mais aussi de fournir les connaissances manquantes pour améliorer les interventions thérapeutiques. Ce projet permettra notamment l’identification de nouvelles thérapies pour restaurer le microbiote intestinal et l'immunité, pour in fine renforcer l’écosystème intestinal général face aux infections et optimiser la formulation des régimes thérapeutiques et des vaccins. Ce projet fera avancer les connaissances dans les domaines de la nutrition, l'immunité, l'infection, la vaccinologie et le microbiote intestinal. Bénéfices à long terme : ce projet fournira des informations importantes pour concevoir des thérapies nutritionnelles adaptées aux garçons et aux filles souffrant de malnutrition. Des stratégies multifactorielles comprenant des probiotiques devraient fournir des approches thérapeutiques durables en favorisant aussi bien la reprise de poids et la croissance, que la maturation du système immunitaire et du microbiote intestinal.
Procédures
Consommation d’un régime alimentaire carencé en macro- et micronutriments durant 4 semaines ou 8 semaines. Prise de poids sur animaux vigiles quotidienne ou hebdomadaire, durée estimée à 2 minutes/souris. Contention des souris associée à l’administration par gavage de probiotiques, de molécules servant à étudier la perméabilité intestinale ou la capacité d’absorption des graisses, d’une solution de glucose (2g/Kg pour suivi glycémique), de souche vaccinale et souche virulente de bactéries causant des infections intestinales sur animaux vigiles : durée estimée à environ 30 secondes/souris (gestes de contention 10 secondes + de gavage 10 secondes). Mise à jeun 4h00 ou sur la nuit : 1 fois durant la procédure. Prélèvements sanguins sous-mandibulaire sur animaux endormis : 1 à 2 fois/souris sous mélange à 4% d'isoflurane et 96% d'oxygène. Prélèvements sanguins caudaux sur animaux vigiles : 6 fois/souris.
Impact sur les animaux
Le but de ce projet est de suivre l’impact d’une alimentation entrainant une dénutrition sévère sur la physiologie, l’immunité et le microbiote intestinal des individus. Grâce à notre expérience dans ce domaine, nous savons aujourd’hui que notre modèle murin de malnutrition ne présente pas de signe manifeste de souffrance hors un retard de croissance chez les mâles juvéniles. Nous nous attendons à ce que les femelles juvéniles soient moins sévèrement impactées du fait de leur capacité à mieux résister à certaines carences en vitamines. Dans ce projet, nous nous intéressons donc à caractériser les différences entre mâles et femelles lors d’une dénutrition apportée par un régime fortement carencé en macro- et micronutriments. Ces différences seront également étudiées lors d’essais vaccinaux réalisés avant l’infection. L’administration du vaccin ne devrait pas induire de souffrance particulière chez les animaux. Par contre la combinaison d’une malnutrition et d’une infection intestinale peut engendrer une souffrance liée à une réponse immunitaire faible chez les groupes d’animaux qui n’auront pas été vaccinés. Afin de renforcer le système immunitaire et contrer les effets de la dénutrition, des probiotiques seront également testés chez les souris dénutries et vaccinées. L’administration des probiotiques ne devraient pas induire de souffrance particulière chez les animaux. Des gavages seront également réalisés sur animaux vigiles. Les gestes de contention (10 secondes), de gavage (10 secondes) génère du stress chez l’animal que nous évaluons à environ 30 secondes/intervention de ce type. En fonction de la procédure cette intervention est occasionnelle, hebdomadaire ou quotidienne. De même, nous allons mettre à jeun les souris 4h00 ou sur la nuit ainsi que réaliser des prélèvements sanguins qui généreront également du stress.
Devenir
De par la nécessité de prélever des organes vitaux pour analyses, tous les animaux seront mis à mort à l’issue des procédures.
Remplacement
De nos jours la complexité de l’écosystème intestinal et notamment l’interaction entre système immunitaire et microbiote intestinal ne peut être reproduite in vitro, les organoïdes ne peuvent pas remplacer l’animal dans ce projet. L’étude de la physiologie, de l’immunité et du microbiote intestinal des individus, implique de facto l’utilisation d’animaux.
Réduction
Grâce à un test effectué au préalable sur 6 souris femelles (3 souris sur régime contrôle (Ctrl) + 3 souris sous régime SAM), nous avons pu réaliser un test statistique basé sur la prise de poids hebdomadaire des souris, et calculer l’effectif nécessaire par expérience pour obtenir une puissance du test 80% minimum, avec un risque de se tromper de 5%. Ceci nous amène à un nombre sujets de 5/groupe pour une puissance du test de 81%. Le projet est organisé de façon à réduire au strict nécessaire le nombre de souris utilisées. En parallèle des souris femelles, nous allons utiliser certaines souris mâles que nous allons décomptés d’une autre DAP et non de cette DAP. Nous allons également étudier certains paramètres avant la mise à mort des souris, qui seront par la suite mises à mort pour l’analyses d’autres paramètres. Nous aurons donc besoin de 5 souris/groupe. Nous réaliserons 3 expériences indépendantes pour chaque lot de souris enrôlé dans chaque procédure. Le nombre de souris utilisé est justifié au sein de chaque procédure expérimentale, soit 1140 souris. Nous aurons également 60 souris mâles qui seront décomptés dans une autre DAP.
Raffinement
Les souris seront hébergées à raison de 5 souris/cage maximum avec la nourriture et l’eau fournies à volonté. Des dômes et du papier seront mis à disposition dans chaque cage pour enrichir le milieu. La température, l’hygrométrie et la photopériode de l’animalerie sont contrôlées et régulées. Nos visites quotidiennes pour la surveillance des souris seront réalisées plutôt en fin de journée afin de respecter le cycle de sommeil de la souris. La souffrance potentielle induite par ce régime et son impact sur l’efficacité vaccinale sera prise en compte dans le respect du bien-être animal, et les souris seront observées quotidiennement ou 2 fois par jour afin de prévenir l’apparition de points limites : prise alimentaire et poids corporel, signes cliniques (fièvre, respiration), comportement, apparence générale (poils et sécrétions). Des mesures adéquates seront prises pour soulager la douleur comme l’administration éventuelle d’un analgésique.
Choix des espèces
Le but de ce projet est de caractériser l'impact d'une dénutrition sévère sur la physiologie, le système immunitaire et le microbiote intestinal afin de proposer un régime thérapeutique durable aux enfants souffrant de SAM. Il est maintenant bien reconnu que le système immunitaire et le microbiote intestinal de la souris sont suffisamment proches de celui de l’Homme pour pouvoir utiliser la souris comme modèle avant qu’une transposition ne soit faite chez l’Homme. De plus, l’épithélium intestinal murin est anatomiquement et physiologiquement proche de celui de l’Homme. Aucun autre organisme modèle de petite taille (danio zébré, drosophile) ne possède une telle structure aussi similaire. Par ailleurs, le modèle murin est celui pour lequel les effets de la dénutrition ont été validés chez les souris mâles. Enfin, le modèle infectieux que nous souhaitons utiliser est très bien décrit et étudié chez la souris. L’ensemble de ces critères fait de la souris l’espèce animale la plus appropriée pour effectuer notre étude. Nous utiliserons des souris mâles et femelles sevrées à 21 jours afin d’être au plus proche des conditions de développement de la SAM observée chez l’Homme entre trois et 24 mois lors du sevrage. En effet, l’épithélium intestinal des rongeurs est immature à la naissance. L’intestin grêle de la souris continue à se développer après la naissance et sa maturation est fortement associée à la période de sevrage. Le sevrage est donc une étape clef dans la structuration de l’épithélium intestinal, le développement immunitaire et la maturation du microbiote intestinal des rongeurs. Par ailleurs notre étude chez les mâles a montré que la dénutrition induite à 21 jours reproduit les principaux critères de dénutrition décrits chez l’Homme. A cet âge la maturité du système immunitaire, la physiologie et la maturation du microbiote intestinal sont en cours de développement chez la souris, tout comme ça l’est chez l’enfant à bas âge.
Rôle des cellules immunitaires et du nerf vague dans un modèle murin de fibrose hépatique
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une section chirurgicale du nerf vague au cou, cinq gavages quotidiens, des injections dans l'abdomen trois fois par semaine et un régime qui attaque les canaux biliaires : 8 832 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La finalité déclarée est de comprendre les liens entre cellules immunitaires, nerf vague et cholangite sclérosante primitive, maladie rare qui touche six à dix personnes sur cent mille en France et pour laquelle aucun médicament n'a fait la preuve de son efficacité. Le porteur prévoit qu'une perte de poids de 20 % conduira à interrompre le régime quelques jours, avant de le reprendre pour atteindre la durée totale prévue. L'effectif est rapporté à un calcul de puissance, sans qu'un seul chiffre soit donné.
Objectifs
La Cholangite Sclérosante Primitive (CSP) est une maladie hépatique chronique, rare (6 à 10/100 000 habitants en France) caractérisée par une inflammation du foie, une prolifération des cholangiocytes et une fibrose péri-portale. Cette recherche vise à fournir des éclairages essentiels permettant une compréhension approfondie des liens entre les cellules immunitaires, l’inflammation, le nerf vague et la pathogenèse de la CSP. A ce jour, aucune approche pharmacologique n’a démontré son efficacité dans le traitement de cette maladie. Les stratégies thérapeutiques actuelles se concentrent sur le ralentissement de la maladie et la prévention des complications qui lui sont associées. Des études suggèrent que certaines cellules immunitaires pourraient induire les lésions hépatobiliaires au cours de la CSP, notamment la fibrose. Toutefois, les mécanismes, notamment ceux à l’origine de la fibrose, demeurent encore mal connus. Afin de mieux appréhender les interactions complexes opérant au cours de la CSP, une perspective globale en examinant le rôle potentiel de diverses populations cellulaires dans la mise en place de la fibrose sera adoptée. D’autre part, le rôle du nerf vague dans la CSP sera étudié. En effet, la modulation de l'activité vagale pourrait influencer la mobilisation des cellules immunitaires, notamment les monocytes, bien que les mécanismes précis de ces interactions restent encore mal compris. Pour mieux appréhender ces interactions complexes, une approche chirurgicale consistant à réaliser une vagotomie cervicale unilatérale chez des souris, qui seront ensuite soumises à un régime pour induire la CSP, sera réalisée. Cette recherche vise à fournir des éclairages essentiels permettant une compréhension approfondie des liens entre l’inflammation, le nerf vague, la pathogenèse de la CSP et sa résolution. En décryptant ces mécanismes, les bénéfices attendus du projet sont d'ouvrir de nouvelles perspectives permettant le développement de nouveaux traitements et ainsi contribuer à une meilleure prise en charge de la CSP. Les informations obtenues grâce à cette recherche pourraient ainsi contribuer à une avancée significative dans la prise en charge de la CSP. La CSP constitue un facteur de risque important pour le développement de cancers des canaux biliaires, du foie et de la vésicule biliaire. Une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à cette maladie pourrait permettre de réduire l'incidence de ces cancers.
Bénéfices attendus
La Cholangite Sclérosante Primitive (CSP) est une maladie rare qui touche entre 6 à 10 personnes pour 100 000 habitants en France. Cette recherche vise à fournir des éclairages essentiels permettant une compréhension approfondie des liens entre les cellules immunitaires, l’inflammation, le nerf vague et la pathogenèse de la CSP. Aucune approche pharmacologique n’a démontré son efficacité dans le traitement de cette maladie. Les stratégies thérapeutiques actuelles se concentrent sur le ralentissement de la progression de la maladie et la prévention des complications. Les informations obtenues grâce à cette recherche pourraient ainsi contribuer à une avancée significative dans la prise en charge de la CSP. La CSP constitue un facteur de risque important dans le développement de cancers des canaux biliaires, du foie et de la vésicule biliaire. Une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à cette maladie pourrait permettre de réduire l'incidence de ces cancers.
Procédures
Les souris seront soumises à : 1.une administration de molécule pour les modèles murins inductibles (via soit 5 gavages quotidiens pendant 5 jours, d'une durée de moins de deux minutes par gavage ; soit nourriture changée une fois par semaine ou eau de boisson changé tous les deux jours ; soit injection intrapéritonéale 3 fois par semaine, d'une durée de moins de deux minutes par injection, tout au long de la mise sous régime) 2.un régime alimentaire spécial (tous les jours pendant 28 jours maximum) 3.des traitements par injection d'anticorps en intrapéritonéale sur animal vigile (une à deux fois par animal, durée de quelques secondes) 4.une intervention chirurgicale sous anesthésie et analgésie (une fois par animal, durée de 10minutes) 5.un prélèvement sanguin sur animal vigile (une fois par animal, durée de quelques secondes) 6.Une euthanasie par une méthode réglementaire (durée de quelques secondes). Tous les prélèvements tissulaires se feront suite à l’euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
Les régimes alimentaires spéciaux pourront entraîner une modification du poids pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. Le régime induisant la Cholangite Sclérosante Primitive (CSP) peut provoquer une perte de poids. Les manipulations des animaux pourront induire un stress de courte durée. Les injections pourront induire une douleur de courte durée aux animaux. Les gavages pourront induire une irritation de l'oesophage. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardiorespiratoire. La procédure chirurgicale pourra induire une douleur en post-opératoire malgré la prise en charge prévue ainsi que des risques d'infections dans de rares cas. Les prélèvements sanguins pourront induire une douleur de courte durée aux animaux ainsi qu’un risque d’hématome ou d’hémorragie.
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et que cela implique donc l'euthanasie de l'ensemble des animaux.
Remplacement
Actuellement, il n’existe pas de substitut non animal capable de reproduire avec précision les mécanismes complexes impliqués dans la genèse de la Cholangite Sclérosante Primitive (CSP) et les réponses immunitaires associées. Parmi les différentes espèces, la souris s’avère être la plus appropriée pour étudier cette pathologie. De plus, l’utilisation de modèles murins est nécessaire pour explorer la pathologie au sein d’un organisme complet, ce qui ne peut être fidèlement reproduit en se basant uniquement sur des cultures de cellules isolées.
Réduction
8832 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Lorsque cela sera possible et afin de limiter le nombre total de souris utilisées, nous essaierons de mettre en commun des souris contrôles pour l’étude de différents modèles murins.
Raffinement
Le bien-être animal sera une priorité constante tout au long de la durée du projet, en minimisant la douleur et le stress. Les animaux seront hébergés en groupe avec des éléments d’enrichissement (lanières de papier kraft et bâton en bois au minimum). Une période d’acclimatation d’une semaine précédera les expérimentations. Une vérification visuelle quotidienne de l’état général des souris sera effectuée en ouvrant chaque cage. L’accès à l’eau et à la nourriture sera mis à disposition ad libitum. Tout signe d’inconfort, de détresse ou de comportement anormal (agressivité subite, inactivité, vocalisation, mutilation, isolement, diminution de l’appétit) ainsi que toute modification physique (pelage ébouriffé, dos courbé, perte excessive de poils) sera étroitement surveillée. Les critères absolus d’inconfort (état de choc, léthargie, inconscience, immobilité, forte hypothermie, difficultés respiratoires), qui ne devraient pas être déclenchés par la procédure utilisée, mèneront à l’euthanasie immédiate de l’animal. Une grille de suivi sera mise en place avec pesée hebdomadaire des animaux. En cas d'observation d'une perte de poids trop rapide (20 pourcents par rapport à l’initiation des régimes), des mesures appropriées seront prises. Plus spécifiquement, le régime sera interrompu pendant quelques jours afin de permettre une récupération, puis le régime induisant la cholangite sclérosante primitive sera repris pour atteindre la durée totale prévue du régime. Cette approche vise à assurer une tolérance optimale du régime, comme démontré dans des études antérieures.
Choix des espèces
Cette recherche vise à fournir des éclairages essentiels permettant une compréhension approfondie des liens entre les cellules immunitaires, l’inflammation, le nerf vague et la pathogenèse de la Cholangite Sclérosante Primitive (CSP). La souris a été sélectionnée comme modèle expérimental en raison de sa capacité à reproduire de manière précise les mécanismes impliqués dans le développement de la CSP. En effet, le modèle murin permet de modéliser et d’intégrer les réponses immunitaires comme observé chez l’Homme. La souris offre l’avantage d’être un modèle bien établi pour l’étude de la CSP et permet également d’utiliser un certain nombre de lignées transgéniques générées au préalable. Les animaux âgés d’au moins 8 semaines seront utilisés pour l'entrée dans la procédure expérimentale afin que les animaux aient un métabolisme, un système immunitaire et vasculaire mature. Les souris pourront entrer en procédure dès leur 8ème semaine d’âge et en ressortiront après 1, 2 ou 4 semaines de régime.