Système gastrointestinal

24 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de tétrachlorure de carbone deux fois par semaine pendant quatre semaines pour induire une fibrose du foie, avec imagerie TEP puis mise à mort pour prélever le foie. Le porteur décrit une fibrose insidieuse et indolore, tout en signalant une possible irritation du péritoine, une fatigue et une perte d'appétit, la mise à mort étant déclenchée à 20 % de perte de poids. Il affirme qu'aucune approche in vitro ne permet d'étudier cette pathologie et qu'une étude chez un organisme vivant est "indispensable".

Objectifs

D’un point de vue scientifique, ce protocole expérimental in vivo est justifié d’une part, par la nécessité d’accroître nos connaissances du point de vue des mécanismes impliqués dans la survenue et l’aggravation de la fibrose. D’autre part, il est nécessaire d’identifier de nouvelles méthodes moins invasives que la biopsie du foie pour évaluer correctement l’organe. Les résultats obtenus devraient permettre une étude translationnelle chez l’homme dans les maladies chroniques du foie qui sont caractérisées par une inflammation et une fibrose.

Bénéfices attendus

D’un point de vue scientifique, ce protocole expérimental in vivo est justifié d’une part, par la nécessité d’accroître nos connaissances du point de vue des mécanismes impliqués dans la survenue et l’aggravation de la fibrose. D’autre part, il est nécessaire d’identifier de nouvelles méthodes moins invasives que la biopsie du foie pour évaluer correctement l’organe. Les résultats obtenus devraient permettre une étude translationnelle chez l’homme dans les maladies chroniques du foie qui sont caractérisées par une inflammation et une fibrose.

Procédures

1/ Dès leur réception, les animaux auront une période d’acclimatation d’une semaine pour s’adapter à leur nouvel environnement. 2/ La fibrose sera induite (procédure 1) par une injection IP de 100ul d’un mélange de CCl4 0,5 µl/g reconstitué dans de l’huile d’olive 2 fois par semaine pendant 4 semaines. 3/ Les stades de la fibrose seront évalués de manière non invasive par tomographie par émission de positon au [68Ga]-FAPI la dernière semaine (procédure 2). En fin de protocole, (i) une injection intrapéritonéale de bromodéoxyuridine (procédure 3, marqueur non toxique pour évaluer la prolifération des cellules hépatiques) sera réalisée 2 à 6 heures avant la mise à mort. (ii) une injection d’une seconde dose d’environ 5 MBq dans un volume maximal de 0,1 à 0,2mL de [68Ga]-FAPI sera réalisée une heure avant la mise à mort des animaux (procédure 4), un morceau du foie sera prélevé et analyse par autohistoradiographie.

Impact sur les animaux

La fibrose hépatique est un processus insidieux et indolore. Les souris recevant une injection intra-péritonéale de CCl4 ne développent pas de complications sévères. Bien qu’une intoxication à ce produit cause une élévation des enzymes hépatiques et de la fibrose après 4 semaines et de l’hypertension portale avec des saignements digestifs après 8 semaines, ces conditions ne sont pas douloureuses chez la souris. Cependant, l’injection IP est susceptible d’irriter le péritoine avec des adhérences et des spasmes temporaires. D’après la littérature (Scholten D et collaborateurs. The carbon tetrachloride model in mice. Lab Anim. 2015), l’application bi-hebdomadaire de CCl4 jusqu’à 4 semaines ne générant pas d’hépatopathie majeure devrait être classée comme « procédure modérée » selon l’article 15 de la directive européenne de 2010/63. Une fatigue et une perte d’appétit étant concevable, le point limite est basé sur l’identification d’une perte de 20% du poids. Des signes de mal-être définis au préalable par notre vétérinaire référent (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, yeux et abdomen creux, perte des réflexes de fuite) conduiront à une prise en charge de type nursing (modification des enrichissements, facilitation d’accès à la nourriture, applications abdominales de Lidocaïne).

Devenir

A l'issue des procédures: (1) injection IP 2fois par semaine de CCL4, (2) examen d'imagerie non invasive de la fibrose hépatique (3) et injection du bromodéoxyuridine (marqueur non toxique pour évaluer la prolifération des cellules hépatiques) , les animaux seront gardés en vie et A la fin de la procédure 4 ( injection du radiotraceur pour analyse autohistoradiographiques) les animaux seront mises à mort

Remplacement

Il n’existe aucune approche in vitro pour étudier l’évolution d’une pathologie inflammatoire multifactorielle évoluant vers la fibrose du foie combinée à un radiotraceur. Une étude chez un organisme vivant est indispensable.

Réduction

L’étude sera menée avec un nombre total de 24 souris jeunes adultes mâles, basé sur le calcul a priori du nombre de souris nécessaires tenant compte de la variabilité interindividuelle, ainsi que de l’effet du genre, sur l’évolution de la pathologie hépatique.

Raffinement

Dès leur réception, les animaux auront une période d’acclimatation d’une semaine pour s’adapter à leur nouvel environnement. Ils seront hébergés dans une animalerie dotée de tous les paramètres nécessaires (température, hygrométrie, filtration de l’air, …) à leur bien-être. La fibrose sera induite par une injection intra-péritonéale de 100ul d’un mélange de CCl4 (0,5 ul/g) reconstitué dans de l’huile d’olive 2 fois par semaine pendant 4 semaines. Les stades de la fibrose seront évalués de manière non invasive par tomographie par émission de positon au [68Ga]-FAPI la dernière semaine.

Choix des espèces

Nous avons une bonne connaissance des modèles murins et de plus, le choix de l’espèce « souris » se justifie par l’existence de modèles transgéniques concernant les implications futurs de ce projet si les résultats escomptés se confirment. Enfin nous possédons une expertise sur l’utilisation du CCl4 chez la souris. Les souris auront au minimum 8 semaines et pèseront au moins 18 à 20g. Un âge et un poids minimum afin de garantir une bonne tolérance de la procédure expérimental chez des souris jeunes adultes mâles.

264 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent la toxine cholérique par gavage une fois par jour pendant quatre jours, avec un double gavage le dernier jour, puis sont mises à mort six heures après pour prélever l'intestin, afin de comparer des substances mucoprotectrices contre la diarrhée. Le porteur indique que la toxine peut provoquer diarrhée, déshydratation, douleur intestinale et perte de poids, effets qu'il décrit comme transitoires et réversibles. Sur le remplacement, il affirme que le modèle animal donne une image intégrée des dommages intestinaux que les approches sans animaux ne reproduiraient pas.

Objectifs

Notre projet a pour but d’évaluer et de comparer les effets de différentes substances mucoprotectrices (polysaccharrides naturels qui adhèrent au mucus) et leurs associations sur la sécrétion d’eau provoquée par la toxine cholérique dans un modèle d’anse intestinale ouverte chez la souris C57Bl6J.

Bénéfices attendus

La gastro-entérite aiguë caractérisée par une diarrhée reste un motif fréquent de consultation en Occident, et demeure une cause de mortalité dans les pays en voie de développement. La réhydratation orale est le traitement de première intention pour la prévenir ou la traiter. Cependant, la thérapie de réhydratation orale ne réduit pas la fréquence des selles et la perte de liquide et ne raccourcit pas la durée de la maladie. Ainsi les professionnels de la santé s'intéressent à la mise au point de nouveaux produits, à visée préventive et curative, efficaces et peu coûteux qui pourraient renforcer l'effet de la thérapie de réhydratation orale.

Procédures

Les animaux sont soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 4 jours (0.15 ml) et, le dernier jour, un deuxième gavage est effectué 20 min après le premier (0.1 + 0.1 ml). Ils sont mis à mort 6 heures après le dernier gavage.

Impact sur les animaux

La toxine cholérique chez la souris induit une hypersécrétion d’eau dans l’intestin 6 heures après son administration par voie orale. Cela peut donc entrainer, une diarrhée, une déshydratation, une douleur intestinale, une diminution d’activité, une perte de poids. Ces effets sont en général transitoires et réversibles sans autre traitement.

Devenir

Les souris seront sacrifiées 6 h après traitement par la toxine cholérique et des analyses post-mortem seront effectuées. D'une part l’intestin sera clampé au niveau du pylore et du caecum, débarrassé du tissu mésentérique et prélevé. La quantité d’eau secrétée dans la lumière intestinale sera évaluée par pesée du segment intestinal clampé plein, moins le poids de celui-ci vidé. L’état de la muqueuse intestinale par établissement de scores histologiques à partir d’un segment intestinal prélevé après la fin de la mesure de la quantité d’eau secrétée.

Remplacement

Le modèle animal mime les principales caractéristiques de la diarrhée induite par des toxines bactériennes incluant la toxine cholérique et donne une image intégrée des dommages intestinaux provoqués. Parmi ces caractéristiques figurent la sécrétion d’eau et les altérations de la muqueuse intestinale associées (altération des villosités, infiltration par des immunocytes augmentation de la perméabilité intestinale par rupture du complexe des protéines de jonctions serrées intercellulaires…) qui sont les résultats des régulations neuro-humorales et de ce fait observable à l’aide du modèle intégré qu'est le modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans chaque groupe expérimental a été optimisé en tenant compte de la variabilité interindividuelle en se basant sur des études utilisant le même modèle. Ces effectifs (n=12) sont suffisants pour atteindre une validité statistique.

Raffinement

Les animaux utilisés seront des animaux sains provenant d’un élevage agréé. Ils seront hébergés dans des conditions normalisées optimales et suivis quotidiennement pour leur apporter tous les soins nécessaires et assurer leur bien-être. Leur milieu sera enrichi en buchettes de peuplier pour satisfaire leur besoin de ronger et un abri en inox leur permettra de s’y loger. Toutes les mesures ont été prises pour réduire l’inconfort (période d’adaptation, habituation) et prévenir toute douleur ou anxiété susceptible d’être subie par les animaux (détection de toute anomalie ou apparition de mal être). Si malgré les mesures prises, une souffrance était constatée la procédure serait arrêtée.

Choix des espèces

Les souris C57Bl6 sont communément utilisées pour mimer des conditions physiopathologiques observées chez l’homme et appréhender les mécanismes d’action impliqués. Elles sont ainsi utilisées pour l’exploration de la physiopathologie digestive. Le modèle de diarrhée induite par la toxine cholérique ainsi que le modèle de anses ouvertes chez la souris C57Bl6 est décrit et validé par la communauté scientifique (Finkelstein, R 1976, Stephen H. et al. 1983, R.A.Fenton 2019). Les animaux seront des souris C57Bl6J adultes de 5 à 6 semaines (environ 20 à 25g). L’utilisation d’animaux adultes est nécessaire pour évaluer différentes substances mucoprotectrices sur une barrière intestinale parfaitement mature, sachant qu’en condition périnatale la barrière intestinale présente des caractéristiques biologiques complètement différentes de celles observés chez l’animal adulte

204 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumises à un régime gras puis gavées neuf fois d'un mélange de six perturbateurs endocriniens, une dioxine, deux plastifiants, deux pesticides et un isolant électrique, elles doivent confirmer chez la souris des effets d'abord observés sur des larves de poisson-zèbre. Le porteur qualifie la maladie du foie gras d'indolore et ne décrit comme atteinte que l'inconfort du gavage. Il présente ce travail comme une étape vers le remplacement de la souris par la larve de poisson, tout en jugeant "indispensable" le recours aux souris pour valider ce modèle, et les met toutes à mort pour prélever leurs organes.

Objectifs

La maladie du foie gras (i.e. NAFLD: non-alcoholic fatty liver disease) est devenue une priorité de santé publique à cause de sa prévalence grandissante (20% de la population générale et plus 70% des personnes obèses). Elle débutent avec la stéatose hépatique (foie gras), stade bénin, qui peut progresser vers la stéatohépatite, propice au développement des cirrhoses et cancers du foie. Bien que les causes/mécanismes de cette progression pathologique restent à clarifier, l’exposition aux perturbateurs endocriniens seuls ou mélange, est suspectée. Il apparait donc urgent de développer de nouveaux modèles permettant de mieux évaluer l’impact des perturbateurs endocriniens sur la santé, en particulier sur la maladie du foie gras. Etant donné la nature complexe de cette maladie qui dépend des interactions étroites entre différents organes et types cellulaires, il est indispensable d’avoir une approche intégrative uniquement retrouvée dans les modèles in vivo. Ainsi, nous avons mis en place une stratégie en deux temps : d’abord un criblage de l’impact sur le foie de l’exposition chronique à des mélanges de perturbateurs endocriniens dans notre modèle de larve de poisson-zèbre obèse suivi de la confirmation de ces effets dans un modèle murin pertinent. L’objectif de ce projet est donc la réalisation de la 2éme phase de confirmation des effets observés chez la larve de poisson zèbre de mélanges de perturbateurs endocriniens sur le developpement de la la maladie du foie gras chez la souris.

Bénéfices attendus

Le caractère novateur de ce projet repose sur le choix du modèle pour répondre aux enjeux de la recherche sur les perturbateurs endocriniens, notamment dans des populations dites à risque. En effet, ce modèle, qui possède de nombreux atouts, est relativement proche de l’humain, notamment en ce qui concerne le développement de la maladie du foie gras. En outre, l’emploi de ce modèle, en accord avec la règle des 3R, peut être une alternative ou un prérequis à l’emploi des modèles in vivo de mammifères classiquement utilisés. Ainsi, cette étude de faisabilité a pour but de proposer un nouveau modèle in vivo visant à mieux caractériser les effets des perturbateurs endocriniens en mélange sur la maladie du foie gras et ainsi de répondre aux préoccupations concernant leurs potentiels effets cocktails. Pour cela, 6 perturbateurs endocriniens ont été choisis car la population y est couramment exposée et pour garantir les chances de démontrer un effet cocktail (une dioxine issue de rejets d’industrie ou d’incinération, deux plastifiants, deux pesticides, un isolant électrique). En effet, ces molécules sont reconnues pour leurs implications dans la maladie du foie gras et ont des modes d’actions variés, ce qui pourrait ainsi potentialiser leurs effets lors de mélange. Enfin, le choix du modèle s’est porté sur la larve de poisson-zèbre, dont la sensibilité aux perturbateurs endocriniens a été démontrée et pour lequel nous avons déjà mis en place un modèle développant une stéatose rapidement, et qui nous a permis de mettre en évidence qu’un mélange à faible dose de molécules toxiques pour le foie aggrave la maladie du foie gras. Le premier volet de ce projet sur le modèle de larve de poisson-zèbre a été en partie réalisé et a fait l’objet de saisines spécifiques. Les résultats ont permis de déterminer la composition de de différents mélanges pour lesquels on a observé une aggravation de la maladie du foie gras pour des concentrations où chaque molécule en exposition unique n’avait que peu ou pas d’effet, ce qui indique un effet cocktail de ces molécules.

Procédures

Les animaux seront soumis à un gavage pour maitriser l'exposition aux perturbateurs endocrniens à rasion d'un traitement par semaine 9 fois (entre la 3eme semaine de régime riche en graisse et la 12eme semaine).

Impact sur les animaux

Le gavage induit un inconfort des animaux, reste que la NAFLD est une pathologie indolore.

Devenir

tous les animaux sont mis à mort afin de recolter les organes pour permettre l'etude scientifique.

Remplacement

Le développement des pathologies du foie comme la stéatose et la stéatohépatite dépendent étroitement de la communication entre les organes (foie, tissu adipeux et pancréas notamment) mais aussi de la communication entre les différents types cellulaires qui constitue le foie. De plus, l’altération des systèmes de communications hormonaux est le mécanisme d’action définissant l’action des perturbateurs endocriniens. Seuls les modèles in vivo présentent toutes ces interactions. Le développement d’un nouveau modèle animal pour étudier la stéatohépatite qui peut être mis en œuvre sur des temps plus court et plus éthique a été proposé par l’équipe. Il utilise les larves de poisson zèbre et a montré des premiers résultats très encourageants qui doivent être confirmés sur le modèle murin de référence pour les études de toxicologie pour valider la pertinence de ce modèle de poisson zèbre et permettre la substitution de l’utilisation des souris par ces larves de poissons.

Réduction

Les plans d’expérimentations ont été réalisés de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en vue de l’obtention de résultats statistiquement significatifs et d’éviter les réplicats inutiles. Enfin le projet vise à confirmer chez la souris la validite de résultats obtenus dans un autre modele

Raffinement

les études seront conduites dans des installations modernes et agréées pour assurer un confort maximal aux animaux, une attention journalière à l’état des animaux sera mise en œuvre, et un grand nombre de mesures sur les échantillons prélevés sont envisagées pour récolter un maximum d’informations. Les souris seront traitées dans une pièce isolée de leurs congénères sur un temps court ne permettant pas le développement de douleur.

Choix des espèces

Ce projet vise à évaluer l’utilisation du modèle de poisson-zèbre pour étudier l’impact de cocktail de perturbateurs endocriniens sur la transition de la stéatose en un état pathologique, la stéatohépatite et à valider le caractère prédictif du modèle de poisson-zèbre en le comparant à un modèle murin classiquement utilisé pour l’étude des NAFLD. Il est donc indispensable d’utiliser des souris pour remplir les objectifs du projet. Adulte, pour étudier une pathologie qui affecte surtout des adultes. Animaux âgées de 8 à 12 semaines, d’environ 20g

30 porcelets mini-porcs Yucatan vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Séparés de leur mère à deux jours puis isolés en cage individuelle pendant dix-neuf jours, ils reçoivent par un distributeur automatique un lait infantile enrichi ou non en métabolites du lait maternel, pour améliorer les préparations pour nourrissons. Le porteur reconnaît que la séparation maternelle et l'isolement peuvent être une source de stress, tout en affirmant que les porcelets ne montrent aucun stress au-delà des douze premières heures. Il justifie le recours au porcelet par sa proximité physiologique avec le nouveau-né humain, et prévoit la mise à mort de tous les animaux pour prélever tissus digestifs et cérébraux.

Objectifs

Ce projet a pour enjeu l’amélioration des propriétés fonctionnelles des préparations pour nourrissons (PPN) afin de mimer les effets bénéfiques du lait maternel (LM) et de garantir un développement adéquat du nouveau-né. En effet, il reste à ce jour des différences entre le LM et les PPN, notamment concernant les composés bioactifs retrouvés dans le LM peu ou pas présents dans les PPN. Ainsi, ce projet s’intéresse aux métabolites du LM, afin d'évaluer leurs effets sur le développement du nourrisson, particulièrement au niveau des régions digestives et cérébrales. Plus spécifiquement, nous nous intéressons à des métabolites capables d’être produits par des bactéries et dont l’origine au sein du LM peut être bactérienne, issus de la circulation plasmatique maternelle ou produits in situ au sein du LM par la flore résidente. En effet, l’un des objectifs de ce projet est de pouvoir incorporer ces métabolites dans les PPN par procédés fermentaires. Ainsi, 4 groupes de métabolites ont été sélectionnés : acides gras à chaîne courte, polyamines, dérivés du tryptophane et acides organiques. Ces métabolites ont été préalablement testés in vitro sur des modèles cellulaires d'épithélium intestinal et cérébral afin de sélectionner ceux présentant des intérêts fonctionnels et développementaux. Les métabolites sélectionnés seront ainsi étudiés in vivo dans le modèle mini-porcs Yucatan en les incorporant dans des PPN fournies de façon continue des 2 aux 21 jours des porcelets. Nous disposerons de trois groupes de porcelets, un groupe témoin qui recevra une PPN sans métabolites et deux groupes expérimentaux qui recevront des PPN supplémentées en métabolites, à des concentrations proches du LM, par deux procédés distincts ; une supplémentation par des métabolites achetés dans le commerce et une supplémentation en métabolites apportés par fermentation d'une matrice laitière via des souches de bactéries lactiques et propioniques. Ainsi, nous pourrons évaluer l'impact des métabolites sur le développement physiologique intestinal et cérébral du mini-porc et valider que la fermentation d'une fraction laitière est un procédé fiable pour les apporter.

Bénéfices attendus

L’enjeu de ce projet est d’améliorer la fonctionnalité des PPN en s’intéressant aux métabolites du LM pour mimer au mieux les effets bénéfiques de ce dernier sur la santé et le développement du nourrisson. La sélection des métabolites présentant des intérêts fonctionnels et développementaux est en cours de finalisation et se basera sur les résultats obtenus à partir de modèles in vitro d'épithélium intestinal et de neurones cérébraux. Les métabolites d'intérêts appartiennent aux 4 groupes suivant : acides gras à chaîne courte, polyamines, dérivés du tryptophane et acides organiques. Les métabolites sélectionnés seront incorporés aux PPN à des concentrations proches de celles du LM. L’expérimentation sur porcelet, présentant des caractéristiques physiologiques proches du nouveau-né humain, permettra d’évaluer l'impact de l'apport de ces métabolites par voie orale au cours de la période post-natale précoce au sein d'un système plus complexe et intégré que les modèles cellulaires in vitro et permettant également de prendre en compte la présence du microbiote intestinal et les effets que les métabolites peuvent avoir sur ce dernier. Ce projet contribuera à enrichir les connaissances concernant les métabolites retrouvés au sein du LM en vue d’améliorer la composition des PPN et de se rapprocher des propriétés fonctionnelles du LM. Il permettra également de valider que l'incorporation des métabolites par fermentation bactérienne d’une matrice laitière est un procédé pertinent.

Procédures

Les porcelets seront isolés en cage individuelle durant toute la durée du protocole expérimental, de l'âge de 2 jours à l'âge de 21 jours. Chaque cage individuelle est équipée d'un distributeur automatique de lait par lequel chaque porcelet recevra l'un des trois traitements alimentaires du projet de façon contrôlée et adaptée. Les traitements alimentaires fournis sont les suivant : une PPN témoin sans métabolites et deux PPN enrichies en métabolites, l'une par ajout d'une fraction fermentée de matrice laitière et l'autre par ajout direct des métabolites via des produits achetés dans le commerce. Aucun prélèvement biologique, ni intervention chirugicale ne sera réalisé sur les animaux vivants durant la période d’expérimentation. Les paramètres mesurés concerneront la consommation alimentaire et la croissance des porcelets. Tous les animaux concernés par la procédure (n = 30) seront euthanasiés à la fin de l’expérience pour réaliser des prélèvements post-mortem de tissus et contenus digestifs et de zones cérébrales.

Impact sur les animaux

Les métabolites testés sont naturellement présents dans le LM, les concentrations testées sont proches des concentrations retrouvées dans celui-ci et ne présentent pas de danger pour les porcelets. De plus, ces métabolites ont été testés in vitro à différentes concentrations pour identifier leurs propriétés bénéfiques sur l'épithélium intestinal et le système nerveux central. Enfin, la plupart de ces métabolites ont été étudiés sur différents modèles cellulaires et animaux sans effets toxiques notables dans le cadre de problématiques de recherches différentes. Cependant, l'utilisation de PPN "porcinisées" peut entrainer un effet indésirable sur l’appétit des animaux et possiblement provoquer une perte de poids. Néanmoins, la PPN qui sera distribuée aux animaux dans ce projet est identique à la PPN porcinisée utilisée dans un précédent projet qui s'est déroulé de septembre à novembre 2022 et qui n’a engendré aucun problème d’alimentation, ni de trouble digestif chez les porcelets. La séparation brutale de la mère et l’isolement relatif en cage individuelle pendant une période de 19 jours pourraient constituer une source de stress pour les porcelets. Cependant, les porcelets ne subissent pas de stress répétés (une séparation unique et définitive de la mère), ils seront hébergés dans une salle contenant 5 cages permettant des contacts olfactifs et sonores avec leurs congénères et leur environnement sera enrichi avec des jouets, sources d’interaction avec le milieu environnant.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par la procédure décrite (n = 30) et ils seront tous euthanasiés à la fin de l’expérience. L'euthanasie des animaux est nécessaire pour récupérer les tissus et contenus intestinaux ainsi que les tissus cérébraux qui seront analysés par des approches de biologie moléculaire, d'histologie et ex vivo, afin de répondre à notre question scientifique.

Remplacement

Le projet s’intéressant à l’impact de l’alimentation sur les fonctions physiologiques et développementales du nourrisson, l’utilisation d’un modèle animal vivant reste indispensable pour une évaluation globale et intégrée de l’effet des métabolites étudiés et de prendre en compte le rôle du microbiote intestinal, qui sont impossible à reproduire dans leurs complexité dans des modèles in vitro. Le porcelet a été choisi pour sa proximité physiologique avec le nourrisson.

Réduction

L’étape in vitro permet de réduire le nombre de métabolites d’intérêt à fournir aux porcelets, métabolites retrouvés au sein du LM et ne présentant pas d’effets négatifs dans les tests effectués (pas de cytotoxicité, pas de perte d’intégrité de l’épithélium, pas d’activité pro-inflammatoire aigüe). Ils seront additionnés à une PPN reconstituée et distribuée sous forme d’alimentation liquide aux porcelets. L’impact des PPN enrichies en métabolites par apport direct ou par fermentation d'une fraction de PPN ou d'une autre matrice laitière à des concentrations proches de celles du LM sera ainsi étudié. Une PPN ne contenant pas de métabolites sera considérée comme la PPN de référence. Un effectif de 10 porcelets par types de PPN soit 30 porcelets au total a été calculé par un test de puissance sur des paramètres étudiés dans d'autres contextes sur ce même modèle, en lien avec des réponses physiologiques. Les données seront analysées statistiquement par des tests ad hoc (analyse de variance multifactorielle) prenant en compte les facteurs traitement alimentaire, sexe, portée et répétition.

Raffinement

Les métabolites testés sont naturellement présents dans le LM, les concentrations testées sont proches des concentrations retrouvées dans celui-ci et ne présentent pas de danger pour les porcelets. Cependant, l'utilisation de PPN "porcinisée" peut entrainer un effet indésirable sur l’appétit des animaux et possiblement provoquer une perte de poids. Néanmoins, la PPN qui sera distribuée aux animaux dans ce projet est identique à la PPN porcinisée utilisée dans un précédent projet qui s'est déroulé de septembre à novembre 2022 et qui n’a engendré aucun problème d’alimentation, ni de trouble digestif chez le porcelet Yucatan. Néanmoins, le poids des animaux sera surveillé pour s'assurer qu'ils n'accusent aucune perte de poids. Les porcelets seront inclus dans le protocole à 2 jours d’âge. La séparation brutale de la mère et l’isolement relatif en cage individuelle pendant une période de 19 jours pourraient constituer une source de stress pour les porcelets. Cependant, les porcelets ne subissent pas de stress répétés (une séparation unique et définitive de la mère), ils seront hébergés dans une salle contenant 5 cages permettant des contacts olfactifs et sonores avec leurs congénères, leur environnement sera enrichi avec des jouets, sources d’interaction avec le milieu environnant, et leur alimentation répond à leurs besoins nutritionnels. L’ensemble de ces éléments, associé à des interactions régulières avec les animaliers, induit un comportement des porcelets qui ne traduit aucun état de stress au-delà des 12 premières heures post-séparation maternelle. De plus, au cours des 12 premières heures qui suivent leur séparation de la mère, les animaliers sont en permanence présents dans les salles.

Choix des espèces

Le mini-porc Yucatan est un modèle animal proche de l’Homme, plus que ne peuvent l'être les rongeurs sur de nombreux aspects tels que la taille, l'anatomie du cerveau avec la présence de circonvolutions cérébrales notamment, l’anatomie de tube digestif, la physiologie digestive, le système immunitaire et le microbiote. S’intéressant à l’alimentation infantile, il est à noter que la dynamique de croissance et de développement des organes digestifs et du cerveau chez le porc nouveau-né est très proche de celle décrite chez le nouveau-né humain. De plus, il s’agit d’un animal omnivore monogastrique, ce qui en fait un modèle très utilisé pour les recherches en nutrition humaine. Enfin, sa taille et sa maturité à la naissance sont compatibles avec un allaitement avec des PPN dès les premiers jours de vie. S’intéressant à l’alimentation infantile, les porcelets inclus dans le protocole seront des nouveau-nés de 2 jours d’âge. Ils seront suivis pendant les trois premières semaines de vie avec une alimentation lactée.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intradermiques et intraveineuses sous anesthésie, des sensibilisations à la gliadine, puis un test d'anaphylaxie passive consistant à injecter de l'histamine dans l'oreille pour en mesurer le gonflement, avant une mise à mort par ponction cardiaque au trente-cinquième jour. L'objectif est de préciser le rôle de la protéine PCSK9 dans l'allergie et d'élargir une piste thérapeutique, retombée que le porteur situe au conditionnel. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne permet d'évaluer ce traitement et que seul un modèle murin allergique le permet.

Objectifs

PCSK9 (Pro Protein Convertase Subtilisine/Kexine de type 9) appartient à la famille des proprotéines convertases et est sécrétée par les hépatocytes dans le sang. Elle est un régulateur naturel du récepteur au LDL en l’envoyant à la dégradation lysosomale. Depuis une dizaine d’années, différentes études se sont intéressées au rôle inflammatoire de cette protéine. L’allergie étant une maladie inflammatoire chronique, nous souhaitons étudier le rôle de PCSK9 dans le cadre de l’allergie. Par une précédente étude, nous sommes en train de caractériser l’effet de PCSK9 dans l’allergie alimentaire. Ayant pu déterminer son rôle sur certaines cellules immunitaires liées à cette pathologie, notamment les mastocytes, nous souhaitons poursuivre cette approche par une expérimentation qui ne peut s’effectuer que chez la souris : le test d’anaphylaxie passive. Ce test consiste en l’injection auriculaire d’un médiateur inflammatoire (l’histamine) et d’en mesurer les conséquences chez la souris par la mesure d’un changement anatomique de l’oreille (gonflement et hypervascularisation).

Bénéfices attendus

Actuellement, aucun traitement ne permet soigner la cause de l’allergie, de plus, les effets secondaires liés aux corticoïdes sont notables et la désensibilisation n’est pas efficace chez tous les patients. PCSK9 devient une cible de plus en plus privilégiée dans le cadre de maladies inflammatoires, de plus, notre première étude sur le traitement anti-PCSK9 soigne les symptômes de l’allergie alimentaire chez la souris. Cette étude permettrait de comprendre le mécanisme par lequel PCSK9 agit sur le mastocyte et ainsi, élargir la thérapeutique de l’anti-PCSK9.

Procédures

Les animaux seront soumis des injections intradermiques et intraveineuses sous anesthésie à l’isoflurane et à des sensibilisations à la gliadine par voie intrapéritonéale. Pour finir, un prélèvement du sang terminal sera effectué par ponction intracardiaque après anesthésie sous isoflurane.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont une perte de poids. Une observation régulière des souris sera effectuée, les souris serons également pesées 3 fois par semaine.

Devenir

A la fin du protocole d'allergie au jour 35 post sensibilisation, toutes le souris seront mises à mort pour analyses.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle cellulaire permettant d’évaluer le bénéfice du traitement anti-PCSK9 dans le cadre de l’allergie. Seul un modèle murin allergique nous permettra de mesurer l’amélioration des symptômes via ce traitement et comprendre les effets de PCSK9 dans la physiopathologie de l’allergie. Les principes de raffinement et de remplacement contribuent à réduire le nombre d’animaux utilisés tout au long du protocole. Le projet étudiera l’allergie respiratoire dans des modèles déjà établis dans le laboratoire.

Réduction

Le modèle animal utilise a été soigneusement conçu et évalué pour permettre de réduire au maximum le nombre d’animaux du fait de la connaissance et la précision des paramètres observés selon la règle des 3R. Le projet étudiera l'allergie dans des modèles déjà établis dans le laboratoire. Un test non paramétrique et non apparié de type Student test, Mann-Whitney ou une analyse de la variance par un test de Bonferroni sera realisé. Une p-value inferieur a 0.05 sera considérée comme significative.

Raffinement

Le projet étudiera l’allergie dans des modèles déjà établis dans le laboratoire. Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Une observation journalière des souris sera effectuée, les souris serons également pesées 3 fois par semaine. Ainsi, les souris seront hébergées 5 par cage ventilée maximum. Elles auront accès à l’eau et à la nourriture de manière illimitée et suivront un cycle de lumière et d’obscurité de 12h. Des frisottis seront placées dans les cages. Les souris seront anesthésiées à l’isoflurane au moment de l’anaphylaxie passive.

Choix des espèces

Au cours de cette étude seront utilisées des souris de souche C57/Bl6 et Balb/c. Ces souris constituent un modèle de choix, reconnu, dans le cadre d’étude du système immunitaire et du métabolisme lipidique du fait de la caractérisation approfondie de ces souches. Des analyses métaboliques seront réalisées. L’utilisation de souris nous donne accès à de nombreux outils immunologiques, notamment les anticorps nécessaires aux marquages ainsi qu'à de nombreux outils de biochimie (ELISA, dosage colorimétrique...). Souris C57/B6 et Balb/c femelles âgées de 5 semaines au début du protocole ce qui correspond à des souris sevrées donc adultes ayant un système immunitaire mature ou quasi-mature.