Système gastrointestinal

56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles subissent un stress chronique de sept semaines, des prises de sang à la queue et une série de tests comportementaux dont la suspension par la queue et l'isolement en cage individuelle, pour évaluer si un aliment enrichi en fibres atténue les effets du stress. Le porteur attend des symptômes comme une toilette négligée et une perte de poids, les souris étant tuées pour analyser cerveau et tube digestif. Il présente l'axe microbiote-intestin-cerveau et affirme qu'aucune alternative non animale n'est assez sophistiquée pour cette étude, un bénéfice pour les troubles psychiatriques humains restant annoncé.

Objectifs

Le stress chronique a des effets délétères bien établis sur le cerveau et le comportement ; il favorise notamment l’émergence de symptômes d’anxiété et de dépression. Parallèlement, des études menées ces dernières années par divers groupes montrent que le stress chronique provoque un déséquilibre du microbiote intestinal. L’existence de l’axe microbiote-intestin-cerveau conduit à l’hypothèse qu’une partie au moins des symptômes neuro-comportementaux liés au stress chronique, tels que l’anxiété, la résignation ou l’incapacité à ressentir du plaisir, pourrait résulter du déséquilibre du microbiote intestinal. L’objectif du projet est de tester si une formulation alimentaire enrichie en fibres, connue pour favoriser le maintien de l’équilibre du microbiote intestinal, peut atténuer les conséquences néfastes du stress chronique sur le cerveau et le comportement.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra de contribuer à documenter (i) le rôle et les mécanismes d’action du microbiote intestinal dans les perturbations cérébrales et comportementales induites par l’exposition à un stress chronique, (ii) la possibilité d’intervenir à l’échelle du régime alimentaire pour atténuer ces perturbations en préservant l’équilibre du microbiote. La progression des connaissances dans ce domaine peut avoir des bénéfices chez les êtres humains en améliorant la prise en charge des troubles psychologiques / psychiatriques liés au stress chronique. Ces bénéfices ont donc un intérêt dans le domaine de la santé humaine, mais aussi dans le domaine de l’économie de la santé, dans la mesure où des interventions nutritionnelles visant à préserver ou restaurer l’équilibre du microbiote intestinal sont moins coûteuses que le développement de médicaments.

Procédures

- 1 implantation sous-cutanée de transpondeur destinée à identifier les souris de manière unique et pérenne (souris vigiles, toutes les souris) - 2 prises de sang à la veine de la queue à 2 semaines d’intervalle (souris vigiles, toutes les souris) : 2 min maximum ; application préalable d’une crème anesthésique locale - 4 tests comportementaux impliquant une contrainte environnementale de quelques minutes (souris vigiles, toutes les souris, une fois par souris) : test de l’openfield pendant 6 min ; test du nouvel objet pendant 10 min maximum ; test du labyrinthe en croix surélevé pendant 5 min ; test de suspension par la queue pendant 6 min - 2 tests comportementaux impliquant un hébergement en cages individuelles de 6 jours (souris vigiles, toutes les souris, une fois par souris) : test de nidification consistant à fournir à chaque souris un carré de coton le soir et à évaluer le lendemain matin la qualité du nid construit ; test de préférence au sucre consistant à présenter aux souris pendant quelques jours consécutifs un biberon d’eau et un biberon d’eau sucrée ; la consommation des boissons est mesurée chaque jour. Les cages individuelles sont les unes à côté des autres de telle sorte que les souris peuvent se voir et communiquer par vocalisations ; leur environnement est enrichi (buchettes de bois à ronger, tunnels où se cacher, papier à déchiqueter).

Impact sur les animaux

Le projet porte sur le stress chronique. Il est donc attendu que les souris présentent, au fur et à mesure de la durée du stress, des symptômes tels que toilette négligée et perte de poids. Toutefois, il s’agit d’une procédure de stress chronique modéré, dont l’utilisation par de nombreux groupes montre qu’elle conduit à des symptômes modérés. Le test de suspension par la queue constituera un stress de quelques minutes ; les tests destinés à évaluer le comportement de type anxieux, qui durent au plus 10 min, provoqueront une anxiété transitoire légère ; les tests de nidification (une nuit) et de préférence pour le sucre (3 jours) nécessiteront d’héberger les souris en cages individuelles pendant 6 jours. Les prélèvements fécaux n’occasionneront aucune nuisance ou douleur aux animaux puisqu’il s’agit de selles spontanément émises. La prise de sang à la veine de la queue avant et après le test de suspension par la queue occasionnera une douleur transitoire légère.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées à la fin de la procédure pour étudier différents paramètres biologiques dans les organes cibles de la procédure, à savoir le cerveau et le tube digestif.

Remplacement

A l’heure actuelle, étudier l’effet du stress chronique et d’une intervention nutritionnelle sur le cerveau et le comportement nécessite de recourir à l’animal car il n’existe pas d’alternative technique non animale suffisamment sophistiquée pour le remplacer.

Réduction

Nous utiliserons 14 souris par groupe. L’expérience de différents groupes de recherche dans l’étude du comportement lors d’une procédure de stress chronique modéré imprévisible indique qu’un effectif de 12-15 souris par groupe est nécessaire pour mettre en évidence des effets statistiquement significatifs. En effet il arrive que certaines souris n’effectuent pas les tests comportementaux correctement ; leurs données doivent alors être éliminées, ce qui réduit artificiellement la taille du groupe et peut conduire à un effectif insuffisant pour espérer mettre en évidence un effet statistiquement significatif. Dans ce projet, les données issues des tests comportementaux seront analysées en deux étapes. Dans une première étape, nous comparerons les 3 groupes traités (stress chronique, stress chronique avec aliment enrichi en fibres à deux doses différentes) et le groupe témoin (pas de stress chronique ni d’intervention nutritionnelle) à l’aide à l’aide outils statistiques adaptés et validés pour ce type d’étude. Dans une seconde étape, nous analyserons mathématiquement l’effet dose de l’intervention nutritionnelle à l’aide des 3 groupes soumis au stress chronique : aliment témoin sans fibres (dose 0), aliment témoin avec fibres à la dose 1, aliment témoin avec fibres à la dose 2.

Raffinement

Le projet porte sur le stress chronique. Il est donc attendu que les souris présentent, au fur et à mesure de la durée du stress, des symptômes tels que toilette négligée et perte de poids. Afin de suivre l’intensité de ces symptômes, nous mesurerons le poids corporel et évaluerons l’état du pelage selon une grille de notation pré-établie, une fois par semaine pendant les 7 semaines de stress chronique. La grille de notation de l’état du pelage consiste à examiner 10 endroits du corps et à les noter 0 (pelage bien entretenu) ou 1 (pelage négligé) : les 10 notes sont additionnées pour aboutir à un score global pouvant aller de 0 à 10. Ces mesures permettront de vérifier que la procédure de stress chronique a les effets attendus et d’en ajuster les paramètres de façon à ce que ces effets restent modérés (perte de poids ne dépassant pas 15 %, score d’état du pelage ne dépassant pas 8). En effet, si la perte de poids excède 15 % du poids initial ou si le score d’état du pelage dépasse 8, la procédure de stress chronique sera immédiatement ajustée afin de diminuer ses effets. L’ajustement consistera à interrompre la procédure pendant 2 jours puis à la reprendre en atténuant son intensité. Afin de minimiser le stress subi lors des 2 prises de sang à la veine de la queue, les souris seront entraînées aux manipulations destinées à effectuer ces prises de sang. Toutes les souris disposeront d’un environnement enrichi grâce à des buchettes de bois à ronger, du papier à déchiqueter, des cylindres en plastique où se cacher et sur lesquels grimper.

Choix des espèces

La majorité des études précliniques publiées sur les effets du microbiote sur le cerveau et le comportement, en particulier celles étudiant l’influence de modifications alimentaires, font appel à des rongeurs, dont la souris. Nous pourrons donc comparer aisément nos résultats à ceux publiés dans la littérature sur ce sujet. Par ailleurs, la souris est un modèle très utilisé en neurosciences, pour lequel nous disposons de procédures de stress chronique et de tests comportementaux bien établies et utilisées par la communauté scientifique internationale de manière consensuelle. En particulier, la souris réagit au stress chronique par des comportements tels que l’anxiété, la résignation et l’incapacité à ressentir du plaisir. Elle est donc un bon modèle pour étudier le rôle du microbiote dans ce type de comportement. Nous utiliserons des animaux adultes (≥ 8 semaines), l’objectif étant d’étudier les effets d’une intervention nutritionnelle sur les effets néfastes d’un stress chronique chez des animaux dont le cerveau est complètement développé (donc après l’adolescence) et le microbiote stable (stade de vie adulte).

170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers pour 100 d'entre elles et modérés pour 70. Elles sont soumises pendant deux à trois mois à un régime gras et sucré pour induire l'obésité, puis à des croquettes contenant une substance opioïde destinée à provoquer un comportement addictif, avant des tests de comportement motivationnel. Le porteur reconnaît que ces croquettes peuvent générer un état de stress ou de manque et revendique un "besoin de stratégies innovantes" contre les troubles métaboliques. Il conclut au recours aux souris car les invertébrés n'ont pas les structures cérébrales équivalentes aux mammifères, et toutes les souris sont tuées pour prélever des tissus.

Objectifs

Ce projet fait partie d’un groupe de projets qui visent à identifier, si et comment certains composés alimentaires agissent directement ou indirectement sur le système de récompense pour modifier le plaisir associé à l’alimentation mais aussi les troubles compulsifs et addictifs qui leur sont associés.

Bénéfices attendus

Les dernières estimations de l'Organisation mondiale de la santé (OMS) révèlent qu'en Europe, plus de la moitié des hommes et des femmes sont en surpoids, et environ un tiers sont obèses. Cela représente également un fardeau social, économique et sanitaire. Bien que certains traits génétiques (causes monogéniques) aient été identifiés et largement étudiés, il est largement reconnu que le syndrome métabolique est par essence un trouble multifactoriel et multidimensionnel qui englobe des réseaux complexes des maladaptations physiopathologiques. Malgré les progrès et les efforts, nous sommes toujours confrontés à un besoin de stratégies innovantes et plus efficaces contre les troubles métaboliques. Des recherches approfondies sur l'obésité et la prise excessive de certains aliments, décrivent l’existence, dans un nombre important des cas, d’un composant de type addictif qui pourrait partager des mécanismes neurobiologiques communs. Ce travail permettra d’identifier formellement si une ou plusieurs composés alimentaires sont responsable de la mise en place de consommation compulsive.

Procédures

Les animaux ne subiront aucune procédure invasive, ils seront soumis à un régime riche en gras et sucre (2-3 mois) pour induire l’obésité et des régimes spécifiques (1-2 semaines) pour induire un comportement addictif. Ils seront aussi soumis à des tests de comportement motivationnel (1-2 semaines).

Impact sur les animaux

L’exposition à des croquettes contenant une drogue pour induire le comportement addictif peut générer des situations de stress chez les rongeurs ou une situation de manque. Nous surveillerons de près tous les jours le comportement de chaque souris pour détecter des signes de détresse ou une perte de poids importante( >15% du poids d'une souris contrôle). Le cas échéant, nous arrêterons le traitement et nous écarterons la souris qui montre un état de santé dégradé, pour qu’elle récupère. Basée sur notre expertise et sur la littérature nous prédisons que l’exposition relativement courte aux substances opioïdes devrait augmenter l’appétence pour la nourriture mais ne devrait pas créer de situation de manque trop rapide ni trop aigue.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements de tissus.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet nous devons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée. De plus, les invertébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et du comportement.

Réduction

Les groupes expérimentaux et le nombre d'animaux ont été déterminés par une approche statistique en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus. Selon les dessins expérimentaux et les nombres de variables (groupes; temps; régimes; comportements) nous utiliserons des tests paramétriques et si nécessaire des tests non paramétriques.

Raffinement

Les soins apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs ont pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement et du régime alimentaire. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton, bâtons de bois ou tunnels en carton. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé : notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.

Choix des espèces

Notre étude repose entièrement sur la physiopathologie intégrée et nécessite du modèle rongeur, notamment la souris. Toutes les souris seront utilisées à l’âge adulte (au moins 2 mois) afin que les réseaux neuronaux soient stables.

250000 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie expédiée aux scientifiques qui les ont commandés et le reste tué. Ce projet d'élevage industriel de lignées génétiquement modifiées prévoit identification, jusqu'à quatre biopsies à l'oreille ou à la queue et des prélèvements sanguins par animal, certaines lignées exprimant un phénotype dommageable comme un diabète, une hémophilie ou une immunodéficience. Le porteur indique que les animaux "appartiennent au scientifique" et ne peuvent être replacés. Il présente l'élevage sur mesure de rongeurs "à fournir aux scientifiques" comme un service rendu à la communauté de recherche.

Objectifs

Ce projet a pour objectif la création, caractérisation et/ou l’élevage de lignée transgéniques à phénotypes dommageables ainsi que la réalisation d'une biopsie par méthode invasive séparément du geste d'identification sur des lignées transgéniques dans le but d'héberger ou de maintenir des lignées de rongeurs génétiquement modifiés pour le compte de la communauté scientifique. Les animaux génétiquement modifiés sont utilisés comme modèle expérimental pour la recherche (compréhension de maladies d’origine génétique comme par exemple la mucoviscidose, l’hémophilie ou encore la myopathie dans différents domaines : facteurs de risque, mécanismes physiopathologiques, essais thérapeutiques, ...) ou pour le développement de médicaments. A la réception ou à la création de lignées transgéniques, si la présence d’un phénotype dommageable n’a pas été analysée, une caractérisation de la lignée sera réalisée afin d'évaluer le bien-être animal et permettre la gestion optimale des possibles expressions cliniques du phénotype dommageable, leur prévention ou leur traitement adéquat. Lorsque le phénotype dommageable est avéré et connu, la gestion de cette lignée sera adaptée à ce dernier par la définition / surveillance des possibles signes cliniques associés à l'expression de ce phénotype ainsi que leur prévention et traitement. Pour toute lignée transgénique hébergée/élevée, il est important de connaitre le génotype des animaux, ainsi, en plus de l’identification, une biopsie avec une méthode invasive sera réalisée. Le but de cette biopsie est donc d’analyser le génotype de chaque animal afin de sélectionner celui d'intérêt. En 2022, sur 505 projets transgéniques au total (225 000 animaux), seulement 95 lignées étaient signalées avec un phénotype dommageable (19%, soit 43 000 animaux). Parmi ces 19%, moins de 1% ont réellement exprimé un phénotype dommageable. Ces phénotypes peuvent être catégorisés en tant qu’immunodéficient ; hémophile ; maladie métabolique ; trouble neurologique ; pathologie musculaire et articulaire ou cancer, mais nous ne pouvons prévoir précisément le nombre de lignées par catégories, cela dépend des sujets de recherche des scientifiques. Pour ce projet, nous comptons 250 000 animaux (ajout de 10% en prévision de la hausse d’activité) répartis entre 500 et 600 projets d’élevage de lignées transgéniques différentes. Entre 15- 20% de ces projets concerneront des lignées dont une partie des animaux pourront exprimer des phénotypes dommageables.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux transgéniques (avec un statut génétique et sanitaire connu) qui leur permettront de réaliser leurs études sur des organismes entiers et vivants. Ainsi, le bénéfice de ce projet sera de permettre une évaluation et une prise en charge des nuisances causées par la mutation génétique des lignées génétiquement altérées et une standardisation et raffinement des méthodes de prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique de ces lignées. Le tout permettra d’avoir une meilleure maitrise de la production et de la qualité génétique, sanitaire et zootechnique des animaux génétiquement altérés à fournir aux scientifiques pour leurs expérimentations.

Procédures

Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis par animal : A une identification unique, acte d’une durée maximale de 20 secondes, à maximum 4 biopsies (à l’oreille préférentiellement ; à la queue sur justification scientifique), acte d’une durée maximale d’une minute, à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale d’une minute. Un hébergement isolé peut être nécessaire en cas d’animal fragile ou d’animal agressif. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront être de phénotype dommageable.

Impact sur les animaux

Expression possible d’un phénotype dommageable due à la mutation génétique (immunodépression, arthrite, diabète, hémophilie, …). Chaque effet indésirable est notifié si connu à l’arrivée des animaux ou estimé lors de l’hébergement. Un suivi adapté et des mesures de raffinement spécifiques sur avis vétérinaire sont mis en place en fonction de l’impact observé / attendu chez l’animal. Sur la base du suivi rapproché effectué sur ces souches et des raffinements mis en place, la nuisance sur l’animal est légère à modérée. Stress suite à la contention pour identification Douleur et stress dus aux biopsies (nombre maximum de 4) si besoin d’identifier le génotype d’intérêt. La biopsie à l’oreille est privilégiée (environ 3mm x 3mm ou languette de 5mm de large maximum, plusieurs biopsies peuvent être faite si nécessaire et justification, âge minimum : 7 jours). Compte tenu de la taille de la biopsie et de la zone (oreille peu sensible), la nuisance sur l’animal est légère. Les biopsies à la queue sont possibles sur justification scientifique (biopsies de queue de 5mm maximum, une 2eme biopsie peut être réalisée sous justification du scientifique, âge minimum : 7 jours). Compte tenu de la taille de la biopsie et de la zone, la nuisance sur l’animal est légère pour les animaux de moins de 3 semaines (queue peu sensible) et modérée pour les animaux de plus de 3 semaines. Douleur et stress dus aux prélèvements de sang (volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur et les bonnes pratiques et raffinements internes). Une anesthésie pourra être appliquée en fonction du lieu du prélèvement. Hébergement isolé la période de récupération post opératoire pour les femelles réimplantées ou en cas d’agressivité au sein du groupe social afin de limiter la douleur et le stress liés à cette agressivité. Mise en place d’enrichissements supplémentaires et adaptés en cas d’hébergement isolé.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux sont soit expédiés, soit mis à mort (les animaux appartiennent au scientifique et ne peuvent être replacés).

Remplacement

Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. Ceci implique l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle et nécessite de disposer d’organismes vivants et entiers afin de pouvoir observer l’impact de l’altération génétique ou d’une molécule thérapeutique dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels projets sur des modèles in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux hébergé et mis en accouplement est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et nous mettons en œuvre des améliorations continues de nos méthodes de reproduction pour réduire le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un niveau d'élevage correspondant aux objectifs du projet (par exemple : Adaptation du sexe du reproducteur transgénique quand il est accouplé avec des animaux non transgéniques afin de maximiser les chances de fertilités (phénotype impactant la reproduction), ou d’éviter les mères dont le phénotype réduit les comportements maternels).

Raffinement

Les observations par le personnel permettent d’évaluer le stress, la douleur et la souffrance et d’y répondre au plus vite en contactant les techniciens qualifiés, compétents et le vétérinaire. Si un point limite est atteint, le technicien met en place des soins particuliers, un enrichissement adapté, un isolement et/ou si besoin la mise à mort de l’animal. En cas de signe clinique particulier, un suivi adapté est mis en place et géré par des techniciens qualifiés, compétents au suivi vétérinaire des animaux. Les lignées connues pour pouvoir présenter un phénotype dommageable peuvent être observées et vérifiées de manière plus fréquente et plus spécifique avec des points limites et des raffinements précis. Ceci est évalué lors de la caractérisation du phénotype de la lignée ou en lien avec le scientifique en charge de cette lignée et le vétérinaire lorsque le phénotype attendu est connu. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score. En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort. Pour chaque phénotype dommageable, une mise en place de points limites non terminaux est adoptée afin de réaliser un suivi plus précis et plus optimum et la mise en place de soins adaptés (soutien nutritionnel, enrichissement spécifique, …). Si des animaux présentent des signes cliniques qui peuvent être atténués ou guéris à l’aide d’un traitement, avec accord du scientifique, ce traitement est mis en place. Les animaux déclarant un phénotype dommageable léger à modéré mais aptes à voyager seront expédiés avec une communication auprès de l’utilisateur final afin qu’il puisse gérer selon les règles éthiques et de bien-être animal leur réception et utilisation. En cas de prélèvements sanguins, les volumes prélevés ainsi que les périodes de récupération suivront la réglementation, les recommandations de la « Federation of European Laboratory Animal Science Associations » (FELASA) ainsi que les raffinements et bonnes pratiques internes. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisées que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique. A chaque abord d’une voie vasculaire, un point de compression sera effectué le temps suffisant pour assurer l’arrêt du saignement. Une observation de l'animal sera réalisée au retour dans sa cage pour s'assurer de sa récupération immédiate.

Choix des espèces

Les rats et les souris sont les espèces pour lesquelles les manipulations génétiques sont les plus développées, les mieux maitrisées et pour lesquelles les données scientifiques sont nombreuses. De plus, ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables. Ce sont les espèces qui permettent à la communauté scientifique de réaliser un certain nombre d’études en recherche et développement grâce aux données historiques et à leur connaissance de ces modèles animaux. Lors de la caractérisation des lignées, l’observation détaillée et l’analyse de la présence du phénotype dommageable sont réalisées à la naissance, au sevrage et 8 semaines d'âge. Il est également possible de prolonger sur l'âge adulte si les animaux sont conservés plus longtemps. - Hébergement des lignées à phénotypes dommageables fait à tout âge. -Biopsies réalisées le plus souvent (99% des cas) une semaine avant le sevrage ou au sevrage. Dans environ 1% des cas, une recoupe à l’âge adulte peut être demandé par le client. - Prélèvement de sang dans la plupart des cas fait en submandibulaire après 4 semaines d’âge minimum (adulte).

2 340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des transplantations de matière fécale par gavage et subissent des colites provoquées, soit par un produit dans l'eau de boisson soit par injection de cellules, avant le prélèvement de plusieurs organes. Le porteur décrit une inflammation intestinale douloureuse qu'il estime de quelques heures, et tue les souris qui perdent plus de 15 à 20 % de leur poids. Il affirme qu'aucun système in vitro comme les organoïdes ne recrée la complexité d'un "organisme entier", et justifie l'effectif de 2 340 par des groupes de dix répétés sur au moins deux expériences.

Objectifs

L'hypothèse principale du projet est que l'altération du microbiote intestinal dans les maladies inflammatoires de l'intestin (MICI) contribue à l'altération du métabolisme énergétique des cellules humaines intestinales et immunitaires, et au développement de la maladie. Les objectifs sont donc (i) d'identifier les composants du microbiote ayant un impact sur le métabolisme énergétique des cellules et les mécanismes impliqués, (ii) de déchiffrer les conséquences des altérations du microbiote intestinal sur le métabolisme énergétique dans les maladies inflammatoires de l'intestin, et (iii) de concevoir de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur le microbiote pour manipuler l'état énergétique cellulaire. La compréhension du rôle du microbiote intestinal dans la physiologie humaine est d'une importance cruciale, car il est impliqué dans de nombreuses maladies humaines, notamment les MICI, mais aussi, le cancer, le syndrome métabolique et les troubles neuropsychiatriques.

Bénéfices attendus

Ce projet représente un programme de recherche complet aux multiples bénéfices susceptibles de découler de ces travaux : - la caractérisation de la modulation fine du métabolisme énergétique des cellules hôtes par le microbiote intestinal ; - l'identification des principaux acteurs microbiens dans ces processus ; - l’identification de nouvelles stratégies thérapeutiques potentielles dans les maladies inflammatoires de l'intestin et probablement dans plusieurs autres maladies humaines affectées par le microbiote intestinal (maladies inflammatoires rhumatologiques, maladies métaboliques, cancer…). Les résultats obtenus chez la souris seront confrontés à des données obtenues à partir d’échantillons humains, ce qui ouvrira la voie aux développements de nouvelles interventions thérapeutiques. Ce projet va donc relever des défis importants en produisant des résultats d’avant-garde pour une meilleure compréhension du dialogue entre microbiote et cellules humaines. Ces résultats ouvriront la voie au développement de nouveaux traitements pour les dans les maladies inflammatoires de l'intestin d'abord, puis pour de nombreuses autres maladies affectées par une altération du microbiote.

Procédures

*Transplantation fécale : un gavage intragastrique (2 secondes) par jour, trois jours de suite +/- un gavage intragastrique unique (2 secondes) *Colite induite par traitement dans l’eau de boisson pendant 7 jours +/- un gavage intragastrique unique (2 secondes) *Colite induite par le transfert adoptif : une injection intrapéritonéale unique (2 secondes) +/- un gavage intragastrique unique (2 secondes) *Transplantation fécale: un gavage intragastrique (2 secondes) par jour, trois jours de suite +/- Colite induite par traitement dans l’eau de boisson pendant 7 jours *Transplantation fécale : un gavage intragastrique (2 secondes) par jour, trois jours de suite +/- Colite induite par le transfert adoptif : une injection intrapéritonéale unique (2 secondes) *Gavage intragastrique (2 secondes) une fois par jour durant 4 à 5 semaines ou 8-12 semaines +/- Colite induite par le transfert adoptif : une injection intrapéritonéale unique (2 secondes) Chaque point (*) représente une trajectoire de vie pour un groupe d’animaux et donc le maximum d’actes effectués sur ce même groupe.

Impact sur les animaux

Le projet comprend différentes techniques d’administration basique (gavages, injections intrapéritonéales ou encore intraveineuse) pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste. Les modèles de colites sont associés à des effets indésirables attendus. Dans ces modèles la douleur imposée aux animaux est liée à l’inflammation intestinale qui n'entraîne pas la mort de l'animal. On peut estimer que son intensité sera légère ou modérée au maximum et qu’à ce niveau, sa durée sera de quelques heures au maximum.

Devenir

L’ensemble des animaux (n= 2340) sera euthanasié à la fin de la période de maintien afin de pouvoir réaliser les différents prélèvements d’organes et réaliser les analyses nécessaires au projet de recherche. Sur chaque animal, plusieurs organes sont prélevés en entier pour analyse ce qui impose une euthanasie.

Remplacement

Malgré le développement et l’utilisation de modèles non animaux tels que les organoïdes ou les systèmes d’intestin artificiel, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans les interactions complexes entre le microbiote intestinal et son hôte en situation basales et inflammatoires. A l’heure actuelle il n’est donc pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et microbiens rentrant en jeu.

Réduction

Nous limiterons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Du fait des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Le nombre d’animaux utilisés par groupe est basé sur notre expérience de plus de 15 ans d’utilisation des modèles en question. Pour prendre en compte la variabilité biologique et assurer la robustesse des résultats obtenus, nous avons besoin de réaliser les expériences décrites dans des groupes expérimentaux de 10 souris et ce dans au minimum 2 expériences indépendantes (10 x2 = 20 souris en tout par condition). Le recours à une troisième expérience indépendante ne sera réalisé qu’en cas d’interprétation impossible des résultats après la 2eme expérience. Ce projet impliquera donc un maximum de 2340 animaux. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. D’une façon générale, les modèles seront testés avec un seuil de validité de 5%. Nous utiliserons des tests statistiques non paramétriques car les conditions de normalités ne sont fréquemment pas remplies.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Le personnel impliqué dans le projet est formé en continu pour garantir leur compétence et une veille scientifique et technique en continue. Il y aura une vérification quotidienne des animaux et une observation individuelle hebdomadaire à l’occasion des interventions d’entretien (litière/abreuvement/nourriture). Les animaux seront hébergés en isolateur dans des cages standards par groupes de sexe identique (4-6 souris/cage). Du papier absorbant à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter et des tunnels en plastique pour se cacher seront ajoutés dans les cages. Les souris recevront à volonté un aliment standard et de l’eau stérilisé. La litière sera constituée de copeaux stérilisés. Points limites en dehors des situations d’inflammation intestinale: Si l'expérimentateur observe les critères suivants, une euthanasie sera pratiquée : - Perte de poids > 15% par rapport à la première mesure - Dégradation de l’état général de l'animal : difficulté de mobilité, dos vouté, état du pelage (poil hérissé). - Problème lors du gavage ou de l’injection avec agitation anormale ou trouble de la respiration/saignement après le geste. Points limites dans les deux modèles d’inflammation intestinale : Si l'expérimentateur observe les critères suivants, une euthanasie sera pratiquée : - Perte de poids >20% sur la durée de l'expérimentation en comparaison avec le poids de J0 (début de la procédure DSS ou injection cellules). - Dégradation de l’état général de l'animal : difficulté de mobilité, dos vouté, état du pelage (poil hérissé). - Problème lors du gavage ou de l’injection IP avec agitation anormal ou trouble de la respiration/saignement après le geste.

Choix des espèces

La souris est une espèce de référence en immunologie, microbiologie et métabolisme, qui sont les thématiques de notre projet. La souris est un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies intestinales humaines. Les souris seront utilisées à l’âge adulte, entre 6 et 14 semaines. Les souris axéniques seront colonisées avec les microbiotes d’intérêt dès leur sevrage (3-4 semaine de vie) mais les autres étapes ne se feront qu’à partir de l’âge adulte (minimum 6 semaines de vie). La colonisation le plus proche possible du sevrage permet d’éviter les altérations du système immunitaire observée chez les souris axéniques colonisées à l’âge adulte Apres colonisation de souris axéniques, il est nécessaire d’attendre 3 semaines pour que le microbiote et le système immunitaire se stabilise.