Système gastrointestinal
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Caractérisation du mécanisme et du rôle de la fixation dans le cycle de vie d’une bactérie commensale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Rats : 432
1 344 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent par gavage une bactérie commensale de l'intestin, puis des prélèvements de fèces, avant une mise à mort pour prélever leurs tissus intestinaux, aucun ne pouvant être réutilisé en raison du risque de contamination. Le porteur étudie comment cette bactérie s'attache à l'intestin et stimule l'immunité, en vue d'une plateforme de vaccins et d'un probiotique, des applications renvoyées au long terme. Il affirme que la culture in vitro ne reproduit pas les interactions d'un organisme complexe et retient le modèle murin.
Objectifs
La Bactérie Filamenteuse Segmentée (SFB, segmented filamentous bacteria) est une bactérie commensale commune de l'intestin. Contrairement à la plupart des autres commensaux, qui résident généralement dans la lumière intestinale, SFB se fixe intimement aux cellules de l’intestin d'une manière spécifique de l'espèce. En raison de cet attachement, SFB stimule puissamment le système immunitaire de l'hôte. Comme l'attachement à l’intestin est une étape clé de son potentiel de stimulation immunitaire, nous visons à mieux comprendre cette partie du cycle de vie en analysant les détails structurels et moléculaires de SFB lorsqu'il est cultivé dans un hôte où il peut se fixer et dans un hôte où il lui est impossible de s'attacher. Il y a deux objectifs principaux à ce projet : 1. Mise en évidence des caractéristiques structurelles de SFB dans des conditions d'attachement et de non-attachement. Les différences structurelles fourniront des informations importantes sur la manière dont SFB peut interagir avec son hôte. 2. Comprendre comment la motilité et la reconnaissance de ses composants par le système immunitaire inné peuvent impacter le potentiel immunostimulateur de SFB.
Bénéfices attendus
La compréhension de l’attachement de SFB à son hôte aura des conséquences translationnelles directes. En effet, ces connaissances nous permettrons de modifier la spécificité d’hôte et d’utiliser SFB de souris chez l’homme pour concevoir une nouvelle plate-forme d'administration de vaccins. Ce projet nous permettra également de mieux comprendre l'impact de la colonisation du SFB sur d'autres commensaux et pathogènes intestinaux. En effet, nous pensons que SFB a co-évolué avec son hôte afin d’obtenir de l'énergie en échange d'une résistance à la colonisation : SFB façonne la composition du microbiote et en même temps renforce la barrière intestinale et les défenses immunitaires. Ces connaissances constituent la base d'une application translationnelle de SFB pour à la fois améliorer la santé intestinale à l'avenir en tant que probiotique et comme outil de vaccination. Il est important de savoir comment des facteurs bactériens et des facteurs de l'hôte sont impliqués dans le puissant potentiel immunostimulant de SFB. Ces données nous amènerons à comprendre comment SFB est capable de modifier l'environnement immunitaire homéostatique chez l'hôte pour à la fois le protéger mais aussi exacerber des phénotypes pathogéniques. Ce n'est qu'avec une meilleure idée des détails moléculaires de ces mécanismes que des études thérapeutiques pourrons être conçues pour stimuler ou entraver les effets immunologiques de SFB sur l'hôte.
Procédures
Lors de la première procédure, les animaux subiront une inoculation de SFB par gavage (introduction d’une suspension bactérienne concentrée dans l'estomac à l'aide d'une sonde gastrique) au jour 0, ce qui prend environ 1 minute. Au début et au fin de l’expérience (8, 14 ou 21 jours) des prélèvements de fèces seront réalisés sur animaux vigiles, ce qui prend environ 5 minutes. Lors de la deuxième procédure, les mères souris subiront une inoculation de SFB par gavage et sur leur ventre avec une solution bactérienne concentrée au jour 0 (2 semaines après la naissance de ses petits). Des fèces seront prélevés sur les souris mères vigiles à J0 (semaine 2 des nouveau-nés) de la procédure et une ou deux semaines après en fonction du point final. Un prélèvement de fèces prend environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
La colonisation par les SFB est sans complication chez l’animal. Le seul risque est lié au gavage qui peut provoquer l’introduction de liquide dans les poumons de l'animal. Pour s'assurer du bien-être des animaux, ils seront surveillés pendant 10 minutes après la procédure.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car le risque de contamination par transferts répétés de souris est trop important. A l’issue de la première procédure expérimentale, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir récupérer les SFB intestinaux pour analyse. A l’issue de la deuxième procédure expérimentale les animaux seront mis à mort afin de pouvoir récupérer les tissus intestinaux pour analyse.
Remplacement
SFB est une espèce commensale spécifique qui se cultive très difficilement, ce qui limite l’utilisation de système in vitro. Notre laboratoire a réussi à mettre au point un protocole de culture in vitro pour les SFB. Cependant cette technique est difficile et limitée dans le temps, et ne nous permet pas de modéliser fidèlement les interactions microbiennes pouvant avoir lieu dans un organisme complexe tel que l’Homme. Afin de pouvoir atteindre nos différents objectifs, nous devons donc utiliser des organismes tels que le rongeur pour reproduire le plus fidèlement possible les interactions multiples observés chez l’Homme. Par ailleurs, pour comprendre l’interaction complexe entre l'hôte et les SFB, des modèles de souris in vivo génétiquement modifiés sont nécessaires pour l’étude tissulaire du système immunitaire. L'utilisation de rats est nécessaire pour pouvoir étudier SFB dans des conditions in vivo où il s'attache et ne s'attache pas afin de décrypter les facteurs impliqués dans l'attachement Lors de nos différentes procédures expérimentales nous utiliserons un modèle animal qui nous permettra d’observer et d’étudier les différentes réactions immunitaires induites par les SFB dans un organisme ayant un système immunitaire mature et pouvant être contrôlé. Ce modèle animal nous permettra également d’étudier et de caractériser les interactions physiques et moléculaires des SFB avec leur hôte, notamment au niveau de l’épithélium intestinal. Ce modèle nous permettra également d’étudier la réponse immunitaire induite par les SFB chez des hôtes ayant des caractéristiques immunitaires et tissulaires différentes. Cela nous permettra d’étudier plus précisément les différents mécanismes immunitaires mis en jeu lors d’une colonisation bactérienne.
Réduction
Afin de respecter le principe de réduction dans la conception de nos expérimentations, limité au maximum le nombre de procédure expérimentale tout en permettant d’atteindre nos objectifs, chaque procédure expérimentale nous permettra d’atteindre un des objectifs spécifiques précédemment cités. Nous nous sommes assurés de la non redondance de nos expérimentations afin d’exclure toute répétition d’étude antérieures. Ainsi nous garantissons lors de notre projet l’obtention de résultats originaux. Nous nous attachons à partager et réutiliser les tissus et prélèvements pour des analyses multiples. Afin de garantir l’obtention de résultat concluant tout en utilisant le moins d’animaux possible, chaque expérimentation a fait l’objet d’une réflexion approfondie en amont. Nous avons fait appel à un biostatisticien afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaire tout en nous permettant d’atteindre nos objectifs scientifiques. Nous utiliserons lors de nos procédures expérimentales des animaux ayant des caractéristiques similaires nous permettant de diminuer la variabilité entre individu. Nos protocoles expérimentaux sont parfaitement au point pour limiter au maximum la variabilité technique.
Raffinement
Dans un principe de raffinement, et afin de limiter l’impact de la vie en captivité, les souris et les rats seront hébergées dans des cages correctement alimentées en nourriture et en eau pour garantir leurs besoins physiologiques. Pour garantir les besoins comportementaux de base des souris, les cages seront enrichies avec des cylindres de coton, des bâtons à ronger et un tunnel. Les souris et les rats seront hébergées en groupe. Si cela est justifié par le comportement agressif ou pour permettre la récupération d’une souris après une manipulation technique, une souris pourra être isolée pour une durée ne dépassant pas 3 semaines. Un complément alimentaire pourra être rajouté pour accélérer la récupération de la souris. Nous avons également favorisé aux maximum les procédures non invasives, et limité à l’essentiel les procédures invasives. Les procédures invasives décrites ci-dessous seront réalisées par des personnels compétents et limité au maximum dans le temps. Dans ce projet, nous ne nous attendons pas à avoir d’altération du bien-être des animaux. Toutefois, le bien-être des animaux sera évalué avec une grille de score et si à un moment quelconque de l'expérience, nous observons que l'animal a un score clinique de 2 ou plus, l'animal sera mis à mort.
Choix des espèces
Nous avons choisi de réaliser nos expérimentations sur des modèles murins. Ces modèles présentent plusieurs avantages. D’un point de vue technique l’utilisation d’un modèle murin nous permet d’utiliser des infrastructures déjà existantes et respectant la législation en termes d’expérimentation animale. La reproduction et la maturation rapide du modèle murin nous permettra de rapidement obtenir des individus pour nos expérimentations. De plus, le modèle murin nous permet de bénéficier d’un nombre important de modèle génétiquement modifié et humanisé nous permettant de mener à bien nos investigations scientifiques. D’un point de vue anatomique le modèle murin présente de grandes similitudes avec l’Homme. Ces similitudes nous permettrons de modéliser le plus fidèlement les mécanismes observer chez l’Homme et fond du modèle murins un modèle idéal pour l’étude des interactions hôte-microbiote. L'utilisation de rats est nécessaire dans un contexte très limité pour pouvoir traiter l'adhérence spécifique à l'espèce de SFB, ce qui n'est pas possible en utilisant un autre système modèle. Pour la première et deuxième procédure, des souris et des rats mâles et femelles âgées de 8 à 12 semaines, seront utilisés. Pour cette étude nous avons choisi de travailler avec des souris et des rats adultes dont le système immunitaire est pleinement développé. De plus, les procédures de manipulation telles que le gavage sont plus faciles à réaliser chez les souris et les rats adultes. Pour la troisième procédure, nous visons à déterminer l'activation immunitaire induite par SFB chez les jeunes souris avant et après le sevrage. Pour cela, nous avons conçu notre procédure pour minimiser la détresse des animaux. Nous ne ferons donc un gavage à la mère que la deuxième semaine après la mise bas et répandrons également la bactérie sur le ventre de la mère souris pour faciliter la transmission aux petits. Nous avons choisi de ne pas nourrir de force les jeunes souris (dans leur deuxième semaine d'âge) mais plutôt de les nourrir d'une petite quantité de solution bactérienne sans aucune procédure invasive pour maximiser le succès de la colonisation et de la reproductibilité.
Validation de la pré-vascularisation d’un greffon de tissu conjonctif oral cellularisé obtenu par bio-impression 3D
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance légère. Elles reçoivent sous la peau un substitut de gencive obtenu par bio-impression, puis des séances d'imagerie sous anesthésie jusqu'au douzième jour, avant mise à mort pour vérifier au microscope la connexion des vaisseaux. Le porteur cherche à valider un greffon vascularisé transposable à d'autres tissus, une preuve de concept encore initiale. Il affirme qu'aucun modèle hors animal vivant ne reproduit une circulation sanguine réelle.
Objectifs
L’objectif principal du projet est de valider l’efficacité de pré-vaisseaux contenus dans des substituts de gencive obtenus par bio-impression 3D sur un modèle de souris immunodéprimée en implantation sous-cutanée. Ceci a pour but de démonter la connexion du substitut au réseau vasculaire de la souris par la présence de globules rouges dans les pré-vaisseaux contenus dans le substitut. Les objectifs secondaires sont : -de confirmer la compatibilité biologique de l’hydrogel servant de matrice au substitut (absence de réaction inflammatoire) -de montrer la faisabilité chirurgicale de l’utilisation de ce type de greffon (maniabilité)
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont d’abord la validation du modèle de pré-vaisseaux produits in vitro dans un système vivant. Ceci permettrait de montrer la capacité des pré-vaisseaux à se connecter à la vascularisation de l’organisme hôte sans provoquer d’inflammation ni de dégradation. Ce modèle bio-imprimé applicable à la gencive pourra être transposable à d’autres modèles de tissus. La muqueuse orale (doit la gencive fait partie) forme une barrière protectrice contre les agents pathogènes de l’environnement tels que les bactéries, les virus, les produits chimiques et l’abrasion due à la mastication. Cependant dans le cas d’inflammations récurrentes, de certaines infections, de traumatismes ou de tumeurs, le potentiel de défense de la muqueuse peut être dépassé, laissant les pertes de substances tissulaires progresser jusqu’à la perte de l’os sous-jacent et des dents. Ainsi, une procédure de reconstruction des tissus mous oraux peut être nécessaire pour restaurer efficacement la fonction de protection muqueuse. Une augmentation des tissus mous oraux peut donc être envisagée pour reconstituer en épaisseur et/ou en hauteur les tissus dans un contexte d’édentement, de racine dentaire ou d’implant exposé. L’autogreffe de gencive est la technique de choix pour reconstruire, et repose sur un prélèvement chez le même patient (le plus souvent au niveau de la muqueuse du palais). Cette technique a le plus de recul clinique et assure l’obtention d’un greffon très proche biologiquement du tissu perdu avec une intégration sans risque de rejet. Cependant, l’autogreffe présente des inconvénients certains tels que (i) une insuffisance de tissu selon l’anatomie du palais et les tissus résiduels du patient, (ii) le besoin d’avoir un site chirurgical supplémentaire pour prélever le tissu et (iii) des suites post-opératoires prolongées. A terme, l’obtention de substituts gingivaux pré-vascularisés permettrait de contourner ces inconvénients en ayant des greffons de taille personnalisée, vascularisés et sans site opératoire additionnel.
Procédures
Les animaux seront soumis à un implantation sous-cutanée sous anesthésie et analgésie avec une durée d’intervention inférieure à 10 minutes (anesthésie comprise). Afin d’observer les vaisseaux au microscope à luminescence, une injection de luciférine et les acquisitions seront effectuées sous anesthésie (une vingtaine de minutes par animal). Les observations au microscope a luminescence seront effectuées aux jours de suivi J2, J5, J7 et J12 post-implantation.
Impact sur les animaux
L’implantation sous-cutanée étant une chirurgie peu invasive et de courte durée, les nuisances ou effets indésirables sont réduits. En effet, un inconfort dû aux points de suture au niveau dorsal est possible, pouvant occasionner une modification du comportement des animaux (soit évitement et fatigue soit au contraire interaction des animaux avec risque d’arrachage des points). L’implantation sous-cutanée ne laisse pas de séquelle sur l’animal. De plus, le risque de contamination des plaies est extrêmement réduit car la chirurgie est effectuée en conditions stériles. Ainsi, le degré de dommages et l’impact sur le bien-être des animaux seront légers à modérés.
Devenir
Aux temps correspondants, un sacrifice des animaux sera effectué car il est nécessaire de valider de manière histologique la connexion vasculaire entre le substitut et la souris.
Remplacement
Le remplacement n’est pas possible car aucun modèle non animal ne permet d’étudier la connexion vasculaire entre le substitut de gencive et un organisme vivant. En effet, la connexion vasculaire ne peut être prouvée sur des modèles ex vivo et in vitro car il est nécessaire d’avoir une circulation du sang dans le substitut pré-vascularisé. Aucun système hors in vivo n’a réussi à reproduire la circulation sanguine pour prouver la connexion entre les vaisseaux du substitut et les vaisseaux de l’organisme recevant le substitut.
Réduction
Le substitut de gencive contenant des pré-vaisseaux a été optimisé lors de tests in vitro, ceci permettant de limiter le nombre d’expériences in vivo et donc le nombre d’animaux. De plus, une expérimentation préliminaire afin d’optimiser les conditions expérimentales sera effectuée en amont. Enfin, le suivi cellulaire par imagerie permettra également de limiter le nombre d’animaux nécessaires. La pertinence et la puissance des résultats sera évaluée à l’aide de tests statistiques.
Raffinement
L’implantation sous-cutanée est une chirurgie relativement peu invasive qui sera réalisée par des personnes qui maîtrisent ce type de chirurgie. Une anesthésie locale en complément de l’anesthésie gazeuse permettra d’améliorer le confort per et post-opératoire. Les souris étant immuno-déficientes, des précautions particulières seront prises en termes d’hébergement, d’habituation et de suivi. La souffrance, les activités et les comportements des animaux seront surveillés très régulièrement par le personnel de l’animalerie et par les expérimentateurs. Toute souffrance persistante sera traitée avec des antalgiques.
Choix des espèces
Les souris utilisées seront des adultes (7 à 8 semaines au moment de l’implantation). Ceci permet d’éviter une interférence entre la croissance des animaux et les processus d’angiogénèse et de vascularisation. Etant donné que c’est la première fois que ce type de substitut est testé in vivo, il semble nécessaire d’effectuer une première preuve de concept sur le petit animal (souris) dans un modèle d’implantation sous-cutanée avant de passer à un modèle de chirurgie gingivale sur un animal plus volumineux.
Identification et Caractérisation de bactéries intestinales pour un meilleur traitement du Syndrome de Grêle Court
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
580 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une résection étendue de l'intestin sous anesthésie, puis des injections et des gavages de matières fécales, avec pour conséquences déclarées une perte de poids, une diarrhée pouvant être sévère et des carences. Le porteur cherche des bactéries améliorant le traitement d'une maladie rare de l'intestin. Il affirme mimer "en tous points" la pathologie humaine et reconnaît que son modèle d'organoïdes ne peut être fabriqué qu'à partir d'animaux.
Objectifs
Le syndrome du grêle court (SGC), est une maladie rare qui touche 7 à 10 patients par an par million d’habitants. Il résulte d’une importante réduction de l’intestin qui conduit à un intestin restant de moins de 150-200 cm qui ne peut pas assurer une absorption des aliments pour satisfaire les besoins nutritionnels des patients. Une nutrition par voie veineuse est alors mise en place et peut entraîner de nombreuses complications dont l’une est un dysfonctionnement majeur du foie dont les causes restent à identifier. L’évolution des problèmes de foie est rapide et conduit parfois à une dégradation sévère de ses fonctions dont le seul traitement efficace est la double transplantation foie-intestin. Une alternative thérapeutique est un traitement médicamenteux dont le coût actuel est exorbitant et qui présente une grande variabilité de réponses chez les patients. Les patients souffrant du SGC ont une composition particulière de bactéries intestinales appelée lactobiote. Caractériser ce lactobiote nous semble pertinent pour identifier des espèces bactériennes particulières qui aideraient au développement de nouvelles stratégies de traitement des patients. Un modèle de rat mimant au plus près les caractéristiques de la pathologie SGC humaine, sera utilisé. L’objectif du projet est de comprendre comment ce lactobiote en absence ou en présence du traitement médicamenteux actuel participe à l’amélioration de l’état général du rat grêle court et, de rechercher d’autres causes des dysfonctionnements du foie liée l’importante réduction de l’intestin. Les buts ultimes sont : 1°) de développer des stratégies et des approches thérapeutiques pour les patients qui souffrent d’une sévère malabsorption intestinale dans la perspective de réduire la nutrition par voie veineuse, source de nombreuses complications et, 2°) d’identifier d’autres causes des dysfonctionnements du foie lié à l’importante réduction de l’intestin afin d’optimiser la prise en charge des patients.
Bénéfices attendus
Les résultats devraient permettre: i) de développer de nouvelles stratégies pour des approches thérapeutiques adaptées pour les programmes de rééducation intestinale des patients souffrant d’une importante réduction d'absorption des aliments dans la perspective de réduire la dépendance à la nutrition par voie veineuse de substances nutritives ; ii) de découvrir d’autres causes et/ou mécanismes conduisant aux dysfonctionnements du foie ( fabrication de la bile, détoxification de produits alimentaires ingérés etc… …).
Procédures
Les animaux auront une chirurgie, d'une durée d'environ 35 min, consistant en une importante réduction de l'intestin sous anesthésie générale et analgésie. Les conséquences de cette réduction intestinale sont la perte de poids et la diarrhée. Les animaux évéillés auront des injections intraperitonéales d'antibiotiques (geste sans anesthésie d'une durée de 10 secondes maximum) et de substances chimiques dans l'abdomen 1 fois tous les 2 jours pendant 2-3 semaines apres la chirurgie et des gavages (geste sans anesthésie d'une durée de 30 secondes maximum) de fèces (1 fois par semaine) pour la transplantation de microbiote fécal (TMF), pendant 3 semaines apres la chirurgie
Impact sur les animaux
Ces chirurgies qui portent sur une importante réduction de l’intestin entrainent une perte de poids, une diarrhée qui peut être sévère conduisant à une malabsorption avec des carences nutritionnelles.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure puis l'estomac, l'intestin, le foie, le cerveau sont préléves pour des analyses .
Remplacement
Afin de limiter le nombre d’animaux, nous mettrons en place un modèle simplifié de l’intestin dans un tube à essai, (organoïdes) qui sera produit à partir de cryptes (contenant les cellules souches) des fragments intestinaux des différents groupes d’animaux utilisés. Ce modele de l'intestin simplifié ne peut cependant etre créer qu'en utilsant des animaux. Une partie de ces organoïdes sera congelée, conservée pour être utilisée dans d'autres études. A terme ce modèle simplifié de l'intestin en tubes à essai, pourra etre utilisé en lieu et place des animaux..
Réduction
Nous limitons le nombre par groupe au nombre nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement fiables. Cependant, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables ne permettant pas de tirer de conclusions des données. Ce nombre de rats par groupe a été calculé pour pouvoir mettre en évidence une récupération. En outre, les animaux témoins dans les différents groupes pourront être utilisés pour les analyses de plusieurs groupes d’expérience, permettant ainsi une réduction substantielle du nombre d’animaux.
Raffinement
L'ensemble des procédures de ce projet se fera dans le respect du bien-être animal. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et la prise en charge de la douleur, conforme à celle réalisée chez les patients opérés. Nous avons inclus dans toutes les procédures des grilles de suivi : la pesée journalière pour le suivi du poids, la mesure de la prise alimentaire avant et après l’opération, une grille d'évaluation de la douleur avec des points limites précis et adaptés. Après les opérations chirurgicales, les animaux sont placés dans des cages séparées pour suivre leur prise alimentaire individuelle et la reprise du transit intestinal indispensables à leur surveillance individuelle. Les cages sont alors enrichies avec des tubes en polycarbonate. Les animaux seront donc suivis sur le plan hygiénique tous les jours par un personnel expérimenté afin de respecter le bien-être animal. Afin de limiter leur isolement, ils seront transférés ensuite dans des cages séparées par une grille et enrichies avec des tubes en polycarbonate.
Choix des espèces
Nous utiliserons le/la rat.e adulte car il/elle dispose d'un microbiote intestinal plus diversifié et proche de celui de l’homme. En outre, nous avons développé et caractérisé un modèle de résection intestinale étendue (rat syndrome de grêle court) qui mime « en tous points » la pathologie humaine du syndrome de grêle court.
Rôle du microbiote intestinal dans les changements de comportement alimentaire lors d’expositions répétées à un régime riche en gras et sucre chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent neuf gavages, dont cinq en deux heures pour vider leur microbiote, un geste que le porteur qualifie lui-même de stress sévère, puis une coupe de la queue et un prélèvement de sang avant mise à mort pour prélever le cerveau. Le porteur étudie le lien entre microbiote intestinal et attrait pour les régimes gras et sucrés, un enjeu qu'il présente comme majeur. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit ces relations entre intestin, cerveau et comportement.
Objectifs
L’augmentation de la consommation alimentaire liée au plaisir à manger est un facteur clé dans l’augmentation de la prévalence du surpoids et de l’obésité. La compréhension des dérégulations de ce système du plaisir à manger est un enjeu scientifique et médical majeur. Parmi les nouveaux acteurs de la régulation du comportement alimentaire, le microbiote intestinal est de plus en plus étudié . Des données préliminaires pointent son rôle potentiel dans la régulation du comportement du plaisir à manger dans le cadre d’alternance entre des régimes normaux et régimes gras/sucrés. Ce type de comportement est largement répandu dans la population en général et dans les stratégies nutritionnelles pour la perte de poids, qui sont généralement peu efficaces en termes de perte de poids sur le long terme. Ce travail pourra permetre de mettre en évidence le rôle de certaines bactéries en particulier et leurs cibles au niveau de certaines régions du cerveau impliquées dans la régulation de la prise de nourriture. Des modifications du comportement alimentaire et notamment du plaisir alimentaire qui entraine une augmentation de la prise alimentaire ont été mises en évidence chez des souris lorsqu'elles sont exposées plusieurs fois (effet YOYO) à un régime gras/sucré. En parallèle des modifications du microbiote intestinal et une prise poids plus importante ont été observées chez ces souris YOYO en comparaison avec des souris maintenues en permanence sous un régime gras/sucré. Ceci mettant en évidence l’aspect détrimentaire de l’alternance des régimes alimentaires. L’objectif de ce projet est de mettre en évidence un éventuel lien de cause à effet entre les modifications du microbiote intestinal et le comportement alimentaire. Pour cela, le microbiote caecal de souris YOYO (ayant été exposées plusieurs fois au régime gras sucré) ou pas sera transféré à des souris receveuses naives n’ayant jamais consommé de régime gras/sucré. L'objectif de ce travail est d’une part d'analyser le comportement des souris receveuses et d'autre part de mettre en évidence les aires cérébrales activées par les microbiotes YOYO. Pour cela, des analyses de biologie moléculaire ou des immunohistochimies dirigées contre des gènes impliqués dans le comportement alimentaire et des protéines marqueurs de la neuroinflammation seront réalisées sur les cerveaux des souris receveuses.
Bénéfices attendus
L’augmentation de la consommation alimentaire liée au plaisir à manger est un facteur clé dans l’augmentation de la prévalence du surpoids et de l’obésité. La compréhension des dérégulations de ce système du plaisir à manger est un enjeu scientifique et médical majeur. Parmi les nouveaux acteurs de la régulation du comportement alimentaire, le microbiote intestinal est de plus en plus étudié. Des données préliminaires pointent son rôle potentiel dans la régulation du comportement du plaisir à manger dans le cadre d’alternance entre des régimes normaux et régimes gras/sucrés. Ce type de comportement est largement répandu dans la population en général mais également dans les stratégies nutritionnelles mise en œuvre pour la perte de poids, qui sont généralement peu efficaces en terme de perte de poids sur le long terme. Ce travail pourra permettre de mettre en évidence le rôle de certaines bactéries en particulier et leurs cibles au niveau du cerveau afin, à long terme, d’envisager des développmenents thérapeutiques utilisant les bacteries indentifiées pour moduler la prise alimentaire.
Procédures
Les animaux seront soumis à une contention nécessaire lors des 9 gavages (quelques secondes) réalisés lors de la déplétion du microbiote (5 gavages en 2h), le transfert du nouveau microbiote (3 gavages en 48h) et au cours du test de tolérance au glucose (un gavage à la fin des 8 semaines). Pour ce test les souris subiront une petite coupure à l’extrémité de la queue (incision : 1 seconde) et massage de la queue pour récupérer la goutte de sang (quelques secondes). Un prélèvement de sang à la veine submandibulaire sera réalisé une fois sur animaux vigiles en fin de procédure avant l’euthanasie. Ce prélèvement dure 10-15 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à un stress de par leur placement en cage individuelle tout au long de la procédure. Lors de la déplétion du microbiote, les gavages au polyéthylène glycol (PEG), d’une durée de 10 secondes, constituent un stress sévère compte tenu de leur fréquence (5 gavages en 2h). Lors du transfert de microbiote, les gavages d’une durée de 10 secondes, constituent un stress modéré car ils sont espacés de 24h. Une petite coupure au niveau de la queue réalisée une seule fois par l'expérimentateur lors du premier prélèvement du test.
Devenir
Les 72 souris seront euthanasiées pour prélever les cerveaux.
Remplacement
Il n’existe aujourd’hui pas de modèle ou de technique in vitro permettant de simuler les relations entre le microbiote intestinal, le système nerveux central et le comportement alimentaire d’un individu. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données sur la composition et l’abondance du microbiote intestinal et des données phénotypiques et comportementales obtenues sur les mêmes animaux.
Réduction
Nous avons prévu d’inclure 24 souris par groupe expérimental et nous avons 3 groupes expérimentaux. Chaque groupe sera divisé en deux sous-groupes de 12 animaux qui seront respectivement dédiés à l’analyse de l’expression de gènes ou au marquage de protéines. D’après les études déjà menées au laboratoire, nous estimons que 12 animaux par sous-groupe sont nécessaires afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier de nidification et une maison en propylène rouge pour permettre aux souris respectivement de faire un nid et de se cacher. Elles auront également un bâton à ronger. Afin de palier au stress dû à l'isolement des animaux , les cages seront en plexiglass transparentes et mises côte à côte pour permettre les interactions visuelles et sonores entre les animaux. Ces enrichissements permettent d'assouvir au mieux les comportements naturels de l'animal. Les animaux seront surveillés chaque jour (surveillance visuelle) au moment de la prise alimentaire (mesurée par pesée de l’aliment). Un score clinique sera établi lors de la surveillance quotidienne. Une perte de poids dépassant 20 % du poids initial de l’animal sera considérée comme un point limite majeur. Des points limites spécifiques lors des gavages seront également mis en place.
Choix des espèces
Des souris C57BL6 mâles adultes (agés de 12 semaines au début de la procédure) seront utilisés. Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques induites par des régimes riches en énergie en raison de ses réponses reproductibles. Des données préliminaires sur ce modèle animal sont de plus disponibles notamment sur les souris donneuses dont sont issus les microbiotes qui seront transférés. Il est donc indispensable d’utiliser des animaux de la même espèce, du même âge et du même sexe que les souris donneuses de microbiote. Nous avons choisi de travailler sur des animaux de 12 semaines d’âge afin de travailler sur des animaux adultes ayant un microbiote stabilisé.
Cibler le microbiote intestinal pour améliorer les réponses vaccinales
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1090 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent un régime gras et sucré, du dextran sulfate provoquant une inflammation intestinale, huit gavages et des injections d'ovalbumine, avec prélèvements de sang sous anesthésie. Le porteur cherche des probiotiques améliorant la réponse aux vaccins, un bénéfice formulé comme une perspective. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative" pour étudier l'influence du microbiote sur l'immunité.
Objectifs
La récente pandémie a démontré l’importance de l’utilisation de la vaccination lorsqu'elle est disponible. Elle a aussi mis en lumière l’une des problématiques majeures des vaccins qui est celle de leur efficacité. Cette efficacité est moindre chez les sujets âgés, immuno-déprimés, atteints de pathologies chroniques (notamment les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin). Elle peut être évaluée par plusieurs paramètres, en particulier la proportion de sujets répondeurs, l’intensité et la qualité de la réponse chez le sujet vacciné, la durabilité de cette réponse protectrice, et enfin le spectre d’efficacité du vaccin. Les microbiotes au sens large, et notamment le microbiote intestinal sont connu pour jouer un rôle primordial dans la régulation du système immunitaire. Ce microbiote peut être modulé par l’utilisation de probiotiques, de prébiotiques ou de postbiotiques. En comparaison avec les probiotiques que l’on doit administrer vivants, l’option pré- ou postbiotique présente un intérêt pratique en vue d’une utilisation possible chez l’homme. Nous chercherons donc à identifier un ou des candidats probiotiques permettant de renforcer la réponse vaccinale en condition de microbiote altéré. Nous testerons ensuite si ce candidat est également efficace en contexte de microbiote sain. Nous déterminerons si l’utilisation d’un lysat ou d’un surnageant de ce probiotique récapitule les résultats obtenus avec le micro-organisme vivant, dans l’objectif de travailler sur un postbiotique dérivé de ce microorganisme. Les objectifs expérimentaux de cette étude sont les suivants : 1/ Valider notre modèle d’immunisation chez la souris et démontrer l’importance du microbiote intestinal dans ce modèle, choisir un ou plusieurs modèles de microbiote altéré pour la suite de l’étude. 2/ Dans un modèle de microbiote altéré, cribler dix candidats probiotiques susceptibles de renforcer la réponse à la vaccination, sélectionnés d’après la littérature et notre expérience. 3/ Vérifier si le ou les candidat(s) efficace(s) dans un modèle de microbiote altéré le sont aussi lorsque le microbiote est normal. 4/ Comparer l’efficacité du ou des candidat(s) retenu(s) avec celle de leur forme lysée et de leur surnageant de culture en contexte de microbiote sain ou altéré, et déterminer si un apport conjoint de prébiotiques peut optimiser l’efficacité du ou des candidat(s) retenu(s).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier des candidats probiotiques permettant d’améliorer la réponse vaccinale et d’envisager déjà l’utilisation de pré ou post-biotiques dérivés de ces candidats.
Procédures
Prise d’alimentation riche en graisse et en sucres (en continu). Administration dans le biberon de dextran sulfate sodium, de bactéries, de fibres fermentescibles (en continu). Administration intragastrique à l'aide d'une sonde adaptée (8 gavages + éventuellement gavage bi-quotidien de paracétamol si un animal est souffrant). Injection intramusculaire d’ovalbumine purifiée ou de sérum physiologique (trois injections). Prélèvement sanguin sous anesthésie (trois prélèvements).
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, les animaux pourront subir des contentions (stress), des gavages intragastriques (stress, éventuellement douleur légère), des injections intramusculaires sous anesthésie (douleur légère) et des prélèvements sanguins sous anesthésie dans le respect des volumes recommandés (douleur légère, possibilité d'anémie légère transitoire). Le traitement au dextran sulfate sodium et le traitement antibiotique peuvent provoquer une légère inflammation intestinale associée à une perte de poids n'excédant pas 10% du poids corporel. L’alimentation riche en graisse et en sucres ne nuira pas à leur santé ou à leur bien-être sur la durée courte de l’expérience.
Devenir
La mise à mort de ces animaux est nécessaire pour les prélèvements post-mortem envisagés.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’étudier la réponse immunitaire de l’hôte suite à la vaccination, et encore moins pour étudier l’influence du microbiote intestinal sur ce phénomène : le microbiote influence les réponses immunitaires à distance, par des mécanismes multiples et encore mal caractérisés.
Réduction
La bibliographie montre une hétérogénéité inter-individuelle dans les réponses à l’immunisation. C’est pourquoi nous prévoyons 10 animaux par lot, ce nombre est nécessaire pour garantir des résultats fiables et statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux par lot (prévu à 10) sera éventuellement revu à la baisse (6 à 8 par lot), en fonction des données de variabilité inter-individuelles obtenues lors des permiers essais d'immunisation. De plus, en fonction des résultats, le projet peut soit s’arrêter rapidement (si aucun traitement n’impacte la réponse anticorps) soit être poursuivi mais pas forcément avec les trois modèles de déstabilisation du microbiote : il est probable qu'un voir deux de ces traitements ne soient finalement pas utilisables. Enfin, les expériences ne seront répétées que sur les candidats probiotiques donnant des résultats significatifs : nous avons considéré qu’au mieux, trois candidats seraient intéressants, ce qui nous semble déjà optimiste. Chaque fois que possible, le prélèvement sanguin avant immunisation servira de contrôle, évitant ainsi de réaliser un lot d'animaux non-immunisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cages ventilées dans le respect de la réglementation et auront libre accès à l’eau et à la nourriture. Une période d’acclimatation de 7 jours sera réalisée avant le début de l’expérimentation. Les conditions d’hébergement sont les conditions standard. Un enrichissement est proposé aux souris : tube/cachette en polycarbonate teinté rouge préalablement lavé et stérilisé. Il est à noter qu’il n’y a aucune raison objective pour laquelle les animaux pourraient se trouver en état de souffrance suite aux procédures proposées dans ce projet. Toutefois, dans la mesure où le modèle d’immunisation n’est pas encore établi au laboratoire, une attention particulière sera apportée à l’évaluation quotidienne du bien-être de chaque animal par des personnels formés, à partir d’une grille d’évaluation pré-établie. En fonction de ce score individuel de bien-être et de son évolution, l’animal sera isolé, la surveillance sera adaptée et le traitement de l’animal par des antalgiques (paracétamol) sera envisagé. Si un animal dépasse ce score limite, il sera alors euthanasié.
Choix des espèces
Le choix du modèle souris est lié à 3 paramètres essentiels : - disponibilité des outils moléculaires et expertise technique du laboratoire pour cette espèce ; - importance des données bibliographiques déjà publiées sur la réponse immunitaire et le lien avec le microbiote sur ce modèle; - utilisation des modèles de déstabilisation du microbiote établis au laboratoire. Les expérimentations débuteront sur des animaux âgés de 5 semaines (4 semaines + 1 semaine d’acclimatation). L’immunisation interviendra à l’âge de 8 semaines. L’expérience prendra fin 5 semaines plus tard.
CREATION DE LIGNEES AVEC VIEILLISSEMENT ACCELEREE DANS LE FOIE
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance légère. Le porteur crée par croisements quatre lignées porteuses de mutations du vieillissement, avec coupe du bout de la queue puis prélèvement de sang et perfusion du foie sous anesthésie avant mise à mort. Il décrit pourtant des atteintes lourdes attendues des délétions génétiques, réduction de poids, infertilité, atrophie et durée de vie parfois réduite à quelques mois, ce qui contraste avec la gravité légère déclarée. Il affirme "être obligé" de créer ces lignées faute de modèle in vitro du foie vieillissant.
Objectifs
Le vieillissement de la population mondiale est un problème majeur de santé publique. Le vieillissement est associé à un déclin de la fonction d'un certain nombre d’organes, ce qui contribue à un risque accru de développement de maladies liées à l'âge. Il est décrit chez la personne âgée une augmentation du passage des bactéries de l’intestin vers le sang responsable ainsi d’une inflammation générale dans le corps, inflammation qui est impliqué dans de nombreuses pathologies liées à l’âge dont les maladies chroniques du foie et les infections. Le foie reçoit le sang passant par le système digestif, et participe activement au contrôle de l’inflammation et à l’immunité grâce aux cellules immunitaire résidentes mais aussi aux cellules endothéliales du foie (cellules qui bordent les vaisseaux sanguins présents dans le foie), qui ont des fonctions immunitaires et anti-inflammatoires. Le vieillissement hépatique, qui a été montré comme touchant particulièrement les cellules endothéliales du foie, pourrait participer à l’inflammation générale et au développement de maladie liées à l’âge. Afin de diminuer au maximum la durée de l’expérimentation (4 à 6 mois au lieu de 24 mois) et d’étudier l’impact du vieillissement uniquement de certaines cellules du foie sur tout l’organisme, nous souhaitons créer des souris qui aient un vieillissement accéléré seulement dans les cellules endothéliales du foie et dans les hépatocytes. Notre projet est de créer ces lignées et de vérifier qu’elles ne présentent pas de phénotype ayant un impact sur le bien-être des souris.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet sont de créer 4 lignées murines qui auront un phénotype de vieillissement accélérée seulement dans le foie et non dans tout l’organisme. Ainsi par la suite, nous pourrons étudier l’effet de ce vieillissement spécifique sur le développement et la lutte aux infections et élaborer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Nous allons créer 4 lignées murines par croisement d’animaux sur plusieurs mois et plusieurs générations. Nous allons suivre la croissance des souris. A la naissance, les animaux seront identifiés par un tatouage ou une puce (durée 2min). Un petit morceau du bout de la queue des souris sera coupé (durée 1 min). Tout au long de la vie de la souris (maximum 6 mois), les animaux seront observés afin de déterminer si elles ont un phénotype qui peut avoir un effet sur le bien-être animal. Aucun geste invasif ne sera réalisé. Au bout de 6 mois, les souris seront anesthésiées et un prélèvement de sang sera effectué avant l’euthanasie de la souris (cela durera 10min). En ce qui concerne la chirurgie afin d’isoler les cellules endothéliales et les hépatocytes, les souris seront anesthésiées et recevront une injection d’analgésique. La souris sera euthanasiée en perfusant son foie à l’aide d’une solution afin de récupérer les cellules pour les étudier (cela durera 20min).
Impact sur les animaux
Les délétions totales des gènes SIRT6 et TERT provoquent des malformations chez les souris. Pour la délétion totale de TERT, les souris semblent en bonne santé pour les premières générations puis montrent une réduction du poids corporal et de la masse graisseuse sans réduction de prise alimentaire, infertile après 4 générations, déclin fonctionnel de certains organes (intestin, système immunitaire) et une atrophie croissante. (Margaret A. Strong – Mol Cell Biol – 2011) Pour la délétion totale de SIRT6, les paramètres différents selon le background (souche) de la souris utilisée : 129/SvJ ou 129/SvJ/BALB/c : les souris vivent en moyenne de 30 à 300 jours à cause : d’une absence de graisse sous-cutanée, d’une mortalité prénatal importante, de problème intestinal, de problème du système immunitaire et d’ostéoporose (Raul Mostoslavsky –Cell – 2006 ; Victoria Peshti – Plos One -2017). Par contre, il est possible que comme la mutation sera restreinte à un seul type cellulaire, aucun effet indésirable ne soit observé.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées à la fin de la procédure afin de vérifier: * le phénotype dommageable (effet sur le bien-être de l'animal) sur les organes; * la délétion des gènes dans les cellules intérêts et leur phénotype vieillissant. Après euthanasie, nous préléverons les organes (foie, rein, coeur, poumon ...) afin de les analyser et de regarder si les organes sont en bonne santé, ou si la mutation les a modifié ce qui peut avoir un effet ou non sur le bien-être de l'animal.
Remplacement
Nous souhaitons étudier l’impact du vieillissement du foie sur l’ensemble du corps et sa réaction face aux infections qui impactent les personnes agées qui plus sensible que les personnes jeunes (infection à certains virus : COVID; grippe... ou à des bactéries : E. Coli...). Des expériences in vitro seront réalisées afin de caractériser le foie vieillissant. Par contre, pour regarder l’effet du foie sur les injections, nous sommes obligés de passer par un modèle animal, et c’est pourquoi nous devons créer ses 4 lignées murines.
Réduction
Nous avons suivi les recommandations pour le choix du nombre de souris par sexe afin d’étudier le phénotype dommageable (impact sur le bien-être animal). Afin de caractériser et vérifier le phénotype et le génotype du foie des souris crées, nous avons déterminer un nombre de souris selon notre expérience. Ce nombre a été défini afin d’utiliser le minimum de d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs
Raffinement
Tous les animaux qui seront utilisés dans ce projet seront surveillés de manière visuelle quotidiennement et toutes les mesures nécessaires à leur bien-être seront prises par l’enrichissement des cages (présence de maisons en plastique dans les cages, bâtonnets en bois et cotons). LLe suivi clinique des animaux se fera une fois par semaine afin de vérifier si le phénotype est dommageable ou non (ayant un impact sur le bien-être animal). Une grille de scoring a été réalisé afin de répertorier tous les aspects de l’animal et d’agir en euthanasiant l’animal si celui est en souffrance. Pour les chirurgies sans réveil (perfusion pour prévélement d'organes, du sang et des cellules du foie), nous utiliserons de l'analgésie et de l'anesthésie.
Choix des espèces
Le choix des souris permet d’avoir accès à des animaux génétiquement modifiés. Les souris génétiquement modifiées permettront de mettre en évidence le rôle ou l’implication d’un processus donné dans un type cellulaire précis dans le développement de pathologies liées à l’âge. De plus, il existe de nos jours de nombreux outils adaptés à la souris (anticorps, analyses protéomiques...) nécessaires à cette étude. S’agissant d’un projet sur le vieillissement et de l'utilisation de lignées avec vieillissement accélérée, les souris seront étudiées à 4 et 6 mois.
Influence des entérotypes bactériens du microbiote intestinal sur les capacités fonctionnelles et le métabolisme énergétique chez le mus musculus.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité sévère. Elles reçoivent un traitement antibiotique pendant neuf jours, puis une transplantation de microbiote fécal par gavage et des tests de course sur tapis roulant, pour établir un lien de cause à effet entre type de flore intestinale et endurance. Le porteur indique que le gavage, les tests physiques et l'antibiotique à large spectre génèrent stress et inconfort intestinal, et héberge chaque animal en cage individuelle. La mise à mort est présentée comme "indispensable" pour accéder aux organes.
Objectifs
Le microbiote intestinal représente tous les microorganismes, bactéries, champignons et virus vivant le long du tractus gastro-intestinal d’un hôte. Ces différents microorganismes et plus particulièrement les bactéries vivent en homéostasie au sein de l’intestin, c’est-à-dire qu’il existe un équilibre entre les bactéries commensales (i.e. bactéries non néfastes et contribuant au bon fonctionnement de l’hôte), les bactéries parasites et les pathogènes permettant un état d’eubiose de la flore intestinale. Au cours de la dernière décennie, un certain nombre d’études scientifiques ont été conduites pour établir le lien qu’il existe entre ce microbiote intestinal et la performance sportive. Certains travaux scientifiques, et notamment ceux conduits au laboratoire M2S, ont ainsi mis en évidence un lien direct entre le microbiote intestinal et le muscle squelettique, organe central dans la performance sportive. Récemment, nous avons en effet conduit une étude clinique pilote chez l'humain pour caractériser la composition du microbiote intestinal en fonction du profil glucido-lipidique à l'exercice. Nous avons montré que des sujets utilisant principalement des lipides à l'exercice présentent en très grande majorité un entérotype bactérien dominé par le genre Prevotella (espèce de bactérie). A l'inverse, les individus n'utilisant pas ou peu de lipides présentent un entérotype dominé par le genre Bacteroides (autre espèce de bactérie). En réalisant une transfection fécale des deux entéroypes chez des souris, l'objectif de ce projet vise à déterminer si un lien de cause à effet existe entre le type d'entérotype bactérien et les capacités d'endurance à l'exercice.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus dans le cadre de cette étude permettront de déterminer si une relation de cause à effet existe entre un entérotype bactérien retrouvé chez les populations sportives et la performance en endurance. Sur le plan de la santé, ils permettront de déterminer si un entérotype bactérien peut être bénéfique pour oxyder préférentiellement les lipides dans la fourniture d'énergie, caractéristique bien reconnu comme étant associé à un meilleur état de santé métabolique.
Procédures
Aucune intervention chirurgicale n'est prévue. Les 3 groupes expérimentaux auront un traitement antibiotique pendant 9 jours dans l'eau du biberon. Puis 2 groupes expérimentaux seront assujettis à une transfection fécale par gavage soit 3 doses (1 dose/j la première semaine) puis 1 dose par semaine pendant 4 semaines. La durée de manipulation pour réaliser le gavage est de moins d'une minute. Ils effectueront également, avant et pendant la durée de l'étude, des tests de course sur tapis roulant pour évaluer leurs capacités fonctionnels. Un des tests mesurant la vitesse de course maximale durera environ 20min alors que l'autre test mesurant la capacité d'endurance durera environ 1h. Des prélèvements fécaux non-invasifs seront réalisés chez les animaux (durée de la manipulation : moins d'une minute).
Impact sur les animaux
Les animaux sont hébergés dans des cages individuelles. Les procédures de gavage et les tests physiques peuvent engendrer du stress pour les animaux. Le traitement antiobiotique à large spectre peut générer un inconfort intestinal durant les 9 jours de traitement. Toutefois, ces approches expérimentales sont communément utilisées pour les protocoles de transfection fécale chez l'animal.
Devenir
A la fin de ces protocoles expérimentaux, les animaux seront euthanasiés. La mise à mort des animaux est indispensable à l’étude pour avoir accès aux différents organes. L’objectif sera entre autres de réaliser des analyses moléculaires sur ces tissus.
Remplacement
Les résultats que nous avons obtenus sur la cohorte d'individu sains démontrent que les profils oxydant préférentiellement des lipides à l'exercice sont associés à un entérotype Prevotella dominant chez l'homme. L’étude de la causalité (soit l'effet de l’entérotype sur le métabolisme), ne peut se faire qu’à travers une étude chez le rongeur. Il n'existe pas d'alternative in vitro, ou ex-vivo, pour évaluer de manière efficace l’impact d’un entérotype bactérien sur le métabolisme et les capacités fonctionnelles.
Réduction
La cohorte constituée de 36 souris sera répartie en 3 groupes expérimentaux (12 animaux/groupe) afin d'obtenir les effets des différents entérotypes sur les capacités fonctionnelles.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet nécessitent un hébergement en cage individuelle car il est indispensable d'éviter le transfert du profil microbiote et il est nécessaire de mesurer la consommation quotidienne de nourriture et d'eau. Mais des précautions sont prises. Les animaux seront hébergés dans des cages individuelles, côte à côte et enrichies avec de jouets et un tunnel ce qui permet de limiter l'isolement social et le stress. De plus, tout au long de la durée du protocole, les animaux suivront un contrôle quotidien effectué par les chercheurs via un registre journalier et individuel. Un questionnaire pour mesurer le niveau de souffrance des rongeurs est mis à disposition et disponible dans les locaux de l’animalerie. Le questionnaire fait ressortir les signes visibles de douleur et d’inconfort chez le rongeur (vocalisation, agressivité, retrait d’un membre, autres). En cas d'atteinte des points limites décrits dans chacune des procédures, nous procéderons à la sortie la souris du protocole.
Choix des espèces
Les souris constituent une espèce qui très facile à manipuler et à faire courir sur des tapis. Le matériel que nous avons à disposition est également optimisé pour évaluer les performances physiques chez la souris. Par ailleurs, la nécessité d'avoir une population la plus homogène possible place la souris comme un modèle de choix pour cette expérimentation. Nous disposons par ailleurs de précédentes expériences validant l'usage d'un traitement antibiotique à large spectre chez cette espèce. Les animaux seront âgés de 7 semaines au début de l'expérimentation pour étudier de l'effet de la flore intestinale sur les capacités fonctionnelles et le métabolisme énergétique. Il faut disposer d'animaux adultes dont le métabolisme énergétique est stabilisé.
Evaluation de la cinétique de digestion des protéines issues d’insectes comestibles (farine de Tenebrio Molitor)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
8 cochons miniatures vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardés vivants pour être réutilisés dans un autre projet. Chaque animal subit une chirurgie abdominale de trois heures pour la pose de cathéters, puis trois séances de prélèvements sanguins de sept heures après ingestion d'une farine d'insectes, pour mesurer la vitesse de digestion d'un ingrédient protéique destiné à l'alimentation humaine. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer des douleurs abdominales dans les jours suivants, et fixe un point limite de mise à mort en cas de perte de poids supérieure à 20 %. Il affirme que la biodisponibilité des nutriments "ne peut pas" être reproduite in vitro et présente le miniporc comme un modèle proche de l'appareil digestif humain.
Objectifs
Cette étude entre dans le cadre de la caractérisation de la qualité nutritionnelle d’un nouvel ingrédient protéique obtenu à partir d’insectes comestibles. Ce nouvel ingrédient est destiné à la consommation humaine. Au-delà de la composition en acides aminés indispensables et de la digestibilité dans l’intestin grêle, la qualité nutritionnelle d’une protéine dépend de la vitesse à laquelle elle est digérée, paramètre qui va influencer l’efficacité d’utilisation métabolique des acides aminés qui la compose. Ce projet a pour objectif d’évaluer la vitesse de digestion des protéines du nouvel ingrédient à base d’insecte en suivant l’évolution de la concentration en acides aminés dans le sang, suite à un repas test contenant cet ingrédient protéique, chez le miniporc.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de cibler un ensemble de produits alimentaires dans lesquels, la farine pourra être introduite et ceci pour répondre à des besoins spécifiques. Elle va également nous permettre de préconiser la temporalité de la consommation de ce produit. En effet, l’ingrédient à tester ne répondra pas de la même manière, selon certaines conditions physiologiques et selon la cinétique d’absorption. Les résultats de cette étude permettront d’envisager les prochaines investigations pour compléter la caractérisation de l’ingrédient. Eventuellement, imaginer une étude sur modèle in vivo dans l’objectif d’étudier ses effets à plus long terme sur une situation physiologique ou physiopathologique précise. La notion de qualité protéique est aujourd’hui très recherchée par le particulier et notamment chez le sportif. Aussi on accorde également de l’importance à la qualité des protéines dans d’autres conditions, comme le vieillissement, la dénutrition, en post chirurgies lourdes. Cette première étude d’analyse de la qualité des protéines permettra de préciser les futures investigations concernant cet ingrédient.
Procédures
Chaque animal subira une seule demi-journée (3h) d’intervention chirurgicale (1h de préparation pré-opératoire, et 2 h entre l’incision cutanée et le réveil de l’animal). Une période de récupération de 15 jours est laissée pour chaque animal, entre la chirurgie et la première journée de prélèvements. Chaque animal participera au final à 3 cinétiques post-prandiales d’une durée de 7h suivie d’une période de récupération de 7 jours entre chaque cinétique. Lors d’une journée de prélèvement, les animaux recevront le matin comme seul aliment une des modalités à tester (TM, TMB ou WB). Des prélèvements de sang seront réalisés simultanément dans les 2 cathéters avant et après le repas selon la cinétique suivante : -0,5h, 0, 0,25h, 0, 5h, 1h, 1h30, 2h, 3h, 5h et 7h, soit au total 10 prélèvements sanguins en simultanés sur chaque vaisseau pour chaque animal. Pour chacune des journées de prélèvements, 2.7 ml de sang seront prélevés sur chaque cathéter selon la cinétique suivante : -0,5h, 0, 0,25h, 0, 5h, 1h, 1h30, 2h, 3h, 5h et 7h après le repas. Ce qui représente un volume total de 54 ml par cinétique (2.7 mL x 2 cathéters x 10 temps), ce qui est acceptable pour des animaux de plus de 35 kg.
Impact sur les animaux
Des douleurs abdominales peuvent être ressenties par l’animal suite à l’intervention chirurgicale. Elles peuvent se manifester dans les premiers jours suivant l’opération, mais après cette période de récupération, elles restent mineures.
Devenir
Tout les animaux seront gardés en vie dans l'objectif d'être réutilisés pour un autre projet de recherche faisant l'objet d'une autre demande d'autorisation de projet.
Remplacement
La biodisponibilité des nutriments fait intervenir de nombreux processus biologiques coordonnés et régulés, qui à ce jour ne peuvent pas être reproduits in vitro. Le porc présente un certain nombre de similitudes anatomiques et physiologiques avec l'homme. C’est la raison pour laquelle il est fréquemment utilisé comme modèle pour les études de nutrition. Le mini-porc permet de travailler sur des adultes (à stabilité pondérale) d'une taille compatible avec l'expérimentation animale. Il présente de plus l'avantage d'avoir un système digestif très proche de celui de l'Homme et d'accepter de manger tous types d'aliments.
Réduction
L'effectif prévu dans le schéma expérimental (6 animaux inclus dans le schéma expérimental) est réduit à son minimum en tenant compte de la variabilité du principal paramètre mesuré (apparition des acides aminés dans le sang), estimée à partir de nos précédentes études sur la biodisponibilité des nutriments réalisées avec un design expérimental similaire. Cette variabilité est liée non seulement de la variabilité interindividuelle des animaux, mais aussi à la qualité des prélèvements effectuées et à la précision des données obtenues par l’analyse biochimique. Ces aspects sont parfaitement maitrisés par les expérimentateurs du projet qui ont une longue expérience dans le domaine. Le fait d’utiliser un schéma expérimental en carré latin permet de diminuer significativement le nombre d’animaux utilisés (chaque animal étant son propre témoin). Après analyse de la fonction de répartition de la loi de Chi2, un nombre minimal de 6 animaux par conditions expérimentales est nécessaire pour obtenir une différence significative à 5% entre les lots sur le critère principal (biodisponibilité du fructose). 2 mini-porcs supplémentaires sont également prévus pour faire face aux aléas (mauvaise récupération chirurgicale des mini-porcs, perte précoce de perméabilité des cathéters, ...). L’approche développée sera peu invasive, et peu traumatisante pour l’animal. La douleur imposée aux animaux pendant l’expérimentation est liée à l’acte chirurgical. Les animaux recevront pendant 6 jours un traitement analgésique et spamolytique, mais après cette période de récupération, elles restent mineures. Pendant la période de récupération, les animaux sont surveillés régulièrement (visite toutes les 2 h pendant la journée). L'évaluation de la gêne et de la douleur est faite par observation du comportement des animaux : reprise de l'alimentation, du transit intestinal, posture, vocalises, réactivité et la température corporelle.
Raffinement
Les douleurs potentielles que pourraient ressentir les animaux pendant l’expérimentation sont liées à l’acte chirurgical. Celui-ci est réalisé sous anesthésie gazeuse, avec l’injection d’un dérivé morphinique avant l’incision cutanée, toutes les précautions sont ainsi prises pour éviter la douleur pendant le temps opératoire. Celle-ci peut se manifester dans les premiers jours suivant l’opération. Afin de la prévenir et de la limiter au maximum, les animaux reçoivent un traitement antalgique systématique à base d’AINS. Pendant toute la durée de l’expérimentation, les animaux sont surveillés régulièrement (visite toutes les 2 h pendant la journée). L'évaluation de la gêne et de la douleur est faite par observation du comportement des animaux : reprise de l'alimentation, du transit intestinal, posture, vocalises, réactivité et la température corporelle. Les critères d’arrêt concernent essentiellement la période de récupération post-opératoire. Si l’alimentation et le transit digestif ne sont pas normalisés au bout de 10 jours, malgré les soins apportés pour soulager la douleur et stimuler la motricité intestinale et/ou si une perte de poids supérieure à 20% du poids avant l’apparition des premiers signes cliniques d’altération de l’état physiologique est observée, nous discuterons avec le personnel de l’animalerie, afin de décider si l’animal sera soigné ou euthanasié. Pendant toute la durée de la période d'expérimentation, les animaux seront hébergés dans des cages au sol de taille réglementaire avec des copeaux de bois comme litière leur permettant de réaliser une activité de fouissage, et avec des parois latérales en plexiglass pour que les animaux puissent se voir et interagir entre eux. Leur environnement est enrichi à l’aide d’une chaîne en métal fixée sur les parois et de ballons. La pièce est à température régulée. Les animaux ont libre accès à l'eau.
Choix des espèces
Le porc présente un certain nombre de similitudes anatomiques et physiologiques avec l'homme. C’est la raison pour laquelle il est fréquemment utilisé comme modèle pour les études de nutrition. Le mini-porc permet de travailler sur des adultes (à stabilité pondérale) d'une taille compatible avec l'expérimentation animale. Il présente de plus l'avantage d'avoir un système digestif très proche de celui de l'Homme et d'accepter de manger tous types d'aliments. Ces animaux sont utilisés dans la très grande majorité des études réalisées auparavant dans notre équipe de recherche, ce qui facilite la comparaison des données issues des diverses expérimentations réalisées. La procédure expérimentale est réalisée sur des animaux en fin de croissance (âge>10 mois), afin de bénéficier d'une stabilité pondérale pendant la totalité de la période d'intervention.
Identification du rôle d’une hormone dans la « maladie du greffon contre l’hôte » chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées puis greffées par injection, pour étudier le rôle d'une hormone du fer dans la maladie du greffon contre l'hôte, complication fréquente des greffes de moelle. Le porteur indique que la maladie provoque une perte de poids, une alopécie et une desquamation de la peau, et que les souris sont mises à mort pour prélever peau, intestin et foie. Il affirme qu'il est impossible de reproduire le système immunitaire in vitro et conclut que l'expérimentation animale est un "élément clé" du projet, les retombées thérapeutiques restant formulées au conditionnel.
Objectifs
La greffe de moelle est un traitement majeur de nombreux cancers du sang. Dans certaines formes de leucémies aiguës notamment, il s’agit du seul traitement permettant potentiellement d’obtenir la guérison. L’efficacité de la greffe de moelle est limitée par les complications de ce traitement. En effet, dans près de 50% des cas, la greffe de moelle se complique d’une réaction immunitaire appelée maladie du greffon contre l’hôte. La maladie du greffon contre l’hôte est caractérisée par une toxicité de certains organes : principalement la peau, le tractus gastro-intestinal et le foie. Cette complication est parfois gravissime puisqu’elle entraîne le décès du patient dans environ 15% des cas. Il s’agit de la principale cause de décès après greffe de moelle. De manière intéressante, il a été montré que la surcharge en fer chez les patients exacerbait la maladie du greffon contre l’hôte, suggérant un rôle du fer dans la pathogenèse. L’hormone clé de régulation du fer est principalement secrétée par le foie mais peut être exprimée localement dans la peau et intestin et joue un rôle majeur dans le recrutement de cellules immunitaires. Des données montrent l’expression de cette hormone dans la peau et l’intestin de patients souffrant de la maladie du greffon contre l’hôte. Le projet visera à comprendre le rôle de cette hormone et du fer dans le développement de cette maladie.
Bénéfices attendus
Dans la peau et l’intestin, l’hormone du fer pourrait avoir un rôle inflammatoire en induisant d’une part la surcharge en fer dans les cellules de ce tissu et d’autre part en activant les cellules immunitaires. Ce projet pourrait avoir des retombées en recherche fondamentale (meilleure connaissance des processus de la GVH) mais également en recherche appliquée en proposant de cibler l’hepcidine ou le fer en thérapeutique dans cette pathologie.
Procédures
Sur animaux vigiles : - Les souris seront irradiées pendant 3 minutes 30 (quelques secondes de contention pour les placer dans les boites d’irradiation). - 3 heures après irradiation: les souris subiront une injection intraveineuse caudale (100 ul ; temps de contention de 20 secondes). - 14 jours post-greffe : prélèvement sanguin de 50 ul via la veine mandibulaire par simple contention (20 secondes) à l’aide d’une lancette. - 1 mois post-greffe : Injection sous-cutanée (100 ul Buprénorphine à 0,1mg/kg) avec une aiguille de 26G 1⁄2 (temps de la réalisation impliquant la contention: 20 secondes). 30 minutes après, sur animaux anesthésiés à l’isoflurane (1 minute par souris) à 4% avec un mélange d’air, 500ul de sang sera prélevé par voie rétro-orbitale à l'aide de capillaires héparinés (Hirschmann TM).
Impact sur les animaux
L’irradiation (sans transplantation) provoque (aux cinétiques étudiées) une rougeur de la peau. La maladie du greffon contre l'hôte va induire une perte de poids, une alopécie et une desquamation de la peau (formation « d’écailles »).
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélever la peau, l’intestin et le foie ainsi que le sang afin de mesurer différents paramètres biologiques.
Remplacement
Des tests in vitro sur des cellules de la peau ont été effectués en amont pour déterminer le rôle de l’hormone du fer dans l’inflammation. Nous avons en parallèle accés à des biopsies de patients atteints de la maladie du greffon contre l'hôte. Les modèles animaux sont utilisés ici dans le but d'obtenir un modèle pathologique proche de celui développé chez l’homme. Au cours de la « maladie du greffon contre l’hôte » de nombreuses cellules immunitaires sont impliquées et leurs interactions ont un rôle fondamental dans le développement de la maladie. De plus, cette réaction du greffon congre l'hôte est caractérisée par le déclenchement de symptômes, uniquement observables in vivo. Il est donc impossible de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes et en particulier le système immunitaire uniquement par des études in vitro. Ainsi l'expérimentation animale est un élément clé de ce projet.
Réduction
Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. L'étude statistique permet de calculer au plus juste le nombre d'animaux à utiliser.
Raffinement
La durée et la dose de traitements utilisées seront réalisées selon les protocoles préétablis et maitrisés par notre équipe. Les souris sont mises sous antibiotique pour éviter tout risque d’infection. Des analgésiques et anesthétiques seront utilisés pour le prélèvement sanguin et en cas de mal être. Les animaux sont en groupes sociaux et disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés.
Choix des espèces
Les réactions observées au cours de la « maladie du greffon contre l’hôte » chez la souris sont les mêmes que celles observées chez l'homme. Des souris adultes de de 8 à 12 semaines seront utilisées, car à cet âge, le système immunitaire est mature ce qui est indispensable à l’étude de la « maladie du greffon contre l’hôte ».
Etude pilote – Absorption intestinale et metabolisme du phosphate dans des souris CD1/129sv en situation d’insuffisance renale chronique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit deux chirurgies retirant les cinq sixièmes du rein, puis dix semaines de régime plus ou moins riche en phosphate et des passages en cage métabolique, avec un risque d'anurie, d'hypothermie, de perte de poids et de douleurs gastriques. Le porteur présente cette étude pilote comme un moyen de fixer le sexe et le nombre d'animaux d'une étude ultérieure sur des souris génétiquement modifiées. Il affirme que seul un modèle in vivo permet d'étudier la relation entre rein, intestin et vaisseaux.
Objectifs
La mortalité cardiovasculaire est la principale cause de décès dans l'insuffisance rénale chronique (IRC) à cause du développement de calcifications vasculaires (CV), facteur prédictif important de la mortalité. Lors de cette pathologie, la diminution de la fonction rénale induit la réduction de l’élimination du phosphate (Pi) (sel minéral présent dans le corps humain), cela conduit à une accumulation de cet élément dans le corps au niveau sérique. Ce phénomène est la principale cause de développement de CV. Chez un individu sain, la concentration sérique de Pi est maintenue dans la plage normale par l'équilibre entre un phénomène d’entrée au niveau intestinal et de sortie au niveau rénal, ce dernier étant donc déficient lors de l’IRC. Dans notre étude, nous nous intéressons essentiellement aux mécanismes d’entrée du Pi via le processus d’absorption intestinale et spécifiquement à celui du passage du Pi entre les cellules intestinales. De plus, malgré l’augmentation du taux sériques de Pi, le processus d’entrée reste anormalement activé, cela suggère que la détection et/ou le transport du Pi intestinal sont défectueux dans cette pathologie. Nous souhaitons donc étudier les médiateurs impliqués dans l’absorption du Pi de façon à identifier, dans le futur, des cibles thérapeutiques pour diminuer la concentration sérique de phosphate via la réduction de l’entrée de ce sel dans l’organisme. Ceci permettrait de limiter le développement de CV et donc de réduire la mortalité des patients atteints d’IRC. Nous avons récemment découvert que des souris modifiées génétiquement pour une certaine protéine : la sialoprotéine osseuse (BSP) présentent une absorption intestinale de Pi réduite, ce qui en fait un modèle intéressant pour tester le rôle de ce défaut dans le développement des CV au cours de l'IRC. Dans le futur ces souris seront étudiées et donc rendues malades via une opération d’ablation de 5/6ème des reins (néphrectomie (Nx)-laissant donc 1/6ème de la masse rénale initiale en place). De plus ces souris recevront une alimentation avec des taux de Pi normaux ou très élevés durant 10 semaines. Cependant, la présente demande concerne la mise en place d’une étude pilote préalable. Ici, nous chercherons uniquement à caractériser la réponse en termes de CV de souris contrôle néphrectomisées, en fonction de leur régime (plus ou moins riche en phosphate) et de leur sexe.
Bénéfices attendus
Sur le court terme, cette étude pilote nous permettra de savoir si les souris contrôles tolèrent bien la néphrectomie, si elles sont capables de développer des CV sous régime riche en phosphate et également si le sexe des animaux impacte leur réponse. Les résultats de cette étude pilote nous permettront d’ajuster le nombre et le sexe des animaux pour la prochaine étude.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une néphrectomie des 5/6ème (laissant donc 1/6ème de la masse rénale initiale en place), il s’agit de deux procédures chirurgicales à 1 semaine d’intervalle, et chaque chirurgie dure environ 30 minutes. Les animaux auront eu une analgésie préalable ainsi qu’une anesthésie locale et gazeuse lors des procédures : buprénorphine (injection sous cutanée de 5 secondes, 30 minutes avant le début de la chirurgie et 4 heures post-op) ; xylocaine (injection sous cutanée de 5 secondes sur le site de l'opération - 5 minutes avant la chirurgie). La couverture analgésique post-opératoire est également prévue et sera en continue et adaptée en fonction de l’étude des signes cliniques (buprénorphine avec respect du délai d'administration - délai de 4 à 8 heures). Les animaux seront ensuite placés pendant 10 semaines sous régime ± riches en phosphate. Pendant cette période, les animaux seront placés 2 fois pendant 24 heures en cage métabolique pour collecter les urines et les fèces. 6 et 2 jours avant le prélèvement sanguin terminal, les animaux recevront une injection en IP de tétracycline (marqueur de formation osseuse). Ces injections seront effectuées rapidement sur animal vigile par contention (5 seconde/animal). A la fin de l’étude, un acte de prélèvement de sang sur cœur battant va être réaliser via une ponction cardiaque (sur des animaux anesthésiés (injection en intrapéritonéale de 5 secondes- mélange de Kétamine et Xylazine)), les animaux seront ensuite euthanasiés à l’aide d’une injection d’un produit pharmaceutique (Euthasol, injection en intrapéritonéale de 5 secondes) , pour ensuite collecter les organes nécessaires aux analyses de l’étude.
Impact sur les animaux
La chirurgie peut être source de douleur, mais également la modification du régime alimentaire, les injections et le passage en cage métabolique. Les effets possibles sont : l’anurie, la perte de poids, l’hypothermie, des modifications comportementales (prostration, hypoactivité), une zone d’incision douloureuse, des douleurs gastriques (dos vouté, diarrhée). Anurie : durée post-chirurgical (environ 3h), Hypothermie : pendant chirurgie et réveil : environ 2h, Modifications comportementales : peut se déclencher pendant les 11 semaines post chirurgie, Zone d’incision douloureuse : pendant la cicatrisation post – chirurgie, Douleurs gastriques : peut arriver pendant les 10 semaines de régime.
Devenir
A la fin de la procédure expérimentale, tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements de tissu biologique et de sang.
Remplacement
Nous souhaitons investiguer la relation entre divers organes : le rein (néphrectomie), l’intestin (via l’absorption paracellulaire) et l’arche aortique/carotides (développement de CV). La relation entre ces organes va nous permettre d’étudier le métabolisme minéral et surtout celui du phosphate. Seul un modèle in vivo permet de réaliser cette étude.
Réduction
De façon à optimiser le nombre d’animaux et notamment à réduire au juste nécessaire, cette étude pilote est proposée. Ces résultats vont nous permettre de choisir le sexe des animaux utilisés pour les prochaines études (non présentées dans cette demande), et d’adapter le nombre au taux de mortalité observer ici. Après étude statistique ; il faut inclure au moins 8 animaux par groupe, mais en prenant en compte un taux de mortalité inférieur à 10% 12 semaines après néphrectomie, un nombre de 12 animaux par groupe a été jugé suffisant pour obtenir une puissance statistique robuste. Les études de cages métaboliques seront réalisées sur les mêmes animaux avant et après de façon à ce que l’animal soit son propre contrôle et donc diminuer la variabilité inter-individus.
Raffinement
Les animaux proviennent de l’élevage du laboratoire, ils sont donc habitués aux expérimentateurs et au personnel de l’animalerie, notamment via le change toutes les semaines. Les animaux sont dans la salle d’hébergement avec de la musique, un passage quotidien, ils ont également de l’enrichissement physique et sociale : cage transparente, 3-4 animaux par cage, bâtons de bois, et copeaux pour les nids. La procédure expérimentale implique la réalisation d’une néphrectomie pour induire une insuffisance rénale chronique, ce qui engendre de la douleur pour les animaux. Pour limiter le stress des autres animaux dans la salle d’hébergement, tous les animaux ayant subi l’intervention seront placés dans une autre salle d’isolement. Avant l’expérience, les animaux seront déjà placés dans cette salle pour les habituer. De plus, les souris seront entrainées à être changées via un passage dans un tube pour ne pas avoir à toucher leur dos/queue lors des changes après néphrectomie car la zone pourrait être douloureuse. Ce tube sera toujours dans la cage et constituera également un enrichissement physique. Une grille de scoring sera proposée pour évaluer le bien-être des animaux, et cette évaluation sera effectuée régulièrement. Les actes douloureux comme la chirurgie seront effectués sous anesthésie, et la couverture analgésique sera continue et suffisante durant toute l’étude. De plus, toutes les procédures chirurgicales seront réalisées par un même expérimentateur de façon à réduire la variabilité inter opération. Également, la personne choisie possède de l’expérience dans la réalisation de Nx, ce point permettra de réduire le taux de mortalité. Les animaux seront sous surveillance accrue à compter de leur chirurgie. Concernant les injections en fin de protocole de tétracycline (IP ; 30mg/kg), elles seront effectuées par un expérimentateur habilité et formé. Les animaux seront habitués à la contention 48h avant les injections pour diminuer leur stress et également pour vérifier que la contention ne génère pas de douleur au niveau des cicatrices, bien que les cicatrices soient loin de la zone d’injection. De plus, il n’y a aucun risque de toxicité car la concentration utilisée (30mg/kg) est largement en dessous de la DL50 décrite pour ce produit. L’acte de ponction cardiaque sera réalisé sous anesthésie lourde, la mise à mort sera rapide et sans douleur via l’injection d’un produit euthanasiant.
Choix des espèces
Ici, l'étude pilote est proposée sur des souris contrôles. Dans le futur (si les résultats de cette étude pilote sont concluants), une seconde étude sur des souris génétiquement modifiées sera réalisée pour une meilleure compréhension de la pathologie. Ces études sont la suite de projets portant sur l'étude du métabolisme et menées dans le laboratoire. De ce fait, nous souhaitons continuer ce nouveau projet sur le même modèle que les souris utilisées précédemment au laboratoire et nous disposons de ces modèles de souris à l'animalerie. Cette étude pilote est donc proposée sur la souris. L’induction de l’insuffisance rénale chronique via une néphrectomie des 5/6ème (laissant donc 1/6ème de la masse rénale initiale en place) est connue et maîtrisée chez la souris (plus de 200 animaux opérés, et un taux de mortalité global post opératoire faible). L’étude pilote sera menée sur des animaux âgés de 20 semaines. A cet âge, le phénotype des animaux est suffisamment établi pour obtenir des résultats représentatifs d’une population.
Rôle de la voie métabolique de la tyrosine dans la progression métastique de l’adénocarcinome canalaire pancréatique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue et toutes classées en souffrance sévère, dans des procédures impliquant une greffe de cellules cancéreuses dans la rate ou le foie sous anesthésie. Le porteur indique que ces souris sont identifiées dès l'âge de sept jours par coupure des phalanges, et que la chirurgie entraîne un stress et d'éventuelles douleurs, sutures comprises. La greffe vise à générer des métastases hépatiques pour tester un régime alimentaire et un médicament, la nitisinone, bloquant la dégradation de la tyrosine. Il affirme que le recours aux animaux est "absolument indispensable", les souris étant euthanasiées par dislocation cervicale pour autopsie.
Objectifs
Ce projet innovant a pour objectif de déterminer les changements métaboliques associés aux caractéristiques agressives et métastatiques du cancer pancréatique (ADKP). Pour répondre à cet objectif, nous avons défini et comparé le profil métabolique des métastases hépatiques (MH) associées à la tumeur pancréatique à celui de la tumeur pancréatique elle-même. Nous avons révélé que l’utilisation de l’acide aminé tyrosine est activée dans les MH par rapport à l’ADKP. Cette différence laisse envisager que l’utilisation de la tyrosine soutiendrait la survie des cellules cancéreuses au sein du tissu hépatique, lors du processus métastatique. A présent, nous souhaitons étudier le rôle de la tyrosine dans la progression métastatique de l’ADKP. Nous avons aussi démontré que les hépatocytes produisent des taux élevés de tyrosine. Cette donnée renforce l’hypothèse selon laquelle les cellules cancéreuses métastatiques s’adaptent au foie en sollicitant de manière importante l’utilisation de la tyrosine au sein du tissu hépatique pour en dériver différents composés qui lui seraient utiles. Le rôle de la tyrosine est jusqu’à présent très peu étudié dans les processus métastatiques mais représente un intérêt thérapeutique certain en laissant entrevoir son rôle dans la généralisation du cancer. Ce projet a pour but d’apporter à terme de nouvelles approches thérapeutiques aux patients à un stade avancé et métastatique de la maladie alors exclus du seul protocole curatif disponible en clinique : la chirurgie. C’est dans cette démarche préclinique que souhaitons valider notre hypothèse par l’utilisation de différents modèles de souris.
Bénéfices attendus
Ce projet par ces approches in vivo, nous permettra de valider le rôle de la voie de dégradation de la tyrosine dans le développement des métastases hépatiques associées à l’ADKP. L’inhibiteur pharmacologique de la dégradation de la tyrosine, la nitisinone, etant utilisé en clinique avec autorisation de mise sur le marché (AMM), nous souhaitons valider son utilisation dans le cadre du traitement du phénotype invasif du cancer du pancréas pour proposer un repositionnement de la nitisinone pour le développement d'une approche thérapeutique chez les patients atteints d'un cancer pancréatique métastatique. L'utilisation d'un régime pauvre en tyrosine sera une double validation de l'interêt clinique du ciblage du métabolisme de la tyrosine dans le cadre du cancer du pancréas métastatique. Ainsi, ce projet apportera à terme de nouvelles approches thérapeutiques aux patients à un stade avancé et métastatique de la maladie alors exclus du seul protocole curatif disponible en clinique : l’exérèse chirurgicale. C’est dans cette démarche préclinique que nous souhaitons valider notre hypothèse par l’utilisation de différents modèles de souris.
Procédures
Les souris sont soumises à une procédure chirurgicale de greffes de cellule stumorales dans la rate ou le foie, 1 procédure chirurgicale par souris sera effctuée. Cette procédure chirurgicale sera de 20 min maximum entre le temps d'endormissement et de réveil de l'animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances subies par les animaux sont dues tout d’abord à leur identification, à l'âge de 7 jours, par coupures des phalanges. Certaines nuisances sont aussi dues à l’acte chirurgicale qui entraîne inévitablement un stress et éventuellement des douleurs chez la souris, même si tout est mis en oeuvre au moment de la chirurgie pour les réduire. Ces nuisances sont dues i/à l’anesthésie avant l’acte chirurgical, ii/à l’injection avec des cellules tumorales au niveau de la rate et du foie pour générer des métastases hépatiques, iii/ aux sutures qui peuvent aussi entraîner une gêne, démangeaisons qui poussent l’animal à se gratter et à former des plaies au site de fermeture de la cicatrice (cette gêne disparait généralement en quelques jours). Ces douleurs post-opératoires sont minorées par une antalgie. Les nuisances liées au développement de métastases hépatiques sont : douleur, perte de poids, mobilité réduite, apparences et/ou comportements anormaux, qui indiquent une progression métastatique avancée. Notre expertise nous permet de détecter quotidiennement tout signe de douleur, d’angoisse et de souffrance de l’animal. A ce-jour, aucun marqueur de dépistage précoce de la progression métastatique de la maladie ne peut être utilisé pour ce modèle et notre infrastructure n’est pas encore pourvue d’un échographe qui permettrait de diagnostiquer les métastases et de suivre leur évolution.
Devenir
Afin d'évaluer la prise métastatique au sein du foie et de la rate en fonction des traitements administrés aux animaux, ceux ci seront euthanasiés par dislocation cervicale et autopsiés.
Remplacement
Le recours à des animaux est absolument indispensable pour mener à bien ce projet qui vise à inhiber les échanges métaboliques au sein du foie, entre les cellules cancéreuses et les hépatocytes à proximité de la métastase, en utilisant un régime alimentaire spécifique, et à observer la progression/régression des métastases hépatiques. Ce projet fait suite à plusieurs validations in vitro et ex vivo (sur cultures primaires en 2 dimensions, en organoïdes) de la pertinence de cette inhibition du dialogue métabolique entre hépatocytes et cellules métastatiques pour limiter l’expansion métastatique. Ainsi, il est à présent nécessaire de démontrer au sein d’un hôte vigile, porteur de métastases et avec des fonctions hépatiques conservées, qu’un régime alimentaire dédié permettrait de réduire la progression métastatique et d’envisager une telle approche, par régimes alimentaires spéciaux, chez des patients atteints d’un cancer pancréatique métastatique, évitant/limitant ainsi une approche thérapeutique lourde. L’utilisation d’alternatives expérimentales ne faisant pas appel à l’utilisation d’animaux sera envisagée chaque fois que c’est possible (ex : caractérisation moléculaire des hépatocytes et des cellules métastatiques après inhibition des échanges métaboliques entre les 2 types cellulaires).
Réduction
Le nombre d’animaux/groupe expérimental et par procédure expérimentale nécessaire à l’obtention d’une significativité statistique a été défini à partir du site biostatgv en déterminant : - le test statistique à utiliser : T-test ou ANOVA et test post-hoc (Tukey) en fonction du nombre de groupes expérimentaux à comparer (deux ou plus de deux, respectivement). - l’effet biologique traduisant la progression tumorale et la prise métastatique et la dispersion escomptés, cette estimation a été faite d’après les données bibliographiques et/ou les résultats antérieurs obtenus par le laboratoire - la puissance du test à 0.8 - le risque de 1ère espèce à 0.05. Ainsi, le nombre d’animaux/groupe expérimental, tel que défini au-dessus, est de : - 8 pour le groupe 1 (régime contrôle), 2 (régime nitisinone) et 3 (régime tyr-/Phe 0,25%)) des procédures 1 (greffes intraspléniques) et 2 (greffes intrahépatiques).
Raffinement
Une personne compétente (formations en expérimentation animale + chirurgie) réalisera l’implantation des cellules tumorales par chirurgie dans la rate et le foie en traitant les animaux opérés avec une injection d’antalgique (buprénorphine) en pré- et post-opératoire. Une observation quotidienne des animaux (poids, douleur/souffrance) sera faite et permettra de déceler des apparences/comportements anormaux, des signes physiologiques altérés : ces observations seront mesurées/quantifiées pour leur intensité/importance sur une échelle de 0 à 3, qui constituera un score que nous reporterons dans une grille (voir grille de score jointe). Les scores obtenus chez l’animal éveillé, après anesthésie ou au cours du développement métastatique nous conduiront à arrêter l’expérience si le score 3 a été atteint au moins une fois pour l’un des symptômes mentionnés dans cette grille. Un enrichissement matériel (twists, cocon ou nid) de l’environnement des animaux est mis en place dans toutes les cages afin qu’ils expriment un répertoire diversifié de comportements normaux.
Choix des espèces
Nous nous servirons de souris syngéniques ne développant ni tumeur primaire ni métastases de manière spontanée. Ce modèle nous permettra d’injecter en intra-splénique ou en intra-hépatique des cellules cancéreuses métastatiques syngéniques préalablement isolées du modèle murin de carcinogenèse pancréatique d’origine. Cette compatibilité immunologique entre les cellules greffées et l’hôte murin nous permettra de réaliser cette expérience dans un modèle murin immunocompétent nous évitant ainsi d’exclure la composante immunitaire requise au processus métastatique. Pour les protocoles 1 et 2, nous utiliserons des souris syngéniques de sexes indifférents, âgées d'environ 6 semaines : à cet âge les animaux sont sevrés, correspondent au stade de développement jeune adulte auquel les études de l’impact du métabolisme sur la progression métastatique ne sont pas impactées par une prise de poids ou tout autre facteur lié au vieillissement de l’animal.
Explorer les axes intestin / système nerveux autonome et central / cœur pour ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
475 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une arthrite rhumatoïde leur est induite par injection de collagène ou d'auto-anticorps, avec implantation chirurgicale d'un capteur cardiaque, échocardiographie et gavages destinés à modifier leur microbiote intestinal. Le porteur indique que les animaux implantés doivent être isolés en cage individuelle et que les injections visent à établir un "tableau clinique de polyarthrite rhumatoïde". Il affirme que l'étude des interactions entre microbiote, système nerveux et cœur ne peut se mener directement chez les patients ni sur cellules, les tissus étant prélevés après la mise à mort.
Objectifs
L'objectif de notre projet global est de comprendre les interactions entre le microbiote intestinal et le reste de l’organisme et en particulier le système nerveux autonome , le système cardiovasculaire, et l'intestin et comment elles peuvent être modulées par l’alimentation ou les probiotiques dans la polyarthrite rhumatoïde.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet seront une meilleur compréhension du rôle de microbiote intestinal dans la physiopathologie de la polyarthritre rhumatoïde et comment une modification de ce microbiote influe sur l'activité du sytème nerveux autonome et finallement sur la fonction cardiovasculaire. Cette meilleur compréhension devrait permettre d'identifier de nouveaux marqueurs de la polyarthrite rhumatöide, et d'identifier les voies impliquées dans ce processus pathologique. Ces voies indiqueront de possible cibles thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à - l'induction de l'arthrite rhumatöide par injection de collagène (injection J0, J21 et suivi sur 56 jours) en sous-cutanée sous anesthésie gazeuse ou à -l'induction de l'arthrite rhumatöide par injection d'auto-anticorps anti collagène/LPS (injection J0, J3 et suivi sur 10 jours) en sous-cutranée sous anesthésie gazeuse. Les animaux seront soumis ensuite à - la mesure de l'electrocardiogramme par télémétrie (implantations du capteurs de télémétrie sous anesthésie gazeuse) et à la mesure échocardiographique non invasive (sedation gazeuse). Les animaux seront soumis à une humanisation du microbiote intestinal par gavage. Certains animaux auront une modulation du microbiote intestinale par option thérapeutique (modulateur du métabolisme par l'alimentation ou probiotiques, médicaments ciblant les voies identifiées dans le projet).
Impact sur les animaux
Le projet nécessite l'enregistrement de l'électrocardiogramme par système holter implanté. Pour ne pas gêner les mouvements de l’animal, le capteur est implanté sous la peau au niveau du dos. Pour éviter les blessures post-opératoires entre les animaux au niveau de la suture, les animaux implantés devront être isolés en cage unique. Cet isolement et la chirurgie seront pris en compte par un suivi journalier de l'animal. Les modifications du microbiote par gavage auront un effet minime sur le bien-être animal et sont censés seulement moduler l'activité du système nerveux (rythme cardiaque). Les interventions du projet (injection de collagène ou auto-anticorps anticollagène) visent à établir un tableau clinique de polyarthrite rhumatoïde très modéré.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèver différents tissus qui seront analysés.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de développer de nouvelles approches thérapeutiques dans la polyarthrite rhumatoïde basées sur la modulation du microbiote par l’alimentation et les probiotiques et d’en évaluer les conséquences à l’échelle de l’organisme. Les approches directement chez les patients permettront de voir les effets cliniques et immunologiques mais ne permettront pas de décortiquer les effets liés au microbiote ni d’appréhender l’influence du système nerveux et des autres organes dans les effets observés. Actuellement, seul le recours aux expériences de transfert de microbiote chez l’animal in vitro permettent d’évaluer les fonctions d’un microbiote. Tous ces éléments ne peuvent absolument pas être appréhendés en dehors de modèles in vivo.
Réduction
Pour réduire la variabilité interindividuelle et donc le nombre de souris nécessaires pour démontrer un effet, nous utiliserons des lots d’animaux du même âge et du même genre au moment de l’initiation du protocole. Nous avons fait le choix de méthodes (télémétrie, échocardiographie), compatible entre elles et permettant le suivi des animaux dans le temps pour réduire le nombre de groupes utilisés et obtenir le maximum d'information sur chaque animal.
Raffinement
L'ensemble de la procédure d'implantation du capteur de télémétrie sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse. L'animal est monitoré jusqu’à son réveil complet puis placé dans une couveuse à 30°C / 3 heures en cage unique. Le jour de la procédure, des visites régulièresl sont effectuées. Des soins per- et postopératoires appropriés seront réalisés depuis l'avant réveil puis dans les 2 jours suivant l’implantation. Une grille d'évaluation clinique de l'animal permettra son suivi et le respects des points limites. A l'exception des animaux en télémétrie, les animaux seront hébergés en cage par 5 pour respecter leur caractère grégaire, avec présence d'outil de raffinement (nid en cellulose et carré de cellulose).
Choix des espèces
Le projet utilise la souris car c’est le modèle mammifère de référence pour les expériences de transfert de microbiote chez l’animal in vivo, permettent d’évaluer les conséquences fonctionnelles intégrées d’un microbiote précis. La régulation autonomique (afférences/éfférences) est similaire entra l'Homme et la souris. L'expérience du laboratoire dans le transfert de microbiote chez la souris, dans les investigations cardiaques et autonomique (HRV) permet d'éviter une mise au point/validation du protocole et la consommation d'animaux d'autres espèces pour cela. Par ailleurs, un projet connexe sur le modèle murin est déjà en cours sur cette thématique au laboratoire. Notre structure et son matériel est de plus adaptée à la souris.