Système gastrointestinal

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de gravité modérée. Rendues obèses par un régime gras, elles reçoivent un gavage quotidien, des prélèvements sanguins hebdomadaires et des prélèvements de fèces répétés, avec des risques d'irritation du larynx ou de fausse route liés au gavage et des troubles digestifs, pour tester si une bactérie intestinale réduit l'inflammation liée à l'obésité. Le porteur ne détaille aucun test comportemental. Il affirme qu'"il n'existe pas de méthode alternative", le modèle d'obésité alimentaire chez le rongeur étant présenté comme classique.

Objectifs

La littérature scientifique montre que l’obésité d’origine alimentaire est associée à une diminution de la prévalence d’une bactérie particulière du microbiote intestinal humain. De plus, il a été montré que l’obésité d’origine alimentaire provoque une inflammation systémique de bas grade, ou méta-inflammation. De précédentes études menées par une équipe de recherche ont montré que l’administration par gavage d’une souche particulière de cette bactérie permet de réduire la prise de poids de souris nourries par un régime riche en gras. L’objectif de l’étude est de déterminer si l’administration de cette bactérie permet également de réduire l’inflammation induite par l’obésité d’origine alimentaire chez des souris déjà obèses.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence les potentiels effets anti-inflammatoires de Xla1 sur l’inflammation systémique induite par l’obésité. Dans un premier temps, il permettra de déterminer si la prise de Xla1 modifie l’inflammation systémique d’une souris mince. De plus, il permettra de déterminer si, dans un contexte d’obésité, Xla1 permet de réduire l’inflammation systémique ou locale, notamment au niveau du colon.

Procédures

Les souris seront soumises à un régime normal ou riche en graisse pendant 8 semaines. Une partie des souris sera suivi pendant deux semaines, avec pesée journalière, prise de sang hebdomadaire et prélèvement de fèces 4 fois par semaine. Ces souris seront aussi gavées quotidiennement à partir d’une semaine après réception pendant une semaine. Le reste des souris sera suivi pendant 8 semaines, avec pesée journalière, prise de sang hebdomadaire et prélèvement de fèces 4 fois par semaine. Les souris seront aussi gavées quotidiennement à partir d’une semaine après réception pendant 7 semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux nourris avec un régime riche en gras pendant 12 semaines peuvent développer des effets indésirables liés à l’obésité. Notamment, un début de diabète entrainant une polyurie et/ou une polydipsie peuvent être observés. Pour le confort des animaux, la litière pourra être changée plus régulièrement et de l’eau sera à disposition ad libitum. La procédure de gavage peut entrainer des irritations du larynx ou des risques de fausse route pendant l’administration. La prise du traitement par Xla1 ou le véhicule peut entrainer des modifications du confort digestif des animaux, avec possibles diarrhées/constipations ou maux de ventre. Enfin, des saignements peuvent être observés à la suite des prises de sang.

Devenir

150 animaux sont inclus dans la procédure 1. Ces animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale : une partie 2 semaines après réception, une autre 8 semaines après réception.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à ce projet car la prévention de l'obésité d'origine alimentaire (DIO) chez le rongeur est le modèle classique pour étudier l'effet des médicaments anti-obésité. De plus, il est nécessaire d’effectuer ces expériences sur des souris déjà obèses afin d’observer un état inflammatoire induit par l’obésité et ainsi déterminer l’efficacité de Xla1 sur l’inflammation. Des expériences in vitro préliminaires ont conforté les résultats observés mais la confirmation de ces résultats sur un organisme complexe est nécessaire.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires a été déterminé grâce à des expériences préliminaires : ces expériences ont montré que 10 animaux par groupes permettaient de réaliser des tests statistiques robustes (ANOVA) notamment sur le dosage de l’IL-6. De plus, le nombre d’animaux à sacrifier en début d’expérience a été réduit par 2 : les animaux n’ayant subi aucun traitement, la variabilité entre les souris sera réduite et permettra un test statistique robuste malgré un échantillon réduit. L’expérience sera répétée 3 fois pour confirmer les résultats.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bien-être (en groupe). Notamment, pour leur confort, les animaux obèses seront hébergés par 2 ou 3 maximum, et les animaux minces par 5. Les cages seront agrémentées d’un milieu enrichi avec des tunnels en carton, dômes et bâtonnets permettant la création de nids afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Les prises de sang submandibulaires seront réalisées sur des animaux vigiles. Pour leur confort et réduire le stress, les tentatives de piqûres seront réduites au minimum (deux tentatives maximum). L'inconfort et la souffrance seront limités grâce à l'utilisation d'un tableau de score, permettant l'établissement de points limites et la mise en place de mesures adaptées aux événements rencontrés (ex. injection d'anti-inflammatoire, utilisation de crème cicatrisantes, enrichissement des cages, adaptation de la nourriture).

Choix des espèces

Nous utiliserons les souris C57Bl/6 pour cette expérimentation. Le comportement alimentaire, la balance énergétique et le métabolisme glucidique et lipidique sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. De plus, ces souris possèdent un système immunitaire fonctionnel permettant d’étudier les effets de l’inflammation induite par l’obésité. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 18 et 20 semaines) car le développement des organes sera terminé. De plus, il est nécessaire que les souris soient au moins nourries 12 semaines avec un régime riche en gras afin de pouvoir observer l’établissement de l’inflammation induite par l’obésité. Chez le fournisseur, après 6 semaines de croissance, les souris seront donc nourries au moins 12 semaines avec un régime riche en gras. Les souris contrôles seront sélectionnées parmi la fratrie des souris obèses et seront nourries à partir de 6 semaines et pendant la même durée que les souris obèses avec une alimentation standard. Toutes les souris seront donc âgées de 18 à 20 semaines lors de leur réception et du début de la procédure.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée. Elles subissent un protocole de stress chronique léger, confinement et inclinaison de la cage répétés, censé induire une anxiété transitoire, pour mesurer l'effet du stress de l'hôte sur le transfert de gènes de résistance aux antibiotiques dans le microbiote intestinal. Le porteur décrit des nuisances minimes tout en classant les procédures en gravité modérée, et ne détaille comme test comportemental qu'un open field. Il affirme que le remplacement "n'est pas possible" car les effets du stress dépendraient de processus physiologiques que seuls des modèles in vivo permettraient d'appréhender.

Objectifs

Le microbiote intestinal est un écosystème microbien complexe dont l'équilibre et l'homéostasie sont entretenus par un afflux constant de micro-organismes commensaux. Sa composition est affectée à la fois par des facteurs intrinsèques tels que la génétique de l'hôte, et des facteurs extrinsèques comme les médicaments ou l'alimentation. De récents travaux, ont également montré que le stress de l’hôte, aigu ou chronique, pouvait avoir des effets profonds sur la composition et l'organisation du microbiote intestinal. Ces modulations peuvent être la conséquence soit de l'action directe des médiateurs du stress libérés dans la lumière intestinale sur les bactéries in situ, soit des modifications de la physiologie intestinale induite par le stress. Le microbiote intestinal est par ailleurs un réservoir majeur de gènes de résistance aux antibiotiques (ARG) dont la dissémination pourrait également être influencée lors d’un stress de l’hôte. En effet, le microbiote intestinal représente un milieu extrêmement propice aux transferts de gènes de résistance entre bactéries dû à la grande diversité d’espèces incluant des souches résistantes aux antibiotiques, et un dialogue permanent entre les bactéries. En cas d’un stress de l’hôte, les bactéries constituant le microbiote vont se retrouver au contact de concentrations croissantes de marqueurs de stress (noradrénaline, glucocorticoïdes) provoquant des modifications de croissance et de virulence de certaines espèces. De plus, des données in vitro ont démontré que la noradrénaline stimulait le transfert de gènes entre deux souches bactériennes. Cet effet est inhibé par l’ajout dans le milieu de culture d’inhibiteurs de la noradrénaline. L’ensemble de ces observations suggère que le stress de l’hôte pourrait impacter la fréquence des transferts de gènes dans l’intestin, notamment des ARG, dans un contexte mondial préoccupant quant à l’expansion considérable des bactéries multi-résistantes. A l’heure actuelle, cette observation n’a pas été confirmée in vivo et nous souhaitons explorer cette hypothèse et évaluer la fréquence de transferts de gènes dans un modèle murin de stress léger chronique.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus ici permettront de conclure quant à la nature de l’effet d’un stress chronique vis-à-vis des transferts de gènes au sein du microbiote. Ces résultats seront donc tout à fait novateurs. Ces données permettront d’apporter un éclairage sur le rôle des facteurs liés au stress dans l’adaptation et l’évolution de l’écosystème digestif et notamment la mobilisation des gènes de résistance aux antibiotiques au sein du réservoir intestinal, ouvrant ainsi de nouvelles pistes de réflexion quant à la lutte contre la résistance aux antibiotiques. Dans le cas où une stimulation de ces transferts est observée, nous envisagerons de caractériser ultérieurement les voies impliquées dans ces phénomènes.

Procédures

Le protocole d'induction de stress chronique léger est basé sur l'utilisation de facteurs de stress sociaux et environnementaux. Aucun d'entre eux ne peut être considéré comme inducteur de douleur. Ce protocole de stress est léger car il y a des périodes pendant lesquelles l’animal n’est pas soumis à des stress et d’autre part ou il est exposé plusieurs fois dans la même semaine aux mêmes facteurs stressants (confinement, inclinaison de la cage). L’exposition répétée aux mêmes facteurs de stress donne généralement lieu à une habituation.

Impact sur les animaux

Aucun signe de douleur ou de détresse (telles qu’une position voutée, prostration, toilettage anormal (absent ou excessif) n’a été mis en évidence avec ces séquences comportementales sur 21 jours. Ce protocole de stress chronique entraîne l’apparition de traits d’anxiété mis en évidence en openfield. D’autres études montrent une disparition de l’anxiété et une récupération d’un état normal quelques jours après l’arrêt du protocole de 21 jours. Tous ces éléments indiquent qu'aucun effet indésirable n'est attendu. La seule nuisance attendue est une anxiété, induite par le protocole de stress chronique mais elle est transitoire.

Devenir

N/A

Remplacement

Les données in vitro de la littérature montrent un lien entre des molécules telles que les glucocorticoïdes, induites par le stress chronique, sur le transfert de gènes dans une souche bactérienne précise. Néanmoins, ces expériences ne prennent pas en compte la complexité du microbiote intestinal. De plus, le protocole d’induction du stress chronique léger comprend un ensemble de facteurs sociaux et environnementaux plus proche de la réalité physiologique que les modèles in vitro. Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est donc pas possible dans ce contexte. En effet, les effets du stress chronique léger dépendent d’interactions cellulaires, de processus physiologiques et de l’état de l’être vivant. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé que par l’utilisation de modèles in vivo.

Réduction

L'effectif total des animaux de ce projet a été déterminé par une analyse statistique permettant la réduction maximale du nombre de sujets inclus tout en garantissant une fiabilité forte des résultats qui seront obtenus dans ce projet.

Raffinement

Les cages seront munies d’éléments d’enrichissement (buchettes, sizzlenet), permettant d’offrir aux animaux la possibilité d’évoluer en espaces clos, type de milieu préférentiel chez des rongeurs. L’état des animaux sera évalué quotidiennement par observation de tout comportement pouvant suggérer la présence de mal être chez les animaux de cette étude.

Choix des espèces

Des études récentes ont validé les effets de la procédure de stress chronique léger de 3 semaines sur des souris C57BL/6J. En effet, celui-ci induit une augmentation des glucocorticoïdes sanguins (marqueur du stress) et un phénotype anxieux (openfield). De plus, les expériences précédentes du laboratoire sur le transfert de gènes d’une bactérie donneuse au microbiote intestinal ont été optimisées sur les souris mâles C57BL/6J de 8 semaines. En particulier, la dose de bactéries donneuse capable d’induire une bonne implantation de la souche en 21 jours a été déterminée dans des souris C57BL/6J non soumises au stress. Pour toutes ces raisons, nous utiliserons le modèle murin C57BL/6J dans cette étude.

7 200 larves de poissons zèbres vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime enrichi en graisse pendant huit jours puis une exposition à des polluants, benzo[a]pyrène ou pyrène, pendant sept jours, pour reproduire une maladie du foie gras et ses atteintes cérébrales. Le porteur décrit une nage plus faible ou anarchique comme effet attendu et renvoie au conditionnel un éventuel intérêt chez l'Homme. Il présente le poisson zèbre comme une alternative au modèle rongeur tout en jugeant l'expérimentation animale "indispensable".

Objectifs

Les maladies non-alcooliques du foie (i.e. NAFLD: non-alcoholic fatty liver disease) sont devenues une priorité de santé publique à cause de leur prévalence grandissante (25% de la population générale et plus 70% des personnes obèses). Elles débutent avec la stéatose hépatique (foie gras), stade bénin, qui peut progresser vers la stéatohépatite ou NASH (non-alcoholic steatohepatitis), propice au développement des cirrhoses et cancers du foie et qui peut avoir des répercussions au niveau du cerveau avec le développement d'encéphalopathies. Bien que les causes/mécanismes de cette progression pathologique restent à clarifier, l’exposition aux polluants environnementaux comme les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs) est identifiée comme un facteur de risque. L’un de mécanismes suspectés fait intervenir les vésicules extracellulaires comme un moyen de communication crucial participant aux échanges entre le foie et le cerveau et favorisant la progression de ces maladies et l’apparition de dommages aux niveaux de ces organes. Il apparait donc important d’évaluer le rôle de ces vésicules dans ce contexte de NAFLD et d’exposition aux HAPs et en particulier sur les dommages hépatiques et cérébraux. Etant donné la nature complexe de ces pathologies qui dépendent des interactions étroites entre différents organes, dont le foie et le cerveau, et différents types cellulaires, il est indispensable d’avoir une approche intégrative uniquement retrouvée dans les modèles in vivo. Ainsi, nous mettrons en place une approche expérimentale sur un modèle de poisson-zèbre afin de comprendre le rôle des vésicules extracellulaires dans la progression des NAFLD induite par une exposition aux HAPs.

Bénéfices attendus

Cette phase d'expérimentation in vivo devrait permettre de confirmer le rôle des vésicules extracellulaires dans les effets néfastes d'une exposition à un polluant de l'environnement (benzo[a]pyrène ou pyrène) dans les maladies du foie et les dommages cérébraux associés. En outre, l'étude des potentiels effets protecteurs de molécules capables de réduire la production ou la capture de ces vésicules dans le cadre de ces pathologies pourra être une preuve de concept pertinente et permettre d'envisager d'autres études pour une éventuelle utilisation chez l'Homme.

Procédures

Alimentation avec un régime enrichi en graisse (8 jours) Exposition à des polluants de l'environnement (7 jours)

Impact sur les animaux

L'objectif de ce projet est d'étudier l'apparition et la progression de pathologies hépatiques avec des complications au niveau du cerveau. On s'attend donc à un impact sur la santé des poissons : développement d'une steatohépatite et peut-être le développement des premiers signes d'une encéphalopathie hépatique. Cependant cet impact restera modèré puisque qu'à ce stade de maladie, aucun signe de souffrance ne devrait se manifester mais il se pourrait que le comportempent des poissons soit légèrement altéré (nage plus faible ou anarchique; recherche alimenataire plus lente).

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin d'obtenir suffisamment d'échantillons biologiques pour réaliser les expériences envisagées et garantir au maximum l'obtention de résultats significatifs.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est indispensable à l’atteinte des objectifs du projet (3R : Remplacement) puisqu’il s’agit d’étudier le rôle des vésicules extracellulaires, un moyen de communication entre cellules et organes et qui circulent dans le sang. En particulier, l’un des objectifs de ce projet est d’évaluer si des vésicules émises par le foie peuvent induire des dommages au niveau du cerveau. Dans ce contexte, seul l’utilisation de modèles animaux permet d’appréhender la complexité de ces relations entre cellules et organes. Toutefois, l’utilisation du modèle poisson-zèbre reste une alternative au modèle rongeur dans le contexte de l’étude du rôle des vésicules extracellulaires dans les effets délétères des NAFLD.

Réduction

Les plans d’expérimentations ont été réalisés de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en vue de l’obtention de résultats significatifs et d’éviter les réplicats inutiles. En effet, de par l’expérience que nous avons de ce modèle et des expériences que nous voulons réaliser, nous avons pu déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser pour obtenir des résultats significatifs et reproductibles malgré la variabilité liée à l’expérimentation animale.

Raffinement

Les études seront conduites dans le respect des normes les plus strictes en matière de soins des animaux et d’évaluation de la souffrance animale (suivi d’une grille d’évaluation de la souffrance adaptée au modèle). Les animaux seront maintenus dans des installations modernes et agréées pour assurer un confort maximal aux animaux (qualité de l’eau, accès à la nourriture, température, cycle jour/nuit, nombre de poisson par bac…). Si une souffrance excessive venait à être détectée, quelle qu’en soit la cause (hébergement, manipulation, impact des traitements), les expérimentations concernées seront arrêtées et les procédures seront révisées (modifications des conditions d’hébergement, réduction des doses d’exposition aux agents toxiques…). Tout le personnel impliqué dans le travail des animaux a suivi une formation conformément aux réglementations institutionnelles et aux lois nationales relatives à la protection des droits des animaux.

Choix des espèces

Ce projet vise à évaluer l’impact des HAP sur l’appartion et la progression des NAFLD (maladies du foie allant de la stéatose vers un état pathologique, la stéatohépatite et qui peut se traduire également par complication au niveau cérébral). Le modèle de poisson zèbre se positionne comme un modèle d’étude intermédiaire entre les modèles in vitro et les modèles murins et ainsi à l’avenir limiter l’utilisation de ces modèles mammifères. Le modèle zebrafish possède, en effet, de nombreux atouts : une grande similitude physio-pathologique avec l’Homme notamment concernant le foie et les NAFLD (types cellulaires et métabolisme) mais également au niveau de la neurotoxicité ; une grande sensibilité dans la réponse aux agents hépatotoxiques et aux perturbateurs endocriniens ainsi que des avantages méthodologiques (transparence des larves permettant l’observation directe d’organes internes). Les animaux seront utilisés, après éclosion, au stade larvaire entre 4 et 12 jours post-fertilisation. En effet, à partir du 4ème jour, les larves présentent un foie fonctionnel et sont capables de se nourrir de l’alimentation apportée : 2 éléments essentiels à ce projet. D’autre part, de nombreuses études ont montré qu’à cet âge, les larves de poisson-zèbre pouvaient être utilisées comme modèle pour tester la toxicité d’agents chimiques au niveau du foie ou étudier le développement des NAFLD (induite par l’alimentation notamment) mais également pour évaluer la neurotoxicité de différents traitements.

1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intra-péritonéales répétées, jusqu'à seize semaines pour certaines, et un régime provoquant une accumulation de graisses dans le foie, pour tester un inhibiteur de l'autophagie contre la toxicité hépatique. Le porteur indique que l'induction de la toxicité peut provoquer douleurs abdominales, fatigue et diarrhée. Il juge "indispensable" le recours à l'animal vivant, la complexité de la toxicité hépatique étant selon lui impossible à reproduire in vitro.

Objectifs

L’autophagie (AP) est un processus physiologique qui régule l’homéostasie cellulaire. L’AP est aussi un mécanisme d’adaptation cellulaire en condition de stress et son absence est souvent observée dans des maladies neurodégéneratives et cancers. On connaît les effets bénéfiques de l'augmentation du flux autophagique dans différentes pathologies, notamment les maladies du foie. L’objectif de ce projet est de déterminer l’implication de ce processus dans la prévention et le traitement de la toxicité hépatique chez des modèles murins appropriés.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique une nouvelle stratégie thérapeutique pour palier à la toxicité hépatique, qui entraîne un déclin progressif de la fonction hépatique, la fibrose, la cirrhose et souvent un carcinome hépatocellulaire.

Procédures

Tous les animaux du projet seront soumis à des injections intra-péritonéales (i.p). Les injections i.p. ne provoquent pas de symptômes majeurs et seront effectués sur l’animal vigile par du personnel formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Selon les différentes procédures du projet : (i) les animaux seront euthanasiés 6h et/ou 24h après le traitement (3/4 injections totales); (ii) les injections hebdomadaires dureront 16 semaines ; (iii) les animaux seront soumis à un régime alimentaire (de 4 semaines) permettant l'accumulation de triglycérides et cholestérol, mais qui n'est pas un régime alimentaire obésogène. Les traitements i.p. seront journaliers jusqu’à 6 semaines. La durée de chaque injection sous-cutanée et intra-péritonéale est de quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les procédures de ce projet prévoient seulement des injections intra-péritonéales. Les injections intra-péritonéales ne provoquent pas de symptômes majeurs et seront effectués sur l’animal vigile. Des douleurs abdominales, une fatigue, une diarrhée peuvent survenir lors des procédures d’induction de la toxicité hépatique.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, les conséquences et les effets sur l’organisme de la toxicité hépatique vu sa complexité.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 1440 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs tests statistiques seront utilisés pour les analyses pour comparer les divers groupes de traitements.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, analgésie des animaux, utilisation de tapis et lampes chauffantes, ...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont jointes chirurgicalement deux par deux par parabiose, opération d'environ 45 minutes créant une circulation sanguine commune, puis reçoivent des injections et des prélèvements de sang au sinus rétro-orbital sous anesthésie. Le porteur décrit un protocole "parfaitement maîtrisé" et une "absence de signes quantifiables de souffrance". Il étudie la circulation de cellules immunitaires liées à l'asthme et renvoie les applications thérapeutiques au long terme.

Objectifs

Le système immunitaire permet de se défendre contre les agressions des pathogènes, mais sa dérégulation est aussi impliquée dans le développement diverses maladies telles que l’asthme. Le système immunitaire est partagé en deux grandes parties : la partie innée, préexistante, et reconnaissant des caractéristiques partagées entre différents pathogènes, et la partie adaptative, qui comme son nom l’indique s’adapte en fonction du pathogène rencontré, par des jeux de sélection et de prolifération de cellules extrêmement spécifiques du pathogène en question. Les cellules innées de groupe 2 (ILC2s) sont des lymphocytes innés résidents des tissus (poumons/intestin). Elles participent à la défense contre les parasitique, à la réparation tissulaire mais aussi aux processus physiopathologiques comme l’asthme. Les ILC2 se développent dans la moelle osseuse puis se maintiennent à long terme dans les tissus, avec la capacité de proliférer et répondre in situ en cas d’inflammation. Des résultats récents indiquent cependant qu’il existe des sous-populations ILC2s circulantes stimulées par l’inflammation et impliquées dans le maintien de l’intégrité d’un tissu, selon un axe intestin-poumon et/ou axe moelle osseuse-poumon. La fonction de ces ILC2s est encore peu connue (inflammation/régénération). Seules des expériences de parabioses peuvent permettre dans un même tissu de différencier les cellules ILC2s circulantes du sous-groupe des cellules résidentes. Les objectifs du projet sont donc 1- de déterminer les situations inflammatoires qui aboutissent à une circulation d’ILC2 2- comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans cette circulation 3- déterminer le stade de développement auquel les ILC2s circulent (progéniteur ou cellule mature) 4- déterminer l’importance physiologique de ce recrutement sur la situation inflammatoire et la régénération tissulaire. Cliniquement, il est important de comprendre ces processus car dans les cas d’allergies et asthme, la présence d’ILC2 en circulation corrèle avec une évolution défavorable ; déterminer leur rôle et mode de migration nous permettra d’envisager de bloquer leur migration chez les patients à risque.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet scientifique permettra de comprendre ce qui régit la circulation des ILC2 en détaillant les mécanismes moléculaires mis en jeu par cette population pour se propager dans les tissus en inflammation. Le mode de circulation de populations cellulaires initialement considérées comme résidentes est encore peu compris mais des données préliminaires indiquent que leur rôle serait crucial pour obtenir une réponse adaptée du tissu. A long terme, ces données moléculaires de la circulation de sous-populations d’ILC2s pourrait représenter une source importante de moyen d’actions supplémentaires pour lutter contre les crises d’asthme ou d’allergies non résolues par les corticoïdes. Ces cas sont nombreux et en constante augmentation au vu du nombre croissant d’allergies dans le monde. Il est clairement établi que ces ILC2 seraient « trop » inflammatoires dans le cas d’inflammation chronique de type 2 et donc qu’un moyen d’empêcher la mise en place d’un recrutement constant de cellules supplémentaires dans les voies aériennes des patients pourraient représenter une chance thérapeutique de deuxième intention.

Procédures

• Chirurgie de parabiose : 1 chirurgie par animal, environ 45 minutes d’anesthésie générale • Prélèvements de sang au sinus rétroorbital sous anesthésie, 1 fois 5 minutes. Si le chimérisme n’est pas effectif, les animaux pourront être prélévés de la même manière à 4 semaines et à 6 semaines • Des injections de molécules non toxiques seront réalisées dans l'abdomen des animaux anesthésiés à raison de 3 à 7 fois sur une semaine. Des administrations de molécules non toxiques seront réalisées en intranasale sur des animaux anesthésiés à raison de 2 à 3 fois. Pour ces interventions les anesthésies sont de l’ordre de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Le protocole de parabiose est parfaitement maîtrisé dans notre laboratoire tant au niveau réalisation qu'au niveau de la gestion de l'analgésie pré et postopératoire avec une absence de signes quantifiables de souffrance animale, sans réduction de la mobilité. Injections de cytokines et d’anticorps antagonistes. Toutes les injections sont réalisées par voie intrapéritonéale ou intranasale après anesthésie des animaux en utilisant l’isoflurane, le dépôt dans la première narine est réalisé en sortant la souris une minute de la chambre à induction suivi d’un retour et du dépôt dans la seconde narine de façon identique. Ces injections n’induisent pas de douleur perceptible chez les animaux traités (pas de perte de poids, pas de changement de comportement alimentaire, pas de perturbation du comportement social ou nerveux (mobilité, interactions, agressivité ou prostration).

Devenir

les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Aucune data préliminaire in vitro ne peut être réalisée pour motiver cette étude de circulation. La présence d’une fréquence de cellules ILC2s non négligeable dans le sang de patients asthmatiques contrairement aux contrôles sains est une motivation importante pour décider de comprendre ce qui génère des cellules circulantes à partir de populations résidentes et le mécanisme de circulation mis en place. La circulation des populations immunes à travers les différents organes est très contrôlée. Les cellules passent par une circulation sanguine et lymphatique qui sont des environnements complexes et impossible à mimer sur des tests in vitro. Afin de pouvoir conclure sur des fonctions différentielles de nos cellules circulantes versus celles résidentes et de comprendre les mécanismes moléculaires en jeu, les expériences in vivo sont absolument essentielles et aucun système in vitro n’existe pour obtenir des résultats préalables.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires, l'étude des mécanismes moléculaires (anticorps bloquants) ne sera réalisée que si le taux circulation des ILC2s est significativement différent entre les conditions testées. De plus, les données de la littérature et celles déjà générées au laboratoire nous permettent de limiter le nombre d’hypothèses à tester. Enfin, le nombre de souris à utiliser a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Seulement dans les conditions adéquates où l'augmentation du taux circulant des ILC2s est validé, une étude du blocage des molécules de circulation se fera par l’injection des anticorps bloquants. Nous vérifierons ainsi en étudiant le tissu cible si les populations ILC2s bloquées avaient plutôt un effet inflammatoire ou réparateur. Appliquer les bloquants uniquement dans le cas d’une circulation statistiquement signifiante permet de réduire les effectifs requis et visera à réduire le nombre de souris nécessaires pour maintenir une interprétation biologique robuste.

Raffinement

Les animaux seront manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences afin de les habituer et de limiter leurs stress. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement lors de la première semaine post-chirurgie, puis deux à trois fois par semaine afin d’assurer leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress. Une grille de score a été établie afin d’évaluer régulièrement la souffrance des souris, et des points limites ont été définis. Une fiche d’observation tout au long des procédures permettra de vérifier leur état (pelage, poids, respiration, mobilité…) et des scores seront tenus afin de vérifier que le traitement n’induit pas de modifications des habitudes et du bien-être animal. En cas de changement des scores, des points limites sont établis (perte de poids rapide, modification aspect pelage/alopécie, déshydratation, changement de consistance/couleur des selles) et le suivi rapproché des animaux permettra de définir s’il est nécessaire de - diminuer la dose et/ou d’administrer des antalgiques selon la gravité des changements de comportement. Ces conditions s’appliquent à toutes les procédures.

Choix des espèces

Une circulation d’ILC2s chez l’homme est corrélée à la sévérité des allergies/crises d’asthme. La souris est un modèle de choix par la forte similitude des systèmes immunitaires humains/murins. Elles sont les plus facilement manipulables (chirurgie ici et génétiquement modifiées) pour comprendre la circulation (système sanguin/lymphatique et production des cellules immunes). Nous avons besoin de travailler avec différents types de souris depuis longtemps utilisées dans les laboratoires et qui ne présentent pas de signe de souffrance. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (6 à 10 semaines après la naissance, afin d’avoir un système immunitaire mature). Nous n’attendons pas d’effet lié à l’âge des souris. Cependant, des animaux plus âgés ont aussi une peau plus épaisse. Nous éviterons donc de les utiliser.

256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par dislocation cervicale, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour inactiver le gène CAR, elles sont nourries pendant 40 semaines avec un régime gras induisant obésité et troubles métaboliques, avec trois prélèvements de sang à la joue, un gavage de FITC dextran et des prélèvements à la queue pour mesurer la perméabilité intestinale. Le porteur décrit une obésité et une intolérance au glucose provoquées "sans souffrance visible", et renvoie les retombées pour les patients, un meilleur ciblage des médicaments, au conditionnel. Sur le remplacement, il affirme que l'étude de l'axe intestin-foie impose un "organisme entier" et conclut à la "nécessité" de la souris.

Objectifs

Le syndrome métabolique touche actuellement 18% des habitants en France. Au niveau du foie, les complications de ce syndrome se caractérisent par une accumulation de graisses dans l'organe, puis peuvent évoluer vers des stades plus avancés d'inflammation, de fibrose et de dysfonction du foie. Ces maladies représentent maintenant la deuxième cause de transplantation de foie et il n'existe pas de traitement de référence contre ces pathologies. Dans ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur le rôle d'une protéine (le récepteur nucléaire CAR (Constitutive Androstane Receptor)) dans le développement de ces maladies chroniques du foie. Ce recepteur est impliqué dans le maintien des fonctions de détoxification et de métabolisme lipidique du foie et des études préliminaires montrent que son expression est très diminuée dans les maladies métaboliques du foie. Cependant, son rôle dans l'avancée de la pathologie est inconnu. Ainsi pour cette étude nous utiliserons des souris dont le gène CAR a été invalidé et nous les nourrirons avec un régime induisant une obésité et une pathologie hépatique mimant celle observée chez l'Homme. Nous étudierons le rôle de la protéine CAR dans le dialogue entre l’intestin et le foie lors de ce régime. Les institutions internationales recommandent de prendre en compte l’effet du sexe dans le métabolisme énergétique puisqu’il existe chez l’Homme un fort dimorphisme sexuel. Nous étudierons donc le rôle de CAR dans les 2 sexes.

Bénéfices attendus

Avec ce projet nous souhaitons approfondir les connaissances sur le rôle de CAR dans le développement des maladies chroniques métaboliques du foie, pour pouvoir par la suite proposer des stratégies thérapeutiques chez l'Homme. En effet, il n'existe à ce jour aucun traitement de référence pour les patients atteints de ces maladies, qui représentent actuellement la 2e cause de transplantation de foie dans le monde. De plus, ces maladies touchent particulièrement les hommes. Ainsi, nos études permettront de mieux cibler les médicaments nécessaires à chaque sous-catégorie de patients, notamment en fonction de leur sexe.

Procédures

Ainsi, les animaux transgéniques seront exposés à un régime riche en graisse pendant 40 semaines, à 3 prélèvements de sang à la joue (représentant moins de 10% de leur volume de sang total) espacés chacun de 10 semaines. Les animaux seront soumis également à un jeûne de 6 heures, à un gavage oral de FITC dextran ainsi qu'à un prélèvement d'une goutte de sang d'environ 5 microlitres à la queue pour chaque mesure de la perméabilité intestinale in vivo qui seront faite 2 fois au cours de l’expérimentation chacune espacée de 14 semaine.

Impact sur les animaux

Les régimes WD et HFD vont induire une obésité chez les animaux, ainsi que les perturbations métaboliques généralement associées à l'obésité: intolérance au glucose (diabète), accumulation de triglycérides dans le foie, augmentation de la perméabilité intestinale, sans souffrance visible des animaux, ni changement drastique de leur comportement. Le seul effet indésirable provoqué par le prélèvement à la joue et l'administration orale du FITC dextran est le stress lié à la contention.

Devenir

A l'issu de la procédure tous les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale.

Remplacement

L’utilisation d’animaux de laboratoire entier est nécessaire car le projet implique le dialogue entre organes, en particulier entre le foie et l'intestin. Pour étudier l'interaction entre l'alimentation et le microbiote intestinal, ainsi que les voies moléculaires impliquées dans l'axe intestin-foie, l'utilisation de souris de laboratoire est appropriée avec la possibilité d'utiliser des animaux génétiquement modifiés. L'étude spécifique de l'axe intestin-foie justifie l'utilisation d'expériences in vivo car l'étude in vitro de lignées cellulaires clonales ne permet pas d'examiner les interactions complexes entre les différents compartiments et organes qui composent l'axe intestin-foie intact.

Réduction

Nous avons soigneusement conçu les expériences pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs. Un nombre suffisant de souris sera utilisé dans toutes les expériences afin d'observer des effets biologiquement pertinents et statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux a été déterminé par un calcul de puissance et basé sur les résultats antérieurs d'études similaires. Voici les résultats d’une étude de pouvoir statistique basée sur nos résultats préliminaires de mesure d'alanine aminotransférase (ALAT marqueur utilisé en clinique pour évaluer les dommages hépatiques) obtenus sur des souris C57bl6/j sous régime CD versus WD. Variation minimale d’intérêt (Δ): ~50%. ALAT initiales CD : 200 U/L, ALAT WD: 324 U/L, écart type moyen 120 U/L. Calcul du nombre d’animaux (n) nécessaire pour un risque α de 5% avec une puissance de 80% n=16. Le nombre idéal d’animaux par lots est donc de 16.

Raffinement

Le milieu d’élevage des souris est enrichi d’un abri en inox permettant aux souris de s'isoler de leurs congénères si besoin. Pour limiter le stress, les animaux sont manipulés régulièrement et habitués à la contention. Nous procèderons également à une surveillance accrue des souris (toutes les heures le premier jour puis 2 fois par jours pendant 1 semaine) après chaque prélèvement à la joue et également après chaque mesure de la perméabilité intestinale. Concernant la gestion de la douleur nous appliquerons un analgésique local EMLA 5% sur le bout de la queue avant incision à l’aide d’un scalpel 1heure avant chaque intervention, lors de mesure de la perméabilité intestinale. Pour le prélèvement à la veine porte et à la veine cave on réalise une pré-médication avec une injection intrapéritonéale de Xylazine à 10 mg/kg est effectuée par voie intra-péritonéale afin d’induire l’analgésie des animaux. Ensuite après 2 minutes, on débute l'anesthésie avec 4% d'isoflurane dans une cage à induction volatile. L'anesthésie est maintenue sous masque pendant le prélèvement. Le contrôle de l’efficacité de l’anesthésie est fait par vérification du réflexe de retrait à la patte. Pour l'évaluation de la souffrance, de la détresse et de l'inconfort des animaux, des points limites gradés seront mis en place basés sur l'évaluation de cinq aspects de l'état de l’animal: variation du poids de l'animal (et variations connexes au niveau de l'ingestion de nourriture et d'eau); apparence physique externe; signes cliniques mesurables (ex.: changements du rythme cardiaque, du rythme respiratoire et de la nature de ceux-ci); changement dans les comportements non provoqués; et, réponses comportementales aux stimuli externes. Pour chaque catégorie, un système d'évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) est proposé. L'indice cumulatif obtenu en ajoutant les valeurs de chacune des catégories indique chez l'animal une déviation croissante par rapport à la normale qui peut être interprétée comme étant une indication de souffrance et/ou de détresse croissante. Ainsi si un animal présente un score de 3 après évaluation de ces 5 critères, le critère d’arrêt sera atteint et l’animal sera retiré de l’expérimentation.

Choix des espèces

Nous souhaitons étudier le rôle du récepteur CAR dans la stéato-hépatite non alcoolique, pathologie qui met en jeu le dialogue entre plusieurs organes (tissus adipeux, intestin foie) ainsi il est impossible d'étudier cette pathologie via l'utilisation de modèles cellulaires. C'est la raison pour laquelle nos études nécessitent un organisme entier. De plus, nous souhaitons étudier le rôle du récepteur CAR dans la stéato-hépatite non alcoolique, ainsi nous utiliserons un modèle murin C57Bl6j déficient pour le récepteur CAR au niveau systémique ces modèles existent uniquement chez la souris. Nous utilisons uniquement des souris adultes car il est nécessaire que la fonction hepatique ait pleinement atteint sa maturite physiologique. (7 semaines minimum)

2 530 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections d'adénovirus sous anesthésie, subissent des changements de régime et des jeûnes répétés dont un jeûne intermittent de deux semaines, des injections d'insuline et une incision de la queue pour prélèvements sanguins. Cette recherche fondamentale sur le métabolisme du glucose, le diabète et la stéatose hépatique mobilise un effectif de plus de deux mille cinq cents animaux. Le porteur affirme que le modèle animal est "indispensable" pour étudier la régulation de la glycémie de manière intégrée.

Objectifs

Des perturbations du métabolisme du glucose pourraient jouer un rôle important dans des pathologies humaines comme le diabète de type 2. Ce projet nous conduit à nous focaliser sur deux cibles moléculaires. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer les contributions de ces deux cibles moléculaires et des protéines produites dépendantes de ces cibles et pouvant signalées dans d’autres tissus, au maintien des fonctions hépatiques et de l’homéostasie glycémique et lipidique.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de comprendre les mécanismes impliqués dans le développement de l'insulinorésistance et de la stéatose hépatique. Très peu de molécules pharmacologiques sont développés pour réverser la stéatose hépatique. Nos recherches en modulant les acteurs moleculaires clefs de la voie d'utilisation du glucose

Procédures

Une partie des animaux subira une injection veineuse d'adenovirus sous anesthésie, cette injection durera par voie veineuse sera de 30 secondes maximum. Des changements de régime alimentaire seront réalisés avec des durées de 4 à 20 semaines en fonction des régimes. Nous réaliserons des tests physiologiques sur une durée de 2 heures. Pour cela après injection d'insuline ou gavage de glucose, des prélèvements de sang sur les animaux vigiles au niveau codal. Ces prélèvements se feront par une incision légère de la queue qui sera réalisée une seule fois et des prélèvements seront réalisés 7 fois pendant les 2 heures suivant cette incision. Nous réaliserons une injection d’insuline par voie intra-péritonéale. Les animaux seront mis à jeun pendant 5 heures puis seront injectées d’insuline, injection qui durera 30 secondes maximum. Nous ferons une manipulation nutritionnelle sur nos souris. Pour cela, les souris seront soit mises à jeun 24h soit mises à jeun puis renourries pendant 18h ou on ajoutera à l’alimentation des souris de l’eau glucosée pendant 24h. pour les manipulations nutritionnelles, les souris subiront un jeûne intermittent pendant 2 semaines, ainsi il y aura un cycle de jeûne et d’alimentation toutes les 24h Les souris seront anesthésiées par une injection par voie intrapéritonéale en fin d’expérience afin de réaliser les prélèvements nécessaires.

Impact sur les animaux

Pour les procédures impliquant des injections des adénovirus, l’injection par voie veineuse d’adénovirus sous anesthésie ne cause pas de douleur. Pour les procédures impliquant un changement de régime, parmi les effets indésirables, il peut y avoir une perte de poids. Pour les procédures impliquant des injections d’insuline, il peut y avoir des risques d’hypoglycémie.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les tissus et le sang pour des analyses biochimiques et moléculaires.

Remplacement

L’utilisation d'un modèle animal est indispensable pour étudier la régulation de la glycémie de manière intégrée ainsi que le développement de maladies tels que la NAFLD. Par ailleurs, l'identification et la validation de cibles thérapeutiques par des traitements pharmacologiques nécessite l'utilisation d'un modèle in vivo mimant le plus fidèlement la pathologie humaine (diabète de type 2). La réalisation d'explorations fonctionnelles sur animal vigile ne peut donc pas être subsituée par des approches entièrement in vitro.

Réduction

Nous nous assurons d'utiliser le nombre d'animaux nécessaires afin de vérifier nos résultats et les valider sans que cela conduise à des répétitions inutiles. Pour cela, nous faisons en sorte, dans la mesure du possible d'exploiter au maximum nos animaux pour ne pas avoir recours à d'autres groupes expérimentaux. **Pour ce projet, nous utiliserons 2530 souris réparties sur 9 procédures. Un nombre minimum de souris sera inclus dans chaque groupe, La taille des effectifs ayant été établie grâce à un calcul de puissance pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions.

Raffinement

** Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont hébergés par 6 et l'isolement est évité. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft ou maisons en carton. Pour respecter le principe des 3R, les mêmes souris seront soumises à différents tests physiologiques et métaboliques permettant de limiter le nombre de groupes expérimentaux. Pour la procédure impliquant des injections en intraveineuse, l’injection se faisant sur animal anesthésié à l’isoflurane (1-2% isoflurane dans 100% O2), cette procédure n’engendre pas de de douleur. Le suivi de ces animaux sera suivi quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Pour les procédures impliquant un changement de statut de régime alimentaire, Le changement de régime pouvant induire une variation de poids, nous suivons le poids des souris par une pesée hebdomadaire et un suivi sur fichier excel. Toutefois, les souris seront observées par les expérimentateurs pendant toute la durée du protocole puis quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Enfin, nous surveillerons l’apparition des signes systémiques de souffrance suivant: 1) Apparence physique :0 : Normal 1 : Poils légèrement ébouriffés 2 : Poils ébouriffés, dos « vouté », yeux plissés 2) Apathie 0 : activité normale 1 : activité réduite 3 : activité nulle, apathie 3)Perte de poids 0 : Normale 1 :Perte de poids> 10% 2 :Perte de poids > 10% et 20% Pour une valeur totale égale à : 2 : l’animal sera suivi 2 fois par semaine et nous tenterons une réhydratation par injection de serum physiologique. Si le score maximal de 3 de l'un des critères est atteint ou si le score global atteint 6 l'animal sera mis à mort sur décision du porteur du projet**

Choix des espèces

L’espèce souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux (même fond génétique). De plus, la souris représente un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements métaboliques car de nombreuses voies de régulation métabolique sont conservées entre souris et homme. De plus,l'utilisation de modèles de souris transgéniques (knock-out) permet de mieux comprendre le rôle de différents gènes dans le développement de s maladies que nous étudions et que ce sont le diabète et la stéatose hépatique. A terme cela permettra de tester de nouvelles pistes thérapeutiques. Nous utiliserons des souris adultes à partir de 8 semaines chez lesquelles la régulation de l'homéostasie glucidique est fonctionnelle.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 180 d'entre elles, dont une lignée génétiquement modifiée privée de cellules tuft, sont infectées par voie gastrique avec trois virus digestifs puis autopsiées entre un et dix jours après, pour mesurer le rôle de ces cellules dans la défense antivirale de l'intestin. Le porteur qualifie la balance bénéfice-risque de "clairement favorable" et attend une perte de poids et des coliques comme principaux effets. Il affirme ne disposer d'aucune méthode alternative au modèle souris pour ces questions.

Objectifs

L’objectif de ce projet est simple, et consiste à évaluer la susceptibilité d’une lignée de souris génétiquement modifiées (dans lesquelles certaines cellules, nommées cellules tuft sont absentes) à des infections virales. Nos données, obtenues dans un modèle cellulaire, indiquent que l’absence des cellules tuft inhibe la synthèse de molécules antivirales sans lesquelles la réponse d’un hôte infecté est compromise. Ces données, inédites et encourageantes, méritent d’être approfondies le plus rapidement possible dans un modèle physiologique, afin de mesurer le réel impact de ce défaut. Notre stratégie expérimentale est simple, et consistera à infecter des souris de nos souches avec des virus digestifs. Les virus utilisés seront de 3 types, pour des expériences n’excédant pas 10 jours. Nous comparerons ainsi la progression de l’infection et de la réponse antivirale mise en place entre nos souris contrôle, et les souris sans cellules tuft. Cette stratégie nous permettra de répondre à des questions simples : (1) quelles sont les cellules impliquées dans la mise en place de la réponse immune suite à une infection virale et (2), l’absence de certains type cellulaire compromet-elle l’efficacité de la réponse de l’hôte suite à une infection ?

Bénéfices attendus

La balance bénéfice/risque associée à ce projet est clairement favorable. Nos données préliminaires indiquent en effet que les expériences associées à cette étude peuvent aboutir à la découverte de nouveaux mécanismes associés à l’immunité antivirale. Les retombées attendues en termes de connaissances fondamentales sont importantes, et pourraient avoir des répercussions en termes de santé publique, dans le contexte de pandémie que nous connaissons. Ce projet pourrait virtuellement d’expliquer les raisons pour lesquelles certains individus réagissent favorablement à une infection virale (réponse adéquate), alors que d’autres développent des formes graves (réponse inflammatoire prédominante). Notre stratégie expérimentale est simple, et devrait donner des résultats rapides et robustes.

Procédures

Les souris de nos 3 cohortes expérimentales se verront chacune être infectées par chacun des trois virus décrits, par voie gastrique (pour un total de 180 souris infectées et 60 souris contrôle non infectées). Suite aux traitements, les animaux seront progressivement analysés dans un laps de temps allant de 1 à 10 jours tout au plus, se focalisant sur les conséquences précoces de l’infection.

Impact sur les animaux

La source principale de stress pour tous les animaux impliqués dans ce projet sera l’étape d’inoculation des particules virales, et, selon nos prévisions, une potentielle perte de poids et des coliques.

Devenir

Les animaux devront être mis à mort, puisqu’autopsiés afin de récupérer les organes digestifs.

Remplacement

Ce projet a pour objet l’étude des interactions entre les cellules épithéliales intestinales, les cellules immunitaires et certains virus. Nous ne disposons pas de méthode alternative à ce jour pour traiter ces questions autre que les modèles de souris.

Réduction

Le nombre de souris engagées dans cette procédure a été défini selon les données de méthodologie classiquement retrouvées dans la littérature, nous conduisant à utiliser des cohortes de 40 individus par infection. Ce nombre, étant donnée l’effet drastique que nous attendons, nous permettra d’assurer des données robustes et exploitables. Nous réduirons le nombre d’animaux à produire en utilisant des individus des deux sexes. Finalement ; lorsque possible, nous compléterons nos données en utilisant des modèles de cultures cellulaires.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie. Afin de réduire au maximum les hypothétiques risques de douleur et d’angoisse chez les individus du groupe mutant, un suivi individuel des individus sera réalisé selon les paramètres de masse corporelle et d’activité. Une perte de poids supérieure à 20% du poids initial, ou l’apparition de signe de prostration seront considérés comme des points limites. En cas de signes de détresse ou de douleur, d’atteinte d’un point limite, en accord avec le personnel qualifié, le protocole sera immédiatement stoppé pour ces animaux qui seront euthanasiés et autopsiés.

Choix des espèces

Le système digestif de la souris présente de nombreuses similitudes avec celui de l’homme. De plus, nous disposons du modèle idéal (souris KO Pou2f3, dans lesquelles les cellules tuft sont absentes) pour aborder notre question. Les individus seront utilisés à partir de 8 semaines d’âge, lorsque le système digestif est mature. Notre étude se focalise sur les individus adultes et la mise en place précoce de la réponse antivirale.