Système gastrointestinal

2 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Le porteur provoque chez elles une inflammation intestinale par le dextran sulfate de sodium ou l'indométacine, se traduisant par des diarrhées et du sang dans les selles, après des gavages quotidiens de micro-organismes. Toutes sont euthanasiées en fin de procédure pour prélever leurs organes. Il affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas l'écosystème intestinal et que le recours à la souris est "indispensable".

Objectifs

L'objectif de ce projet est de comprendre les rôles des différents acteurs entrant en communication dans l'écosystème intestinal : l'hôte (par l'intermédiaire de son système immunitaire), le microbiote bactérien et le microbiote fongique (mycobiote). Pour cela nous souhaitons évaluer l'impact de la modulation d'un ou plusieurs de ces acteurs sur l'équilibre et l'inflammation intestinale. Dans le cadre de notre projet, nous utiliserons des souris ayant des mutations sur des récepteurs immunitaires impliqués dans la reconnaissance du microbiote fongique (notamment les récepteurs Dectin1 et 2, Card9). Grâce à ces souris, nous pourrons approfondir les connaissances sur l'impact du microbiote sur l'inflammation intestinale (comme observée chez les patients atteints de maladie de Crohn ou de rectocolite hémorragique). A l'aide de procédures d'administration de traitements microbiens et antimicrobiens et d'induction d'inflammation, nous pourrons modifier le microbiote et observer l'effet d'une telle modification sur l'évolution de l'inflammation intestinale. Ces recherches nous permettront de participer à l'élaboration de nouvelles voies thérapeutiques pour traiter les personnes atteintes de maladies inflammatoires de l'intestin.

Bénéfices attendus

Grâce à ces recherches, la découverte de souches fongiques bénéfiques ou néfastes pour l'homéostasie intestinale pourrait conduire à l'élaboration de nouvelles pistes thérapeutiques à base de probiotiques fongiques ou de traitements anti-fongiques ciblés pour traiter les pathologies inflammatoires intestinales.

Procédures

Lors de certaines procédures, les animaux recevront des micro-organismes administrés par gavage par voie orale. Ces administrations seront quotidiennes sur toute la durée de l'expérimentation (de 7 à 21 jours, en fonction de la procédure). Des prélèvements de fèces seront effectués aux points clés de la procédure (2 fèces par souris). Durant les procédures impliquant une inflammation intestinale, chaque procédure étudiera l'effet de traitements différents induisant des inflammations aux mécanismes spécifiques, dans le but de reproduire les symptômes de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, observées chez l'humain. L'induction d'une inflammation intestinale par traitement chimique au dextran sodium sulfate (DSS) afin d'établir un modele d'inflammation qui nous rapproche de celle observée chez les patients atteints de maladie de Crohn ou de recto-colite hémorragique, et l'induction d'une inflammation intestinale par administration d'un traitement anti-inflammatoire non stéroïdien (AINS), l’indométacine. Les AINS modifient le système immunitaire et participent a l'apparition d'une inflammation intestinale chez certains individus. Le traitement au DSS durera 7 jours, tandis que le traitement à l'indométacine durera 5 jours. Nous effectuerons les prélèvements de fèces dans la matinée (les souris ayant été actives et ayant consommé de la nourriture durant la nuit, leur transit intestinal est plus rapide le matin). Pour cela nous isolons chaque souris durant quelques minutes (5 minutes généralement), nous récupérons deux fèces au maximum puis nous replaçons la souris en cage.

Impact sur les animaux

L'inflammation intestinale provoquée chez les animaux dans nos différents modèles induiront une douleur légère à modérée. Lors de ces procédures, les animaux seront soumis à une inflammation intestinale qui se caractérise par une modification du transit intestinal avec apparition de diarrhée et ponctuellement de sang dans les selles. Aucune autre nuisance n'est associée à ce projet.

Devenir

La fin de chaque procédure nécessite de prélever différents organes afin d'effectuer nos analyses, et donc d'euthanasier tous les animaux.

Remplacement

Les modèles in vitro ne parviennent pas à reproduire l'écosystème intestinal complexe que nous cherchons à étudier. En effet, les interactions entre les différentes populations cellulaires de l'hôte, le microbiote intestinal, mais également les facteurs génétiques, sont des éléments indivisibles lorsque l'inflammation intestinale est étudiée, rendant indispensable l'utilisation de modèles animaux dans nos recherches.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé dans chaque procédure, nous avons calculé, grâce à des calculs statistiques, le nombre de souris minimum dont nous aurons besoin pour nous assurer des résultats interprétables. Basés sur un paramètre clé nous permettant de valider une expérimentation, ces calculs statistiques nous ont permis de déterminer que chaque groupe doit être constitué de 20 animaux pour chaque procédure. Nous avons choisi d’effectuer deux expérimentations indépendantes et donc d’utiliser 10 animaux par groupe pour chaque expérimentation.

Raffinement

L'état de santé des animaux est un point crucial lors des procédures, c'est pourquoi une attention particulière y sera apportée pour respecter le bien-être animal. Un enrichissement du milieu de vie des animaux sera réalisé ave des cages supplémentées de cellulose et d'abris. Enfin, les animaux seront hébergés en groupe dans les cages, en nombre adapté à l'espace disponible dans la cage (5 animaux maximum pour une cage de 370cm² par exemple) et feront l'objet d'un suivi et d'une observation quotidiens par un personnel compétent et formé afin de détecter tout signe de souffrance animale. Ainsi, les animaux seront immediatement euthanasiés si l'un de ces critères est observé : immobilité de l'animal, perte de poids supérieure ou égale à 20% par rapport au poids en début d'expérimentation, poil hirsute.

Choix des espèces

Notre projet implique l'étude des interactions hôte/microbiote. Ce type d'interaction complexe nécessite un modèle présentant un système immunitaire et des voies de signalisation proches de ce qui est observé chez l'humain. Le modèle murin est un modèle de référence pour étudier l'inflammation intestinale et présente une homologie avec l'humain sur plusieurs niveaux. Dans notre cas, c'est-à-dire les pathologies intestinales, de nombreuses données bibliographiques démontrent que ce modèle rentre en adéquation avec le type de recherche que nous souhaitons effectuer. De plus, l'utilisation du modèle murin offre une plus grande disponibilité de mutation de gènes associés aux récepteurs immunitaires. Toutes nos expérimentations utiliseront des souris âgées de 6 à 8 semaines, âge correspondant à la période où le système immunitaire est mature et fonctionnel.

2 400 souris hémophiles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Sous anesthésie, elles reçoivent des facteurs de coagulation par le nez ou par un patch collé sur la langue, puis subissent un prélèvement sanguin terminal ou une section de la queue pour mesurer le temps de saignement, sans être réveillées. Le porteur indique que leur maladie prédispose à des hémorragies parfois mortelles en cas de bagarre, d'où une surveillance quotidienne, week-ends compris. Il affirme que la souris hémophile est, après le chien, le seul modèle permettant de mesurer l'activité de ces médicaments et que son statut hémophile est "indispensable".

Objectifs

L’hémophilie est une maladie hémorragique grave caractérisée par un déficit en agents de la coagulation, appelés facteurs de coagulation, sans lesquels la coagulation (formation du caillot de sang permettant de tarir l’hémorragie lors d’un traumatisme) est impossible. Un déficit en facteur numéro VIII aboutit à l’hémophilie de type A et un déficit en facteur numéro IX aboutit à l’hémophilie de type B. Le traitement actuel de cette maladie, qui consiste en l’administration régulière au long cours des facteurs de coagulation par voie intraveineuse, est efficace pour prévenir ou traiter l’apparition d’un saignement mais altèrent fortement la qualité de vie des patients. Le développement de voies d’administration, autres qu’intraveineuse, pour le traitement de l’hémophilie, permettrait donc d’améliorer la qualité de vie des patients. En pratique courante, il existe des médicaments qui peuvent être administrés au travers des muqueuses de la bouche ou du nez. Le nez a déjà montré son efficacité pour le passage de médicaments et de vaccins en dehors de l’hémophilie. La bouche présente elle l’avantage d’éviter le tube digestif (pas de dégradation du médicament, ni de réaction de défense de l’organisme) et d’avoir une muqueuse très fine facilitant la traversée des médicaments. Parmi les éléments impliqués dans la biodisponibilité muqueuse, un récepteur semble jouer un rôle majeur dans la capture des médicaments, qui s’appelle le FcRn. Ce récepteur joue ainsi un rôle de transporteur permettant le passage d’actifs à travers la barrière muqueuse. L’objectif de ce projet est ainsi de comparer deux voies d’administration muqueuses (voie nasale et voie buccale) de facteurs anti-hémophiliques dans un modèle de souris (souris sauvages ou modifiés génétiquement). Ce modèle permettra d’identifier les paramètres d’efficacité et de toxicité associé à ces deux nouvelles voies d’administrations non invasives. Cinq médicaments seront testés : les facteurs VIII et IX non modifiés, 2 dérivés du facteur IX et 1 dérivé du facteur VIII, modifiés pour améliorer leur disponibilité dans le sang leur liaison au récepteur FcRn. Après chaque traitement, des études de coagulation seront effectuées, nécessitant 2400 souris sur une durée de 5 ans afin d’atteindre une puissance statistique nécessaire à l’interprétation des données.

Bénéfices attendus

Le développement de voies d’administration non invasives pour les facteurs anti-hémophiliques pour le traitement de l’hémophilie A et B seraient bénéfiques pour les patients : - Améliorer l’adhésion au traitement - Améliorer l’observance (la prise régulière des médicaments à visée préventive) - Améliorer la qualité de vie en réduisant les contraintes liées aux injections répétées - Eviter des réactions de défenses de l’organisme en évitant le tube digestif (comprimé) et la circulation sanguine (administration par voie intraveineuse)

Procédures

Pour la procédure 1, seulement un poiçon d'oreille sera réalisée pour pouvoir bien contrôler la qualité génétique de la lignée, Ce geste de quelques secondes sera réalisée par un zootechnicien entrainé et une légère compression (quelques secondes) sera réalisée si besoin. Pour les procédures 2 à 5, l’administration des médicaments se fera sur des animaux anesthésiés pour pouvoir évaluer l’efficacité de deux nouvelles voies d’administrations au travers de la muqueuse, la voie nasale (gouttes nasales) et la voie buccale (application d’un patch). Le patch, composé de sucres et des facteurs de coagulation, mesure 6mmx2mm et est placé sur la face ventrale de la langue. Il est mucoadhésif, biocompatible et se dégrade dans la salive en environ 20 min. Seulement une voie d’administration sera testée pour chaque souris. Il s’agit d’un inconfort de niveau léger et de très courte durée (temps d’administration inférieur à 1min dans les 2 cas (nasale et buccale) et prélèvement au maximum 24 heures après l’administration). De plus, cette administration sera exécutée après une anesthésie générale gazeuse. Il y aura 2 tests d’efficacités, un prélèvement sanguin et une section de la queue pour observer la coagulation, un seul réalisé pour chaque souris. Dans les deux cas, les gestes seront réalisés sous anesthésie générale et suivi d’une mise à mort alors que la souris sera toujours sous anesthésie générale. Ces tests seront réalisés au maximum 24 heures après l’administration nasale ou buccale. Durant le projet, tout sera mis en œuvre pour répondre au mieux aux critères de remplacement, de réduction et de raffinement (3R).

Impact sur les animaux

Un inconfort léger après administration nasale ou buccale est attendu pour une durée de quelques minutes. Puis les animaux seront tous mis à mort au maximum dans les 24h après l'administration des facteurs de la coagulation pour prélever le sang et pouvoir doser les facteurs de coagulation qui sont passés de la muqueuse à la circulation sanguine. Concernant le test de coagulation par section de la queue, il sera intégralement réalisé sous anesthésie générale avec mise à mort en fin d’expérimentation donc aucun effet indésirable n'est attendu. En raison du phénotype dommageable (l’hémophilie prédispose à des saignements), même si ces souris présentent très peu de signes cliniques tels qu’observés chez l’homme (hémorragies internes spontanées), en cas d’agressivité et de combats dans la cage, une hémorragie peut survenir et elle peut être mortelle. Une surveillance quotidienne de ces lignées est donc prévue (weekends et jours fériés inclus). En cas d’hémorragie, les souris seront mises à mort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure : - pour la procédure 1 : après 6 mois de reproduction les souris seront mise à mort pour le remplacement des géniteurs. - pour les procédures 2 et 3 : le prélèvement sanguin est terminal car un important volume de plasma (partie du sang contenant les facteurs de coagulation) est nécessaire. Les souris seront mises à mort en fin de prélèvement alors qu’elles sont encore sous anesthésie générale. - pour les procédures 4 et 5 : l’efficacité clinique des facteurs anti hémophiliques, c’est-à-dire leur capacité à arrêter un saignement, ne peut se démontrer qu’à l’aide d’un test de coagulation réalisé en conditions réelles de blessures. Ce test de référence est la section d’un petit morceau de queue et une observation du temps de saignement (au maximum pendant 10minutes) chez une souris sous anesthésie générale. Les souris ne seront pas réveillées à l’issu du test, et elles seront mises à mort. - pour toute les procédures de 1 à 5, si un point limite est atteint, les animaux seront tous mis à mort.

Remplacement

Des analyses préliminaires sur modèle murin sont nécessaires avant de commencer les essais cliniques chez l’homme. Premièrement, des études préliminaires de toxicité de ces médicaments sur les muqueuses ont été effectuées in vitro, mais bien que satisfaisante, la toxicité n’a pas été étudié in vivo et donc le recours à l’homme n’est pas possible. Deuxièmement, le recours à l’animal vivant est justifié car il n’existe pas d’autres modèle permettant l’analyse des effets doses et effets temps après que des médicaments aient été administrés par voie nasale ou buccale. De la même façon, seul un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire est nécessaire pour des études sur la coagulation sanguine (test de saignement). Enfin, des études chez l’homme ne peuvent pas être réalisées car cela mettrait le pronostic vital de patients hémophiles en jeu et le volume sanguin requis serait trop important dans un délai trop court.

Réduction

Dans la procédure 1, le nombre minimal de reproducteurs a été sélectionné. Dans les procédures 2 à 5, le groupe contrôle est commun à l’analyse des facteurs VIII et IX ce qui réduit le nombre d’animaux. Dans les procédures 4 et 5, seulement 2 temps d’analyse seront étudiés car les résultats des procédures 2 et 3 seront utilisés pour réduire le nombre d’animaux utilisés. De plus, des souris mâles et femelles seront utilisées de façon indifférente car aucune différence n’est attendue entre espèces pour les paramètres étudiés. Ainsi, toutes les naissances d’animaux seront concernées par les procédures, sans mise à mort sélective d’un des deux sexes. Ainsi, le principe de réduction du nombre d’animaux est appliqué au sein des 5 procédures.

Raffinement

Pour veiller au bien-être de l’animal, les conditions d’élevage, d’hébergement, des soins et des méthodes utilisées pour chaque étape de l’expérimentation seront optimisées pour minimiser douleurs, souffrance et angoisse, tel que l’enrichissement du milieu (copeau de bois, coton et dôme de cellulose). Un suivi quotidien des animaux sera effectué, cela permettra d’augmenter la surveillance (contrôle à 1h et antalgique dans l’eau de boisson) en cas d’altération du comportement (présence d’une courbure du dos) et d’identifier rapidement si un animal a atteint un des points limites définis ; auquel cas il sera profondément anesthésié puis mis à mort. L’administration par voie buccale ou nasale (inconfort de niveau léger et de très courte durée) sera exécutée sous contention légère après anesthésie gazeuse. Le prélèvement sanguin et le test in vivo de coagulation par section de la queue seront réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie (anti-douleur).

Choix des espèces

La souris hémophile est la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de la coagulation. En effet, le dosage de l’activité coagulante des facteurs anti-hémophiliques humains ne peut être effectué qu’en l’absence des protéines analogues du modèle. Le statut hémophile est donc indispensable. C’est pourquoi l’utilisation de souris pour cette étude se justifie car uniquement deux modèles d’animaux hémophiles sont disponibles : le chien et la souris. Les deux modèles murins hémophiles (hémophilie A et hémophilie B) servant de base à tout protocole préclinique concernant l’activité coagulante des facteurs sont très bien caractérisées. Ils permettent de mettre en évidence la capacité coagulante des molécules générées après l’administration de molécules thérapeutiques. L’absence des facteurs anti-hémophiliques murins proches de nos facteurs anti-hémophiliques humains est un prérequis pour la mesure de l’activité du produit. En plus d'être un modèle pertinent en hématologie et en immunologie, la souris est un animal de petite taille, facilement manipulable et génétiquement bien caractérisé. Ce protocole sera effectué sur des souris sevrées depuis 3-4 semaines (le sevrage se fait entre 3 et 4 semaines de vie selon la taille des souriceaux). Ces souris (entre 6 et 12 semaines) seront pesées quotidiennement à partir de la 3ème semaine de sevrage pour vérifier qu’elles ont le poids idéal (soit au moins 20-25g), pour recevoir un maximum de 10µl de matériels à tester par voie nasale et un patch de 10mm². En effet, ces jeunes individus présentent des parois vasculaires plus propices à une bonne efficacité des molécules à tester nous permettant de nous rapprocher des conditions chez l’homme. Ainsi, les modèles animaux seront bien représentatifs du profil hémorragique observé dans l’hémophilie. Des individus plus âgés ont un profil de coagulation différent des individus plus jeunes. Les expérimentateurs sont formés aux gestes impliquant un contact avec la souris, et à l'observation des signes cliniques fondamentaux, coagulation inclus.

478 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, presque toutes tuées à l'issue et quatre gardées pour l'entraînement du personnel. Elles reçoivent une infection grippale, jusqu'à 26 gavages de microorganismes, des prélèvements de sang et de fèces et des séances d'imagerie sous anesthésie, avant le prélèvement des poumons et du tube digestif. Le porteur teste des probiotiques censés réduire les symptômes grippaux et évoque un objectif commercial. Il affirme que les interactions virus-hôte ne peuvent pas être reconstituées en culture cellulaire.

Objectifs

Les virus influenza A sont responsables de milliers d’infections chaque année et constituent de ce fait un problème de santé publique. Le modèle d'infection grippale par le virus influenza que nous utilisons chez la souris reproduit très bien ces mécanismes inflammatoires et son emploi permet d'étudier en détail la réponse immunitaire développée en réponse à l'infection. Dans ce modèle infectieux, le virus grippal induit une pathologie marquée. Ce modèle pathologique permet de tester des stratégies antivirales (drogues, probiotiques, vaccins) en développement afin de valider leurs effets contre ce type de virus. En outre, des virus modifiés permettent le suivi de la réplication virale in vivo grâce à un système d’imagerie intra-vitale. L’imagerie intra-vitale consiste à observer des processus biologiques et à quantifier des signaux lumineux provenant de l’animal vivant sans devoir l’euthanasier, de façon non-invasive. Ce système permet de visualiser in vivo l’importance de la réplication virale la réponse de l’hôte. L'emploi du modèle souris pour étudier les mécanismes pathologiques liés aux virus influenza est extrêmement puissant car il permet de comprendre la dynamique de l'inflammation pulmonaire et de suivre l'afflux de cellules immunitaires au niveau des voies respiratoires. Il permet ainsi de caractériser finement des éléments clés de la réponse de l'hôte qui peuvent être de futures cibles thérapeutiques. Par ailleurs, certaines souches de microorganismes ont été étudiées pour leurs effets positifs sur ces infections virales En effet, il a été démontré que les produits contenant des probiotiques ont un effet immunomodulateur et un effet protecteur contre les infections virales respiratoires chez les souris et l’Homme Plusieurs études, incluant des essais cliniques chez l’homme, démontrent que certains microorganismes peuvent réduire les symptômes pseudo-grippaux (fièvre, écoulement nasal, incidence de la toux et durée de la prescription d'antibiotiques). Ainsi leur emploi comme agents préventifs et thérapeutiques dans les infections respiratoires communes constitue une piste sérieuse pour la réduction de la sévérité de ces infections dans la population générale.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus à court terme : Certains microorganismes sont déjà inclus dans des produits destinés à la consommation humaine. Si des effets bénéfiques sont confirmés par ces essais, les microorganismes testés au cours du projet pourraient également être inclus dans des études cliniques humaines ciblant les pathologies grippales. Il pourrait amener à un positionnement nouveau pour ce produit et bénéficier à la population générale en terme de bien-être (réduction de symptômes grippaux). Par ailleurs, des bénéfices en termes de connaissance sur l’interaction hôte-microorganisme, et plus particulièrement l’interaction microbiote intestinal/santé pulmonaire devraient pouvoir être obtenus en cours de projet. Il s’agit pour notre équipe de l’intérêt principal. Par quelle(s) voie(s) les microorganismes utilisés peuvent-ils stimuler les réactions de défense de l’hôte ? Dans cet objectif d’acquisition de connaissances sur le mode d’action de microorganismes et le rôle du microbiote intestinal dans des pathologies respiratoires, nous inclurons également un groupe test avec de l’acetate. L’acetate est un acide gras à chaine courte (AGCC) produit et consommé par le microbiote intestinal. Il peut notamment être consommé par certaines espèces bactériennes pour produire un autre AGCC, le butyrate, doté de propriétés anti-inflammatoires. Dans la littérature, une administration d’acetate à des souris dans un modèle comprenant une infection grippale suivie d’une infection bactérienne a permis d’amoindrir les effets de ces agents pathogènes. Nous voudrions voir si une protection peut être conférée dans le cas d’une infection grippale seule. Cela pourrait orienter les futures sélections de souches bactériennes, en retenant des bactéries capables de produire des quantités importantes d’acetate. A plus long terme : Pour les microorganismes nouveaux, n’étant actuellement pas commercialisés, leur mise à disposition sur le marché sera forcément plus longue mais constituent un objectif également à la fois commercial et de bien-être (réduction de symptômes grippaux).

Procédures

Prélèvement de feces : sur animal vigile, 474 animaux concernés, 1 prélèvement = maximum 10 minutes dans un pot transparent, 4 prélèvements prévus pour chaque animal sur la durée de la procédure Gavage : sur animal vigile, 478 animaux concernés, 1 gavage = 5-10 secondes avec insertion d’une sonde de gavage dans l’œsophage et injection de 200µl de liquide, 26 gavages prévus pour chaque animal (1 par jour) Contention pour le gavage, sur animal vigile, 478 animaux concernés, 1 contention = 10 secondes où l’animal est immobilisé par une main de personnel compétent / empêche mouvement pour permettre gavage, 26 contentions prévues pourr chaque animal (1 par jour)? Administration intra-nasale : sur animal anesthésié, 474 animaux concernés, 1 administration = 20 secondes, 1 seule par animal pendant la procédure Anesthésie générale pour administration intra-nasale : sur animal vigile, 474 animaux concernés, 1 anesthésie = 1 piqûre en voie intra-péritonéale avec injection de 150µl, 1 seule par animal pendant la procédure Anesthésie gazeuse générale pour imagerie : sur animal vigile, 474 animaux concernés, 1 anesthésie = faire respirer du gaz isoflurane dans une boite hermétique jusqu’à endormissement puis déplacement des animaux dans l’imageur, prise de clichés et remise en cage pour réveil, durée totale = 5 minutes, 3 sessions d’imagerie Prélèvement de sang : sur animal vigile, 474 animaux concernés, 1 prélèvement = une incision à la veine submandibulaire pour recueillir environ 300µl de sang, durée totale = 30 secondes, 1 seule fois par animal pendant la procédure

Impact sur les animaux

L’aspect dommageable de ce protocole réside dans l’infection virale elle-même. Le virus utilisé génére des symptômes très légers à très sévères, en fonction de la dose utilisée lors de l’infection. Dans le cadre de ce projet, aucune mortalité consécutive à l’infection n’est attendue car nous souhaitons utiliser des doses faibles de virus qui ne génèrent pas de symptômes trop importants. Le suivi quotidien est néanmoins indispensable afin d’effectuer un contrôle des signes cliniques. Les dommages principaux liés à l’infection peuvent se manifester par une perte de poids, une détresse respiratoire (sifflement respiratoire, bronchoconstriction) ou une hypothermie. Des signes cliniques peuvent également être relevés : pelage hérissé, posture voûtée, yeux clos ou mi-clos.

Devenir

A l’exception des animaux destinés à l’entrainement pour la contention et les gavages, les autres animaux subiront un prélèvement d’organes post-mortem (poumons, tractus digestif) incompatible avec une survie.

Remplacement

Les rongeurs sont couramment utilisés pour les études des interactions virus-hôte. De telles expériences ne peuvent être réalisées sur des cultures cellulaires qui ne permettent pas de reconstituer les communications entre les différents organes. De plus, les paramètres respiratoires : fréquences respiratoires, volumes respiratoires, bronchoconstrictions; ainsi que les paramètres sanguins : pression partielle en oxygène, hypoxie; malgré de gros progrès réalisés dans le développement d'organoïdes respiratoires, ne peuvent encore aujourd'hui être quantifiés que sur l'animal.

Réduction

Comment mentionné dans les objectifs, certains microorganismes sont issus d’un programme de criblage in vitro au préalable. A partir d’une collection contenant plusieurs dizaines de souches de microorganismes, des essais in vitro sont effectués. Ils ont pour but d’identifier des microorganismes potentiellement intéressants. Ainsi seuls des microorganismes les plus prometteurs sont envisagés pour un test in vivo. Alternativement, d’autres microorganismes ont déjà fait preuve d’une efficacité contre une autre pathologie et sont étudiés dans ce projet en repositionnement. Ce sont des candidats avec de bonne chances de succès, également. Par ailleurs, nous utilisons toujours une approche statistique pour déterminer la taille de nos groupes en fonction de l’intensité des effets que nous souhaitons mettre en évidence et des données déjà disponibles. Dans notre cas, des données acquises les années précédentes nous ont permis de calculer les tailles de groupes suivants avec des paramètres classiques (risques α=0,05 et 1-β=0,9) : Pour les pertes de poids, nous avons mesuré un écart-type de 5.33 et nous aimerions distinguer des groupes différents par 5% de perte de poids. Les tables indiquent dans ce cas 25 animaux nécessaires. Pour les analyses en plethysmographie, nous avons un écart-type de 0.8 sur l’indicateur PenH et nous aimerions distinguer des groupes différents par 0.6 unités de cet indicateur. Les tables indiquent dans ce cas 38 animaux nécessaires. Nous pensons qu’un compromis de 30 animaux par groupe reste raisonnable : il nous permettra de mettre en évidence des différences de poids et nous donnera de bonnes opportunités de voir une différence en détresse respiratoire également. Nous effectuerons des ANOVA non paramétriques (Kruskal-Wallis) suivies de test de Dunnet. D’autres types de tests pourront également être menés, notamment pour les analyses de microbiotes où des procédures dédiées existent.

Raffinement

Tout au long des procédures expérimentales, les animaux sont observés et pesés quotidiennement. A partir du moment où la phase infectieuse débute, la température des animaux est également prise chaque jour, et un score clinique individuel est établi. Toutes ces mesures représentent une surveillance accrue nécessaire à cette phase. Par ailleurs, les animaux sont hébergés à plusieurs (4 ou 5) afin de ne pas exposer ces animaux sociaux à un stress lié à l’isolement. Les quelques fois où les animaux sont séparés ne représentent qu’un temps très faible (5-10minutes, environ une fois par semaine) et ne sont pas considérées comme dommageables. Des anesthésies sont prévues lors des phases qui pourraient être stressantes pour l’animal (administrations intra-nasales). L’anesthésie est également requise pour l’imagerie, afin que l’animal ne bouge pas. Nous veillons toujours à ce que les durées d’anesthésie soient limitées au minimum nécessaire (quelques minutes pour l’imagerie, 30 minutes maximum pour l’administration intra nasale). Nous incluons des enrichissements dans les cages : cellulose à dechiqueter et permettant la création de nids, bâtons à ronger et maisonnettes en carton (sans encre). Le matériel que nous utilisons (sonde rectale pour la prise de température, sonde de gavage) est évidemment adapté à nos animaux. Les sondes de gavages sont en plastique souple et fin (diamètre externe voisin du millimètre), à bords arrondis et de taille adaptée (4cm) pour empêcher les blessures et réduire l’inconfort. Des points limites sont définis afin de réduire au maximum la douleur ressentie par les animaux. Enfin, toutes les personnes manipulant les animaux sont formées et compétentes pour ce type d’expérimentation.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence très largement utilisé dans le cadre de l'étude de la réponse développée en réponse aux infections respiratoires virales. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines afin de disposer d'un système immunitaire mature.

24 mini-porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, la plupart tués à l'issue et deux gardés vivants s'ils perdent leur implant. Chaque animal subit une demi-journée de chirurgie pour poser un dispositif intestinal abritant des probiotiques, puis des prélèvements sanguins répétés jusqu'à 168 ml par cinétique sur deux mois de régime gras. Le porteur vise à terme une application chez l'humain contre le diabète de type II et l'obésité, mais l'objectif immédiat reste d'évaluer la tolérance du dispositif. Sur le remplacement, il affirme que la biodisponibilité des nutriments ne peut pas être reproduite in vitro et retient le mini-porc pour son système digestif proche de celui de l'humain.

Objectifs

Le dispositif "Symbiote" testé dans le projet pourrait avoir de nombreuses applications chez l’Homme, en particulier une contribution à la prise en charge du diabète de type II et des obésités : dans ces situations, il est admis que l’élimination d’un pourcentage significatif de la ration calorique présente un intérêt médical. De nombreuses approches thérapeutiques (inhibiteurs de l’alpha-Glucosidase pour diminuer l’absorption des sucres, médicaments diminuant le seuil de réabsorption du glucose, pour éliminer une partie du glucose sanguin dans l’urine) ont été proposées pour cela. Malgré leur intérêt thérapeutique, leurs indications sont limitées par leurs effets secondaires non négligeables. Notre dispositif "Symbiote" pourrait représenter une alternative à ces méthodes. En effet, les bactéries abritées dans le « réacteur » pourront représenter une masse biologique significative, consommant pour leur propre compte des nutriments qui auraient normalement été absorbés (d’autant que le « réacteur » est positionné dans une zone de l’intestin où la concentration en bactéries est relativement faible). Les bactéries seront choisies ou bien parce qu’elles sont déjà naturellement présentes dans l’organisme (par exemple divers types de Lactobacillus normalement présents dans l’organisme, dont Lactobacillus salivarius), ou bien parce qu’elles ont démontré un potentiel probiotique intéressant (E. Coli Nissle, par exemple, qui présentent le double intérêt d’avoir démontré un intérêt anti-inflammatoire et d’être relativement facilement accessible au génie génétique, ce qui permettra dans le futur d’envisager d’utiliser ces bactéries pour produire des molécules d’intérêt, par exemple des vitamines). Avant d’envisager une étude chez l’homme, l’objectif de cette étude pré-clinique sur du long terme chez le mini-porc est d’évaluer les effets du dispositif implanté sur la physiologie digestive de l’hôte, et sur son potentiel d’action dans le contrôle du métabolisme dans des situations de perte d’homéostasie (obésité et diabète de type II, mais potentiellement à terme également les pathologies liées à un dysfonctionnement du microbiote). L’ensemble des dispositions prises dans ce projet répond aux principes fondamentaux des 3Rs (réduction, raffinement, remplacement) dans le cadre de l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont la contribution au traitement des pathologies induites par un microbiote inadapté : de nombreuses études ont mis en évidence le lien entre microbiote et diverses pathologies (dont obésité, certains cancers, etc). Les études cliniques qui deviendront possibles après cette expérimentation animale permettront d’explorer ce qui pourrait être une méthode originale de modulation du microbiote intestinal. Un tel dispositif a toute ces chances pour être bien toléré chez l’homme, car dans de nombreuses situations cliniques des sondes duodéno-jéjunales sont installées, et l’expérience montre qu’elles sont très bien tolérées.

Procédures

Des prélèvements de sang seront réalisés à 0, 15 et 60 jours après la mise en régime des animaux. Pour chacune des journées de prélèvements, 8 ml de sang seront prélevés sur chaque cathéter selon la cinétique suivante -0.5, 0, 0.5, 1, 2, 5 et 7h après le repas. Ce qui représente un volume total de 168 ml par cinétique (8 mL x 3 cathéters x 7 temps), ce qui est acceptable pour des animaux de plus de 25 kg. Des prélèvements de sang artériels seront effectués tous les 15 jours sur tous les animaux. Ces prélèvements uniquement sur du sang artériel seront réalisés à jeun pour permettre un suivi du statut physiologique des animaux pendant toute la durée de l’expérimentation. Chaque animal subira une demi-journée d’intervention chirurgicale. Les prélèvements de sang réalisés à J0, J15 et J60 après la mise en régime des animaux, s’effectueront pour chaque animal sur 3 demi- journée de cinétique de prélèvement de sang, cumulé sur 60 jours.

Impact sur les animaux

La douleur imposée aux animaux pendant l’expérimentation est liée à l’acte chirurgical. Elle peut se manifester dans les premiers jours suivant l’opération, mais après cette période de récupération, elles restent mineures. Pendant la période de récupération, les animaux sont surveillés régulièrement (visite toutes les 2 h pendant la journée). L'évaluation de la gêne et de la douleur est faite par observation du comportement des animaux : reprise de l'alimentation, du transit intestinal, posture, vocalises, réactivité et la température corporelle. Les critères d’arrêt concernent essentiellement la période de récupération post-opératoire. Si l’alimentation et le transit digestif ne sont pas normalisés au bout de 10 jours, malgré les soins apportés pour soulager la douleur à l'aide d'un analgésique et stimuler la motricité intestinale et/ou si une perte de poids supérieure à 20% du poids avant l’apparition des premiers signes cliniques d’altération de l’état physiologique est observée, Les animaliers et les responsables de l’étude effectueront une observation plus poussée de l’animal et renseigneront le tableau d’observation des points limites. Si 3 points limites notables ou 1 point limite grave sont observés, nous discusterons avec le personnel de l’animalerie, afin de décider si l’animal sera soigné ou euthanasié.

Devenir

Les animaux de la procédure 1 seront mis à mort à la fin de la période expérimentale après 2 mois d’un régime HF-HF, sauf si le point limite est atteint avant. Les animaux expérimentaux sont mis à mort en fin d’expérience pour : 1) vérifier le bon positionnement des cathéters sanguins et du tænia artificiel 2) réaliser des prélèvements tissulaires pour des études métaboliques. Tous les animaux de la procédure 2 seront mis à mort pour vérifier le positionnement et l’état de l’ancrage du dispositif implanté. Dans le cas ou l’animal perde son dispositif et qu’il se retrouve dans les fèces, celui-ci sera gardé en vie et pourra être réutilisé à des fins pédagogiques au sein de la structure.

Remplacement

La biodisponibilité des nutriments fait intervenir de nombreux processus biologiques coordonnés et régulés, qui à ce jour ne peuvent pas être reproduits in vitro. Le porc présente un certain nombre de similitudes anatomiques et physiologiques avec l'homme. C’est la raison pour laquelle il est fréquemment utilisé comme modèle pour les études biomédicales. Le mini-porc permet de travailler sur des adultes (à stabilité pondérale) d'une taille compatible avec l'expérimentation animale. Il présente de plus l'avantage d'avoir un système digestif très proche de celui de l'Homme et d'accepter de manger tous types d'aliments.

Réduction

L'effectif prévu dans le schéma expérimental de la phase 1 est réduit au minimum en tenant compte de la variabilité du principal paramètre mesuré, estimée à partir de nos précédentes études sur la biodisponibilité des nutriments réalisées avec un design expérimental similaire. Après analyse de la fonction de répartition de la loi de Chi2, un nombre minimal de 6 animaux/lot est nécessaire pour obtenir une différence significative à 5% entre les lots sur le critère principal (biodisponibilité du fructose). 2 mini-porcs supplémentaires sont également prévus pour faire face aux aléas (mauvaise récupération chirurgicale des mini-porcs, perte précoce de perméabilité des cathéters, ...). Ils seront alloués aux différents groupes (si c’est le cas) en fonction des besoins. L’effectif prévu pour la phase 2 est le minimum requis pour un test de faisabilité d’implantation et de pérennité de l’ancrage du dispositif dans l’intestin par la voie endoscopique. 14 animaux seront utilisés pour la première phase du projet (procédure 1). Ils seront distribués en 2 lots : un lot témoin (dispositif implanté sans probiotique) et un lot expérimental (dispositif implanté avec probiotique greffé). 10 animaux seront utilisés pour la phase 2 du projet pour tester la fiabilité de la technique d’ancrage du dispositif par endoscopie. (procédure 2). L’approche développée sera peu invasive, et peu traumatisante pour l’animal. La douleur imposée aux animaux pendant l’expérimentation est liée à l’acte chirurgical. Les animaux recevront pendant 6 jours un traitement analgésique et spamolytique, mais après cette période de récupération, elles restent mineures. Pendant la période de récupération, les animaux sont surveillés régulièrement (visite toutes les 2 h pendant la journée). L'évaluation de la gêne et de la douleur est faite par observation du comportement des animaux : reprise de l'alimentation, du transit intestinal, posture, vocalises, réactivité et la température corporelle.

Raffinement

La douleur imposée aux animaux pendant l’expérimentation est liée à l’acte chirurgical. Elle peut se manifester dans les premiers jours suivant l’opération, mais après cette période de récupération, elles restent mineures. Pendant la période de récupération, les animaux sont surveillés régulièrement (visite toutes les 2 h pendant la journée). L'évaluation de la gêne et de la douleur est faite par observation du comportement des animaux : reprise de l'alimentation, du transit intestinal, posture, vocalises, réactivité et la température corporelle. Les critères d’arrêt concernent essentiellement la période de récupération post-opératoire. Si l’alimentation et le transit digestif ne sont pas normalisés au bout de 10 jours, malgré les soins apportés pour soulager la douleur et stimuler la motricité intestinale et/ou si une perte de poids supérieure à 20% du poids avant l’apparition des premiers signes cliniques d’altération de l’état physiologique est observée, nous discuterons avec le personnel de l’animalerie, afin de décider si l’animal sera soigné ou euthanasié. Pendant toute la durée de la période d'expérimentation, les animaux seront hébergés dans des cages au sol de taille réglementaire avec des copeaux de bois comme litière leur permettant de réaliser une activité de fouissage, et avec des parois latérales en plexiglass pour que les animaux puissent se voir et intéragir entre eux. Leur environnement est enrichi à l’aide d’une chaîne en métal fixée sur les parois et de ballons. La pièce est à température régulée. Les animaux ont libre accès à l'eau.

Choix des espèces

Le porc présente un certain nombre de similitudes anatomiques et physiologiques avec l'homme. C’est la raison pour laquelle il est fréquemment utilisé comme modèle pour les études biomédicales. Le mini-porc permet de travailler sur des adultes (à stabilité pondérale) d'une taille compatible avec l'expérimentation animale. Il présente de plus l'avantage d'avoir un système digestif très proche de celui de l'Homme et d'accepter de manger tous types d'aliments.