Système gastrointestinal

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont implantées dans le foie après incision de l'abdomen, sur des souriceaux âgés de neuf jours pour reproduire un cancer du très jeune enfant, puis elles reçoivent deux médicaments et un suivi de la tumeur par imagerie. Le porteur affirme que les effets indésirables sont "proches de zéro" grâce à l'anesthésie et à l'absence de toxicité observée chez la souris adulte, alors que le modèle reproduit une dissémination tumorale vers les poumons. Il indique qu'aucun système in vitro ne reconstitue la complexité tumorale et juge indispensable cette souche de souris immunodéprimée.

Objectifs

L’hépatoblastome est le cancer primaire du foie le plus fréquent chez l’enfant de moins de 5 ans. Le traitement de référence utilise une chimiothérapie à base de cisplatine, un médicament qui tue très efficacement les cellules tumorales mais reste très toxique pour les enfants. Un modèle juvénile de cancer du foie chez la souris a été mis au point récemment. Nous souhaitons maintenant tester l’efficacité d’une nouvelle thérapie de deux médicaments dans le traitement de ce cancer pédiatrique à l’aide de ce modèle.

Bénéfices attendus

Montrer que ces cellules d’hépatoblastome répondent à une chimiothérapie à base de deux composés et donc que le modèle est pertinent pour tester de futurs médicaments. Disposer d’un modèle juvénile pour étudier les mécanismes à l’origine de ce cancer pédiatrique.

Procédures

Implantation de cellules tumorales dans le foie après incision de la peau au niveau ventrale (durée : 10 min). Points de sutures au niveau ventrale (durée : 5 min). Administration de médicaments 2 fois par semaine (durée : 2 min par jour d’injection). Mesure de la tumeur par imagerie à bioluminescence 3 fois par semaine (durée : 15 min par mesure). Pesée des souris deux fois par semaine (durée : 1 min).

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales utilisées dans ce projet sont de classe modérée. Elles prévoient la greffe de cellules tumorales dans le foie. Les souris seront également manipulées afin de mesurer la croissance des tumeurs par bioimagerie. Toutes les manipulations des animaux sont réalisées sous anesthésie générale et les yeux des animaux sont protégés avec de la pommade vit A. Les effets indésirables sont donc proches de zéro. Il n’y a pas de risque particulier lié au développement de la tumeur qui se fera dans une partie localisée du foie. Le modèle reproduit la dissémination des cellules tumorales dans les poumons comme cela est observé chez les patients. Celles-ci sont 10 fois plus petites en taille que la tumeur hépatique d’origine. Des analyses précédentes dans un modèle de souris adulte montrent l’absence de toxicité de cette combinaison de drogues ou de chaque drogue utilisé seule.

Devenir

Les 80 souris de ce projet seront euthanasiées afin de procéder au prélèvement des tissus tumoraux et à leur analyse pas des approches moléculaires et histologiques.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculaire de notre objet d'étude, l’hépatoblastome. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris (souris immunodéficience, NOD/LtSz-scid IL2R gamma, NSG). Les conclusions recherchées ne peuvent être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiments stromales et tumorales en action in vivo chez la souris.

Réduction

Le nombre d’animaux et l’analyse des résultats sont déterminés à l’aide de tests statistiques adaptés. Pour renforcer la puissance statistique de nos données, nous prévoyons de réaliser l’expérience deux fois. Si les résultats de nos analyses sont convaincants dès la première série d’expérience, celle-ci ne sera pas reconduite.

Raffinement

Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse infligées aux animaux. Les souris seront hébergées en animalerie A2, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques par du personnel qualifié. Ces animaux sont hébergés en cages de type 2L à raison de 5 souris par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu. En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Le score limite est de 12. Au-delà, l’animal est euthanasié sans attendre. En tenant compte de ces points limites adaptés et conformément au paragraphe 3 de l’annexe VIII de la directive 2010/63 CE, nous proposons comme classement pour l’ensemble de nos procédures le degré modéré. Les critères prépondérants ainsi que les mesures conservatoires en fonction du score de cette grille sont détaillés dans les procédures. Il n’existe pas de méthode alternative à celle de réaliser une incision de la peau ventrale et d’implanter les cellules tumorales directement dans le foie pour mettre en place ce modèle orthotopique de tumeur du foie chez le souriceau. Les animaux seront manipulés sous anesthésie gazeuse et après intervention chirurgicale, ils seront traités pas des antalgiques. Les expérimentateurs de l’Animalerie ont toutes les compétences et les formations requises pour réaliser les procédures chirurgicales et les manipulations des animaux prévues dans ce projet.

Choix des espèces

- La souche de souris NSG est appliquée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer la maladie étudiée. - Afin de mimer l’apparition du cancer du foie chez des enfants très jeunes, l’implantation des cellules tumorales se fera sur des souris âgées de 9 jours - La capacité d’extrapoler les résultats. - L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. - L’existence des équipements nécessaires à l’étude. - La pertinence des installations de l’Animalerie.

804 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le parasite Giardia puis gavées quotidiennement pendant douze jours, une partie étant des souriceaux non sevrés séparés de leur mère à chaque manipulation, pour tester des probiotiques destinés d'abord à un usage vétérinaire chez le chien. Le porteur décrit un objectif de commercialisation par un partenaire industriel et une application humaine à plus long terme, et indique que l'infection reste asymptomatique et auto-résolutive chez la souris. Il affirme qu'il est "nécessaire" de vérifier in vivo l'efficacité observée in vitro, aucun modèle ne reproduisant selon lui les interactions hôte-parasite-microbiote.

Objectifs

Giardia est un parasite de l’intestin de nombreuses espèces de mammifères dont l’Homme. Il est à l’origine d’infections intestinales souvent chroniques se traduisant par des diarrhées et parfois des signes de malabsorption. Le nombre croissant de cas de giardiose liés à la contamination de l’eau potable, aux effets secondaires des traitements, ainsi qu'à l’émergence de souches résistantes aux médicaments, font de la giardiose un sujet d’actualité de plus en plus préoccupant qui nécessite le développement de traitements alternatifs. Nous avons établi que la microflore et certains probiotiques, comme les bactéries probiotiques Lactobacillus johnsonii, jouent un rôle important dans la protection contre cette parasitose. Des résultats obtenus, in vitro et in vivo, montrent que ces bactéries agissent en produisant des composés toxiques pour le parasite, permettant de réduire les signes de la maladie. Une souche de L. johnsonii a également fait l’objet d’un essai clinique chez le chiot où nous avons pu confirmer ses propriétés anti-Giardia. A partir de ces résultats très encourageants, nous avons obtenus au laboratoire 4 nouvelles souches de probiotiques présentant des propriétés anti-Giardia augmentées comparativement à la souche d’origine in vitro. Afin de déterminer quelle souche sera utilisée sur l’espèce hôte cible (le chien), mais aussi afin d’étudier in situ dans l’intestin les mécanismes à l’origine de ces effets, il est nécessaire de valider les résultats obtenus sur ces différentes souches in vitro, par des essais in vivo d’infection à Giardia sur des modèles rongeurs. Nos objectifs sont la commercialisation par notre partenaire industriel de ce nouveau probiotique chez le chien, d’ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement de la giardiose basées sur l'utilisation de probiotiques ou de molécules actives.

Bénéfices attendus

La majorité des traitements humains ou vétérinaires actuels font appel à l’emploi d’antibiotiques, qui non seulement provoquent d’importants effets secondaires, mais sont également de moins en moins efficaces dû à l’émergence de souches résistantes à ces médicaments. Ce contexte préoccupant nécessite le développement de traitements alternatifs novateurs, et nécessite également des avancées majeures dans la compréhension des interactions hôte/Giardia/microbiote qui seront à la base de nombreuses thérapies innovantes. Giardia est un parasite ayant une prévalence importante dans l’industrie de l’élevage en Europe et dans le monde. La diminution de l’utilisation des antibiotiques dans l’ensemble des traitements des animaux est un sujet de très haute importance étant donné l’apparition de nombreuses souches résistantes. Le développement de ce type de traitement alternatif est donc capital, en particulier dans ce type d’industrie. La réduction de souches résistantes aux antibiotiques ainsi que la diminution des traces d’antibiotiques dans l’alimentation humaine et vétérinaire est au cœur des enjeux sociétaux et environnementaux actuels et pour le futur. Ce projet permettra à court terme le développement et la mise sur le marché vétérinaire de probiotiques anti-Giardia, puis à plus long terme une application chez l’humain. Ceci pourrait permettre un développement de l’éventail thérapeutique, une amélioration de la prise en charge et du traitement de la maladie, pour in fine une amélioration de la qualité de vie des individus concernés. Il permettra également l’avancement des connaissances fondamentales dans l’application de souches probiotiques produisant des composants toxiques pour le parasite, en particulier dans leur action synergique avec le microbiote. Le microbiote est au centre de découvertes majeures dans l’application à la médecine vétérinaire et humaine depuis 20 ans. Ce projet vise à en comprendre les mécanismes clés, ce qui permettrait d’identifier de nouveaux axes de recherche fondamentaux ou appliqués.

Procédures

Au cours des études et pour l’ensemble des animaux rentrant en procédures, les interventions seront : - Prise de poids et gavage quotidiens pendant 12 jours maximum (5 min maximum par animal) - Deux gavages quotidiens espacés d’une demi-journée : 1 fois - Prélèvement sanguin : 1 fois juste avant la mise à mort - Mise à mort

Impact sur les animaux

L’infection à Giardia duodenalis est asymptomatique et auto-résolutive en une dizaine de jours chez la souris. Les potentiels effets indésirables seront les erreurs de gavage (fausse route avec passage de la sonde dans la trachée, détectable par présence de sang sur la sonde). Dans ce cas nous procéderons à l’euthanasie immédiate des animaux concernés. Chez les jeunes souriceaux, un stress est engendré lors des gavages et pesées journalières, mais il est également dû à la séparation de sa mère, qui a lieu durant ces différents gestes. Les souriceaux seront manipulés avec des gants imbibés de l’urine et fèces de la mère afin de réduire le risque de rejet et/ou cannibalisme de la mère.

Devenir

A l’issue de l’ensemble des procédures, les animaux seront euthanasiés afin de procéder au prélèvement des différents organes nécessaires à la quantification de la giardiose et aux traitements des données expérimentales.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est nécessaire pour confirmer les observations faites in vitro. En effet, le test in vitro ne permet d’apprécier que l’efficacité du surnageant de culture bactérienne sur Giardia. Il est donc nécessaire de vérifier l’efficacité de ces stratégies thérapeutiques dans des conditions physiologiques. De plus, il n’existe pas de modèle in vitro envisageable qui permet l’étude des interactions hôte/Giardia/microbiote. L’ensemble des souches de probiotiques qui seront administrées in vivo auront fait l’objet d’études préliminaires in vitro et seront le fruit d’une première sélection visant à ne garder que les souches ayant un réel intérêt anti-Giardia. Préalablement, l’activité transcriptionnelle, la quantité de protéine produite, ainsi que la capacité de ces protéines à hydrolyser les acides biliaires conjugués ont été étudiées afin de sélectionner uniquement des souches ayant un fort potentiel in vivo. Pour chaque formulation, des études de faisabilité, de stabilité de l’activité sont réalisées. Ainsi les formulations qui seront étudiées in vivo seront également issues d’un processus de sélection afin de limiter le nombre de groupes et donc le nombre d’animaux entrant dans cette étude.

Réduction

Pour la procédure sur souriceaux non sevrés, le nombre d’animaux sera réduit au maximum pour mesurer l’efficacité d’un traitement et comparer les traitements entre eux. Afin de déterminer le nombre d’animaux que nous utiliserons au cours de ces études, nous nous appuyons sur l’expérience de collègues ayant déjà utilisé ce modèle. De plus il a déjà été montré et validé par 2 publications que 12 animaux par groupe séparés en 2 lot de 6 animaux étaient suffisants. Pour le modèle de souris âgés de 3 semaines, une publication récente a démontré que 16 animaux par groupe séparés en 2 sous-groupes de 8 animaux étaient suffisants.

Raffinement

Un suivi journalier du bien-être des animaux sera effectué via un cahier de suivi rempli quotidiennement. Les gavages intragastriques des animaux seront pratiqués par des expérimentateurs formés et entrainés. La présence d’une procédure d’entrainement spécifique permettra un raffinement des autres procédures présentes dans le projet. Un enrichissement de milieu sera mis en place pour améliorer les conditions d’hébergement des souris : ajout de cellulose déchiquetée et bâton à ronger. Une attention particulière sera faite pour réduire au minimum les temps de séparation mère-souriceaux dus aux gavages ou aux autres manipulations. Les souriceaux seront manipulés avec des gants imbibés de l’urine et fèces de la mère afin de réduire le risque de rejet et/ou cannibalisme de la mère. L’établissement de points limites s’appuyant sur des paramètres objectifs facilement quantifiables (poids, mobilité) sera mis en place afin d’éviter efficacement tout état de souffrance aux animaux.

Choix des espèces

Deux espèces de Rongeurs sont utilisées pour les études expérimentales de la giardiose : la souris et la gerbille de Mongolie qui est beaucoup plus difficile à manipuler et très sensible au stress et qui n’est utilisée que lorsque le modèle souris ne peut pas être utilisé notamment pour étudier la giardiose chronique. Les modèles souris sont des modèles reproductibles. Ils correspondent aux modèles les plus utilisés pour tester des traitements contre la giardiose. L’infection par Giardia n’est possible que chez le souriceau avant sevrage et jusqu’à l’âge de 4 semaines. Après cet âge, l’infection est inconstante ou nécessite un traitement préalable des animaux (immunosuppression ou antibiothérapie pour détruire la flore digestive). La variabilité de l’infection est plus faible avant sevrage.

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès l'âge de quinze jours, elles reçoivent une injection d'un agent génotoxique qui provoque un cancer du foie, puis à douze mois des traitements pharmacologiques, pour évaluer leur effet sur un carcinome hépatocellulaire avancé. Le porteur indique qu'à ce stade toutes les souris présentent des tumeurs hépatiques. Il affirme qu'aucune méthode ne permet de remplacer l'étude de la progression tumorale in vivo.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer le potentiel thérapeutique de molécules pharmacologiques dans le carcinome hépatocellulaire. Pour cela, nous utiliserons un modèle murin de cancer du foie qui sera induit par administration d'un produit chimique, le N-nitrosodiéthylamine (DEN), à des souris âgées de 15 jours. Dans ce modèle, les souris développent des tumeurs hépatiques à partir de 9-10 mois. Nous étudierons l'effet de molécules pharmacologiques, un inhibiteur du stress du réticulum endoplasmique (InhRE) et/ou un inhibiteur multikinase (Sorafenib), sur la progression du carcinome hépatocellulaire à 12 mois. L'inhibiteur du stress du réticulum endoplasmique (InhRE) a donné des résultats prometteurs dans un modèle murin précliniqiue de cancer du sein triplement négatif (Logue SE, et al. Nat Commun. 2018 Aug 15;9(1):3267). Il sera administré seul ou en combinaison avec le Sorafenib qui est un inhibiteur multikinase et qui est administré chez les patients en seconde ligne de traitement.

Bénéfices attendus

Les études proposées dans ce projet permettront de déterminer l'efficacité anti-tumorale de l'inhibiteur du stress du réticulum endoplasmique (InhRE) administré seul ou en combinaison avec le Sorafénib sur la progression du cancer du foie à un stade avancé pour après pouvoir les utiliser chez l'homme.

Procédures

Les souris seront soumises à une injection unique de dihétylnitrosamine (DEN) ou son diluant (NaCl) en ip 15 jours après la naissance ; deux injections par semaine d'inhibiteur du stress du réticulum endoplasmique ou son diluant (Kolliphor) à 12 mois pour une durée de 4 semaines ; une administration de Sorafénib 5 fois par semaine à 12 mois pour une durée de 4 semaines.

Impact sur les animaux

L'administration de N-nitrosodiéthylamine (DEN) favorise le développement de tumeurs hépatiques. A 12 mois, les souris présentent une hépatomégalie liée au développement tumoral. L'administration d'InhRE n'est pas associé à un effet secondaire connu.

Devenir

Les animaix seront euthanasiés à la fin des procédures afin de faire un prélèvement de sang et du foie pour étudier les effets de l'inhibiteur du stress du réticulum endoplasmique seul ou en combinaison avec le Sorafénib sur la progression du cancer du foie.

Remplacement

Nous avons recours à des animaux car il n’y a pas de méthodes alternatives. En effet, il n’existe aucun moyen de remplacer une telle étude dans laquelle nous étudions la progression tumorale.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats.

Raffinement

Nous effectuerons un suivi quotidien des souris tout au long du protocole en observant leur comportement et les indices pouvant suggérer une douleur. Si nous observons une douleur chez un animal, cela entraînerait son euthanasie anticipée. Par ailleurs, les animaux sont hébergés en présence de papier kraft et de carrées de coton pour faire le nid, ainsi que des maisonnettes et des dômes en cellulose.

Choix des espèces

La souris est l’espèce couramment utilisée dans ce protocole de carcinogenèse hépatique et pour étudier l'effet de molécules avec un potentiel anti-cancéreux. Pour le modèle d'induction d'un carcinome hépatocellulaire, le protocole consiste en une injection unique de N-nitrosodiéthylamine (DEN), un agent génotoxique, à 25 mg/kg ou son diluant (NaCl) à des souriceaux mâles âgés de 15 jours. En effet, la forte prolifération des hépatocytes à ce stade permet d'induire des mutations dans des cellules en prolifération ce qui permettra le développement de tumeurs hépatiques. Les effets de l'inhibiteur du stress du réticulum endoplasmique (InhRE 30 ug/g) administré seul ou en combinaison avec le Sorafénib (30 ug/g) sur la progression du cancer du foie seront étudiés chez les souris agées de 12 mois car le carcinome hépatocellulaire est diagnostiqué chez l'homme à un stade avancé. A ce stade, 100 % des animaux présentent des tumeurs hépatiques à un stade avancé qui est le stade auquel le cancer du foie est majoritairement diagnostiqué. De plus, à ce stade, la survie des animaux est proche de 100%.

1600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie de deux heures induisant une ischémie-reperfusion du foie, puis plusieurs injections, pour tester une molécule contre les lésions hépatiques après chirurgie ou transplantation. Le porteur qualifie de modérées les douleurs abdominales dues au clamp vasculaire et affirme que l'animal vit normalement. Il conclut qu'il est impossible de reproduire in vitro la complexité de l'ischémie-reperfusion hépatique.

Objectifs

L’hépatite ischémique est une lésion du foie induite par un apport insuffisant de sang ou d’oxygène, induisant la mort des cellules hépatiques. Il a été démontré que la neutralisation d’une protéine libérée par les cellules et les organes et qui est impliquée dans un réflexe primitif de la faim induisait l'activation du flux autophagique dans des modèles de toxicité chronique du foie. Sur la base de ces observations, l’objectif de ce projet est de déterminer si l'inhibition de cette protéine peut prévenir ou traiter l’hépatite ischémique chez des modèles murins appropriés.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique une nouvelle stratégie thérapeutique pour palier à l'ischémie-reperfusion hépatique, qui survient après une chirurgie ou une transplantation du foie et qui influence considérablement le pronostic de la fonction hépatique.

Procédures

Tous les animaux du projet seront soumis une seule fois à une chirurgie induisant l'ischémie-reperfusion hépatique (durée environ 2h/souris). L’acte chirurgical sera réalisé sous anesthésie et analgésie. Les animaux recevront 2, 4, 6 ou 8 injections sous-cutanées (animal vigile). Tous les traitements seront administrés par voie intra-péritonéale, les animaux recevront 2, 4, ou 5 injections (animaux vigiles). La durée des injections sous-cutanées et intra-péritonéales est de quelques secondes.

Impact sur les animaux

Tous les animaux du projet seront soumis à une chirurgie induisant l'ischémie-reperfusion hépatique. Aucun autre effet indésirable n’est attendu en dehors de ceux connus et causés par cette induction. Les douleurs abdominales dues au clamp vasculaire seront modérées car les procédures n’excéderont pas 72h. L’animal vit normalement (ses mouvements et sa respiration ne sont pas impactées). Les injections intra-péritonéales et sous-cutanées (animal vigile) ne provoquent pas de symptômes majeurs autre que la douleur de piqure de l’aiguille.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, les conséquences et les effets sur l’organisme de l'ischémie-reperfusion hépatique vu sa complexité.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 1600 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Les tests statistiques utilisés seront des tests « LogRank » pour la survie, et des tests « Anova » pour comparer les divers groupes de traitements.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie/analgésie des animaux, utilisation de lampes chauffantes...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Selon les procédures, les animaux seront utilisés entre 7 et 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. Selon les procédures, les animaux seront utilisés entre 7 et 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

48 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des ions perchlorates dans l'eau de boisson pendant huit semaines, puis une colite est provoquée par instillation intrarectale d'un mélange d'acide et d'éthanol, l'animal étant maintenu allongé quinze minutes, avant une mise à mort trois jours plus tard. Le porteur teste l'hypothèse d'un lien entre pollution aux perchlorates et maladie de Crohn, et qualifie de "très modérée" la colite obtenue. Sur le remplacement, il affirme l'absence de méthode alternative et juge "indispensables" douze rats mâles par groupe.

Objectifs

Ce projet vise la réalisation d’une étude exploratoire de l’effet pro-inflammatoire des ions perchlorates sur la muqueuse digestive du rat.

Bénéfices attendus

Nous n'avons pour le moment aucune information concernant un potentiel effet pro-inflammatoire au niveau intestinal des ions perchlorates chez l'Homme ou dans un modèle expérimental. L’hypothèse testée trouve son origine dans la corrélation spatiale très significative entre pollution des sols et des nappes phréatiques par les perchlorates et prévalence de la maladie de Crohn, qui est maximale en région Hauts de France. D’autre part, le registre EPIMAD sur les maladies inflammatoires du tube digestif apporte un certain nombre d’arguments épidémiologiques compatibles avec cette hypothèse.

Procédures

Les animaux seront soumis pendant 8 semaines à des ions perchlorates administrés par le biais de l'eau de boisson ou non dans le cas des contrôles. Au bout de 8 semaines, une inflammation expérimentale du colon (colite) sera induite par administration d'un mélange d'acide et d'éthanol 50% par voie intrarectale (n=24 animaux au total). L'administration intrarectale du mélange d'acide et d'éthanol se fait très progressivement pendant environ 1 min. Les animaux doivent ensuite être maintenus allongés sur le dos, le tête orientée vers le bas, pendant 15 min supplémentaires afin de prévenir une éjection rapide du produit. Les animaux témoins "colite" (groupes Contrôles et Perchlorates) recevront 100µl en intrarectal d'un mélange sérum physiologique/éthanol. Tous les animaux seront mis à mort 3 jours après l'induction de la colite ou leurs témoins respectifs (solvant).

Impact sur les animaux

Nous n'attendons aucune nuisance particulière sur les animaux. Les ions perchlorates à la dose utilisée ne doivent induire aucun effet particulier sur l'état général des animaux sur une durée de 8 semaines. Le modèle de colite expérimentale à la dose utilisée est un modèle de colite très modérée. Les modèles de colite expérimentale sont parfaitement maîtrisés par le responsable de projet et ce modèle a déjà été pratiqué dans un précédent projet et hormis une diminution de la prise alimentaire et une perte de poids modérée les 2 premiers jours de la colite, aucune autre altération du comportement des animaux n'a été observée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la période d'administration des ions perchlorates et l'induction de la colite expérimentale.

Remplacement

Le recours au modèle animal rat est justifié par l’absence de méthodes alternatives pour les études physiologiques et comportementales telle que des modèles in vitro. De plus, nous étudions des paramètres liés à la survenue de l'inflammation intestinale ainsi que son intensité. impossible à modéliser autrement que par une étude chez l'animal de laboratoire. De plus, les interactions entre différentes fonctions physiologiques et organes (système digestif, microbiote, foie...) est impossible à reproduire par un modèle in vitro. Nous savons également que l’inflammation colique peut produire une élévation de la température corporelle qu’un organisme vivant peut compenser par la mise en place de mécanismes d'adaptation par le biais de certaines fonctions telle que le sommeil ou la prise alimentaire, contrairement à des cellules en culture. De plus le modèle d’induction de la colite expérimentale chez le rat est bien décrit dans la littérature et maîtrisé par l’expérimentateur du projet.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet (n=48; n=12/groupe expérimental, 4 groupes) a été estimé sur la base de nos précédentes expériences sur le même modèle ou des modèles différents utilisés les années précédentes. S’agissant d’une étude exploratoire « preuve de concept », aucun résultat expérimental n’est disponible à ce jour. Nous avons décidé de ne pas travailler sur des femelles gestantes comme ce fut le cas dans nos précédents projets et explorer ensuite les effets sur la descendance mâle et femelle. Dans le cadre de ce projet nous souhaitons commander spécifiquement des animaux mâles juste sevrés de façon à limiter le nombre total d'animaux impliqués. En fonction des résultats que nous obtiendrons dans cette étude préliminaire, nous déposerons un projet plus complet et de plus grande envergure dans lequel les populations mâles et femelles seront étudiées. En conséquence, 12 animaux mâles par groupe expérimental seront indispensables pour s'affranchir de la variabilité des réponses et pour obtenir des données exploitables tant sur l'aspect variabilité physiologique qu'analyse statistique.

Raffinement

Dans la mesure où nous travaillons sur un modèle expérimental de colite, nous ne pouvons utiliser d'antalgique et d'anti-inflammatoire qui auraient pour conséquence de modifier les réponses physiologiques rendant nos résultats inexploitables mais ces traitements pourront être administrés avant induction de la colite si nécessaire. Nous fournissons en annexe une grille d'évaluation de la douleur qui sera scrupuleusement respectée. De par l'expérience que vous avons de ce modèle inflammatoire, nous savons que la dose utilisée est une dose faible permettant d'induire une colite très modérée n'entrainant aucun décès prématuré d'animaux et que très peu d'effets visibles chez le rat sont observés, excepté une perte de poids et quelques selles molles sur les 2 premiers jours expérimentaux après induction de la colite. Dans le cas d'un dépassement d'un score de 9, l'animal sera isolé de ses congénères et mis à mort par une injection d'euthanasiant chimique. En ce qui concerne les conditions d'hébergement, les animaux seront stabulés en groupe (nombre en fonction du poids conformément à la règlementation en vigueur) tout au long du projet. Un enrichissement sera apporté par des tunnels en carton et des frisettes de papier. Des points limites ont été mis en place, ainsi qu'une méthode d'évaluation pour la prise en charge des animaux.

Choix des espèces

Le modèle d’étude sera le rat pour les raisons suivantes : - il est un bon indicateur des effets éventuellement observés chez l’Homme de par la similitude des réponses physiologiques et comportementales mises en jeu lors de l’exposition à différents types de polluants environnementaux, - il s’agit d’un modèle de référence pour l’étude de l’inflammation intestinale comme référencé dans la littérature - l’hébergement au sein de l'animalerie est adapté depuis plusieurs années à cette espèce. Les animaux mâles commandés seront des animaux juste sevrés de façon à pouvoir débuter l'administration orale des ions perchlorates vers l'âge de 5 semaines de vie maximum et pour une durée de 8 semaines consécutives.