Système immunitaire
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Etude de l’impact du microbiote sur les interactions hôte / agent pathogène infectieux viraux et bactériens
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
3 600 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance allant de léger à sévère pour 2 000 d'entre eux, tous tués à l'issue pour prélever leurs organes. Ils sont infectés par bain pendant deux à cinq heures, ce qui peut provoquer nécroses, lésions vasculaires et nage erratique. Le projet étudie comment le microbiote intestinal protège le poisson contre les infections virales et bactériennes. Le porteur présente le poisson zèbre comme un modèle qui "permet de remplacer en partie les modèles mammifères", tout en soumettant 3 600 individus à l'infection expérimentale.
Objectifs
L’étude des maladies infectieuses chez le poisson zèbre consiste à caractériser (1) les microbes qui causant des maladies infectieuses, (2) les bactéries naturellement associées au poisson (son microbiote), et leurs interactions. Pour comprendre les maladies infectieuses et leurs mécanismes, on les reproduit au laboratoire. Ceci permet d’étudier les signes cliniques et la mortalité induite, et de comparer les stratégies des microbes causant des maladies en aquaculture, ou affectant la santé humaine. Le microbiote joue un rôle très important pour protéger le poisson contre les infections, en induisant une résistance à la colonisation. Cette protection s’exerce via la compétition pour les ressources, la stimulation du système immunitaire et les interactions complexes au sein des communautés microbiennes. Cependant ces mécanismes restent mal compris. Les recherches menées sur des poissons zèbres « gnotobiotiques », c’est-à-dire à microbiote contrôlé, ont mis en évidence son influence sur la sensibilité aux infections, le développement immunitaire et les réponses inflammatoires. Ces études concernent surtout les stades larvaires, laissant encore peu explorés les effets aux stades juvénile et adulte, alors que la composition du microbiote évolue au cours du développement. Les modèles « gnotobiotiques » s’imposent donc comme des outils essentiels pour étudier les interactions entre l’hôte, son microbiote et les agents pathogènes. L’importance de ces interactions est soulignée par l’usage du poisson zèbre comme modèle en biologie du développement, infectiologie, neurologie et cardiologie. Comprendre les interactions microbiome–hôte permettrait une meilleure standardisation des modèles d’étude. Des modèles de poisson zèbre gnotobiotique existent déjà, couvrant les quatre premières semaines de vie du poisson, potentiellement jusqu’au stade jeune adulte. Divers modèles d’infection ont été standardisés. Les infections par balnéation reproduisent les voies naturelles d’infection des pathogènes étudiés et seront dans ce projet combinées à des prélèvements biologiques post-mortem. Ce projet vise à : (1) caractériser l’impact du microbiote sur les infections virales et bactériennes, (2) analyser les mécanismes des réponses immunitaires chez des poissons à flore contrôlée, et (3) évaluer l’influence du microbiome sur le développement du système immunitaire.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus en fin de projet sont les suivants : - Compréhension de l’impact du microbiome sur la sensibilité aux infections - Compréhension des mécanismes des réponses immunitaires des poissons à flore contrôlée lors de ces infections - Compréhension de l’impact du microbiome sur le développement de l’immunité du poisson-zèbre. Ces éléments sont essentiels pour le développement du modèle poisson zèbre en infectiologie, qui permet de remplacer en partie les modèles mammifères. Le modèle poisson zèbre gnotobiotique peut offrir un contexte expérimental particulièrement pertinent pour modéliser les interactions entre le microbiote et l’hôte et leur impact sur les infections, à la fois chez l’homme (dans le cadre d’approches « One health ») et chez les poissons d’élevage. La prévention des pathologies est un élément essentiel du développement d’une aquaculture plus « durable ».
Procédures
Les immunisations ou infections expérimentales sont réalisées sur poissons vigiles par bain et impliquent une séance de 1 heure (immunisation) - éventuellement réalisée de nouveau une seconde fois si rappel nécessaire- ou 2 à 5 heures (infections)
Impact sur les animaux
Les manipulations ainsi que la mise à jeun 24 heures avant l’infection peuvent engendrer un stress. L’infection peut conduire chez certains individus à une perte d’appétit, un excès d’excrétion de fèces, une nécrose au point d’injection, différentes lésions en particulier vasculaires, et une nage erratique.
Devenir
Les poissons de ce projet encore en vie en fin d’expérience seront euthanasiés pour prélèvement d’organes.
Remplacement
Il n’existe pas de modèles cellulaires permettant d’étudier les réponses immunitaires systémiques des poissons. La compréhension des processus infectieux, la quantification des réponses immunitaires à l’échelle de l’organisme entier et en particulier la protection induite par les vaccins/immunostimulants, les migrations des globules blancs responsables de la protection et de la mémoire immunitaire, plus généralement la compréhension des interactions hôte-agent infectieux nécessitent de soumettre l’animal à une immunisation ou à une infection expérimentale. Le projet associé à cette DAP chez le poisson zèbre ne peut donc être réalisé avec des méthodes alternatives. Seul un animal ayant un système immunitaire adaptatif permet d’évaluer l’induction d’une réponse spécifique de l’antigène par globules blancs, ou un état de résistance lors d’une épreuve d’infection expérimentale.
Réduction
La taille des groupes (50 individus) a été fixée pour permettre à la fois d’évaluer des taux de survie ou de protection et de réaliser les échantillonnages pertinents sur un nombre suffisant d’individus dans le contexte très particulier des poissons zèbres gnotobiotiques sur lesquels nous avons très peu de recul à ce stade. Cette étude permettra précisément de réduire le nombre d’animaux utilisés dans les projets à venir.
Raffinement
Le stress lié à la manipulation est compensé par anesthésie jusqu’à sédation pour une durée < 2 min. Tout au long de leur vie, les poissons sont élevés dans les meilleures conditions possibles. Ils sont nourris 2 fois par jour. Ils sont toujours en présence de congénères. Sous les aquariums, nous positionnerons un poster imitation « substrat ». Les animaux sont observés au moins deux fois par jour. Les individus atteignant le point limite défini dans le projet sont sortis du protocole et euthanasiés.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre est un modèle d’étude important des relations hôte-pathogène. La disponibilité de poissons zèbres gnotobiotiques est essentielle pour réaliser les recherches décrites ici. Des outils de manipulations de l’expression des gènes, de nombreux mutants, et la séquence complète du génome de cette espèce concourent aussi à son succès. De nombreux modèles de maladies humaines ont été développés chez le poisson-zèbre, non seulement chez la “larve” ou le jeune alevin, mais aussi aux stades plus tardifs ; le poisson-zèbre au stade adulte a été en particulier utilisé pour l’étude des relations entre les mycobactéries et leur hôte. Le modèle poisson zèbre est aussi un modèle de criblage de drogues. Il est donc important de comprendre les mécanismes et modalités des réponses immunitaires innées et adaptatives dirigées contre des agents infectieux, dans ce modèle. Dans ce projet, les poissons seront utilisés entre jour 6 post éclosion et 6 mois. Le modèle gnotobiotique a été caractérisé entre 6 et 28 jours post-éclosion. Des expériences seront aussi réalisées à des stades postérieurs, jusqu’à 6 mois afin d’examiner des poissons dont le système immunitaire adaptatif est complètement mature.
Rôle de la détection des pathogènes dans les différences liées au sexe au cours du vieillissement chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Élevées jusqu'à dix-huit mois pour étudier le vieillissement immunitaire, 1 000 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent jusqu'à deux injections et des prélèvements sanguins sur animal vigile. Le porteur affirme qu'aucun modèle ne reproduit l'évolution du système immunitaire avec l'âge, rendant la souris "indispensable". En fin d'étude, 940 souris sont tuées pour prélèvements, 60 réutilisées dans d'autres projets.
Objectifs
Au cours du vieillissement le système immunitaire s’affaiblit et fonctionne moins bien. Chez la souris une inflammation persistante associée à des changements du microbiote contribue à cet affaiblissement. Ce phénomène est différent entre les mâles et les femelles. Certaines molécules du système immunitaire permettent de détecter la présence d’agents pathogènes et de déclencher une inflammation. Une activation excessive de ces mécanismes pourrait entretenir cette inflammation au cours du vieillissement. L’objectif de ce projet est d’étudier si ces mécanismes fonctionnent différemment entre mâles et femelles et s’ils peuvent expliquer les différences observées le vieillissement du système immunitaire.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait de mieux comprendre comment certains mécanismes du système immunitaire, impliqués dans la détection des agents pathogènes, participent à l’installation d’une inflammation persistante avec l’âge. Il pourrait également expliquer pourquoi le vieillissement du système immunitaire diffère entre les mâles et les femelles. Ces travaux pourraient ainsi ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques visant à mieux contrôler l’inflammation et favoriser un vieillissement en meilleure santé.
Procédures
Des animaux recevront au maximum 2 injections (1min/sur animal vigile). Certains animaux feront l’objet d’un prélèvement de sang (1min/sur animal vigile).
Impact sur les animaux
L’injection peut entraîner un stress et une douleur légère de courte durée. La stimulation des mécanismes de détection des pathogènes peut induire une réponse inflammatoire modérée. Le prélèvement sanguin peut entraîner un stress et une douleur légère de courte durée.
Devenir
940 animaux seront mis à mort afin de récupérer tous les prélèvements nécessaires à l’étude de l’affaiblissement du système immunitaire. Les 60 animaux n’ayant subi qu’un seul prélèvement de sang seront réutilisés dans d’autres projets.
Remplacement
Ce projet a pour objectif d’étudier comment certains mécanismes du système immunitaire, impliqués dans la détection des pathogènes, influencent la production de molécules de l’inflammation, et comment ils participent à l’affaiblissement des défenses immunitaires avec l’âge, en fonction du sexe. Ces mécanismes impliquent des interactions complexes entre différents types de cellules et organes de l’organisme. Il n’existe pas de modèles capables de reproduire ces interactions ni l’évolution du système immunitaire au cours du vieillissement. L’utilisation d’un modèle animal constitue une approche indispensable pour répondre aux questions posées.
Réduction
Le nombre d’animaux impliqué a été réduit au minimum nécessaire pour obtenir des données reproductibles tout en s’assurant d’une interprétation statistique fiable. Les résultats seront analysés à l’aide de tests statistiques adaptés. Certaines souris seront gardées en vie pour une réutilisation dans d’autres projets.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Ils seront sous surveillance quotidienne de la part de l’équipe professionnelle de zootechnie et un suivi de la part de l’équipe scientifique sera mis en place en prenant en compte les points limites établis. Si, au vu des critères, un animal est en mal-être, il sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est le modèle de référence dans l’étude du système immunitaire. En effet, de nombreux mécanismes biologiques sont similaires entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation des travaux de recherche sur ce modèle animal. Une partie des souris utilisées auront entre 2 et 3 mois car à cet âge le système immunitaire est mature. Les souris en vieillissement seront utilisées à 12 mois qui est un âge avancé pour évaluer l’affaiblissement du système immunitaire puis à 18 mois avant que les souris ne développent des maladies liées à l’âge.
Etude de la mémoire inflammatoire de la peau chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
Surveillées par une grille de score qui déclenche leur mise à mort si un seuil est atteint, 1 860 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent une à deux chirurgies de la peau sous anesthésie, des changements de pansement sous anesthésie une à deux fois par semaine pendant vingt jours, des gavages et une injection. Le projet cherche à savoir si une blessure cutanée laisse une mémoire inflammatoire modifiant la cicatrisation. Le porteur affirme que la dynamique du tissu cutané et des cellules immunitaires ne peut être reproduite sans un "organisme entier".
Objectifs
La mémoire immunologique permet au système immunitaire de réagir plus efficacement à des agents pathogènes spécifiques lors d'une seconde rencontre. Un autre type de mémoire existe dans certaines cellules immunitaires : la « mémoire inflammatoire », qui permet une réponse amplifiée lors d'une exposition ultérieure à un agent pathogène différent de l’agent pathogène initial. On ignore encore si ce type de mémoire se développe également suite à une inflammation provoquée par une blessure en l'absence de l’agent pathogène. Dans le cadre de ce projet, nous explorerons cette question au niveau cutané, à l'aide d'un modèle de plaie de la peau. Nous nous intéresserons plus particulièrement à l'impact potentiel de ce phénomène sur l'efficacité de la cicatrisation.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche permettra de mieux comprendre l'impact de cette « mémoire inflammatoire » sur les maladies de la peau. À plus long terme, les résultats de ce projet devraient également ouvrir de nouvelles perspectives pour le traitement des plaies chroniques et des lésions cutanées d'origine immunitaire.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie de la peau sous anesthésie une seule fois ou deux fois (durée 15 min). Pour les animaux qui seront suivis au cours du temps, le pansement sera changé sous anesthésie 1-2 fois par semaine pendant 20 jours (durée 3 min). Des gavages (2 jours consécutifs, 5 secondes) et des injections (1 fois, 2 secondes) seront réalisés sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une chirurgie de la peau, avec une douleur modérée. Les nuisances attendues sont : stress de l'anesthésie, risque d'hypothermie, douleur liée à une blessure cutanée et risque d'infection de la plaie. Le pansement sera changé sous anesthésie 1-2 fois par semaine pendant 2 semaines, les nuisances attendues sont : stress de l'anesthésie, risque d'hypothermie. Les animaux subiront un gavage. Les nuisances attendues sont : stress lié au gavage. Les animaux subiront également une injection. Les nuisances attendues sont : stress lié à la préhension et douleur légère liée à la piqure.
Devenir
Aucun animal ne sera maintenu en vie. Les animaux seront mis à mort à la fin du suivi ou pour des analyses post-mortem.
Remplacement
La dynamique du tissu cutané, des cellules immunitaires qu’il abrite ainsi que les interactions et le recrutement potentiel de cellules d’autres organes sont des conditions qui ne peuvent pas être adéquatement reproduites sans un organisme entier. De plus, le système immunitaire est un système dynamique dont les acteurs évoluent entre différentes localisations au sein de l’organisme selon des flux très précis. Enfin, certaines populations cellulaires du système immunitaire se spécialisent particulièrement en fonction de leur localisation, en particulier dans la peau. Ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes cellulaires ne permettent de reproduire cela, ceci nous oblige donc à utiliser des animaux afin de comprendre les interactions cellulaires régulant les réponses immunitaires et inflammatoires dans la peau. Des expériences sur organismes vivants sont donc nécessaires pour compléter les découvertes obtenues sur cellule. De plus, l’utilisation de modèle animal reste indispensable pour pouvoir aborder la phase d’application de nos découvertes en clinique.
Réduction
Le nombre de souris à utiliser a été calculé à l’aide d'un logiciel statistique, pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Dans le cadre du modèle de blessure cutanée, les animaux sont anesthésiés et un analgésique est administré lors de la chirurgie. Des pansements adaptés sont utilisés (compresse stérile, pansement semi-occlusif et bandage de contention). Les animaux seront surveillés et suivis avec la mise en place d’une grille de score et des points limites adaptés.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix car la physiologie de la souris est proche de celle de l’Homme. D’autre part les mécanismes immunitaires sont bien caractérisés chez la souris, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté pour étudier les cellules immunitaires. La connaissance complète du génome de la souris permet d’utiliser de nombreux outils bien caractérisés, ce qui sera particulièrement pertinent dans le cadre de ce projet. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (de 8 à 12 semaines) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux.
Mécanismes inflammatoires impliqués dans deux modèles d’arthrite induite chez la souris 2/3
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Pour étudier les mécanismes inflammatoires d'une arthrite provoquée dans deux modèles, 898 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Réparties sur trois établissements, elles subissent jusqu'à vingt et une injections, une irradiation de quatre minutes, des prélèvements sanguins et des séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur affirme que l'animal entier est "indispensable" car la réponse inflammatoire résulte d'interactions complexes entre organes. La majorité est tuée pour prélever sang, organes lymphoïdes et pattes, une partie conservée pour l'élevage des lignées.
Objectifs
Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs différents. La polyarthrite est une pathologie très fréquente et invalidante qui représente un enjeu de santé publique. Cette maladie auto-immune provoque une inflammation durable des articulations, ce qui peut endommager les os et le cartilage, entraînant des déformations irréversibles. Nous voulons étudier les mécanismes inflammatoires mis en jeu en modifiant leur expression dans deux modèles de souris d’arthrite induite.
Bénéfices attendus
Ce travail nous permettra de mieux comprendre les mécanismes pathogènes à l'origine de la maladie et pourrait ainsi contribuer au développement de thérapies efficaces.
Procédures
Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs : l'élévage dans l’établissement 1, le suivi clinique et traitement dans l’établissement 2, l’imagerie dans l’établissement 3. Les animaux vigiles seront soumis à : 1) contention et 2 injections d'une durée de 10 secondes ou injections 3 fois par semaine pendant 1 semaine ou 7 semaines, soit au final: respectivement 3 ou 21 injections d’une durée de 10 secondes; 2) une irradiation d’une durée de 4 min, une injection unique d'une durée de 40 secondes, un prélèvement sanguin de 15 sec (5 au total). Les animaux anesthésiés seront soumis à 2 injections d'une durée de 10 secondes et à un acte d'imagerie (au total 6 actes d'imagerie de 15 minutes)
Impact sur les animaux
L’irradiation va induire un stress et une faible perte de poids temporaire. Les injections vont induire du stress et une douleur légère de courte durée. Les prélèvements sanguins vont induire du stress. Le développement de l'arthrite va induire des douleurs au niveau des articulations, et une diminution de la mobilité. Les anesthésies gazeuses sont des actes stressants. Le transport des animaux entre les différents sites peut aussi être stressant pour les animaux.
Devenir
La majorité des souris seront mises à mort pour prélèvement de tissus spécifiques : sang, organes lymphoides et pattes afin de réaliser une évaluation approfondie de l’atteinte articulaire et inflammatoire par différentes techniques. Certains animaux de l'élevage avec le bon génotype seront conservés pour le maintien des lignées.
Remplacement
Bien que nous menions en parallèle des études de culture cellulaire pour tester nos hypothèses, le recours à l'animal est indispensable car la réponse inflammatoire et le développement de l’arthrite résultent d’interactions complexes entre plusieurs organes, qui ne peut être étudiée de façon complète que sur des animaux entiers.
Réduction
Un nombre minimum d'animaux nécessaires, déterminé par une analyse de puissance statistique, sera inclus dans chaque groupe. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. les animaux feront l’objet d’une surveillance continue, pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être et des anti-douleurs pourront être administrés si nécessaire. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale et permettra d’avoir un suivi longitudinal du développement inflammatoire et articulaire pour l'ensemble des animaux ainsi qu’une mise à mort de chaque animal au moment le plus informatif. Les souris seront transférées dans des cages de transport agrées, bords opaques, sans visibilité de l’extérieur.Tout au long de la procédure,
Choix des espèces
La souris développe des réactions immunitaires proches de celles observables chez l’homme. Les atteintes articulaires développées dans ces modèles induits sont similaires à celles observées chez l’homme. Les souris adultes seront âgées de 6 à 17 semaines pour évaluer l’efficacité thérapeutique des études.
Modulation de l’environnement tumoral pour améliorer l’efficacité des cellules immunitaires chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 820 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, pour renforcer un traitement anticancéreux en modifiant l'environnement de la tumeur. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales, puis jusqu'à six prélèvements de sang et douze séances de suivi, les tumeurs sous-cutanées réduisant l'appétit. Une partie des souris est immunodéficiente pour accepter des cellules humaines, l'autre immunocompétente. Les bénéfices pour les patients restent au conditionnel, face à un effectif de 1 820 animaux justifié par des références publiées.
Objectifs
Ce projet vise à améliorer l’efficacité d’un traitement innovant contre certains types de tumeurs. Bien qu’il soit déjà utilisé avec succès pour certains cancers, son efficacité reste limitée pour d’autres formes. L’objectif est donc de tester une approche qui pourrait renforcer l’action du traitement en modifiant l’environnement de la tumeur.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à améliorer l’efficacité de traitements innovants contre certaines formes de cancer qui restent aujourd’hui difficiles à soigner. Il repose sur l’idée que la tumeur n’agit pas seule, mais qu’elle évolue dans un environnement biologique complexe qui peut freiner l’action des traitements. En modifiant cet environnement, par exemple en réduisant les mécanismes de protection de la tumeur ou en facilitant l’accès des médicaments aux cellules cancéreuses, cette approche pourrait lever certains blocages responsables de l’échec thérapeutique. À terme, elle pourrait renforcer la réponse aux traitements existants, améliorer les résultats pour les patients et ouvrir la voie à de nouvelles options thérapeutiques.
Procédures
Nuisances liées à l'administration des cellules tumorales ou de traitements sur animal vigile avec anesthésie locale, douleur légère et transitoire possible . Nuisances liées aux prélèvements sanguins (maximum 6) : douleur légère et transitoire, après anesthésie générale. Nuisances liées à la présence de tumeurs sous-cutanées : gêne mécanique légère, possibilité de diminution modérée de l'appétit.
Impact sur les animaux
Tous les animaux seront soumis aux interventions suivantes : • Administration des cellules tumorales : une intervention par animal, associée à une douleur légère, réalisée sur animal vigile avec anesthésie locale, d’une durée inférieure à 1 minute. • Traitement tumoral : une intervention par animal, associée à une douleur légère, réalisée sous anesthésie générale, d’une durée inférieure à 2 minutes. • Administration de cellules : une intervention par animal, associée à une douleur légère, réalisée sur animal vigile avec anesthésie locale, d’une durée inférieure à 1 minute. • Prélèvements sanguins : jusqu’à 6 interventions par animal, associées à une douleur légère, à raison d’une par semaine, réalisées sous anesthésie générale, chacune d’une durée inférieure à 1 minute. • Suivi de la croissance tumorale et pesée : jusqu’à 12 séances par animal sur la durée de l’étude, réalisées sur animaux vigiles, chacune d’une durée inférieure à 1 minute.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser les prélèvements nécessaires à l'étude et les étudier au laboratoire.
Remplacement
Des études préliminaires ont montré qu’il est possible de modifier l’environnement autour d’une tumeur pour renforcer l’effet d’un traitement innovant contre certains cancers difficiles à traiter. L’utilisation de modèles animaux reste essentielle pour confirmer ces observations dans des conditions proches de la pratique clinique. Les approches in vitro et in silico, bien qu’utiles pour certaines analyses mécanistiques ou pour la modélisation, ne permettent pas de reproduire l’ensemble des interactions complexes entre la tumeur, le système immunitaire et le traitement dans un organisme entier. Pour cette raison, deux types de modèles animaux sont utilisés afin de comparer l’effet de cette approche dans différents contextes biologiques et d’évaluer son potentiel pour une application future chez l’humain.
Réduction
Un suivi régulier de la taille des tumeurs sera réalisé afin de recueillir des données longitudinales chez les mêmes animaux, permettant d’analyser la cinétique de croissance tumorale et d’éviter la répétition d’expérimentations distinctes à différents temps d’analyse, contribuant ainsi à limiter le nombre total d’animaux nécessaires. Les différentes conditions expérimentales seront testées en parallèle, ce qui permet de limiter le recours à des groupes témoins supplémentaires et d’éviter des expérimentations redondantes. Le nombre d'animaux par groupe a été défini pour permettre de tester plusieurs approches sur différents types de tumeurs, tout en assurant la reproductibilité et la robustesse des résultats. Cette organisation permet de vérifier l’efficacité des méthodes testées, d’évaluer leur impact sur la croissance tumorale et de garantir une analyse fiable des données. Le dimensionnement des groupes repose sur des résultats antérieurs et sur des références publiées. Les variations observées seront analysées à l’aide de tests statistiques appropriés,, selon le type de comparaison.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement enrichi, avec un maximum de cinq souris par cage. Les interventions, telles que les injections intratumorales et les prélèvements sanguins, seront réalisées sous anesthésie à l’isofluorane (induction à 4 %, maintien à 2 %) et les animaux seront placés sur une plaque chauffante pour maintenir leur température corporelle. Les injections de cellules, qu’elles soient sous-cutanées dans le flanc ou intraveineuses dans la veine caudale, seront effectuées sur des animaux vigiles après anesthésie locale de la peau à la lidocaïne. Une surveillance quotidienne des animaux sera mise en place tout au long des expérimentations. Celle-ci comprendra l’évaluation de leur comportement, de leur activité, de leur état général et de tout signe clinique anormal. Conformément à la grille de scoring établie, des points limites précoces ont été définis, et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
La souris est le modèle de référence pour ce projet car elle permet d’étudier de manière intégrée les réponses antitumorales des cellules étudiées dans des conditions in vivo. Les souris immunodéficientes sont utilisées pour évaluer l’activité de ces cellules humaines sur des tumeurs humaines implantées, sans rejet immunitaire, tandis que d'autres souris immunocompétentes permettent d’étudier l’efficacité de ces cellules murines dans un contexte immunocompétent. L’utilisation de la souris garantit ainsi la pertinence préclinique des résultats et leur transposabilité pour optimiser les stratégies thérapeutiques étudiées dans ce projet dans les tumeurs solides Les souris utilisées seront âgées de 7 à 12 semaines, une tranche d’âge correspondant au jeune adulte, qui est idéale pour les études de réponse aux traitements antitumoraux en raison de leur forme physique optimale et de l’absence de biais potentiels dus aux changements physiques et hormonaux liés au développement, ainsi qu’au vieillissement.
Caractérisation des cellules immunitaires dans l’environnement du cancer buccal afin de développer de nouveaux traitements neutralisant les cellules favorisant la croissance de la tumeur.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 740 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, pour étudier le rôle de certaines cellules immunitaires dans le cancer de la bouche. Selon le modèle, elles ingèrent un cancérigène dans l'eau de boisson pendant seize semaines ou reçoivent une greffe de cellules cancéreuses dans la langue, les lésions gênant l'alimentation et faisant perdre du poids. Le suivi passe par des injections répétées et de l'imagerie sous anesthésie. Le porteur présente ce modèle comme un "outil indispensable" et pose ces travaux comme la base d'une future étude chez l'humain, encore hypothétique.
Objectifs
Le cancer de la cavité buccale est une maladie de la bouche assez fréquente, difficile à soigner car il peut ré-apparaître après traitement et devenir résistant. On sait aujourd’hui que la tumeur n’évolue pas seule : elle est entourée de nombreuses cellules, notamment des cellules du système immunitaire, qui peuvent soit la combattre, soit au contraire l’aider à se développer. Parmi ces cellules, les macrophages sont des cellules capables de s’adapter à leur environnement et de changer de rôle. Dans ce cancer, une protéine appelée tenascine C est présente en grande quantité autour de la tumeur. Cette protéine, qui joue normalement un rôle dans l’organisation des tissus, semble ici favoriser le développement du cancer et perturber les défenses de l’organisme. Nous pensons que le tenascine C agit en modifiant le comportement des macrophages, en les maintenant dans la tumeur et en réduisant leur capacité à lutter contre les cellules cancéreuses. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre ce phénomène pour identifier de nouvelles pistes de traitement contre ce cancer.
Bénéfices attendus
Ces travaux permettront d’identifier les types des contacts entre la tenascine C et les macrophages et les conséquences de ces contacts sur le comportement des macrophages et de leurs cellules voisines, et sur la croissance du cancer. A terme, ces travaux permettront d’identifier des pistes nouvelles de traitement des cancers de la bouche afin de stimuler la défense anti-cancéreuse. Le modèle sur souris de développement de cancer de la bouche représente un outil indispensable pour réaliser une étude des interactions entre les cellules immunitaires et l’environnement du cancer. Ces études chez la souris poseront les bases indispensables d'une future étude chez l'Homme.
Procédures
Modèle d'induction chimique: Administration d’un carcinogène pendant 16 semaines dans l’eau de boisson avec ou sans injection d’agents thérapeutiques (5 injections, 1 par semaine, 30sec/injection). Modèle de greffe orale : préparation des animaux et injection de cellules cancéreuses sous anesthésie générale (30 minutes), puis injections d’une molécule (3 injections, 30sec/injection) permettant de suivre les cellules cancéreuses par imagerie sous anesthésie gazeuse générale (durée max. : 5 min.) avec ou sans injections d’agents thérapeutiques (2 ou 3 injections selon condition en 14 jours, 30sec/injection).
Impact sur les animaux
Modèle d'induction chimique : lésions au niveau de la langue allant de l’épaississement du tissu de langue au cancer invasif, générant une douleur modérée avec impact sur l’alimentation conduisant à une perte de poids. Stress lié à la contention lors des injections d’agents thérapeutiques. Douleur légère liée à la répétition des injections d’agents thérapeutiques (5). Modèle de greffe orale : 1 lésion à l’extrémité de la langue côté droit pouvant produire une douleur modérée avec impact sur l’alimentation conduisant à une perte de poids. Stress lié à la contention lors des injections (anesthésie/molécule pour suivre les cellules cancéreuses/injection d’agents thérapeutiques). Douleur modérée liée à la répétition des injections des molécules en deux semaines pour suivre les cellules cancéreuses (3 injections) et d’agents thérapeutiques (2 ou 5 injections selon condition).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour réaliser les analyses sur les tissus cancéreux.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative qui reproduit l’ensemble des interactions entre un cancer et le système immunitaire dans un organisme vivant. Les modèles plus simples testés (cultures sur boite ou mini-structure biologique qui reproduit certaines fonctions d’un organe) permettent d’étudier certains mécanismes, mais ne reflètent pas la complexité des interactions ni l’évolution de la maladie dans le corps. Les modèles informatiques apportent également des informations partielles, sans représenter la réponse immunitaire globale. Ainsi, l’utilisation de modèles animaux reste nécessaire pour mieux comprendre comment le système immunitaire interagit avec les tumeurs dans des conditions proches de la réalité biologique.
Réduction
Les effectifs expérimentaux ont été déterminés avec un logiciel d’analyse de statistiques prédictives afin d’assurer une forte validité statistique avec un minimum d’animaux. Les analyses statistiques des résultats seront basées sur la comparaison de groupes expérimentaux indépendants 2 à 2 garantissant ainsi une exploitation optimale des résultats tout en réduisant le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Les procédures susceptibles d’induire une douleur ou un stress (injection des cellules tumorales, imagerie) seront réalisées sous anesthésie générale. Un antidouleur sera administré si nécessaire, notamment en cas de perte de poids supérieure à 10 % en 7 jours témoignant d’une douleur. Afin de faciliter l’alimentation et prévenir une perte de poids, du gel nutritif sera mis à disposition dans la cage. Le suivi du bien-être animal reposera sur une pesée bi-hebdomadaire des animaux. Une grille de score sera utilisée pour évaluer l’état général (poids, prise alimentaire, activité, posture, pelage, croissance de la tumeur) et détecter précocement tout signe de souffrance. Des points limites éthiques prédéfinis seront appliqués afin d’éviter toute souffrance inutile, notamment en limitant la croissance tumorale à un volume inférieur au seuil établi. Le suivi de la croissance tumorale sera réalisé par imagerie, permettant d’observer l’évolution de la tumeur chez un même animal au cours du temps. Cette approche améliore la précision du suivi expérimental tout en contribuant à la réduction du nombre d’animaux utilisés, conformément au principe des 3R.
Choix des espèces
Les modèles de tumeurs buccales chez la souris permettent d’étudier le rôle de certaines cellules du système immunitaire, appelées macrophages, dans le développement du cancer. Ces modèles reproduisent des situations proches de celles observées chez l’être humain, ce qui aide à mieux comprendre comment ces cellules peuvent soit freiner, soit favoriser la progression de la maladie. Ces travaux sont nécessaires pour identifier de nouvelles cibles de traitement, en particulier en lien avec une protéine appelée tenascine C, et pour développer de nouvelles approches thérapeutiques, notamment en immunothérapie. Les souris utilisées seront des mâles et des femelles âgés de 8 semaines, un âge auquel leur système immunitaire est pleinement fonctionnel.
Impact d’une exposition alimentaire à un herbicide chez la souris
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Une partie d'entre elles finit remise à un service de formation aux gestes techniques : 351 souris exposées par leur alimentation à un herbicide très répandu vont être utilisées pour en étudier les effets indirects via le microbiote intestinal, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont suivies jusqu'à l'âge adulte avec pesées, mesures de glycémie et un modèle d'inflammation intestinale provoquant perte de poids et diarrhées. La plupart sont tuées pour prélever des échantillons ou fabriquer des organoïdes intestinaux, tandis que 45 reproductrices sont ensuite remises à un service de formation à la contention et aux gestes techniques. Le porteur présente cette réaffectation comme un moyen d'"optimiser leur utilisation".
Objectifs
Nous étudierons un des herbicides les plus utilisés dans le monde qui agit en bloquant un mécanisme essentiel chez les plantes, ce qui entraîne leur mort. Comme ce mécanisme n’existe pas chez les mammifères, cet herbicide a longtemps été considéré comme sans danger pour la santé humaine. Cependant, certaines bactéries présentes dans notre intestin possèdent ce mécanisme. Or, ces bactéries forment le microbiote intestinal, qui joue un rôle important dans la digestion, le système immunitaire et le bon fonctionnement de l’organisme. Des études chez la souris ont montré que l'herbicide peut modifier la composition de ce microbiote. Ces modifications pourraient avoir des conséquences sur la santé, notamment en favorisant des troubles digestifs ou métaboliques. Toutefois, on ne sait pas encore si l'herbicide peut réellement contribuer au développement de ces maladies via le microbiote. Ce projet vise donc à mieux comprendre ces effets en étudiant des souris exposées à l'herbicide par l’alimentation tout au long de leur vie, de manière à se rapprocher des conditions d’exposition humaine.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons approfondir les connaissances sur l’impact de l’exposition alimentaire à un herbicide et fournir des données indépendantes sur le pesticide le plus utilisé et le plus controversé au monde. Nous étudierons certains paramètres peu explorés dans les études toxicologiques réglementaires, à savoir les effets sur le microbiote intestinal, l'inflammation intestinale et le métabolisme. Ces données indépendantes pourront servir aux agences réglementaires et aux politiques pour formuler des recommandations sur l’utilisation de ce pesticide.
Procédures
Les animaux sont répartis en trois groupes (12 mâles et 12 femelles par groupe) et suivis jusqu’à l’âge adulte (J130). Les 3 groupes correspondent à des souris non exposées, exposées à une dose faible et exposées à une dose plus forte d'herbicide incorporé dans l'alimentation. Tous les animaux font l’objet d’un suivi régulier comprenant une pesée hebdomadaire et un suivi de la consommation alimentaire et hydrique (toute la durée de l’étude). Des prélèvements de fèces non invasifs sont réalisés toutes les deux semaines (environ 1–2 minutes par animal). Une mesure de la glycémie à jeun, similaire à celle réalisée chez l’Homme (prélèvement d’une goutte de sang), est effectuée une fois par mois (moins de 1 minute par animal). À partir de J84, trois interventions sont réalisées à deux semaines d’intervalle : • placement en cage individuelle spécifique pendant 23 heures pour la collecte des urines, • test de tolérance au glucose (durée totale d’environ 2 heures avec mesures répétées), • autre test de tolérance métabolique (durée totale d’environ 2 heures avec mesures répétées). En fin d’expérimentation, un prélèvement sanguin est réalisé (moins d’1 minute), suivi de la mise à mort des animaux. Dans un second groupe d’animaux, un suivi similaire est réalisé (pesée hebdomadaire, consommation, prélèvements de fèces toutes les deux semaines). Ces animaux reçoivent en plus un traitement de 7 jours visant à induire une inflammation intestinale, suivi d’une période de récupération de 5 jours, avec observation quotidienne de leur état général (quelques minutes par animal).
Impact sur les animaux
Aucun signe de toxicité notable n’a été observé dans des conditions d’exposition similaires lors d’études précédentes. Les interventions prévues peuvent néanmoins entraîner des effets indésirables modérés et transitoires, incluant un stress lié aux manipulations répétées et une gêne ponctuelle lors des prélèvements. L’hébergement temporaire en cage individuelle peut induire un stress léger à modéré. Le modèle d’inflammation intestinale induit entraîne des signes cliniques modérés à marqués sur une durée limitée, comprenant une perte de poids, des diarrhées et une altération de l’état général. Ces effets sont réversibles chez la majorité des animaux après la phase d’induction.
Devenir
Les souris F1 seront euthanasiées à la fin de l’expérimentation afin de prélever des échantillons qui seront analysés pour répondre à la question scientifique. Les souris F1 surnuméraires seront mises à mort au sevrage pour préparer des organoïdes intestinaux. Les souris F0 des deux sexes (10 femelles et 5 mâles par procédure, soit 45 souris au total) seront mises à disposition de la DAP de formation à la contention et aux gestes techniques de l’établissement déjà autorisée à cet effet, permettant d’optimiser leur utilisation.
Remplacement
Notre laboratoire utilise habituellement des modèles simplifiés (comme des cellules ou des tissus isolés) pour étudier les effets directs de certaines substances sur les organes. Cependant, dans ce projet, nous cherchons à comprendre des effets indirects d'un herbicide, qui pourraient passer par les bactéries présentes dans l’intestin, appelées microbiote intestinal. En effet, cet herbicide agit principalement sur une cible présente chez certaines bactéries, mais absente chez les cellules humaines, ce qui suggère que ses effets pourraient dépendre de ces micro-organismes. Pour étudier ces interactions complexes, il est nécessaire d’utiliser un organisme entier, car le microbiote, l’intestin, le système immunitaire et d’autres organes (comme le foie ou les tissus adipeux) communiquent entre eux et fonctionnent ensemble. À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode alternative permettant de reproduire fidèlement ces interactions dans leur globalité. Dans un second temps, les résultats obtenus permettront d’orienter des études complémentaires sur des modèles plus simples, afin de mieux comprendre les mécanismes en jeu et de limiter à l’avenir le recours aux animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé à l’aide d’un outil de biostatistique (R), sur la base de données issues d’études préliminaires. Cette approche permet de définir l’effectif minimal nécessaire pour mettre en évidence des effets biologiquement pertinents tout en garantissant une puissance statistique suffisante. Ainsi, un effectif de 12 animaux par groupe a été retenu afin d’assurer la robustesse des résultats tout en limitant le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes de 4 dans des cages enrichies comprenant des dispositifs permettant l’isolement si nécessaire. Ils seront manipulés régulièrement afin de les habituer à la contention et de limiter le stress lié aux interventions expérimentales. Une surveillance régulière des animaux sera mise en place tout au long de l’étude afin d’évaluer leur état général et de détecter précocement tout signe de souffrance ou de détresse. Cette surveillance repose sur une grille de scoring intégrant plusieurs paramètres (poids, apparence physique, comportement spontané et réponse aux stimuli), permettant une évaluation globale et standardisée de l’état de l’animal. Une surveillance renforcée sera appliquée lors des phases expérimentales les plus sensibles, notamment lors de l’induction de l’inflammation intestinale. La grille de score, associée à des points limites prédéfinis et adaptés à chaque procédure, permettra de guider les décisions de prise en charge et, si nécessaire, de déclencher l’arrêt de l’expérimentation afin de préserver le bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris est un modèle couramment utilisé en recherche biomédicale, car son organisme présente de nombreuses similitudes avec celui de l’être humain, notamment pour l’étude du métabolisme, du système immunitaire et du fonctionnement intestinal. De plus, de nombreux outils scientifiques permettent d’analyser précisément ces fonctions chez cet animal. Dans ce projet, des souris adultes seront utilisées pour permettre la reproduction, puis leurs descendants seront suivis jusqu’à l’âge adulte. Cette approche permet d’étudier les effets d’une exposition précoce, dès la vie avant la naissance, ainsi que ses conséquences à long terme sur la santé intestinale et métabolique.
Effets individuels et combinés des checkpoints immunitaires sur les réponses neuroinflammatoires des lymphocytes T
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rendues paralysées par l'induction d'une encéphalomyélite auto-immune, 3 180 souris vont être utilisées comme modèle de sclérose en plaques, 2 460 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 720 opérées sous anesthésie sans réveil, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent des injections par voies rétro-orbitale, intradermique, intrapéritonéale et intracardiaque, et développent une dégradation de l'état général avec déshydratation, dénutrition et paralysie. Le porteur indique que les animaux ne peuvent être ni réutilisés ni adoptés du fait de la maladie induite, ce qui justifie leur mise à mort. Une partie des corps sert ensuite à des prélèvements d'organes pour des analyses complémentaires.
Objectifs
Les lymphocytes T sont des cellules clés de notre système immunitaire, mais lorsqu’ils sont mal régulés, ils peuvent attaquer nos propres tissus et provoquer des maladies auto-immunes. Ces cellules sont contrôlées par des « points de contrôle immunitaires » qui agissent comme des freins pour limiter leur activité. La sclérose en plaques est une maladie auto-immune du système nerveux central, touchant environ 2,8 millions de personnes dans le monde, où des lymphocytes T hyperactifs provoquent inflammation et destruction des neurones. Nous étudions deux points de contrôle immunitaires identifiés comme régulateurs de cette maladie dans des modèles animaux, qui permettent de reproduire rapidement la progression de la maladie et de tester de nouvelles interventions plus efficacement que chez l’humain. Ce projet vise à comprendre comment ces récepteurs modulent l’activité des lymphocytes T, en étudiant les effets de leur absence, seule ou combinée, sur l’évolution de la maladie et le comportement de ces cellules. Ces travaux devraient apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes fondamentaux des maladies auto-immunes et orienter le développement de thérapies ciblées.
Bénéfices attendus
Ces travaux permettront de mieux comprendre les fonctions et mécanismes d’action des points de contrôle immunitaires BTLA et PD1 dans la régulation des pathologies auto-immunes du système nerveux central. Ce projet vise également à découvrir de nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement de pathologie telle que la Sclérose en Plaques. Les connaissances générées par ce projet pourront être transposées à d’autres contextes de maladies auto-immunes.
Procédures
1 – Injection rétro-orbitale. Injection par voie rétro-orbitaire à J0 et J2, 4-5 secondes/injection. Les animaux seront anesthésiés par isoflurane pendant 30 secondes. 2 – Injection intradermique. Injection par voie intradermique à la base de la queue à J0, 10-15 secondes/injection.Les animaux seront anesthésiés par isoflurane pendant 30 secondes. 3 – Injection intrapéritonéale Injection par voie intrapéritonéale, 4-5 secondes/injection. 4 – Injection intracardiaque Injection par voie intracardiaque, 30-45 secondes/injection. Les animaux seront anesthésiés avec une injection de kétamine/xylasine par voie intrapéritonéale (4-5 secondes/injection)
Impact sur les animaux
L’injection d’anticorps déplétants (anti LT CD8) par voie intra-péritonéale peut engendrer une douleur liée à la piqûre, ainsi qu’un stress dû à la contention (animaux vigiles), sur une durée de 10 secondes. Le développement de l’EAE entraîne une altération de l’état général des souris (déshydratation, dénutrition, anémie, perte de poids) ainsi qu’une paralysie. Les souris sont suivies quotidiennement et évaluées selon la grille de scoring clinique.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort car ils ne peuvent pas être éthiquement réutilisées, remplacées ou adoptées, du fait de l’induction de l'EAE. Toutefois, une partie des souris mises à mort permettra d’effectuer des prélèvements d’organes post-mortem, et ainsi mener des expériences ex vivo en plus des données pré-cliniques qu’elles fourniront.
Remplacement
L’étude des réponses cellulaires impliquées dans la physiopathologie de la sclérose en plaque nécessite l’utilisation du modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) permettant d’intégrer à la fois activation, différenciation immunitaire, migration cellulaire, migration et activation dans le système nerveux central. A l’heure actuelle, il n’existe pas de méthodes alternatives à ce modèle permettant l’obtention de résultats scientifiques exploitables et se rapprochant au maximum des réponses cellulaires attendues chez l’humain.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires pour ce projet a été déterminé en se basant sur l’expérience de l’équipe mais également sur la base des connaissances issues d’études publiées dans des journaux de références et utilisant le modèle d’EAE. Le nombre de 10 souris par groupe pour l’étude clinique et 10 souris par groupe pour l’étude phénotypique devrait nous permettre d’obtenir des résultats robustes en termes de statistique. Etant donné que nos modèles sont susceptibles d’exacerber la sévérité de la maladie, des groupes restreints d’animaux seront initialement utilisés pour la mise au point et l’optimisation des différents protocoles expérimentaux, visant à induire des maladies de différente sévérité. Cette approche permettra alors la validation des différents protocoles et le renforcement de nos différentes procédures. Ces protocoles optimisés seront ensuite appliqués à l’ensemble des expérimentations, limitant ainsi les répétitions supplémentaires (sur un grand nombre d’animaux) pouvant être liées à des problèmes méthodologiques. Tout ceci contribue donc à la réduction du nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
En arrivant au service de zootechnie d’expérimentation, les souris sont soumises à une semaine d’acclimatation sans manipulation par l’utilisateur. Une deuxième semaine d’acclimatation aux manipulateurs et aux gestes de manipulation est ensuite mise en place. Cette deuxième semaine d’acclimatation permet de réduire le stress au cours de l’expérimentation. Quatre types d’enrichissements sont ajoutés aux cages des animaux (igloo, sisal, batonnet bois, coton). Comme indiqué précédemment, les modèles d’animaux que nous utilisons sont susceptibles de développer des pathologies sévères. L’utilisation de souris visant à l’optimisation de nos protocoles expérimentaux nous permettra de moduler la sévérité de la maladie et ainsi de limiter au maximum la souffrance des animaux immunisés.
Choix des espèces
Le modèle d’étude choisi est le modèle murin, dont la physiologie, notamment du point de vue du système immunitaire, permet la transposabilité des résultats précliniques à la médecine humaine. Les souris seront incluses en procédure à partir de l’âge de 7 semaines, à partir duquel leur système immunitaire est considéré comme mature.
MODIFICATION : Production de souris humanisées pour le système immunitaire : modèle d’étude pour l’immunobiologie, les pathologies humaines et l’évaluation de traitements.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Immunodéprimées puis dotées d'un système immunitaire humain, 14 400 souris vont être utilisées pour produire un modèle dit humanisé, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent une irradiation, des greffes de tumeurs ou de tissus humains, des infections par le VIH ou d'autres pathogènes, et jusqu'à huit prélèvements ou injections chacune. Leur immunodéficience les rend très sensibles aux infections, et l'irradiation peut provoquer des tumeurs. Le porteur présente ce modèle comme une alternative au primate non humain, jusque-là "modèle de choix" pour ces études.
Objectifs
L’étude in vivo de la physiopathologie de nombreux pathogènes humains ainsi que l’analyse de l’activité et de l’innocuité des traitements et vaccins contre ces pathogènes ne peut être réalisé chez l’Homme pour des raisons éthiques. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces pathogènes dans un modèle expérimental, des modèles de souris humanisées pour le système immunitaire (souris HIS) ont été développés au cours des deux dernières décennies. Ces souris HIS sont des modèles in vivo précliniques qui permettent d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…). Dans ce projet, nous proposons de produire des souris HIS qui seront par la suite soit utilisées par des laboratoires de recherche dans le cadre de leurs projets de recherche sur les pathologies humaines telles que le VIH (virus de l'Immunodéficience humaine) et/ou de développement de nouveaux vaccins ou traitements. Dans ce projet, nous testerons l’activité de nouvelles immuno-modulateurs thérapeutiques ou de nouveaux vaccins afin de tester leur activité anti-infectieuse ou anti-tumorale et/ou leur impact sur le système immunitaire humain et/ou d’autres tissus humains.
Bénéfices attendus
Ces souris HIS générées dans ce projet permettront d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène de pathogènes humains mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…).
Procédures
- irradiation (1 par animal, durée : quelques minutes) - prélèvement sanguin (1 à 8 par animal, durée : quelques secondes, intervalle 2 à 4 semaines) - injection hydrodynamique (1 par animal, durée 7-8 secondes) - injection intra-péritonéale (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1jour à 1 mois) - injection intra-veineuse (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - injection intra-musculaire (1 à 3 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1semaine à 1 mois) - injection sous-cutanée (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - administration dans eau de boisson (1 à 8 par animal, durée 24h à 1 mois, intervalle 1 jour à 1 mois) - administration par gavage (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - imagerie luminescente intravitale (2 à 10 par animal, durée 5min, intervalle entre 3 jours et 1 mois) - greffe de tissus humain (1 par animal, durée 20min)
Impact sur les animaux
Du fait de leur degré d’immunodéficience et après infection par le VIH, ces animaux sont très sensibles aux infections. Après irradiation certaines souris transgéniques peuvent développer avec l’âge des tumeurs d’origine murine. Après humanisation, ces souris peuvent développer des dermatites. L’apparition des signes cliniques est suivie régulièrement et des soins seront apportés en cas d’apparition de symptômes. De potentiels effets néfastes à long terme de l’irradiation, tels que le développement de tumeurs, pourraient apparaitre. Cependant, cette procédure est appliquée depuis de nombreuses années dans le laboratoire et il n’a été constaté des signes cliniques de ces effets néfastes que dans une minorité (5 mois). Un risque de dyspnée peut arriver dans les 5-10 minutes après injection hydrodynamique. Si une dyspnée est observée la souris sera mise à mort. Après injection cellules tumorales humaines les souris développeront des tumeurs.
Devenir
Les animaux portant un système immunitaire humain(HIS), générés dans la procédure « génération de souris HIS » pourront être inclus dans des procédures permettant de stimuler les cellules immunitaires humaines et/ou de valider l’activité d’immuno-modulateurs. Les souris HIS dont la population de cellules immunitaires aura été augmentée, pourront également être incluses, à la demande des utilisateurs de la plateforme dans les procédures permettant de greffer des tumeurs ou des tissus humains et/ou d’infecter les souris par des pathogènes afin d’étudier in vivo la réponse immunitaire humaine contre des pathogènes humains ou des tumeurs humaines. Ces animaux pourront également être inclus dans la procédure permettant de valider l’activité d’immuno-modulateurs ou dans d’autres procédures qui seront décrites dans une demande de projet. Certaines souris issues de la procédure « génération de souris HIS » pourront également être incluses, à la demande des utilisateurs de la plateforme, dans d’autres procédures qui seront décrites dans une demande de projet ultérieure. Les souris HIS issues de la procédure permettant de valider, dans ce modèle de souris, l’activité d’immuno-modulateurs seront mises à mort par analyse des différents organes post-mortem.
Remplacement
Les modèles in vitro ne permettent pas d’étudier la réponse du système immunitaire humain dans son ensemble, contre des tumeurs ou des pathogènes à tropisme exclusivement humain ni de prédire l’efficacité et l’innocuité de nouveaux vaccins ou traitements immunomodulateurs contre ces tumeurs ou pathogènes. Historiquement, le modèle de choix pour ces études est le primate non humain, le modèle de souris HIS est un modèle alternatif qui peut permettre de limiter le nombre d’études sur le primate non humain.
Réduction
MODIFICATION texte en majuscules Nous évaluons notre niveau de production de souris HIS à 938 souris (75SOURIS/UTILISATEUR X10UTILISATEURS X1.25 car la greffe ne prend que dans 80% de cas) par an soit un total de 4690 souris sur 5 ans. Ces chiffres ont été calculés en tenant compte 1. du nombre d’opérateurs de la plateforme. 2. du nombre d’utilisateurs intéressés par les modèles développés par notre plateforme qui est estimé en moyenne à 10 par an. 3. du fait qu’environ 80% des animaux présenteront un niveau d’humanisation >10%, 4. du fait que la plateforme fournira en moyenne 75 souris humanisées par utilisateur et par an (15 pour étude pilote et 30 pour expérience principale, en comptant 1 étude pilote et 2 expériences principales /utilisateur/an). LE BESOIN DE NOS UTILISATEURS EN SOURIS IMMUNODEFICIENTES A 840 CHAQUE ANNEE, EST DE 4200 SUR 5 ANS EN TENANT COMPTE DE 1. NOMBRE D’OPERATEURS DE LA PLATEFORME. 2. NOMBRE D’UTILISATEURS INTERESSES PAR LES MODELES ESTIME A 8 PAR AN. 3. CE QUE LA PLATEFORME FOURNIRA 105 SOURIS IMMUNODEFICIENTES PAR UTILISATEUR ET PAR AN (15 POUR ETUDE PILOTE 30 POUR EXPERIENCE PRINCIPALE, 1 ETUDE PILOTE ET 3 EXPERIENCES PRINCIPALES /UTILISATEUR/AN). Pour produire ces souris POUR NOS COLLABORATEURS, nous maintenons, en continu, un élevage de 8 LIGNEES DE SOURIS immuno-déficientes. Les souris immunodéficientes seront hébergées en groupe dans un environnement protégé pour assurer leur bien-être, NOUS ESTIMONS POUVOIR FOURNIR 4690 SOURIS HIS ET 4200 SOURIS IMMUNO-DEFICIENTES ET MAINTENIR LES LIGNEES. NOUS UTILISERONS UN TOTAL DE 14400. Nous aurons 3 trios reproducteurs de chaque lignée en continu pendant les 5 années. Ce nombre est le minimum possible pour maintenir un élevage sans croiser les frères/sœurs EN TENANT COMPTE QUE CES LIGNEES PRODUISENT PEU DE PETITS. En partant du fait que chaque femelle d’un trio produit 5 petits par mois, chaque trio produit 10 petits/mois soit 10x12 = 120 petits/an. Ainsi pour chaque lignée, 120x3trios= 360 animaux seront produits chaque année. Pour chaque lignée, il y aura donc une production de 360x5ans = 1800 animaux/lignée sur 5 ans. Nous produirons donc, pour les 8 lignées, 1800x8 = 14400 animaux produits en 5ans. Parmi ces 14400 animaux produits en 5 ans, environ 3600 animaux (25%) seront sacrifiés pour mauvais génotype, 4690 seront humanisés, 4200 SERONT UTILISES POUR TESTER LES NOUVEAUX TRAITEMENTS DE NOS COLLABORATEURS, les 1910 animaux restants assureront le maintien des colonies.
Raffinement
La planification des expériences en amont et la concertation entre le personnel de la plateforme et les utilisateurs sont des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux. Par ailleurs, lorsque cela sera nécessaire, des études pilotes seront réalisées en amont des études principales. Un outil informatique de randomisation sera utilisé en amont des expériences pour garantir la répartition équilibrée entre les groupes de souris de variables susceptibles d'interférer (biais) avec la mesure ou l'analyse des résultats de l'essai. Enfin, l’état clinique (pelage, mouvement, activité, pâleur, signes de bagarres, apparition de tumeurs) des animaux sera suivi deux fois par semaine pour permettre la détection de signes de souffrance. En cas d’apparition de dermatite, les animaux seront placés sur une litière à base de cellulose et les lésions traitées avec un désinfectant. Après chaque intervention chirurgicale, les animaux seront placés dans des cages chauffées pendant la phase de réveil, et auront du gel hydrique à disposition pendant plusieurs jours. En cas d’apparition de signes de souffrance, un analgésique pourra être administré aux souris. Si les signes de souffrance persistent, une mise à mort sera effectuée pour prévenir toute souffrance inutile.
Choix des espèces
La souris HIS est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale. Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. MODIFICATION texte en majuscules Les souris HIS sont générées par injection de cellules souches hématopoïétiques humaines dans des souriceaux nouveau-nés (
Modélisation et caractérisation de modèles murins précliniques d’infection par les virus respiratoire syncytial (VRS) : étude des mécanismes physiopathologiques et évaluation de candidats thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
2 700 souris, toutes classées en souffrance sévère et toutes tuées à l'issue, vont être infectées par le virus respiratoire syncytial puis traitées par des molécules candidates administrées par voie orale, nasale, intraveineuse ou dans le muscle. Les manipulations répétées incluent gavages, injections et prélèvements sanguins, le gavage comportant un risque d'étouffement en cas de fausse route. Les fonctions respiratoires sont mesurées sur l'animal éveillé, et les organes prélevés après la mise à mort. Le porteur justifie le recours à la souris par l'incapacité des modèles in vitro à reproduire la complexité des réponses immunitaires d'un organisme vivant.
Objectifs
Ce projet a pour but de mieux comprendre les infections causées par le virus respiratoire syncytial (VRS), un virus responsable notamment de bronchiolites chez les nourrissons, et de développer de nouveaux traitements ou moyens de prévention. Pour cela, nous utilisons des modèles chez la souris qui permettent de reproduire la maladie observée chez l’être humain. Nous étudions comment le virus se développe dans l’organisme, comment il se propage et comment la maladie évolue au fil du temps. Nous analysons aussi la manière dont le corps réagit face à l’infection, en particulier au niveau des poumons, mais aussi dans d’autres organes. Cela nous aide à comprendre pourquoi certaines personnes développent des formes plus graves ou plus longues de la maladie. Le projet permet également de tester de nouveaux traitements et des vaccins potentiels afin de vérifier s’ils peuvent diminuer la gravité de l’infection, réduire les symptômes et éviter les complications. Enfin, nous appliquons les principes des 3R (Réduire, Raffiner, Remplacer), qui visent à limiter l’utilisation des animaux et à réduire leur inconfort. Avant toute étude chez l’animal, les traitements sont d’abord testés en laboratoire sur des cellules. Nous adaptons également nos méthodes pour utiliser le moins d’animaux possible et assurer leur bien-être.
Bénéfices attendus
L’objectif de cette étude est de mettre au point et de valider de nouveaux modèles de souris pour mieux comprendre l’évolution de la maladie provoquée par les VRS et d’identifier les facteurs qui rendent certains individus plus sensibles à l’infection. Ces modèles permettront d’évaluer l’efficacité de nouvelles approches de traitement et de prévention contre ces virus. Les résultats attendus de ce projet visent à améliorer les modèles utilisés avant les essais chez l’Homme ainsi qu’à valider des stratégies médicales prometteuses, contribuant ainsi au devéloppement de solutions plus efficaces pour la santé humaine.
Procédures
Les souris recevront différents traitements selon le protocole étudié et la nature des molécules testées. Les produits pourront être administrés par différentes voies : -Par la bouche : Une à deux fois par jour pendant quelques jours, -Par injection dans le ventre : Une à plusieurs reprises selon le calendrier prévu, -Par injection sous la peau : Une à plusieurs reprises selon le calendrier prévu, -Par le muscle, -Par le nez, -Par voie intraveineuse. L’état général des animaux sera observé attentivement avant et après chaque manipulation afin de s’assurer de leur bon rétablissement. Des prélèvements sanguins pourront être effectués à différentes étapes (avant et après infection) afin de suivre la réponse de l’organisme. Les fonctions respiratoires seront mesurées à l’aide d’un appareil permettant d’enregistrer la respiration de la souris sans la contraindre : l’animal reste éveillé et peut bouger à l’intérieur de la chambre. Une observation clinique sera réalisée avant et après chaque mesure pour vérifier qu’il n’y a pas de signe d’inconfort. Certaines procédures nécessiteront une anesthésie, réalisée avec des produits adaptés au poids de l’animal. Dans certains cas, un antidouleur (buprénorphine) sera administré avant l’anesthésie afin d’éviter toute douleur. En fin d’étude, une anesthésie profonde sera pratiquée avant la perfusion terminale, qui consiste à faire circuler une solution dans les organes pour pouvoir ensuite les prélever et les analyser. Cette étape est effectuée uniquement lorsque l’animal est totalement endormi et insensible.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables généralement attendus dans le cadre de nos projets et procédures expérimentales sont principalement liés à la répétition des manipulations : gavage oral, injections (intramusculaire, intraveineuse, intranasale), prélèvements sanguins et mesures physiologiques. Ces interventions peuvent entraîner des effets transitoires, essentiellement dûs à la douleur locale, au stress de contention ou à des réactions tissulaires passagères. - Gavage oral : Un risque d’étouffement existe en cas de fausse route. Dans ce cas l’animal sera placé en position verticale et frictionné afin de dégager les voies respiratoires. Si ces mesures ne rétablissent pas la respiration de l'animal, une mise à mort immédiate sera réalisée. - Injection intramusculaire : La mise en place d’une réaction inflammatoire locale peut provoquer une sensibilité à la palpation, un léger gonflement ou une réduction temporaire de la mobilité des membres postérieurs. - Injection intraveineuse : L’injection par voie rétro-orbitaire peut entrainer un saignement localisé au niveau de l’œil. Une compression douce suite à l’injection est exercée afin de stopper le saignement et limiter la formation d’un hématome. - Injection intranasale : Une irritation locale transitoire peut être provoquée avec un écoulement nasal ou une respiration plus rapide suite à l’administration. Si une détresse respiratoire ou une fausse route surviennent l’animal sera placé en position verticale et frictionné pour dégager les voies respiratoires. Si ces mesures ne rétablissent pas la respiration de l'animal, une mise à mort immédiate est réalisée. - Equipement d'analyse des fonctions respiratoires : La restriction temporaire de mouvement et l’isolement de l’animal peut induire un léger stress pendant la mesure. Afin de limiter cet inconfort une période d’entrainement préalable est mise en place : par une habituation une à deux fois pendant 30 minutes, dans un délai de deux à trois jours avant les mesures. - Prélèvement sanguin : Le prélèvement sanguin par voie submandibulaire est une procédure rapide. Le volume de sang prélevé est adapté au poids de l’animal. La ponction peut induire une douleur brève, une compression douce et immédiate est alors appliquée afin de stopper le saignement et limiter la formation d’un hématome.
Devenir
Pour toutes les procédures prévues dans ce projet, les animaux sélectionnés seront euthanasiés conformément aux recommandations réglementaires, afin de permettre le prélèvement des organes et leur analyse.
Remplacement
À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet pas de reproduire de manière satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans l’initiation des réponses immunitaires lors d’une infection naturelle ou après une vaccination. En effet, les modèles in vitro ne parviennent pas à capturer la complexité des interactions entre les différents types cellulaires, les tissus et les mécanismes systémiques qui se produisent dans un organisme vivant. C’est pourquoi, il est indispensable de recourir à des modèles animaux, qui permettent une étude plus fidèle des réponses immunitaires dans un contexte biologique complet et dynamique. Ces modèles animaux offrent une plateforme essentielle pour mieux comprendre les mécanismes de défense de l’organisme et pour tester l’efficacité des traitements et des vaccins avant toute application clinique.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour chaque type de procédure sera précisé dans le protocole. Les effectifs sont déterminés sur la base d’expériences antérieures et/ou de calculs de puissance statistique, afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons des animaux des deux sexes, âgés de 6 à 20 semaines et répartis en groupes homogènes pour garantir des analyses statistiques pertinentes. Lorsque possible un même groupe témoin sera partagé entre plusieurs expériences afin de réduire encore le nombre d’animaux.
Raffinement
Les souris sont élevées dans des conditions optimales, avec un soin ainsi qu’un respect constant, et sont exposées à divers éléments d'enrichissement pour favoriser leur bien-être. Elles seront hébergées en groupes de 2 à 5 souris afin de prévenir le stress lié à l'isolement. Les cages seront systématiquement enrichies par l'ajout d'éléments comme un dôme, offrant aux animaux un abri, et de la nourriture hydratée, qui sera fournie dès que nécessaire pour pallier toute perte de poids ou déshydratation durant leur hébergement. Pour tous les actes nécessitant une anesthésie, nous privilégions une anesthésie chimique par voie intrapéritonéale. Les souris en expérimentation feront l'objet d'une surveillance quotidienne par du personnel qualifié et formé pour mener ces expérimentations. L'utilisation d'une grille de score spécifique et un suivi pondéral quotidien permettront de détecter rapidement tout signe de souffrance et de mettre en place les actions nécessaires pour la soulager. Étant donné que notre étude porte sur la réponse immunitaire, il est impératif de ne pas administrer d'anti-inflammatoires aux souris. En effet, ces molécules pourraient interférer avec nos résultats en altérant l'expression des marqueurs d’intérêt, ce qui pourrait fausser l’interprétation des réponses immunitaires observées.
Choix des espèces
Nous utiliserons le modèle murin car ce sont des mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’Homme. C’est un animal de petite taille, à reproduction rapide et facile d’élevage. De plus, la communauté scientifique dispose à ce jour d’une bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Le modèle murin est donc un modèle de choix pour l’étude du système immunitaire dans les conditions d’infection grâce aux connaissances acquises et à l’arsenal d’outils existants. En effet, un vaste répertoire d’anticorps ciblant des marqueurs murrins sont disponibles, permettant de caractériser finement la réponse immunitaire par des méthodes à très haut contenu. Les lignées murines utilisées dans ce projet incluent des animaux génétiquement modifiés afin d’étudier l’impact de certaines mutations sur la susceptibilité à l’infection virale et sur les mécanismes de la réponse immunitaire. Ces modifications génétiques sont utilisées exclusivement dans un objectif de compréhension fonctionnelle des voies impliquées dans l’infection et la pathologie respiratoire. Il est important de préciser que ces lignées ne présentent pas, en conditions d’élevage standard, de phénotype dommageable spontané associé à la modification génétique. Elles possèdent un système immunitaire globalement fonctionnel et ne développent pas d’altération physiologique ou comportementale en dehors du contexte expérimental. L’utilisation de ces modèles permet néanmoins de reproduire ou de moduler spécifiquement des voies biologiques d’intérêt (par exemple des récepteurs ou voies de signalisation impliquée dans l’entrée virale ou la réponse immunitaire), afin d’évaluer leur rôle dans la susceptibilité à l’infection et dans la sévérité de la maladie. Ces approches sont indispensables pour établir un lien causal entre une fonction génique donnée et la réponse à l’infection. Ainsi, les lignées génétiquement modifiées sont utilisées non pas en raison d’un phénotype dommageable intrinsèque, mais comme outils expérimentaux permettant de disséquer les mécanismes de l’infection virale et de la réponse de l’hôte. Pour ces expériences nous utiliserons des animaux adultes âgés de 6 à 20 semaines, présentant un système immunitaire mature.
Développement d’anticorps thérapeutiques contre les orthoflavivirus.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Inoculées avec un virus sous anesthésie, 294 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour 216 d'entre elles et sévère pour 78, toutes tuées à l'issue. Le porteur indique que l'infection peut provoquer une maladie virale avec des atteintes neuro-musculaires modérées à sévères, pour mettre au point des anticorps contre les orthoflavivirus. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit la réponse immunitaire complète d'un organisme vivant et en conclut que le modèle animal est "essentiel". À la fin de chaque procédure, les souris sont tuées afin de prélever leur sang, leur cerveau et leur rate.
Objectifs
Dans un contexte d’émergence croissante de virus transmis par les moustiques et de la multiplication des épidémies associées, ce projet vise à développer des anticorps thérapeutiques, c’est-à dire des protéines capables de neutraliser ces virus. L’objectif est double : d’une part, répondre au besoin de contre-mesures médicales efficaces ; d’autre part, étudier la réponse immunitaire antivirale. L’étude se concentre sur le virus West Nile (WNV), un virus pathogène pour l’Homme responsable notamment d’affections neurologiques sévères et ne disposant à ce jour en Europe d’aucune option thérapeutique spécifique et efficace. Plusieurs versions de ce virus seront testées afin d’étudier les anticorps neutralisants produits associés et de les caractériser.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à produire des données essentielles pour le développement de nouvelles immunothérapies antivirales. Elles permettront : -De valider un modèle d’infection murin non létal pour le virus West Nile (WNV), c’est-à-dire déterminer les conditions d’infection qui garantit la survie des animaux, tout en induisant une réponse immunitaire efficace -De générer des anticorps capables de neutraliser le WNV et identifier de nouveaux candidats thérapeutiques ; -De mieux comprendre les déterminants clés de la neutralisation virale lors de la réponse immunitaire ; -De proposer une nouvelle stratégie de développement rapide d’anticorps thérapeutiques applicable à des virus similaires. Plus généralement, ce projet apportera des connaissances fondamentales sur les mécanismes de la réponse immunitaire antivirale, tout en soutenant l’effort de préparation faces aux futures épidémies virales.
Procédures
L’ensemble des animaux seront soumis à une inoculation (infectieuse ou non) sous anesthésie, une unique fois : 3 à 5 minutes par animal, incluant l’induction anesthésique, l’injection et le réveil.
Impact sur les animaux
La pesée des animaux ainsi que les injections de véhicule ou du virus faites sous anesthésie peuvent provoquer un stress de courte intensité. Le virus injecté peut entrainer le développement d’une maladie virale avec des atteintes neuro-musculaires modérées à sévères.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélever leurs organes (sang, cerveau et rate) afin d’en isoler les cellules immunitaires et étudier la réplication virale.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative fiable pour reproduire la réponse immunitaire complète d’un organisme vivant. L’utilisation du modèle animal est donc ici essentielle pour notre étude.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé a été calculé pour correspondre au minimum requis pour une statistique de base, à l’aide d’une analyse réalisée avec un logiciel de calcul de puissance statistique. Les résultats obtenus lors de la première phase du projet serviront directement à limiter le nombre d’animaux engagés lors de la seconde phase.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés dès réception et hébergés en groupe avec de l’enrichissement. Ils bénéficieront d’un suivi clinique quotidien afin de détecter et prendre en charge tout signe de souffrance à l’aide de points limites prédictifs et d’analgésique. Toutes les manipulations se feront sous anesthésie et la totalité des prélèvements seront réalisés en post-mortem. Les données obtenues lors de la première procédure permettront d’établir un modèle d’étude, réduisant les atteintes cliniques des animaux par la suite.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est un modèle de référence pour l’étude des maladies virales et la génération d’anticorps neutralisants. Les animaux seront adultes, commandés à 6 semaines et inoculés entre 7 et 8 semaines. Les modèles animaux décrits dans la littérature pour ce type d’expérience utilisent des animaux de cet âge.
Evaluation du potentiel allergique et de sensibilisation de novo de la graine de chanvre in vivo, en comparaison à un allergène fort et un allergène faible chez la souris Balb/cJRj MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rasées et sensibilisées à répétition par patch ou grattage de l'abdomen sous anesthésie, 260 souris subissent ensuite un gavage déclenchant la réaction allergique, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour analyser organes et fluides. Le protocole compare la graine de chanvre à la noisette et à l'épinard, et peut provoquer démangeaisons, irritations, tremblements et chute de la température corporelle. Le porteur justifie le recours aux souris par l'absence de modèle in vitro reproduisant la réaction allergique.
Objectifs
Les allergies alimentaires sont un problème de santé publique qui connait une augmentation en termes de prévalence et de sévérité ces dernières années. Les allergies sont répandues et ont été classées comme la quatrième pathologie en termes de morbidité par l’Organisation Mondiale de la Santé. Ce projet prend part dans un contexte de transition de régime alimentaire visant à utiliser de nouvelles sources de protéines comme la graine de chanvre. Il est possible de rentrer en contact avec la graine de chanvre par le biais de deux voies majeures : orale et cutanée. La consommation de la graine de chanvre est en plein essor de par son fort intérêt nutritionnel et peut se faire au travers de la farine, de barres énergétiques, de pâtes, de biscuits, de boissons ou encore de yaourts. D’autre part, un contact cutané est possible à travers l’huile ou des crèmes à base de graine de chanvre, utilisées en cosmétiques. La recherche sur les allergies à la graine de chanvre est essentielle, d’une part car les allergènes déjà connus dans les fleurs et le pollen de chanvre peuvent se retrouver dans la graine et d’autre part par la présence de protéines de stockage dans la graine, connues pour leur fort potentiel allergène. Afin de prévenir les possibles allergies qui pourront être liées à la graine de chanvre, il est alors nécessaire d’évaluer son potentiel allergique par rapport à un allergène fort, ici la Noisette ainsi qu’un allergène faible, l’épinard. Dans le cadre de l’allergie, deux manifestations majeures peuvent avoir lieu, i) une sensibilisation de novo, ce qui veut dire devenir allergique à la graine elle-même ou ii) une réaction dite croisée par le biais d’une similarité entre les protéines de la graine de chanvre et d’autres protéines allergènes. La connaissance de la capacité de sensibilisation de novo des protéines est importante pour appréhender et anticiper les risques allergiques futurs. Actuellement, il n'existe aucune connaissance sur la capacité de sensibilisation de novo de la graine de chanvre dans une population générale Non Allergique, malgré l'exposition croissante de la population à la graine de chanvre par le biais des aliments et des cosmétiques. Ce projet sera donc tourné sur le potentiel de sensibilisation de novo de la graine de chanvre.
Bénéfices attendus
[MODIFICATION] [Ce projet a pour objectif d’évaluer le potentiel allergénique et plus précisément de sensibilisation de novo de la graine de chanvre (nature ou grillée) en comparaison avec un allergène fort, la Noisette connue pour induire des allergies et un allergène faible, l’Epinard qui n’est pas connu pour induire beaucoup d’allergies. Ceci permettrait de pouvoir prédire ou bien d’avoir une indication du niveau de risque encouru par les consommateurs de graine de chanvre ou de produits contenant des graines de chanvre et ainsi de prédire le risque de voir une personne devenir allergique à la graine de chanvre par la suite. De plus, ce projet permettra une compréhension plus approfondie des mécanismes immunologiques associés à une sensibilisation à la graine de chanvre.
Procédures
Toutes les souris seront anesthésiées et rasées au préalable de chaque sensibilisation. Les souris seront sensibilisées quotidiennement avec la pose d’un patch, ou 1 fois par semaine pendant 6 semaines avec la pose d’un patch pendant 3 jours ou bien par grattage et application transdermale de l’allergène sur l'abdomen. Le déclenchement des symptômes de l'allergie sera effectué par un gavage, respectivement 3, 10 ou 7 jours après la dernière sensibilisation. Pour un gavage oral, la durée des interventions correspond au temps d’administration (soit environ 10 secondes). Pour les applications épicutanées avec la pose du patch ou transdermale avec le grattage sur l’abdomen, la durée d’intervention correspond au temps d’anesthésie soit 15 à 20 minutes environ. Selon la procédure, les souris auront également un prélèvement d'une goutte de sang à l'extrémité de la queue 1 fois par semaine (de la sensibilisation 3 à la sensibilisation 6) soit 4 prélèvements au total. Ce geste dépend du débit sanguin et dure environ 30 secondes. Pour l’étude principale, les mêmes interventions que pour l’une des procédures de l’étude pilote seront réalisées et les temps d’interventions seront donc similaires.
Impact sur les animaux
Lors de ce protocole, il est possible que les souris aient des effets indésirables suite aux gestes pratiqués : les méthodes de sensibilisation peuvent provoquer certaines nuisances en raison de la répétabilité des gestes (14 jours consécutifs ou 1x par semaine pendant 6 semaines) mais aussi de par la présence d’un patch sur le dos, des démangeaisons dues au rasage et des irritations dues au patch, un inconfort abdominal suite au grattage lors de la sensibilisation transdermale, des symptômes liés à la mise en place de l’allergie provoqués par le gavage oral (tremblements, chute de la température corporelle, douleurs stomacales), ainsi que les anesthésies gazeuses répétées. La prise de température par voie rectale peut également entrainer un inconfort pour les souris.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à la fin de l’expérimentation. Leurs organes et fluides biologiques seront analysés pour mesurer les biomarqueurs de l’allergie et ainsi valider nos modèles.
Remplacement
Dans le cas de l’allergie alimentaire, les modèles in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire efficacement les systèmes biologiques complexes et en particulier le système immunitaire. Dans l’allergie, de multiples types cellulaires peuvent être impliqués et leurs interactions peuvent avoir un rôle dans la physiopathologie. De plus, l’allergie alimentaire est caractérisée par des symptômes que seuls des modèles animaux et en particulier les souris peuvent adéquatement reproduire.
Réduction
[MODIFICATION] Des protocoles d’allergie alimentaire sont régulièrement réalisés au sein du laboratoire, mais aucun protocole utilisant la graine de chanvre ou la Noisette n’a encore été fait. De ce fait, il est impossible de faire un test de puissance. Néanmoins, en se basant sur des tests statistiques et sur la variabilité individuelle lors des anciens protocoles, le nombre de souris pour l’étude principale avec un allergène fort et un allergène faible a été déterminé à 12 souris par groupe soit 60 souris au total par sexe. Cette procédure sera répétée une deuxième fois avec les mêmes 5 groupes de 8 souris par sexe pour s’assurer de la reproductibilité du protocole. Pour l’étude pilote, le nombre de souris a été réduit à 10 par procédure soit 30 souris au total par sexe. Nous anticipons des écarts nets entre les différentes procédures testées, avec des réponses contrastées de type "tout ou rien". Cette amplitude attendue des effets justifie le recours à un effectif réduit, tout en permettant d’identifier le protocole le plus prometteur dès cette première phase. Pour l’étude principale, ce nombre d’animaux permettra d’obtenir des résultats statistiquement exploitables pour la réalisation d’analyses statistiques.
Raffinement
Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux mais aussi la mise en place des procédures expérimentales d’analgésie (avec notamment l'injection d'anti-inflammatoire) et d’anesthésie permet de minimiser l’inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront hébergées avec au moins 3 enrichissements (dôme, tube et coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique. Aussi une étude pilote sera effectuée sur un nombre de souris restreint pour appréhender les méthodes de sensibilisation, l’effet de l’application du patch et l’utilisation du papier de verre et afin d’affiner et de choisir au mieux, le protocole qui sera appliqué par la suite ainsi que pour appréhender la prise en charge de la douleur le cas échéant. Une attention particulière sera portée à la détection précoce des signes de douleur ou de mal-être chez les animaux. Des points limites adaptés ont été définis pour garantir que tout changement significatif d’état de santé d’un animal déclenche une réévaluation. Un arbre décisionnel encadre les actions à mener : surveillance renforcée, tentative de soulagement, puis prise de décision, avec le responsable du bien-être animal et le vétérinaire si l’état de l’animal ne s’améliore pas. En cas de souffrance persistante ou jugée irréversible, l’animal sera retiré du protocole et mis à mort. Cette approche vise à limiter la souffrance et à respecter les principes éthiques de l’expérimentation animale.
Choix des espèces
La souche de souris utilisée constitue un modèle de choix, reconnue dans le cadre d’étude du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de cette souche. Aujourd'hui, il n’existe pas de méthodes alternatives pour étudier efficacement et dans son ensemble la réaction allergique. De plus, l’allergie est caractérisée par des symptômes que seuls des modèles animaux peuvent pour le moment reproduire adéquatement. Ainsi, le modèle animal ici est un élément nécessaire pour modéliser efficacement la réponse physiologique globale du système lors d’une allergie. Les souris auront 3 semaines de vie à la réception et 4 semaines de vie en début de procédure. Quatre semaines est l’âge idéal correspondant à des souris sevrées et adultes ayant un système immunitaire mature.