Système immunitaire

Pour comprendre pourquoi certaines personnes développent la maladie de Whipple, 60 souris porteuses d'une mutation d'un gène immunitaire sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles sont infectées par voie orale par la bactérie Tropheryma whipplei, après un prélèvement de sang et une habituation à boire une solution sucrée à la micropipette. Le porteur attend des effets modérés et transitoires, perte de poids et baisse d'activité, sans mortalité liée à l'infection. Toutes les souris sont tuées pour prélever fluides et organes, l'étude comparant des animaux mutés à des témoins.

Objectifs

Tropheryma whipplei est l’agent responsable de la maladie de Whipple, une maladie chronique rare pouvant être grave en l’absence de traitement. Bien que cette bactérie soit relativement fréquente dans la population générale et souvent portée sans symptôme, seule une minorité de personnes développe la maladie. Cela suggère l’existence de facteurs individuels de susceptibilité. Des études récentes ont mis en évidence l’implication possible d’un gène, FOXP1, qui joue un rôle dans le fonctionnement du système immunitaire, notamment dans certaines cellules impliquées dans la défense contre les infections. Toutefois, son rôle précis dans la réponse immunitaire contre Tropheryma whipplei reste encore mal compris. Nous faisons l’hypothèse qu’une altération de ce gène pourrait perturber la réponse immunitaire et favoriser l’installation ou la persistance de l’infection. L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact de cette altération génétique sur les mécanismes de défense de l’organisme à l’aide d’un modèle expérimental d’infection. Cette approche repose sur l’identification de variations rares de ce gène chez des patients atteints de la maladie de Whipple. Nous analyserons le développement de l’infection, son évolution dans le temps ainsi que les différentes étapes de la réponse immunitaire, en comparant des modèles porteurs de cette altération génétique à des modèles témoins. L’utilisation de ce type de modèle est essentielle pour étudier de manière intégrée la complexité des interactions immunitaires et la dynamique de l’infection à l’échelle de l’organisme, ce qui ne peut être reproduit par des systèmes simplifiés. Ce projet vise ainsi à mieux comprendre le rôle de FOXP1 dans l’immunité contre Tropheryma whipplei et à éclairer les mécanismes expliquant la susceptibilité à la maladie de Whipple.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre la mise en place et la physiopathologie de la maladie de Whipple. Il permettra également de développer des outils diagnostiques et de prise en charge des patients atteints de maladie de Whipple. Les résultats de ce projet permettront d’améliorer la compréhension des mécanismes immunitaires impliqués dans l’infection à T. whipplei et du rôle de FoxP1 dans la régulation de la réponse immunitaire. Ces données pourraient contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques associés aux infections chroniques et aux dysfonctionnements de la réponse immunitaire.

Procédures

Un prélèvement sub mandibulaire sera effectué une seule fois avant l’infection sur souris vigile à l'aide d'une lancette (Golden Rod4MM). Quelques gouttes (100 microlitres environ) de sang sera prélevé sans dépasser le rapport volume/ poids réglementaire. D'autres prélèvements seront réalisés sur animaux morts. La durée de ce geste par le personnel formé et expérimenté n’excèdera pas 1 minute. Le gavage et le MDA font partis des nuisances possibles bien que nous ne pratiquerons le gavage qu’en cas de problème d’habituation à la méthode MDA « Micropipette-guided Drug Administration ». L’habituation au MDA consiste à présenter la solution sucrée à la souris (500microL) le jour 1 en état de contention. La durée de la prise de ce petit volume et la mise sous contention (maintien par le cou) ne devrait pas excéder 1 minute. Le deuxième jour, la souris est légèrement immobilisée en lui maintenant la queue et en lui présentant la boisson. La durée peut être légèrement variable d’un animal à l’autre. L’estimation est de 1 à 2 minutes maximum. A J3, d’après les auteurs de ce processus, la souris boit sans contrainte la boisson. La durée dépendra de chaque souris comme précédemment mais ne devrait pas excéder 2 minutes. Chaque souris se verra proposer seulement le jour de l’infection, cette eau de boisson avec soit du PBS soit la bactérie T. whipplei.

Impact sur les animaux

L’infection orogastrique par T. whipplei est susceptible d’induire des effets indésirables faibles à modérés chez les animaux. Les effets attendus incluent principalement une altération transitoire de l’état général, une légère perte de poids ou un ralentissement de la prise de poids, ainsi qu’une baisse temporaire de l’activité. Des effets digestifs légers, tels qu’une modification transitoire du transit, peuvent également être observés. Ces effets sont généralement modérés, transitoires et réversibles. Aucun effet indésirable sévère n’est attendu, notamment en termes de douleur intense, de détresse respiratoire, de signes neurologiques ou de mortalité liée à l’infection. Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière afin de détecter précocement tout signe de souffrance et de mettre en œuvre, si nécessaire, des mesures adaptées. En cas de signes de douleur, de souffrance ou d’angoisse suite à l’infection, un analgésique (buprenorphine) sera injecté en sous-cutané, à raison de 0.2 mg/kg de poids corporel.

Devenir

Euthanasie de tous les animaux pour prélèvements de fluides et organes.

Remplacement

Il est nécessaire de tester nos observations dans un modèle murin afin de se rapprocher des conditions physiopathologiques de l’infection par T. whipplei et de comprendre les mécanismes immunitaires sous-jacents, dans le but de fournir des pistes diagnostiques et thérapeutiques pour la prise en charge des patients. En particulier, ce modèle permet d’évaluer l’impact d’une perte de fonction hétérozygote de Foxp1 sur l’installation de l’infection, sa persistance et la qualité de la réponse immunitaire au niveau de l’organisme entier. À ce jour, aucune lignée cellulaire ni modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité des interactions entre T. whipplei et les différentes populations immunitaires, notamment les cellules T CD4+ et les macrophages, ni leur coordination dans le contrôle de l’infection. Les approches in vitro ne permettent pas non plus d’étudier la cinétique de l’infection, sa dissémination tissulaire, ni les mécanismes intégrés impliquant plusieurs organes et compartiments immunitaires. De plus, FOXP1 étant un facteur de transcription impliqué dans la régulation de multiples types cellulaires, son rôle ne peut être pleinement compris qu’à l’échelle d’un organisme intact. Le modèle murin constitue donc une approche indispensable et complémentaire aux études génétiques humaines ayant identifié FOXP1 comme gène de susceptibilité à la maladie de Whipple. Il permet de valider fonctionnellement ces observations, d’établir un lien de causalité entre le déficit en Foxp1 et l’altération de l’immunité anti-T. whipplei, et d’identifier les mécanismes impliqués. Ces données sont essentielles pour améliorer l’identification des individus à risque et orienter le développement de nouvelles stratégies diagnostiques et thérapeutiques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit grâce à la mutualisation des techniques et analyses sur un même animal. De plus, du fait de notre expérience (effets modérés de l’infection à T. whipplei), nous avons déterminé que 10 animaux/groupe/temps sont nécessaires à notre étude pour observer une différence statistique significative entre les groupes (p < 0.05) avec une puissance au moins supérieure à 80%.

Raffinement

La mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel ainsi que le suivi quotidien de l’état de santé des animaux permettront le raffinement de ce projet. Ainsi, les animaux seront hébergés en respectant le nombre maximum d’individus par cage, dans des cages équipées afin d’offrir un environnement enrichi et approprié. Tout au long de l’étude, les animaux seront surveillés quotidiennement, ce qui nous permettra d’intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en envisageant l’utilisation d’antalgiques. Dès lors qu’un animal aura atteint un point limite, la souris sera euthanasiée dans le but de réduire toute douleur, souffrance et angoisse.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de choix pour l’étude du système immunitaire.L’étude de l’infection à Tropheryma whipplei implique des interactions complexes entre l’agent infectieux, le système immunitaire et différents tissus, qui ne peuvent pas être reproduites de manière fiable par des méthodes alternatives in vitro ou in silico. Le recours à un modèle animal est indispensable pour étudier la dynamique de l’infection, la dissémination bactérienne et la réponse immunitaire dans un organisme entier. La souris a été choisie en raison : • de la disponibilité de modèles génétiques pertinents, notamment les souris porteuses d’une mutation hétérozygote perte de fonction du gène FoxP1, • de la bonne caractérisation de son système immunitaire, • de l’existence de données bibliographiques soutenant son utilisation dans l’étude des infections bactériennes. Afin de limiter les variations dues à des différences d’âge, des souris adultes de 6 à 8 semaines seront utilisées.

6 612 souris vont être utilisées dans ce projet sur les cellules CAR T, chacune recevant d'abord une greffe de cellules tumorales. Le niveau de souffrance déclaré est modéré, et toutes sont tuées en fin de protocole, sans réutilisation ni adoption possibles puisqu'elles portent une tumeur. Une partie subit la pose chirurgicale d'une fenêtre d'observation, puis des séances d'imagerie sous anesthésie de deux à huit heures. Le porteur présente l'imagerie sur animal vivant comme un moyen de réduire les effectifs, argument qui coexiste avec un total de plus de six mille souris.

Objectifs

Le cancer est une maladie qui touche de nombreuses personnes et dont certains types restent très difficiles à traiter. Ces dernières années, un nouveau type de traitement a été développé : les immunothérapies. Plutôt que d’agir uniquement sur la tumeur, ces traitements aident le système immunitaire du patient à reconnaître et à éliminer les cellules cancéreuses. Parmi ces traitements, les cellules CAR T sont une approche prometteuse. Il s’agit de cellules du système immunitaire du patient, modifiées en laboratoire pour mieux cibler la tumeur. Elles ont déjà permis de soigner certains cancers du sang, mais leur efficacité est encore limitée. L’objectif de notre projet est donc de mieux comprendre comment ces cellules CAR T agissent et pourquoi elles ne fonctionnent pas toujours de manière optimale. Pour ce faire, nous comparerons l’efficacité des cellules CAR T dans des modèles de tumeurs liquides répondant à ce traitement, par rapport à celle obtenue dans des modèles de tumeur solides. En particulier, nous allons étudier : - Par quels mécanismes ces cellules CAR T impactent-elles la croissance des tumeurs ? - Quels sont les obstacles qui empêchent les cellules CAR T d’éliminer efficacement les cellules cancéreuses ? - Comment optimiser ces traitements en favorisant une coopération des cellules CAR T et le système immunitaire du patient Pour répondre à ces questions, nous devons observer en temps réel ce qui se passe dans la tumeur lorsque l’on administre le traitement, et comment le système immunitaire est recruté au site tumoral. Comme c’est impossible chez l’humain, nous utilisons des modèles animaux, en particulier la souris, dont le système immunitaire fonctionne de manière très similaire au nôtre. Nous avons recours à des techniques d’imagerie avancée qui nous permettent de suivre le comportement des cellules dans la durée en minimisant les perturbations pour l’animal et en diminuant le nombre de souris nécessaires aux expériences. En comprenant mieux ces mécanismes, notre objectif est d’améliorer ces thérapies, en les rendant plus efficaces et plus accessibles aux patients, tout en respectant au maximum le bien-être animal, et en limitant l’utilisation d’animaux aux expériences strictement nécessaires.

Bénéfices attendus

Le développement des immunothérapies a profondément transformé la prise en charge du cancer, offrant de nouvelles perspectives aux patients pour lesquels les traitements conventionnels sont inefficaces. Cependant, malgré des succès notables, ces thérapies présentent encore des limites, en particulier dans le traitement des tumeurs solides. Notre projet vise à lever ces freins en approfondissant la compréhension des mécanismes d’action de certaines cellules et en explorant des stratégies pour améliorer leur efficacité. Les bénéfices scientifiques et médicaux attendus sont multiples : 1. Améliorer la compréhension des mécanismes par lesquels ces cellules limitent la progression tumorale : en étudiant à la fois leur capacité à détruire les cellules cancéreuses et leur potentiel à stopper la croissance tumorale, nous pourrons mieux anticiper les mécanismes de résistance et identifier des leviers pour renforcer l’action thérapeutique de ces cellules. 2. Développer des stratégies innovantes pour mobiliser le système immunitaire naturel : nous chercherons à exploiter la capacité de ces cellules à recruter et activer d’autres cellules immunitaires pour amplifier leur efficacité. 3. Identifier des biomarqueurs prédictifs de réponse au traitement : en mettant en lumière de nouveaux mécanismes de contrôle tumoraux et en précisant leur contribution relative, nous pourrons identifier de nouveaux biomarqueurs prédictifs de l’efficacité de ces cellules. Sur le plan clinique, ces avancées pourraient contribuer à accélérer l’intégration des nouvelles immunothérapies en clinique, en fournissant des données précises sur leur fonctionnement et en optimisant leur utilisation pour un plus grand nombre de patients. En outre, notre étude vise à proposer de nouvelles alternatives thérapeutiques basées sur le mode d’action des cellules que nous allons explorer. À terme, il pourrait ouvrir la voie à des thérapies plus efficaces, mieux tolérées et accessibles pour un plus large éventail de patients atteints de cancers résistants aux traitements actuels. .

Procédures

Les animaux recevront au début du protocole une injection de quelques secondes pour implanter la tumeur. Ils seront ensuite manipulés trois fois par semaine pendant moins de cinq minutes pour mesurer la taille de la tumeur dans le cas des tumeurs solides. Les animaux seront observés tous les jours pour évaluer leur état général. Certains animaux recevront une injection de traitement d’une durée de quelques secondes, réalisée une à plusieurs fois selon le protocole. Pour les études nécessitant une observation en temps réel, certains animaux subiront une intervention chirurgicale d’environ 30 minutes à 1 heure afin de poser une fenêtre d’observation. Les animaux concernés par les séances d’imagerie seront anesthésiés puis maintenus endormis entre deux et huit heures selon la durée d’acquisition. Cette séance d’imagerie sera sans réveil pour la plupart des animaux hormis ceux ayant une fenêtre d’observation. Dans les études de tumeurs liquides, certains animaux recevront une injection intraveineuse ou intrapéritonéale de quelques secondes pour transférer les cellules tumorales ou les cellules thérapeutiques ou les autres thérapies. Ces animaux seront ensuite manipulés brièvement une à deux fois par semaine pour un suivi clinique. En fin de protocole, tous les animaux feront l’objet d’une euthanasie d’une durée de quelques minutes pour permettre les analyses cellulaires, protéiques ou génomiques prévues.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, les animaux pourront être exposés à divers effets indésirables liés aux tumeurs, aux traitements administrés et aux procédures expérimentales. Si on se base sur la définition des libertés individuelles de l’animal, les effets indésirables pourraient être les suivants : Faim, soif, malnutrition : certaines tumeurs solides peuvent induire une perte de poids progressive lors d’un développement tumoral avancé, et la fatigue des animaux peut occasionner des difficultés d’accès à la nourriture. Peur, détresse : les manipulations, la contention, constituent des sources potentielles de stress et de détresse. Douleur, lésions, maladie : la croissance tumorale peut être à l’origine de douleurs, notamment en cas de rupture

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront reçu initialement des cellules tumorales.

Remplacement

Les hypothèses seront validées préalablement sur des modèles in vitro avant toute expérimentation animale. En outre, les différentes doses de traitement seront testées in vitro afin de déterminer la dose optimale de la thérapie. Nous utiliserons la littérature scientifique et les bases de données existantes pour optimiser la conception des expériences et réduire la nécessité d’expérimentations in vivo. Néanmoins, les tests in vitro ne permettent pas de récapituler la complexité des réponses immunitaires ayant lieu in vivo. Par exemple, la composition du microenvironnement de chaque organe est très différente et peut difficilement être reproduit in vitro. C’est la raison pour laquelle nous avons recours aux animaux afin de décortiquer le mécanisme d’action de certaines thérapies.

Réduction

L'utilisation de l'imagerie sur l'animal vivant permet de réduire le nombre d'animaux utilisés car l'observation en temps réel permet d'acquérir plusieurs données à partir d’un même animal, en observant les cellules immunitaires avant traitement, puis dans les heures qui suivent l'administration des traitements. Dès que possible, plusieurs analyses seront effectuées sur les mêmes animaux. D'après notre expertise issue des projets précédents et notre collaboration avec le département de statistiques, nous avons déterminé le nombre d'animaux par groupe qui nous permettront de tirer des conclusions scientifiques robustes pouvant directement bénéficier le développement thérapeutique en clinique. Selon les procédures, les paramètres évalués seront variables avec des effets attendus plus ou moins forts. En fonction de notre question le nombre de groupes peut être variables. Ils sont optimisés et réduits au maximum tout en conservant une forte puissance statistique. Nous pourrons donc obtenir des résultats significatifs tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Les animaux de ce projet ne seront pas réutilisés car ils ont reçu de la tumeur.

Raffinement

Des points limites précoces seront appliqués afin de détecter rapidement toute altération de l’état général (baisse d’activité, début de déshydratation, diminution de prise alimentaire, taille de la tumeur). Dès l’apparition de ces signes, des mesures de soutien simples seront mises en place : - Mise à disposition précoce de gel hydrique et de nourriture humide, pour faciliter l’hydratation et l’alimentation des animaux. - Regroupement des manipulations pour réduire la fréquence de contention et limiter le stress associé. - Réhydratation par injection lors des anesthésies profondes prolongées, notamment lors des procédures d’imagerie intravitale - Maintien thermique systématique lors des anesthésies et des procédures d’imagerie pour éviter les variations de température. - Litière douce et soins si ulcération des tumeurs Ces mesures permettront de limiter la douleur et l’inconfort et d’améliorer la qualité de vie des animaux tout au long du protocole.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus adapté à notre étude, car son système immunitaire est proche de l’humain et permet d’évaluer l’efficacité des cellules étudiées dans un environnement tumoral réaliste. Par ailleurs, c’est un modèle très utilisé ce qui permet d’avoir une bibliographie importante. Contrairement aux modèles in vitro, le modèle murin permet d’analyser les dynamiques cellulaires en temps réel. Les interactions entre cellules évoluent au fil du temps, et ces changements ne peuvent pas être reproduits en culture. De plus, nous étudions le recrutement du système immunitaire par certaines cellules, un processus impliquant de nombreuses cellules et signaux provenant d'autres organes qui ne peuvent pas être reproduit en dehors d’un organisme vivant. Enfin, le modèle murin permet d’utiliser des techniques d’imagerie intravitale, qui offrent une observation directe, précise et longitudinale, ce qui réduit ainsi le nombre d’animaux nécessaires en maximisant les données obtenues par individu. Toutes les souris utilisées seront d’âge adulte entre 6 et 16 semaines afin d’étudier un système immunitaire mature et proche de la réponse immunitaire humaine.

Une colite est provoquée chez 832 souris par un agent chimique irritant administré dans l'eau de boisson ou par voie intra-rectale, dans des procédures classées d'un niveau de souffrance modéré. Le RNT décrit pourtant une perte de poids supérieure à 10 pour cent, des diarrhées, une prostration et des signes de douleur au plus fort de l'inflammation. Toutes les souris seront tuées par dislocation cervicale pour prélèvements, certaines plus tôt si les points limites sont atteints. Le projet teste des molécules censées activer la résolution de l'inflammation, un essai chez l'humain restant une perspective lointaine.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité préclinique de molécules ciblant les voies de la résolution de l’inflammation, tout en limitant l’inflammation persistante et la fibrose, dans des pathologies caractérisées par un déficit de ces mécanismes. Depuis quelques années, il a été démontré que de nombreuses maladies inflammatoires chroniques, telles que les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), sont liées à un échec de la résolution de l’inflammation. Les traitements actuels (corticoïdes, immunomodulateurs) agissent principalement en bloquant l’initiation de l’inflammation, ce qui entraîne des effets secondaires importants. De plus, près de 60 % des patients présentent un échappement primaire ou secondaire à ces traitements, soulignant la nécessité de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients résistants ou en échec. Chez les patients atteints de MICI l’absence de résolution de l’inflammation en dépit des traitements existant est la première cause d’échec thérapeutique, ce qui entraine une persistance de l’inflammation, un développement de fibrose et à des symptômes invalidants comme la douleur, les diarrhées chroniques ou un impact sur la qualité de vie et la santé mentale. Notre projet vise à tester, chez la souris, des molécules innovantes capables d’activer ces voies de résolution lorsque celles-ci sont défaillantes, tout en réduisant l’inflammation chronique et en limitant la fibrose, qui constitue une complication majeure des MICI et d’autres pathologies inflammatoires. Les molécules sélectionnées auront été validées in vitro au préalable. Nous comparerons ensuite nos traitements à des références établies dans chaque modèle, où l’efficacité sera mesurée par une accélération de la résolution de l’inflammation, une réduction des lésions tissulaires et une diminution des marqueurs de fibrose, par rapport à un groupe contrôle. 832 animaux pourront être utilisés, ce qui garantit une puissance statistique tout en limitant le nombre d’animaux conformément aux principes des 3R.

Bénéfices attendus

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin sont actuellement traitées principalement par trois types de médicaments : les corticoïdes, les traitements qui diminuent l’activité du système immunitaire et des thérapies ciblées plus récentes. Les corticoïdes permettent de réduire rapidement l’inflammation, mais leur utilisation prolongée peut entraîner des effets indésirables importants, tels qu’une prise de poids, une augmentation de la pression artérielle, des perturbations hormonales et des troubles du métabolisme du sucre. Les traitements immunosuppresseurs, qui réduisent de façon globale les défenses immunitaires, exposent quant à eux les patients à un risque accru d’infections. Les thérapies ciblées, utilisées lorsque les traitements précédents ne sont plus efficaces, agissent sur des mécanismes précis de l’inflammation intestinale et permettent de ralentir l’évolution de la maladie. Toutefois, environ six patients sur dix ne répondent pas durablement à ces approches, un phénomène également observé dans les modèles animaux. De plus, ces traitements peuvent eux aussi augmenter la sensibilité aux infections. Afin de répondre à ces limites, nous avons développé une nouvelle molécule innovante visant à stimuler les mécanismes naturels de résolution de l’inflammation plutôt qu’à inhiber globalement le système immunitaire. Dans des modèles expérimentaux de colite chez l’animal, nous espérons observer une récupération plus rapide du poids, une amélioration des symptômes digestifs, ainsi qu’une amélioration de l’aspect du côlon, indicateur d’une inflammation réduite. L’objectif est de restaurer une morphologie intestinale proche de la normale. Si ces résultats sont confirmés chez l’animal, nous envisageons à terme un essai clinique chez l’Homme, destiné aux patients pour lesquels les traitements actuels ne sont plus efficaces, afin de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique.

Procédures

Chirurgie : Pas de chirurgie ni sutures. Anesthésie : les animaux seront anesthésiés à J0 pour induire le modèle (protocole 3) par injection intra-rectale à raison d’un maximum de 280 souris. Un prélèvement de sang au niveau de la veine mandibulaire sur des animaux vigiles à hauteur d'une fois par semaine maximum pourra être envisagé (50µL par prélèvement). Cette procédure peut concerner l’ensemble des animaux à savoir un maximum de 832 souris. Les traitements

Impact sur les animaux

Modèle 1 : colite induite par un polysaccharide administré dans l’eau de boisson L’administration orale d’un agent chimique irritant entraîne une augmentation de la perméabilité de la paroi du tube digestif, provoquant une inflammation localisée du côlon, comparable à la rectocolite hémorragique observée chez l’Homme. Ce modèle se traduit par une perte de poids et l’apparition de diarrhée, évaluée à l’aide d’un score compris entre 0 et 4. Les animaux sont surveillés quotidiennement pendant la phase aiguë de l’inflammation, puis tous les deux jours par la suite. Lorsque le score de diarrhée atteint 3, celle‑ci s’accompagne généralement d’une prostration, d’une diminution de l’activité et de signes de douleur. Ces manifestations cliniques, associées à la perte de poids, apparaissent généralement entre le septième et le dixième jour après le début de l’induction, avant une récupération rapide, les animaux retrouvant leur poids initial vers le vingtième jour. Le score de diarrhée égal à 3 correspond à un épisode transitoire, observé sur une courte période, avec une amélioration progressive. Durant la phase la plus sévère, les animaux sont suivis quotidiennement et un traitement analgésique est administré afin de limiter la souffrance. Modèle 2 : colite induite par administration locale d’un agent inflammatoire L’administration locale d’un agent inflammatoire associé à un solvant provoque une augmentation de la perméabilité de la paroi colique et un recrutement important de cellules immunitaires. Ce modèle induit une perte de poids supérieure à 10 % ainsi qu’une diarrhée modérée. Les symptômes apparaissent dès le lendemain de l’administration et s’améliorent rapidement à partir du troisième jour. Les animaux sont surveillés quotidiennement pendant toute la durée de l’étude et un traitement analgésique est administré du jour de l’induction jusqu’au troisième jour afin de limiter la douleur.

Devenir

L’ensemble des 832 souris seront mis à mort par dislocation cervicale en fin d’expérimentation pour effectuer des prélèvements biologiques à des fin d’analyse cellulaire ou tissulaire. Au cours d’une des procédures décrites ci-dessus il se peut également que des animaux soient mis à mort précocement si des points limites sont atteints, que ce soit lié à la pathologie elle-même ou aux traitements si leur efficacité s’avère futile.

Remplacement

Le meilleur moyen pour étudier le rôle d'une molécule sur une réponse immune qui est complexe et qui fait intervenir de nombreux acteurs cellulaires est in vivo et ce en utilisant des animaux. En effet, nos molécules d’intérêt pouvant être exprimées par de nombreux types cellulaires et jouant un rôle sur de nombreux acteurs de l'immunité, il n'est pas possible de reconstituer un modèle de dommage tissulaire et d'étudier l'homéostasie d'un tissu dans des modèles in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit autant que possible. En effet les différents axes définis plus haut ainsi que les études pilotes permettront de réduire l’utilisation de l’animal. Les études pilotes sur un nombre restreintes d’animaux et sans traitements thérapeutiques permette de valider la mise en place du modèle dans les conditions d’hébergement de l’animalerie. En amont nous avons étudié par un test statistique le nombre d'animaux nécessaire afin d'observer une différence significative dans nos expériences. Basé sur un test de distribution normale d'échantillons nous avons tout d'abord déterminé la différence attendue entre le groupe contrôle et le groupe traité ainsi que l'écart-type des échantillons grâce à des expériences précédentes. Ceci nous a permis d'obtenir la variante d= 0.79. Pour un test statistique bilatéral n=22 animaux sont nécessaires pour obtenir une différence significative entre le groupe contrôle et le groupe traité dans nos expériences.

Raffinement

Les animaux auront une phase d’acclimatation de 5 jours et ne seront pas manipulés afin de limiter leur stress. Les protocoles sont planifiés afin d’éviter le stress à l’animal et les points limites définis sont bien intégrés afin d’anticiper toute souffrance inutile. Les animaux montrant des signes de douleurs lors de l’expérience recevront de la buprénorphine dans l’eau de biberon (0.003mg/mL). Lorsque les points limites seront atteint, les animaux seront mis à mort par dislocation des cervicales après anesthésie par un mélange d’air/isoflurane 4%. Les animaux ne seront pas maintenus au-delà des délais décrit pour chaque modèle, limitant leur souffrance. Si un animal montre de l’agressivité il sera isolé afin de préserver les autres animaux et mis dans une cage avec des enrichissements de type : dôme ou tunnel, frisottis, coton. Pour finir, si des animaux montrent des difficultés pour s'alimenter, des croquettes mouillées seront mise au fond de la cage.

Choix des espèces

Afin d’étudier différents mécanismes de l’inflammation chez l’animal vivant, nous utiliserons des souris appartenant à plusieurs lignées connues pour leur sensibilité aux modèles de colite induite chimiquement. Ces lignées présentent des niveaux d’inflammation plus ou moins marqués, ce qui permet d’adapter la sévérité du modèle aux objectifs de l’étude. Le choix de la lignée dépend également du traitement testé, certains agissant uniquement chez des animaux exprimant la cible biologique concernée. Les souris utilisées auront entre 6 et 10 semaines car l’inflammation générée par les molécules chimiques utilisées dans les différents modèles est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse inflammatoire.

Nourris à la pipette dès deux jours de vie, sensibilisés chaque semaine pendant six semaines par un patch sur le dos rasé, les souriceaux issus de la reproduction sont ensuite tués pour prélèvement de tissus. Au total 530 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les mères tuées au sevrage et les mâles reproducteurs à la fin de la reproduction. Le projet cherche à savoir si un additif alimentaire déjà présent dans des produits ultra-transformés favorise l'allergie à la noisette chez le nouveau-né. Le porteur affirme que le modèle in vivo est "actuellement le seul adapté" pour reproduire la réponse allergique.

Objectifs

Le projet vise à identifier comment un additif alimentaire incorporé dans les formulations alimentaires pour équilibrer l’apport en phosphate et calcium, peut conduire à des désordres immunitaires via sa capacité à stimuler le système immunitaire et/ou son affinité pour des protéines identifiées comme allergène. Il peut aussi potentiellement modifier le microbiote intestinal et fragiliser la barrière intestinale. L’augmentation de la prévalence des allergies alimentaires observée depuis une vingtaine d’année coïncide avec l’augmentation de la consommation d’aliments ultra-transformés. Parmi les aliments ultratransformés, on trouve ceux contenant des additifs alimentaires, dont le risque de déclencher des réactions allergiques commence à être évoqué. Ils ont une grande capacité de couplage avec des allergènes. Ces mélanges peuvent à la fois favoriser l’exposition des allergènes dans le corps et interagir avec le système immunitaire en impactant la réponse immunitaire du corps. La consommation de l'additif s’établit donc dès les premiers jours de vie, jusqu’à la diversification alimentaire. Notre question est donc : est-ce que la consommation chronique de l’additif alimentaire a un potentiel effet stimulant du système immunitaire chez le nouveau-né et favorise le développement d’une allergie lors de l’étape de diversification alimentaire ? L’allergène choisi est la noisette.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’apporter des connaissances sur le mécanisme d’action d’un additif alimentaire sur le développement d’une allergie alimentaire à la noisette. Par la comparaison des différents paramètres mesurés, le protocole répondra à l’hypothèse formulée suivant la bibliographie, à savoir : l'additif consommé chroniquement participe à la sensibilisation et au déclenchement de l’allergie alimentaire en favorisant l’exposition des allergènes et/ou limitant la dégradabilité des allergènes lors de la digestion. Ce mécanisme est basé sur les grandes capacités de mélange entre l'additif et les allergènes.

Procédures

Les souris issues de reproduction : les fèces seront récoltées 1 fois par avant la première sensibilisation et 1 fois la veille de la mise à mort. Le tétage à la pipette sera effectué chaque jour à partir de 2 jours de vie jusqu’à 21 jours de vie et une fois lors de la mise à mort. Les souris seront sensibilisées 1 fois par semaine sous anesthésie pendant 6 semaines à partir de 3 semaines de vie. Les femelles gestantes seront pesées tous les deux jours.

Impact sur les animaux

Les femelles gestantes seront pesées plusieurs fois par semaine afin de confirmer la gestation par la prise de poids. La pesée peut occasionner un stress chez la souris par la répétition de la pesée. Ce stress est limité par une pesée rapide effectuée par une personne exercée et avec un tube pour éviter la contention. De plus, il est possible que les souris aient des effets indésirables suite aux gestes pratiqués : les méthodes de sensibilisation peuvent provoquer certaines nuisances en raison de la répétabilité des gestes (1 fois par semaine pendant 6 semaines) mais aussi de par la présence d’un patch sur le dos, des démangeaisons dues au rasage et des irritations dues au patch. Enfin, les souris peuvent exprimer de l’inconfort liés aux symptômes à la mise en place de l’allergie provoqués par l’administration de l’allergène (tremblements, chute de la température corporelle, douleurs stomacales), également par les anesthésies gazeuses répétées. Le tétage répété peut occasionner du stress chez la mère et ses petits.

Devenir

A la fin de la procédure, les souris issues de la reproduction seront mis à mort afin de récupérer les différents tissus nécessaires à l’étude immunologique et de la fonction gastro-intestinale. Les souris femelles reproductrices seront mises à mort au sevrage de leur descendance et les souris mâles reproducteurs seront mis à mort à la fin de la reproduction.

Remplacement

Dans le cas de l’allergie alimentaire, les modèles in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire efficacement les phénomènes intervenant à la fois sur le système immunitaire et la physiologie. Pour étudier le mécanisme de la réponse allergique, le modèle in vivo est donc actuellement le seul adapté.

Réduction

Sur la base d’une étude menée récemment au laboratoire, le nombre minimum d’animaux pour obtenir des résultats statistiquement exploitables sur les molécules d'intérêt dans l'allergie conduit à utiliser des groupes de 12 souris chacun. Dans la mesure où cette étude pourrait générer une alerte en santé publique, nous avons des groupes de 12 animaux. Le protocole est répété une seconde fois pour analyser d'autres paramètres de l'allergie par rapport au premier.

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation soient exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux permettent de minimiser l'inconfort et la douleur. Dans le cadre du projet, une gestation compliquée peut être observée. Elle pourra conduire à une mise à mort en fonction du tableau des points limites. Il est aussi possible d’observer une mise bas problématique (ex : cannibalisme). Dans ce cas, les petits seront séparés de la femelle pour être placés dans une autre portée, ou mis à mort si des signes de souffrances ou des blessures sont observés. Les souris seront hébergées dans des cages dans un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité) selon les groupes dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse. L’eau et la nourriture seront mises à volonté dans les cages. Pour les fécès, le personnel est expérimenté et fait le prélèvement tôt le matin là où les souris défèquent un peu plus vite. Celui réduit leur temps d’isolement. Pour les pesées, les souris sont déplacées à travers leur tube d’enrichissement : de leur cage à la balance. Le personnel les habitue à ces tubes dès la fin de leur acclimatation. Pour la pose de patch, la souris lors de son réveil est placée sous lampe chauffante et de la nourriture est déposée au fond de la cage.

Choix des espèces

Au cours de cette étude seront utilisées des souris mâles et femelles. Les souris constituent un modèle reconnu dans le cadre des études du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de ces souches. De plus, nos modèles d’allergie ont été établis sur cette espèce. L’utilisation de souris nous donne accès à de nombreux outils du système immunitaire. Les souris mâles et femelles reproducteurs seront âgées de 6 semaines à leur arrivée. Les souris seront mises en reproduction à 7 semaines de vie, l’âge où elles sont mâtures sexuellement. Les mâles reproducteurs seront mis à mort à la fin de la reproduction et les femelles reproductrices seront mises à mort au sevrage des souriceaux. Les souriceaux issus de la reproduction auront 2 jours de vie pour le premier tétage à la pipette. La première sensibilisation aura lieu au moment du sevrage des souriceaux, à 3 semaines de vie. La mise à mort sera effectuée à 9,5 semaines de vie.