Système immunitaire

224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du poumon puis des injections de liposomes par voie rétro-orbitaire, avant un prélèvement de la totalité du sang par ponction intracardiaque et le prélèvement de leurs organes, pour mettre au point une nanoparticule censée renforcer l'immunothérapie. Le porteur reconnaît que les tumeurs peuvent métastaser et provoquer des douleurs, et que la contention et l'anesthésie stressent les animaux. Il annonce surtout des retombées de brevet et de modèle mathématique, et affirme ne maîtriser l'étude de l'immunomodulation que in vivo.

Objectifs

L’objectif principal de ce projet est de synthétiser une nanoparticule générique (appelée NanoBooster) pouvant être administrée en amont (ou simultanément) à l’immunothérapie, dans le but de remodeler le terrain immunitaire du patient et ainsi augmenter ses chances de bénéficier au mieux de ces traitements.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra non seulement de consolider l’intérêt de développer des outils in silico pour la synthèse des nanoparticules mais aussi de définir des premières caractéristiques essentielles à un NanoBooster (taille, cytotoxique encapsulé ou non, dose de cytotoxique ) avec l’exemple de son association à un anticorps anti-PD-1 dans le cancer du poumon non à petites cellules. Ces résultats seront valorisés lors de congrès internationaux et dans le cadre d’une publication scientifique. Le modèle mathématique pourra également être valorisé par un brevet. Les perspectives de ce projet sont nombreuses. Elles consistent en : - La Validation du modèle mathématique sur un éventail plus large de molécules d’immunothérapies (nivolumab, Opdivo®, anti-PD-1 et l’atézolizumab, Tecentriq®, anti-PD-L1) et de type de cancers tels que le cancer du sein et du pancréas. - Le développement d’un modèle mathématique afin d’optimiser les modalités de ce schéma combinatoire.

Procédures

Pour l'étude d'immunomodulation: -Greffe de cellules tumorales (injection sous-cutanée sur le flanc de l'animal) : sur animal anesthésié -Administration du lot de liposome (vide ou avec cytotoxique encapsulé) par la voie rétro-orbitale: sur animal anesthésié -Suivi du poids de l'animal et du volume tumoral (3 fois par semaine) : sur animal vigile -Prélèvement de la totalité du sang par ponction intra-cardiaque, prélèvement de la tumeur et de la rate également: sur animal anesthésié Chaque souris subit 1 seule fois chacune des interventions évoquées ci-dessus (excepté le suivi du poids de l'animal et le suivi de la croissance tumoral). Pour l'étude de la pharmacocinétique: -Greffe de cellules tumorales (injection sous-cutanée sur le flanc de l'animal) : sur animal anesthésié -Administration du lot de liposome (vide ou avec cytotoxique encapsulé) par la voie rétro-orbitale: sur animal anesthésié -Suivi du poids de l'animal et du volume tumoral (3 fois par semaine) : sur animal vigile -Prélèvement de la totalité du sang par ponction intra-cardiaque, le cerveau, rein, foie, rate, tumeur, poumon, coeur, et pancréas seront également prélevés sur les animaux ayant reçu le lot de liposome avec cytotoxique : sur animal anesthésié. -Imagerie sur animaux réservés aux temps tardifs et ayant reçu le lot de liposome avec cytotoxique (6 temps seront définis en fonction du cytotoxique encapsulé): sur animal anesthésié -Imagerie pour les animaux ayant reçu le lot de liposome vide (les acquisitions des images auront lieu selon les mêmes temps définis pour le groupe ayant reçu le lot de liposome avec cytotoxique): sur animal anesthésié.

Impact sur les animaux

Les animaux seront greffés avec des cellules de cancer du poumon (LL/2) pouvant métastaser dans de rares cas, et donc engendrer de la douleur. Les injections des traitements se font par voie intraveineuse rétro orbitale, ainsi une douleur courte au site d'injection peut apparaitre. Les animaux seront anesthésiés à l'aide d'une cage à induction ce qui peut les stresser quelques minutes avant l'endormissement. La mesure du volume tumoral sur animal vigile peut également être stressant pour l'animal.

Devenir

Chaque procédure nécessite le prélèvement de sang, et d'organes et donc la mise à mort des animaux. Les 6 souris utilisées pour les études de biodistribution par imagerie en fluorescence des liposomes vides seront mises à mort une fois le point limite atteint.

Remplacement

A ce jour, Il existe des modèles in vitro pour étudier l'immunité tumorale mais ces tests ne sont pas mit en place au sein de notre laboratoire. L'équipe du laboratoire est compétente pour l'étude de l'immunomodulation in vivo seulement. C'est pourquoi nous collaborons avec une autre équipe pour l'évaluation de l'immunomodulation in vitro. Ces études d'immunomodulation sur splénocytes,d'apoptose en co-culture splénocyte/cellules cancéreuses et d'étude d'interaction des liposomes avec les cellules immunitaires (lymphocyte et macrophages) nous permettront de remplacer les expériences initialement prévues in vivo pour sélectionner les deux nanoboosters les plus immunomodulateur.

Réduction

Le logiciel Kinetic pro sera utilisé pour définir des temps informatifs pour les études de pharmacocinétique, afin de réduire au maximum le nombre de temps de prélèvements nécessaires et la durée de l'étude. La pharmacocinétique des liposomes vides sera évaluée en imagerie par fluorescence permettant de faire un suivi non invasif, non destructif et longitudinale de la pharmacocinétique. Que ce soit dans le cadre de l'étude d''immunomodulation ou dans le cadre de l'étude de la pharmacocinétique, le volume tumorale est monitoré 3 fois par semaine et dès lors qu'un animal est mis à mort, la totalité de ses organes et de son sang sont prélevés. Malgré le fait que seuls le sang, la tumeur et la rate soient utilisés pour étudier l'immunomodulation, nous prélevons la totalité des organes afin de pouvoir générer des datas supplémentaires sur la pharmacocinétique de nos formulations. Ces datas (volume tumoral, données sur la pharmacocinétique supplémentaires) nous serviront à valider le futur modèle PBPK (physiologically based pharmacokinetics) développé en parallèle des études expérimentales et donc d'éviter d'utiliser des animaux supplémentaires pour la validation de ce modèle. L’analyse statistique des données sera effectuée avec un test non paramétrique de Mann et Whitney.

Raffinement

Le bien être animal est respecté: - temps d'acclimatation de 10 jours avant toute procédure - enrichissement des cages (dômes - copeaux de cellulose) , prévention de la douleur, réduction du stress (les manipulations telles que les administrations, prélèvements seront conduites sous anesthésie générale et aucun stress ou souffrance particulière n’est attendue au cours de ces diverses interventions sur l'animal) - définition des points limites et évaluation quotidienne du bien être animal.

Choix des espèces

Les données de la littérature montrent que la souris est un bon modèle expérimental pour des études de pharmacocinétiques et d'immunomonitoring , de plus notre laboratoire possède déjà l'expertise de ces procédures sur ces modèles . La souche de souris utilisée est la C57Bl/6, les souris C57Bl/6 sont immunocompétentes. En effet, une partie de l'étude consiste en l'évaluation in vivo de la régulation de plusieurs effecteurs de l'immunité tels que les cellules LT CD8, LT CD4, NK et Treg. Par ailleurs, la facilité de manipuler la souris dans un milieu confiné fait de cette espèce animale l’espèce la plus appropriée pour répondre aux questions posées. Les données bibliographiques se réfèrent principalement à des études effectuées sur des souris de 6 semaines. L'utilisation d’animaux de cet âge permettra une comparaison plus aisée avec les données déjà publiées dans la littérature et permettra ainsi de mieux évaluer la performance de nos nanoboosters. De plus le cancer touche généralement une population adulte.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections pour supprimer la protéine Pax6, puis on leur induit une encéphalomyélite proche de la sclérose en plaques, jusqu'à une paralysie des pattes arrière qui déclenche leur mise à mort. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de démontrer le rôle de Pax6 dans un modèle animal et que les données ne peuvent être obtenues autrement. Il attend que la suppression de Pax6 aggrave la maladie et en avance l'apparition.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier l’implication de la protéine Pax6 dans l’inflammation du système nerveux à l’aide d’un modèle de souris de sclérose en plaques. La protéine Pax6 est essentielle à la formation du cerveau embryonnaire. Nos données récentes non publiées indiquent que cette protéine est importante pour contrôler l’inflammation du système nerveux, ce qui laisse penser que sa régulation puisse aider à traiter certaines maladies neurodégénératrices. La sclérose en plaques (SEP) est une maladie chronique inflammatoire du système nerveux central ou la gaine protectrice des neurones est détruite par des cellules immunitaires. Cela conduit à la dégradation des neurones et la perte de communication entre le cerveau et les organes périphériques. Les cellules immunitaires du cerveau qui participent à la réparation de la gaine protectrice, sont défectives chez les patients atteints de SEP. Toutes les données originales que nous venons d'accumuler des expériences réalisées sur des cellules suggèrent que la protéine Pax6 est présente dans ces cellules immunitaires du cerveau et a un rôle essentiel dans la régulation de l’inflammation dans ces cellules. Afin de confirmer ce lien, il est indispensable de le démontrer dans un modèle animal. Pour la première fois, nous testerons des souris qui présentent une inflammation sévère de type sclérose en plaques en présence ou non de la protéine Pax6.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de comprendre le rôle de la protéine Pax6 dans la régulation de l’inflammation du système nerveux. Elle ouvrira de plus des perspectives concernant toutes les pathologies neuroinflammatoires, de type Alzheimer, Parkinson, la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) et autres. Les données que nous obtiendrons permettront d'identifier de nouveaux outils pronostics et peut-être thérapeutiques pour ces maladies du système nerveux.

Procédures

- Les souris recevront une injection dans le ventre pendant 4 jours consécutifs d’un produit qui permet de supprimer la protéine Pax6 dans les souris qui ont une modification génétique spécifique pour ceci. Cette injection dure moins de 2 minutes. - Les souris recevront au moins 8 jours plus tard, deux injections en dessous de la peau et dans le ventre d’une combinaison des substances qui produisent le modèle de sclérose en plaques chez l'animal (EAE). Ce traitement consiste à injecter deux produits qui induisent une inflammation du système nerveux. Cette intervention dure moins de 15 minutes sur des souris anesthésiées pour ne pas induire du stress chez la souris. Toutes les souris seront quotidiennement observées pour le niveau de gravité de la pathologie et ceux qui présentent une dégradation importante de leur état (perte de poids importante ou réaction violente ou très faible) ou souffrent de paralysie complète des pattes arrière et partielle des pates avant seront immédiatement sacrifiées et analysées. Les autres seront sacrifiées au bout de 30 jours pour analyse.

Impact sur les animaux

Les souris permettant d’obtenir les souris étudiées après injection du produit, vivent normalement. Il a été démontré que ces souris continuent à vivre normalement après l’injection avec le produit et ne présentent aucune souffrance. Cependant, l’injection du produit pendant 4 jours consécutifs peut être une source de stress pour les animaux. Par la suite, l'induction de la maladie peut entraîner des souffrances aux animaux si la paralysie complète des pattes arrières et partielle des pattes avant est atteinte. Dans ce cas, les souris seront immédiatement euthanasiées et analysées. Enfin, nous nous attendons que la suppression de Pax6 après injection du produit dans les souris, va probablement induire la maladie plus tôt avec des symptômes plus forts.

Devenir

Les 120 souris étudiées (souris d’intérêts et souris contrôle) seront euthanasiées à la fin de l’étude, sauf celles qui présentent une dégradation importante de leur état (perte de poids importante ou réaction violente ou très faible) ou souffrent de paralysie complète des pattes arrière et partielle des pattes avant qui seront immédiatement euthanasiées et analysées. Toutes les souris seront euthanasiées. Des études post-mortem seront réalisées sur les cellules immunitaires prélevées à partir de cerveaux de ces souris.

Remplacement

Toutes nos données réalisées dans des cellules montrent clairement, et pour la première fois, que la protéine Pax6 est exprimé par les cellules immunitaires du cerveau. Pax6 est connue comme essentielle au développement normal du cerveau et nos travaux récents démontrent qu'il régule aussi la réponse inflammatoire du cerveau. Nous utilisons une lignée de souris qui permet de supprimer la protéine Pax6 chez l'adulte car sa suppression au cours du développement de l'embryon est létale. Par ailleurs, le modèle de sclérose en plaques que nous utilisons chez la souris est simple expérimentalement. Il permet de mimer au mieux la sclérose en plaques chez l’homme, une des maladies sévères du système nerveux qui est liée à une inflammation des cellules immunitaires du cerveau. Les connaissances issues de cette étude sur l’animal ne peuvent pas être actuellement obtenues par d’autres méthodes compte-tenu de la complexité physiologique du développement de l’inflammation du système nerveux. La suppression de la protéine Pax6 ne peut être fait que chez l'animal et la complexité du cerveau et des interactions entre les nombreux types cellulaires impliqués (neurones, cellules immunitaires) ne peut être reproduit par des cultures en trois dimensions à partir des cellules souches.

Réduction

Nous utilisons l'effectif minimal qui permet d'avoir une puissance statistique pour tester nos hypothèses. D'après la littérature du domaine, le nombre d’animaux pour le modèle de sclérose en plaques que nous proposons est normalement fixé à 10 par groupe de témoins et d’animaux d’intérêt avec au moins 2 expériences reproductibles. Cependant, compte tenu de la variabilité de l’efficacité de la suppression de la protéine Pax6 par le produit injecté, nous avons besoin d'augmenter sensiblement le nombre de souris traitées pour obtenir suffisamment de souris à comparer en présence et absence de Pax6. Donc, nous allons utiliser 10 souris par groupe pour 4 expériences indépendantes. Si dans la première expérience, l’efficacité du produit injecté et le développement de la maladie présentent peu de variabilité, nous pourrons réduire le nombre d’expériences. De plus, pour réduire le nombre total de croisement et donc de souris, nous utiliserons aussi bien des femelles que des mâles, le modèle de sclérose en plaques ne montrant pas de différence dans le développement de la maladie due au genre.

Raffinement

Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes imposées aux animaux. Les souris sont placées dans des portoirs ventilés, 5 individus par cage. La température, l'hygrométrie, la nourriture et l'eau sont contrôlées tous les jours. En plus de la litière, les cages sont enrichies avec 1 bâtonnet en bois, des cotons et du kraft. Avant les injections sous la peau, les souris seront anesthésiées, pour éviter l’induction de stress. Des points limites suffisamment précoces et prédictives ont été définis pour éviter toute douleur, souffrance et angoisse infligée aux animaux. Ces points limites concernent l’apparence, le poids, le comportement et les signes cliniques de chaque animal. D’ailleurs nous avons choisi une dose des substances injectées pour induire la maladie, qui permet un bon développement des symptômes sans induction de douleur et sans perte significatif de poids. A partir du moment où les souris présentent une queue molle et faiblesse des pattes postérieures après l’induction de la maladie, nous veillerons à disposer de la nourriture dans la cage sous forme d’hydrogel (gel rempli d'eau). Cela permettra aux souris de continuer de s’hydrater et s’alimenter sans difficulté. Dans des cas rares des petits ulcères formés sur les sites d’injection, ceux-là seront traités avec une pommade cicatrisante après désinfection. Le suivi quotidien de l'état des souris permettra de réagir immédiatement en cas de souffrance par leur mise à mort dès la détection d’une dégradation importante de leur état (perte de poids importante ou réaction violente ou très faible) ou de paralysie complète des pattes arrière et partielle des pates avant. Ces points limites seront surveillés 1 fois par jour (état général et pesée). Enfin, nous nous attendons à ce que la suppression de Pax6, qui est un facteur anti-inflammatoire, va probablement induire la maladie plus tôt avec des symptômes plus forts. Si notre hypothèse est correcte, nous allons raccourcir la durée de l’expérience.

Choix des espèces

Nous travaillons sur la souris car c’est le meilleur modèle pour réaliser des animaux avec des mutations génétiques et comparer les phénotypes de ces animaux avec les pathologies humaines. Les souris avec des mutations génétiques sont largement utilisées dans l'étude des mécanismes physiopathologiques des différentes maladies. L’objectif du projet est d’étudier le développement de l’inflammation du système nerveux en présence ou absence de la protéine Pax6 grâce à un modèle de sclérose en plaques chez la souris. Toutes nos données obtenues dans des expériences réalisées sur des cellules démontrent que la protéine Pax6 est présente dans les cellules immunitaires du cerveau. Cette protéine a un rôle essentiel dans la régulation de l’inflammation dans ces cellules. Afin de confirmer ce lien, il est indispensable de le démontrer dans un modèle animal. Nous utilisons une lignée de souris qui permet de supprimer la protéine Pax6 chez l'adulte, alors que sa suppression à la naissance est létale (développement précoce anormal du cerveau). Par ailleurs, le modèle de sclérose en plaques chez la souris est simple expérimentalement. Il permet de mimer au mieux la sclérose en plaques chez l’homme, une des maladies sévères du système nerveux qui est liée à une inflammation des cellules immunitaires du cerveau. Toutes les souris seront adultes, âgées de 6-8 semaines pour le traitement avec le produit. L’efficacité de la suppression de la protéine Pax6 induite par le produit aura atteint son maximum 8 jours après la dernière injection, donc les souris auront de 7 à 12 semaines au moment d'induire la maladie.

156 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, les femelles gestantes et leurs petits tués à cinq jours et les mâles reproducteurs transférés vers d'autres expériences. Les femelles reçoivent une injection sous-cutanée de venin de crotale, avec pesées et prises de température rectales répétées, le venin provoquant œdème, hémorragie et nécrose musculaire locale. L'objet est de savoir si les mastocytes de l'embryon protègent le fœtus lors de l'envenimation de la mère. Le porteur affirme que la souris est un modèle incontournable pour cette étude, faute de modèle cellulaire satisfaisant.

Objectifs

Dans la nature, tous les mammifères possèdent des mastocytes, cellules immunitaires innées. Chez la souris et chez l'Homme, les mastocytes apparaissent tôt durant l'embryogénèse et colonisent les tissus dans lesquels ils seront retrouvés chez l'adulte. A l'âge adulte, il a été montré que les mastocytes sont responsables de la détoxification de multiples venins grâce à la sécrétion de protéases (enzymes qui décomposent les protéines et peptides), inactivant les protéines contenues dans ces venins mais, leur fonction dans l'embryon reste à ce jour inconnue. Dans ce projet, nous émettons donc l'hypothèse que l'apparition très précoce de cette population de cellules immunitaires durant l'embryogénèse pourrait conférer un "avantage évolutif" dans la protection des fœtus contre les agressions de type envenimation que pourrait subir la mère. Le but de ce projet sera donc de déterminer le rôle des mastocytes dans la protection du fœtus lors de l'envenimation de la mère et plus globalement comprendre pourquoi nous développons ce type de cellule immunitaire si tôt pendant l'embryogenèse.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait mettre en évidence pour la première fois l'implication des mastocytes du fœtus dans la protection de celui-ci contre une agression de type envenimation, et plus globalement comprendre pourquoi nous développons ce type de cellule immunitaire si tôt pendant l'embryogenèse.

Procédures

Les animaux seront soumis à : des prises de poids journalières 1 fois par jour (procédure d'environ 5 secondes par souris), une seule injection unique en sous cutané de venin de crotale (contention de l'animal puis procédure de 5 secondes) et des prises de température par thermomètre sonde rectale (6 fois pendant l'heure suivant l'injection de venin puis 1 fois toutes les heures pendant les 5 heures suivantes, cette procédure dure environ 10 secondes par prise de température).

Impact sur les animaux

Les doses de venin utilisées ne seront pas mortelles. Elles induisent cependant localement un œdème, une hémorragie et une nécrose musculaire partielles qui guérissent en quelques jours.

Devenir

Les souris mâles utilisées lors de la reproduction seront proposées à la communauté de l'institut afin qu'elles puissent servir à d'autres expérimentations. Les femelles gestantes et les souriceaux seront sacrifiés à J5 après la naissance afin d'analyser l'état d'activation des mastocytes dans différents organes. En effet, grâce à des données préliminaires du laboratoire, nous savons qu'à 5 jours de développement, nous sommes capables d'observer une activation des mastocytes par immunohistochimie si celle-ci a eu lieu.

Remplacement

Ce projet vise à étudier l'effet des mastocytes embryonnaires sur la protection des fœtus lors de l'envenimation par la mère. Il n'existe pas à ce jour de modèle cellulaire satisfaisant qui puisse rendre compte de ce phénomène. De ce fait, les modèles de souris sont des éléments clés et incontournables pour étudier l'impact des mastocytes, in vivo.

Réduction

L'expérience du porteur du projet dans l'étude de l'effet des venins de serpents nous permet d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous effectuerons l'analyse trois fois indépendamment sur la progéniture issue de 3 souris femelles hétérozygotes Sash accouplées à un mâle hétérozygote Sash. Les expériences qui seront réalisées, in vivo, ont été conçues de façon à n’utiliser que le nombre strictement minimum de souris nécessaire à l’obtention de données validées statistiquement (nombre déterminé sur la base de la littérature et une approche statistique). Les souriceaux seront sacrifiés à J5 après la naissance. En effet, grâce à des données préliminaires du laboratoire, nous savons qu'à 5 jours de développement, nous sommes capables d'observer une activation des mastocytes par immunohistochimie si celle-ci a eu lieu.

Raffinement

Lors de la mise en place des procédures expérimentales l’état clinique des animaux sera surveillé tous les jours. Nous analyserons les paramètres suivants : poids (prise du poids initial à l'arrivée des animaux puis suivi constant et régulier (tous le jours) lors de la gestation, température (par thermomètre sonde rectale toutes les 10 minutes pendant une heure après injection du venin puis toutes les deux heures jusque 6h après injection), signes extérieurs de stress tels que le comportement, la prostration ou l’aspect du pelage (poils luisant ou bien collé et gras etc). Si lors d’une procédure expérimentale nous détectons une perte de poids équivalente à 20% du poids d’origine ou bien une perte de température corporelle de - 8°C (un critère courant de morbidité utilisé dans plusieurs modèles), les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines. En effet, l’élevage de souris est très productif (avec une variation possible en fonction des fonds génétiques étudiés) et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués. D’ailleurs, les animaux qui portent la mutation c-kit (souris sash) nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponibles chez la souris et sous un fond C57Bl/6 standardisé et bien contrôlé. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte pour la première procédure (accouplement) et les souriceaux issus de ces accouplements seront utilisés à J5 de développement. En effet, grâce à des données préliminaires du laboratoire, nous savons qu'à 5 jours de développement, nous sommes capables d'observer une activation des mastocytes par immunohistochimie si celle-ci a eu lieu dans l'embryon.

1 608 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une encéphalomyélite auto-immune est induite sous anesthésie puis les souris reçoivent, selon dix-neuf protocoles, des injections de cellules régulatrices et d'autres composés, développant une paralysie ascendante des membres avant une phase de rémission. Le porteur indique que les souris sont mises à mort si elles perdent plus de 20 % de leur poids ou en cas de paralysie complète, et vise à faire de cette approche une thérapie pour guérir la sclérose en plaques. Il conclut que les migrations cellulaires en jeu ne sont pas modélisables in vitro.

Objectifs

L'objectif du projet est de caractériser l'effet protecteur d’une thérapie cellulaire utilisant des cellules B régulatrices dans un modèle de sclérose en plaques (SEP).

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est l’optimisation de cette approche pour en faire une thérapie pour guérir la SEP.

Procédures

L'EAE sera induit dans les 1608 souris sous anesthésie générale. Ces souris suivront 19 traitements différents. Le nombre de souris est indiqué pour chaque traitement additionnel: 1) 1 prélèvement de sang par veine mandibulaire, analyse J30: 24 souris 2) 1 injection Bregs, analyse J30: 624 souris 3) 1 injection Bregs, 1 prélèvement de sang par veine mandibulaire, analyse J30: 24 souris 4) Analyse J7: 24 souris 5) 1 injection Bregs, analyse J7: 72 souris 6) Analyse J10: 24 souris 7) 1 injection Bregs, analyse J10: 24 souris 8) Analyse J17: 24 souris. 9) 1 injection Bregs, analyse J17: 24 souris 10) Analyse J19: : 48 souris 11) 1 injection Bregs, analyse J19: 144 souris 12) Analyse J30: 264 souris 13) 1 injection Bregs, 4 injections TACI-Ig, analyse J30: 24 souris 14) 1 injection anti-CD25, 1 injection Bregs, analyse J30: 24 souris 15) 1 injection anti-CD25, analyse J30: 24 souris 16) 3 injections toxine diphtérique, analyse J30: 48 souris 17) 3 injections toxine diphtérique, 1 injection Breg, analyse J30: 24 souris 18) 4 gavages tamoxifène, analyse J30: 48 souris 19) 4 gavages tamoxifène, 1 injection Bregs, analyse J30: 48 souris.

Impact sur les animaux

L'induction de l'EAE est faite sous anesthésie générale. Le protocole d'induction de l'EAE par immunisation a été optimisé pour que la maladie entre en rémission, et pour réduire le nombre de souris requises, en rapport avec les 3Rs. Les souris développent la maladie vers J11 avec une phase de paralysie ascendante atteignant un maximum vers J17 puis une rémission avec récupération des fonctions motrices des quatre membres vers J22. L’évolution de la maladie est suivie de manière quotidienne sur un maximum de 30 jours, exceptionnellement 40 jours en cas de délai de développement. Nous employons une échelle de scores internationalement reconnue comprenant 6 stades. Les souris développent en général un score de 3 qui correspond à une paralysie partielle des membres postérieurs pendant quelques jours au pic de la maladie avant d’entrer en rémission et atteindre un score 2 correspondant à une démarche anormale vers J22. Ces souris restent donc mobiles et peuvent accéder à la nourriture et l'hydrogel placés au fond de la cage avant rémission des signes cliniques. Les souris souris seront systématiquement mises à mort si elles atteignent une perte de poids supérieure à 20%, ou bien une paralysie complète des membres postérieurs et partielle des membres antérieurs durant 24 heures, ou bien une paralysie complète des membres postérieurs et des membres antérieurs. Avant le développement de l'EAE, les souris sont suivies avec une grille de score incorporant poids, apparence et comportement. Les souris sont mises un mort lorsque l'un des critères ou la somme des critères dépasse un seuil limite tel qu'une perte de poids supérieure à 20%, ou bien un comportement très agité ou immobile ou avec automutilation, ou bien une apparence avec un poil très ébouriffé, des yeux plissés ou bridés, ou une posture anormale.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures. Ceci est justifié par le fait que le statut de leur système immunitaire sera alors caractérisé.

Remplacement

Les protocoles expérimentaux nécessaires pour ce projet ont été optimisés par des expériences in vitro en vue de remplacement pour réduire le nombre de souris nécessaires. En outre, le protocole pour produire des Bregs a été sélectionné suite à un long travail d'optimisation in vitro afin de générer des cultures ne contenant que des Bregs. Les propriétés moléculaires de ces Bregs ont déjà été étudiées in vitro afin de réduire le recours à l'expérimentation animale. Ce projet vise à caractériser l’effet de Bregs dans un modèle de SEP. Les réponses immunitaires se développent dans les organes lymphoïdes secondaires, et impliquent des processus d’interactions entre différents types cellulaires et de migrations cellulaires qui ne sont pas modélisables in vitro actuellement. Les maladies auto-immunes du SNC impliquent aussi la migration des cellules du système immunitaire dans le SNC, puis l’interaction de ces cellules avec des cellules résidentes du SNC. Ces processus ne sont également pas étudiables in vitro. Il n’y a donc pas d’alternative au fait de conduire les investigations décrites chez la souris.

Réduction

Le protocole d'induction de l'EAE a été optimisé de manière à ce que la maladie se développe de manière homogène chez les souris identiques génétiquement, ce qui permet de réduire le nombre de souris utilisées tout en permettant d'obtenir des résultats statistiquement valides. Les mesures de remplacement et de raffinement décrites en 1 et en 3 ont également permis de réduire le nombre de souris nécessaires pour ce projet.Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum pour avoir des résultats statistiquement interprétables. Cest estimations sont basées sur notre expérience, et les estimations obtenues avec le programme d'analyse de puissance statistique G*Power.

Raffinement

Le protocole d'induction de l'EAE a été raffiné de manière à ce que les souris entrent en rémission rapidement après un court épisode clinique afin de réduire la souffrance des animaux. Le protocole a de plus été raffiné de manière à ce que la maladie se développe de manière homogène chez les souris identiques génétiquement, ce qui permet de réduire le nombre de souris utilisées tout en permettant d'obtenir des résultats statistiquement valides. Nous avons établi pour chaque procédure des points limites qui permettent d'éviter toute souffrance indésirable des souris. Les animaux sont hébergés par groupe de 5 par cage maximum et ne sont jamais isolés. Des objets sont ajoutés dans leurs cages pour enrichir leur environnement. Ils sont observés tous les jours par le personnel de l'animalerie formé au bien-être animal, et les expérimentateurs. Le score clinique et le poids sont mesurés quotidiennement.

Choix des espèces

Le modèle d’EAE chez la souris proposé est bien standardisé. Le savoir disponible sur ce modèle permet de mieux définir les plans d’expérience et donc de réduire le nombre de souris nécessaires. De nombreux outils sont disponibles pour ce modèle, qui permettent d’aborder les problématiques posées de la manière la plus pertinente, et de récupérer le maximum d’information. Ce modèle expérimental a été utilisé pour le développement de thérapies aujourd’hui utilisées chez les patients atteints de SEP. Bien que ce modèle ne soit pas un calque parfait de la SEP, c’est un modèle utile pour le développement de pistes thérapeutiques pour cette pathologie humaine. L’utilisation de souris de fond génétique C57BL/6 de 6 à 14 semaines est appropriée pour ces études.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales et un anticorps de synthèse, pour étudier le rôle des cellules sénescentes dans le développement du cancer avec l'âge. Le porteur reconnaît que les procédures seraient plutôt "modérées" mais les classe en sévère à cause du caractère novateur des lignées transgéniques, dont l'une peut provoquer une fibrose du foie après un an. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les interactions entre compartiments cellulaires d'un organe.

Objectifs

Malgré des efforts considérables pour lutter contre le cancer et trouver un traitement efficace, cette pathologie reste l'une des principales causes de décès en France et dans le monde, notamment chez les personnes âgées. En effet, la probabilité de développer un cancer augmente avec le vieillissement, lequel est caractérisé par l’accumulation d’un type cellulaire particulier, la cellule sénescente (CS). La contribution exacte des CS dans le développement tumoral reste discutée, mais il est connu qu’elles peuvent créer un environnement pro tumoral, notamment en inhibant le système immunitaire, lequel est un outil de défense majeur de l’organisme contre le cancer. Le développement tumoral pourrait donc être favorisé par l’inhibition du système immunitaire via les cellules sénescentes. L’objectif de ce projet de recherche fondamentale est de confirmer et de déterminer l’étendue de cette inhibition, notamment pour établir si les CS pourraient constituer une cible thérapeutique potentielle dans la lutte contre le cancer. Ce travail pourrait ainsi mener à une amélioration des traitements en montrant l’intérêt de cibler les CS, seul ou en association avec des traitements déjà utilisés pour favoriser l’activation du système immunitaire comme les Inhibiteurs du Check point Immunitaire ou « ICI ».

Bénéfices attendus

L’objectif est de mettre en évidence le potentiel thérapeutique du ciblage des CS pour traiter le cancer, éventuellement en association avec d’autres molécules thérapeutiques.

Procédures

Ce projet impliquera 2 modèles murins transgéniques permettant soit de marquer les CS à l’aide d’une protéine fluorescente, soit de les supprimer. Chacun de ces modèles sera implanté en cellule tumorale de souris par injection sous-cutanée dans le flanc, ce qui nous permettra non seulement d’évaluer l’importance des CS dans le développement cancéreux, mais également de les localiser au niveau de la tumeur. Nous utiliserons des souris jeunes (7 semaines) et d’âge mûr (12 mois, nommées vieille) afin de pouvoir comparer des organismes respectivement pauvres et riches en cellules sénescentes. Enfin, une partie des souris sera également traitée avec des ICI afin de voir les conséquences de la suppression des CS sur l’efficacité d’un traitement déjà utilisé. L’ensemble des procédures, y compris l’injection de cellules tumorale et le traitement aux ICI, pourraient être considérées de niveau « modérées » car peu, voire pas, douloureuses, mais, vue le caractère novateur des souris transgéniques utilisées, sera classe en sévère . Les souris impliquées seront monitorées quotidiennement afin d’assurer une bonne gestion de la douleur. Notre modèle transgénique marquant les CS n’est pas dommageable, c'est-à-dire n'induit aucun pathologie de façon intrinsèque, mais le modèle les supprimant peut conduire à de la fibrose hépatique chez les souris de plus de 1 an. Ce modèle sera donc considéré comme dommageable à partir de cet âge. Chacune des 320 souris de ce projet sera suivie à l’aide d’une fiche de score adaptée à son traitement, génotype et âge, puis euthanasiée à la fin de la procédure expérimentale ou si l’animal atteint un point limite. Concrètement, les animaux vigiles seront soumis à des injections sous-cutanées de cellules tumorales (une injection par souris) et intrapéritonéale d'un anticorps de synthèse (anti pdl-1). La-aussi une seule injection sera pratiquée par produit. Ces injections, que ce soit de cellules ou d'anti PDL-1, ne dureront que quelques secondes chaque fois.

Impact sur les animaux

Les transgènes DTA (Voehringer et al, 2008) et GFP (dénommé mTmG dans Muzumdar et al, 2007) sont bien connus et considérés comme non-dommageables dans la littérature. Les souris portant le transgène p16 (notées p16-Cre), produit et détenu uniquement par notre laboratoire, n’ont démontré (comme attendu) aucun phénotype dommageable malgré une observation prolongée (cf annexe2). Nous n’attendons pas non plus de phénotype dommageable avec les souris p16-Cre/GFP, jeune et vieille, ou encore les jeunes p16-Cre/DTA. Néanmoins, les souris p16-Cre/DTA de 12 mois pourraient développer une fibrose hépatique se traduisant par un prurit et une perte de poids. En effet, nos analyses précédentes montrent les souris avant 1 an n’auront pas le temps d’activer le gène p16 dans un nombre significatif de cellules, tandis qu’a 1 an la déplétion de cellules peut être assez importante pour affecter la santé de la souris.

Devenir

Le prelevement des tumeurs necessitera l'euthanasie des souris.

Remplacement

Aucune méthode alternative ou modèle in vitro n’existe pour mimer les interactions qui existent entre les différents compartiments cellulaires (immunitaire, epithelial, stromal, etc). En effet, les modèles de co-culture ne permettent pas de récapituler la complexité d’un organe que ce soit par le type de cellules et leur agencement tridimensionnel.

Réduction

Les effectifs ont été choisis afin d’obtenir des résultats significatifs avec le nombre de souris minimum. Nous obtenons 16 souris/groupe en utilisant le logiciel Gpower avec un test de student unilatéral et paramétrique (comparaison de 2 groupes indépendants sous loi normale) de puissance statistique modérée (0.7) associé à un effet taille important (0.8) pour p≤0.05. Considérant une mortalité potentielle, nous l'avons l'augmenté à 20 souris/groupe.

Raffinement

Pour limiter la douleur que notre procédure expérimentale pourrait induire, nous avons établi une grille d’observation visant à définir les points limites précoces à partir desquels l’expérience sera arrêtée et qui indique les mesures que nous prendrons à l’apparition des premiers signes de la douleur. Ces points prennent en compte le caractère potentiellement dommageable de la souche p16Cre/DTA après 1 an. Pour l’évaluer nous avons ajouté certains critères spécifiques à ce modèle dans la feuille de score, tel que la recherche de prurit ou une mesure du poids précoce par rapport à l’injection de cellules tumorales. Après l’injection de cellules tumorales, les animaux seront surveillés de façon quotidienne par les expérimentateurs (annexe1). On notera que les souris p16-Cre/DTA seront suivies à partir de l’âge d’un an jusqu’à la fin de l’expérience avec une feuille de score modifiée (annexe 1, mesure du poids+prurit), mais se suivit sera seulement hebdomadaire jusqu’au moment de l’injection. Utilisation de la feuille de score : -Pesée de la souris : une baisse de poids ≥15% par rapport au poids de la précédente pesée ou de ≥20% par rapport à la pesé avant traitement entraînera une euthanasie. -Un score de 8 ou la mention PL, entraînera l’euthanasie de l’animal. Les points limites seront : Plaie majeur (saignante, suintante ou >1cm), Dos voussé et prostration, automutilation, difficulté respiratoire, paralysie, Prolapsus rectal répété, saignement de l’orifice digestif, après injection : Suintement, taille tumeur >1cm3, nécrose. Principaux problèmes sanitaires scorés (≥4) : Immobilité, convulsions, tremblements, diarrhées, perte de poids 10-15%, prurit, après injection : Rougeur, Gonflement, ulcère cutané, tumeur gênant le déplacement. Autres problèmes sanitaires (

Choix des espèces

Les modèles murins sont les modèles les plus répandus pour étudier l’effet des drogues sur la croissance tumorale, mais également fréquemment utilisés pour l'étude de la senescence. Leur cycle de reproduction court nous permet une optimisation dans la sélection des génotypes d’intérêts. Notons également que cette espèce est facilement manipulable. De plus, la plupart des modèles transgéniques que nous souhaitons utiliser ne sont disponibles que chez la souris. Dans ce projet, nous utilisons des souris immunocompétentes ce qui nous permettra d’évaluer au mieux les coopérations entre les cellules immunitaires et tumorales. Nous utiliserons des souris adultes de 7 semaines et 12 mois.