Système immunitaire
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Rôle des protéines de l’autophagie dans le trafic du récepteur des cellules B
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
180 souris vont être utilisées, dont 80 réutilisées dans d'autres procédures, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Sous anesthésie, elles reçoivent des injections intrapéritonéales ou sous-cutanées et une immunisation, le porteur n'attendant qu'une légère douleur de courte durée aux points d'injection. L'étude croise des lignées transgéniques pour comprendre le rôle de protéines de l'autophagie dans la réponse des lymphocytes B. Le porteur affirme que la maturation de cette réponse ne peut se reproduire in vitro et qu'il doit donc générer de nouvelles lignées de souris.
Objectifs
Les lymphocytes B (LB) sont des précurseurs de cellules productrices d’anticorps. Les LB sont également des cellules présentatrices d’antigènes professionnelles (CPA) qui peuvent activer les lymphocytes T (LT) par la présentation d'antigènes dans le contexte du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH). L’autophagie est un processus de dégradation cellulaire exécuté par des molécules ATG (autophagy-related). L’autophagie est un acteur majeur de la biologie des LB. Elle permet la survie à long terme des LB mémoire, et des plasmocytes à longue durée de vie, et par conséquent le maintien de la réponse à anticorps. L’importance de l’autophagie dans les réponses humorales à long terme est illustrée par sa nécessité dans le maintien d’une protection contre des virus comme celui de la grippe. Nous avons récemment montré qu'en plus de ces rôles initiaux, les protéines ATG participaient au trafic intracellulaire du récepteur à l'antigène des cellules B (BCR). La stimulation du BCR permet à la fois l'activation initiale des LB, et l'acquisition d'antigènes qui seront ensuite présentés aux LT, étape cruciale pour assurer une qualité optimale de la réponse à anticorps. Ainsi il apparait que les protéines ATG pourraient être importantes pour optimiser la qualité de la réponse immunitaire humorale face à certains types d'antigènes. Même si de premières expériences en particulier in vitro ont montré que les protéines ATG participaient à la présentation antigénique par les LB, ses conséquences in vivo sont inconnues. Comprendre de tels mécanismes permettrait d'améliorer l'efficacité de certains vaccins ou de limiter des effets pathogènes de production chronique d'anticorps. Nous voulons donc générer des modèles permettant d'évaluer le rôle des molécules ATG in vivo dans l'activation initiale des LB et à comprendre le processus mis en jeu.
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre à terme de mieux comprendre l'initiation de la production d'anticorps, et de développer de nouvelles approches pour améliorer l'efficacité de vaccins, ou au contraire de limiter l'apparition de réponses autoimmunes.
Procédures
Aucun prélèvement sur animal vigile ou procédure chirurgicale ne sera effectuée. Seules des injections intrapéritonéales ou sous cutanées sur animal anesthésié sont prévues.
Impact sur les animaux
Aucun phénotype dommageable n'a été observé sur les lignées qui seront utilisées et qui ont été déjà décrites. Nous n'attendons donc pas non plus de phénotype dommageable pour les nouveaux croisements générés à partir des souris déjà décrites. Une des procédures implique une immunisation et des injections de cellules. Aucun effet dommageable à long terme n'est attendu. Une légère douleur peut-être observée sur les sites d'injection mais de durée courte (quelques heures).
Devenir
Tous les animaux générés serviront à effectuer les expériences nécessaires. Aucun animal ne sera maintenu en vie à la fin du projet.
Remplacement
L'utilisation de modèles murins permet de suivre la mise en place de la réponse humorale in vivo et sa maturation, ce qui est impossible in vitro. En effet, l'environnement ganglionnaire et en particulier l'émergence des centres germinatifs où a lieu la maturation terminale des LB, ne peut se reproduire par des modèles in vitro. De plus, la génération de modèles transgéniques avec expression de BCR spécifiques d'antigènes modèles est une stratégie courramment utilisée. Elle permet d'augmenter le nombre de lymphocytes spécifiques de l'antigène, et donc de suivre le comportement des cellules sur un nombre suffisant, en imagerie et en cytométrie en flux. Nous devons donc recourrir à des croisements d'animaux transgéniques et générer de nouvelles lignées, afin d'obtenir des modèles exploitables.
Réduction
Le nombre total est de 180 animaux. Nous nous basons sur des protocoles déjà établis dans la littérature, et sur notre propre expérience de modèles décrits dans nos précédents travaux, afin de limiter au maximum le nombre d'animaux. Le nombre minimal d'animaux par groupe expérimental est de 10, pour chaque question posée, pour pouvoir établir des conclusions statistiquement fiables.
Raffinement
Des points-limites ont été établis pour chaque procédure, permettant de soustraire les animaux à toute souffrance. Les traitements potentiellement douloureux seront effectués en anesthésie générale par des personnels compétents. Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d'hébergement: les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans un environnement enrichi (tubes en polycarbonate rouge translucides, frisures de carton, barre en bois à ronger) et observés quotidiennement.
Choix des espèces
Le système immunitaire et les modèles d'immunisation de la souris sont proches des systèmes humains. Outre une littérature abondante sur ces modèles, nous disposons de nombreux outils d'analyse et l'expérience requise pour le suivi des réponses immunitaires chez la souris, nous permettant de limiter le nombre d'animaux utilisés. Nous utiliserons un modèle transgénique n’existant que chez la souris. Les souris SWHEL expriment un BCR spécifique de l'antigène modèle HEL sont disponibles au laboratoire. Nous avons de plus généré et caractérisé précédemment les souris Mb1 cre ATG5flox/flox, Mb1 cre permettant la délétion du gène ATG5 par la recombinase dans les lymphocytes B. Nous croiserons ainsi les souris SWHEL et Mb1 cre ATGf/f pour obtenir le modèle le plus adéquat pour suivre l'induction de la réponse humorale in vivo, en présence ou absence d'ATG5 dans les LB. Nous travaillerons sur des individus de 8 à 12 semaines. Dans cet intervalle d'âges, le système immunitaire de la souris est complètement mature mais non-sénescent. Nous pourrons ainsi étudier les différents paramètres en situation de fonctionnement optimal des lymphocytes B. De plus l'autophagie est décrite comme déclinant avec l'âge d'où la nécessité de ne travailler que sur des animaux relativement jeunes. Enfin aucun impact majeur de l'inhibition de l'autophagie sur la survie des lymphocytes B n'a été identifié à ces âges.
Impact des parodontites dans l’accident vasculaire cérébral: modèle expérimental chez la souris (1/2)
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
126 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Chaque animal subit un modèle de parodontite par pose répétée de ligatures imbibées de bactéries, avec prélèvements sanguins et radiographies sous anesthésie sur trente jours, une partie subissant ensuite un accident vasculaire cérébral provoqué chirurgicalement avant d'être tuée. Le porteur indique que la parodontite peut provoquer des abcès gingivaux et que l'AVC entraîne prostration, difficultés à se déplacer et perte de poids. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative pour étudier les interactions entre parodontite et maladies cardiovasculaires.
Objectifs
La parodontite est une maladie fortement prévalente (47% de la population adulte américaine) qui entraine une destruction des tissus de soutien des dents, et des pertes de dents précoces. Elle est déclenchée par un déséquilibre de la flore bactérienne au sein de la bouche, dont la bactérie Porphyromonas gingivalis (P gingivalis) est clée. La parodontite est une source chronique de bactériémie (passage temporaire de bactéries dans le sang) et d'une inflammation systémique de bas grade (c’est-à-dire diffusée dans tout le corps et de faible intensité). La parodontite favorise des maladies à distance telles que les pathologies cardiovasculaires dont les accidents vasculaires cérébraux (AVC). Cependant, à ce jour, aucune étude n’a pu mettre en évidence un lien de cause à effet entre parodontite et AVC même si P gingivalis est une des principales bactéries de la bouche retrouvées dans les parois des vasseaux sanguins malades et lésées lors des AVC (plaque d’athérome et et zones d’anévrisme). Récemment, il a été identifié que certaines cellules sanguines dites de défense, les globules blancs, comme les macrophages ou les neutrophiles, peuvent conserver une mémoire en réponse à de précédentes infections ou phénomène inflammatoire antérieur, ce qui leur permet de réagir plus fortement lors de futures expositions identiques ou différents. Cet état de réactivité accrue se nomme «immunité innée entraînée » (TII). Elle pourrait expliquer les liens entre parodontite et d’autres maladies inflammatoires chroniques. L’inflammation systémique, généralisée dans le corps, liée à la parodontite induirait une reprogrammation de l'expression de gènes des progéniteurs des cellules sanguines dont les cellules myéloides/globules blancs. Ceci conduirait à une production accrue de globules blancs avec une capacité proinflammatoire augmentée, augmentant le risque cardiovasculaire. Dans ce projet, nous souhaitons tester l’impact de la parodontite sur l’activation et la production des globules blancs par la moelle osseuse, le lien avec la réponse inflammatoire lors d’un AVC et ses conséquences sur l’étendue de l’AVC.
Bénéfices attendus
Grace à cette étude, nous souhaitons étudier si la parodontite, via certaines bactéries, active à distance les cellules de l’immunité en développement au sein de moelle osseuse et favorise la production de cellules activées, « inflammées » dans le sang. Une fois en circulation, ces cellules inflammées pourraient contribuer à l’aggravation de l’AVC. Ceci démontrerait un lien de cause à effet entre parodontite et AVC et appuyerait l’importance du traitement de la parodontite en prévention de l’AVC.
Procédures
Les souris seront soumises au modèle de parodontite : pose d’une ligature (5 minutes) et 1 prélèvement sanguin 3 minutes) par souris sous anesthésie profonde, renouvelés tous les 3 jours pendant 30 jours. Avant et à la fin de la mise en œuvre de ce modèle, une radiographie 3D des machoires sera réalisée pour toutes les souris sous anesthésie (durée 5 minutes/souris). Nous aurons alors 3 groupes de souris : souris contrôle (anesthésie, radiographie et prise de sang réalisés) et 2 groupes test (l’un avec une ligature simple, l‘autre avec une ligature imbibée de bactéries agressives pour le parodonte). Les animaux seront mis à mort à 30 jours pour évaluer l’impact de la parodontite avec ou sans bactérie agressive sur les globules blancs de la moelle osseuse. La meme expérimentation sera réalisée sur de nouveaux lots de souris. Au bout de 30 jours, celles-ci seront transportées au sein de l’animalerie d’un autre laboratoire. Après acclimatation, elles seront soumises sous anesthésie profonde au modèle d’AVC (Durée 15 minutes). Les souris seront gardées en élevage pendant 2 jours avant d’être mises à mort : cette étape vise à évaluer l’impact de la parodontite sur l’AVC. Une sesonde série d’expérience sera réalisée au cours de laquelle une période de cictarisation de 15 jours après induction de la parodontite sera réalisée. Nous aurons à nouveau 3 groupes de souris : souris contrôle (anesthésie, radiographie et prise de sang réalisés) et 2 groupes test (l’un avec une ligature simple, l‘autre avec une ligature imbibée de bactéries agressives pour le parodonte). Les animaux seront mis à mort à 45 jours (30 jours de parodontite et 15 jours de cicatrisation) pour évaluer la cicatrisation du parodonte et le retour à un état basal du nombre et de l’activité des globules blancs de la moelle osseuse. D’autres lots (contrôle, ligature simple et ligature + bactérie agressive) soumis au modèle de parodontite et cicatrisation seront quant à elles transportées au sein de l’animalerie d’un autre laboratoire. Après acclimatation, elles seront soumises sous anesthésie profonde au modèle d’AVC (Durée 15 minutes). Les souris seront gardées en élevage pendant 2 jours avant d’être mises à mort : cette étape vise à évaluer l’impact de l’immunité innée entrainée sur la parodontite sur l’AVC
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues pour l’animal sont : - exceptionnellement pour les souris soumises au modèle de parodontite : des douleurs gingivales post-opératoires, voir des abcès gingivaux, diminuant la mastication et la prise de poids des animaux. -pour les souris soumises au modèle d’AVC : une prostration, des difficultés à se déplacer et la perte de poids. - pour tous les animaux : une hypotherime à l’anesthésie.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux sont mis à mort permettant le prélèvement des tissus nécessaires à nos travaux.
Remplacement
A notre connaissance, il n’existe pas de méthodes alternatives pour l’étude des interactions entre parodontites et maladies cardiovasculaires.
Réduction
Afin de minimiser le nombre d’animaux, une étude statistique a été réalisée pour le modèle de parodontite et pour le modèle d’AVC/ Pour le modèle parodontite, d’après une publication sur la comparaison des modèles de parodontite expérimentale avec ligature +/- P gingivalis chez la souris, et notre expérience, un effectif de 5 souris /groupe est suffisant pour obtenir une puissance statistique. Une souris supplémentaire par groupe est prévue en cas de mort prématurée au cours de l’expérimentation, soit 6 animaux/groupe pour le modèle parodontite (sans AVC). Pour le modèle d’AVC, une étude préliminaire a montré que 8 animaux/groupe sont nécessaires pour obtenir une puissance statistique. En tenant compte d’une perte d’animaux de 20 % dû à la mortalité inhérente au modèle, nous anticipons l’utilisation d’un nombre de 10 animaux pour les lots parodontite + AVC.
Raffinement
Des mesures de raffinement seront prises pour réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux : (1) avant chaque examen radiologique, sans intervention chirurgicale,une anesthésie légère mais dont l’efficacité est validée, est effectuée (2) avant chaque pose de ligature et prélèvement sanguin (même séquence opératoire), les souris sont anesthésiées profondément (3) après chaque anesthésie, les souris sont placées dans un environnement chauffé et surveillées jusqu’à leur réveil (4) les animaux sont surveillés le lendemain de chaque intervention puis tous les 2 à 3 jours par le personnel dédié de l'animalerie ou les responsables de projet (5) des analgésies sont prévues avant les procédures de sévérité élevée et en cas d'atteintes de points limites et (6) des points limites ont été établis.
Choix des espèces
La souris est l’espèce la plus couramment utilisée pour l’étude de la parodontite et tout particulièrement pour l’étude de la composante systémique de la parodontite. De nombreux outils d’analyses, qu'ils soient commerciaux ou dans notre laboratoire, sont développés et adaptés à ce modèle. Il en est de même pour l'étude de l'AVC. Les souris seront agées de 3 mois, âge adulte avec croissance des maxillaires achevée.
Rôle des hormones sexuelles femelles sur la régénération musculaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit des lavages vaginaux, une lésion musculaire provoquée par électrostimulation sous anesthésie, des mesures de force et des injections, avant d'être tué pour prélever l'utérus et le muscle. Le porteur indique que le cumul de ces actes induit un stress. Il reconnaît que la régénération musculaire peut être étudiée en partie in vitro, mais affirme que l'interaction entre cellules ne s'observe qu'in vivo.
Objectifs
Le muscle squelettique peut se réparer complètement après une blessure grâce au processus de régénération musculaire. Il a été montré que ce processus est plus efficace chez les souris femelles par rapport aux souris mâles. Cette différence pourrait être liée, au moins en partie, aux variations d’un type d’hormones sexuelles femelles au cours du cycle ovarien. L’objectif de cette étude est d’évaluer le rôle des hormones sexuelles femelles dans un modèle standardisé de dommage musculaire induit par électrostimulation
Bénéfices attendus
Le projet vise à comprendre le rôle des hormones sexuelles femelles dans la réparation du tissu musculaire. A terme, ce projet pourrait permettre d’améliorer la prise en charge des atteintes musculaires associées à plusieurs situations physiopathologiques affectant la production/disponibilité des hormones sexuelles femelles (ménopause, cancer…).
Procédures
Les souris sont soumises à des lavages vaginaux (2 au maximum, durée 1 minute maximum), un protocole d’électrostimulation (sous anesthésie générale, durée 10-15 minutes), une mesure de force musculaire (5 au maximum, anesthésie générale de 5-10 minutes) et des injections intrapéritonéales (2 au maximum)
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables légers sont attendus du fait d’un cumul d’actes (lavages vaginaux, injections, anesthésies, blessure musculaire), qui induisent du stress.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en vue de récupérer l’utérus et le tissu musculaire pour des analyses histologiques
Remplacement
Des travaux ont déjà démontré in vitro le rôle des hormones sexuelles femelles sur la prolifération des cellules souches musculaires. Aussi, bien que l'analyse de la régénération musculaire puisse être en partie étudiée in vitro, ce processus repose notamment sur l’interaction entre différentes cellules qui ne peut être étudiée qu'in vivo, justifiant le recours à l'expérimentation animale.
Réduction
L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectués précédemment pour ces procédures. Nous utilisons un dispositif expérimental totalement non-invasif qui permet de réaliser des protocoles d’exercice et de mesurer la force musculaire de manière concomitante sur les mêmes animaux rendant les préparations chirurgicales totalement obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. La réalisation complète du projet est conditionnée à la mise en évidence des effets des hormones sexuelles femelles lors d’une première phase expérimentale.
Raffinement
Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. La procédure expérimentale utilisée inclut un recours systématique à l'anesthésie générale adaptée lors de l’électrostimulation et de la mesure de la force musculaire. Notre expérience sur ce modèle de dommage musculaire et de lavages vaginaux montre que l'ensemble (100%) des animaux est inclus pour réaliser des analyses fonctionnelles et biologiques. Un lavage vaginal est effectué ce qui permet d’éviter la réalisation d’un prélèvement intravaginal (frottis)
Choix des espèces
Des travaux précédents ont montré que les processus mis en œuvre au cours de la régénération musculaire chez la souris sont proches de ceux observés chez l'homme. Le projet porte sur le rôle des hormones sexuelles dans la régénération musculaire. Des souris adultes, âgées de 8-12 semaines, sont donc utilisées afin que la production de ces hormones soit fonctionnelle.
Étude de composés anti-virulence dans un modèle murin d’infection pulmonaire à Pseudomonas aeruginosa
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
4 064 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance jusqu'à sévère. Elles sont infectées aux poumons par Pseudomonas aeruginosa au moyen d'injections intratrachéales et intranasales sous anesthésie, pour tester des composés anti-virulence et un candidat vaccin. Le porteur indique que l'infection non traitée provoque perte de poids, catarrhe oculaire, baisse de température et repli, les souris trop atteintes selon un score clinique étant mises à mort. Il affirme que les lignées cellulaires ne peuvent pas remplacer totalement le modèle murin pour étudier les interactions hôte-pathogène et justifie l'euthanasie de toutes les souris par le risque de dissémination des pathogènes.
Objectifs
Pseudomonas aeruginosa est une bactérie opportuniste multi-résistante qui représente la troisième cause d’infections acquises à l’hôpital en France. P. aeruginosa est responsable de pneumonies aiguës chez le patient bénéficiant d’une ventilation mécanique ou d’infections chroniques chez les patients présentant une pathologie respiratoire chronique suppurative comme la mucoviscidose. La morbi-mortalité importante, l’incidence croissante de souches multi-résistantes associées à l’absence de développement à court terme de nouvelles molécules antibiotiques d’intérêt a conduit à classifier cette bactérie parmi les pathogènes prioritaires pour la recherche de nouvelles thérapeutiques par l’OMS. L'incidence élevée, la sévérité et la résistance croissante sont caractéristiques des infections à P. aeruginosa et soulignent la nécessité d'ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques. Une première possibilité serait de cibler un des nombreux mécanismes pathogéniques dont est doté P. aeruginosa grâce à son génome de grande taille codant pour de nombreux facteurs de virulence et de régulation. La seconde voie thérapeutique choisie serait le développement d’un candidat vaccinal potentiellement bispécifique ciblant 2 facteurs respectivement impliqué dans les infections aiguës et chroniques et utilisant un adjuvant constitué d’une structure en nanodiamant comme thérapeutique préventive des infections à P. aeruginosa aiguës et chroniques.
Bénéfices attendus
Ce projet consiste à évaluer l’efficacité de nouvelles molécules permettant d’inhiber la virulence de P. aeruginosa et d’un nouvel agent vaccinal, pour un transfert vers une filière de développement pharmaceutique.
Procédures
Les injections intratrachéales seront effectuées sous anesthésie générale,d’une durée de 30 minutes, via une injection de kétamine-xylazine tandis que les injections intranasales et sous-cutanées le seront sous anesthésie générale gazeuse, d'une durée de 5 minutes, par isoflurane. Les injections intra-péritonéale seront administrées sur animaux vigile. De même le suivi du poids et du score clinique se fera sur animaux vigile. Aucune prélèvements sur animaux vigiles ni procédures chirurgicales ne seront fait dans ce projet.
Impact sur les animaux
L'infection pulmonaire à Pseudomonas aeruginosa non traité se traduit chez la souris par plusieurs effets délétères. L'animal perd du poids, peut présenter une inflammation des muqueses notamment un catarrhe oculaire, sa température corporelle peut baisser et son comportement également (dos courbé et réduction de l'activité et de la mobilité).
Devenir
Tous les animaux devront être euthanasiés à l'issue de chaque procédure du fait du double risque de dissémination dans le milieu extérieur des pathogènes et des souris, génétiquement modifiés ou non .
Remplacement
La sélection des composés ayant la meilleure efficacité contre P.aeruginosa sera réalisée grâce à des modèles in vitro. Des lignées cellulaires épithéliales pulmonaires et des lignées immunitaires (lymphocytes, cellules dendritiques et macrophages) seront utilisées pour évaluer l’innocuité des composés, la production d’anticorps spécifiques, la protection contre l’infection bactérienne.Il n’est pas possible de totalement remplacer l’utilisation d’un modèle murin par l’utilisation de lignées cellulaires seules. En effet, nous nous intéressons aux interactions hôte pathogènes lors d’une infection pulmonaire pour lesquels l’interaction de nombreux acteurs de l’immunité innée et adaptatives sont mises en jeu simultanément.
Réduction
Il n’est pas possible de remplacer l’utilisation d’un modèle murin par l’utilisation de lignées cellulaires seules. En effet, nous nous intéressons aux interactions hôte pathogènes lors d’une infection pulmonaire pour lesquels l’interaction de nombreux acteurs de l’immunité innée et adaptatives sont mises en jeu simultanément. Pour réduire le nombre de souris nécessaires au strict minimum, nous nous appuierons sur les méthodes statistiques suivantes. Pour pouvoir mettre en évidence une différence au niveau des résultats microbiologiques, il nous faudra inclure 15 sujets par groupe. Une comparaison entre les groupes Pour respecter le principe des 3R, les mesures de raffinement suivantes seront employées : les souris seront hébergées en armoire ventilée sous conditions de température contrôlées. Elles auront accès à un enrichissement pendant toute la durée de l’expérience. Une surveillance clinique quotidienne est réalisée afin d’identifier les potentiels signes de douleur engendrée par le protocole durant toute la durée de l’étude. En cas de besoin, un traitement antalgique sera instauré́, et adapté au type de procédure invasive.
Raffinement
Durant toute la durée des expérimentations, les animaux seront surveillés pluri-quotidiennement. Des critères d’évaluation de leur état clinique seront utilisés afin d’établir un score de maladie. Cela nous permettra de déterminer le besoin de me mettre en place un traitement analgésique pour garantir le bien-être des animaux. Si ce score devient trop élevé, notamment lié à une perte de poids trop importante, la mise à mort de l’animal devra avoir lieu. Durant les phases d’anesthésie ou d’injection, une surveillance particulière d’une quinzaine de minutes suivant l’acte sera réalisée pour s’assurer d’un réveil normal. Dès réveil des souris avec reprise d’une déambulation, elles réintégreront leur cage.
Choix des espèces
La validation de nouvelles molécules anti-infectieuses est classiquement effectuée chez la souris du fait d’un recul important en termes de données et d’outils de suivi disponibles sur les infections respiratoires et digestives. C’est le seul modèle officiellement validé et nécessaire au préalable sur le plan pharmaceutique avant un transfert pour un éventuel essai chez l’humain. Dès la réception de souris mâles âgées de 6 à 7 semaines, une stabulation d’une semaine dans l’animalerie sera respectée. Ces dernières seront alors utilisées à un âge compris entre 7 et 10 semaines. Les animaux utilisés doivent avoir atteint la maturité sexuelle pour éviter les biais dus à la perturbation hormonale. Le protocole expérimental a une durée maximale de 28 jours.
Etude de l’inflammation rénale chez la souris par imagerie photoacoustique
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système urogénital
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sévères. Elles reçoivent une injection déclenchant une inflammation rénale, puis la pose d'un cathéter sous anesthésie profonde et une imagerie photoacoustique avec agent de contraste, avant d'être tuées pour prélever les reins. Le porteur indique que le produit inflammatoire peut provoquer une inflammation généralisée, une insuffisance rénale et des lésions de plusieurs organes pouvant mener à la mort, tout en affirmant avoir choisi une dose qui n'entraîne pas de mortalité. Il conclut que l'imagerie in vivo ne peut pas être remplacée par des méthodes sans animaux et qualifie ces procédures de "stricte nécessité", pour tester un nouvel agent de contraste.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de tester in vivo l'imagerie photoacoustique pour le diagnostic précoce de l'inflammation rénale en utilisant un nouvel agent de contraste ciblant certaines molécules d’adhésion. Celles-ci sont exprimées à la surface des cellules lors d’un épisode inflammatoire aigu ou chronique comme une inflammation systémique, une atteinte rénale ou une maladie rénale chronique. Une étude plus récente a d'ailleurs démontré dans un modèle murin d'atteinte rénale aiguë que cet agent de contraste est capable de cibler l'inflammation dans la moelle rénale. Des tests préliminaires sur ces microparticules en imagerie photoacoustique ont montré que ces microparticules possèdent une absorption et une fluorescence considérable dans la région des longueurs d'onde utilisées en imagerie photoacoustique (proche InfraRouge). L'utilisation de ce nouvel agent de contraste semble donc être un outil prometteur pour la détection en pré-clinique de l'inflammation rénale. Enfin, des études in vitro et in vivo ont montré les propriétés biocompatibles et biodégradables de ces microparticules et il a été également démontré que cette stratégie était efficace pour cibler les cellules endothéliales activées humaines, ouvrant la voie à une potentielle translation en clinique.
Bénéfices attendus
Il est attendu de la technique d'imagerie photoacoustique utilisant ce nouvel agent de contraste biocompatible qu'elle puisse permettre d'imager de manière ultra-sensible, spécifique et précoce l'inflammation rénales.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : o Induction du modèle inflammatoire par une unique injection d’un produit induisant l’inflammation (durée : inférieure à 10min) o Pesée lors des manipulations (durée : inférieure à 5 min) o Pose d’un cathéter sous anesthésie profonde (durée : environ 15min) o Imagerie photoacoustique avec injection de produit de contraste (durée : environ 20min).
Impact sur les animaux
D'après les études pilotes précédentes, les deux modèles présentés peuvent en effet induire des effets indésirables sur les animaux. Pour notre 1er modèle, l'injection du produit inflammatoire peut induire une inflammation généralisée, une insuffisance rénale et des lésions touchant plusieurs organes ce qui peut mener à la mort des animaux. Il est important de noter que la concentration choisie pour ce projet n'induit pas de mortalité chez les souris. Pour notre 2ème modèle, ce modèle d'inflammation différent du premier induit la mort des cellules rénales conduisant dans certains cas une insuffisance rénale aigue. Dans ces deux modèles, les animaux peuvent être en mal-être qui peut alors être repéré par un état d'épuisement, une inactivité dans la cage, un arrêt de la prise alimentaire et de boisson suivie d'une perte de poids. Lors du protocole d'imagerie, celui-ci se déroulera sous anesthésie générale des animaux mais la pose du cathéter veineux (la "sonde veineuse" qui permet l'administration de l'agent de contraste) peut provoquer un bleu sur la queue des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les différents organes d'intérêt des animaux (reins), permettant ainsi de compléter les résultats obtenus in vivo par des résultats post-mortem (biodistribution, caractérisations immunohistologiques). De plus, les caractérisations histologiques sont très souvent demandées pour justifier les résultats obtenus lorsqu'une nouvelle technique d'imagerie pré-clinique est étudiée.
Remplacement
Des tests in vitro ont été réalisées sur des microparticules utilisées en imagerie photoacoustique et ont permis de montrer que ces microparticules possède une absorption et une fluorescence considérable dans la région des longueurs d'onde utilisées en photoacoustique (proche InfraRouge). Toutefois, les expériences in vivo ne peuvent pas être totalement remplacées par des études in vitro car il est nécessaire d'estimer l'affinité de ces microparticules pour les molécules d'adhésion exprimées en conditions inflammatoires ainsi que les temps de ciblage et de détectabilité de ces microparticules en imagerie photoacoustique lorsqu'elles sont injectées dans un organisme. D'après les études pilotes, on sait que les microparticules utilisées ciblent efficacement l'inflammation rénale dans les deux modèles cités et l'on souhaite savoir si ce ciblage sera détectable en imagerie photoacoustique. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures par rapport à nos précédents projets ayant utilisé les mêmes modèles animaux et les mêmes types de microparticules. Dans ces deux études précédentes il a été montré que 5 animaux par modèle étaient suffisants pour obtenir une différence significative du signal en imagerie par résonance magnétique. Ces effectifs ont été confirmés par un calcul de taille d'échantillons.
Raffinement
Pendant les différents temps que dureront l'étude, la douleur des animaux sera réduite au maximum en veillant à couvrir ces temps d'étude par une analgésie. De plus en amont de ce projet, pour limiter la douleur engendrée par l'injection de produit inflammatoire, nous avons choisi de n'utiliser qu'une dose, connue pour ne pas induire de mortalité chez les souris. Enfin, les animaux ne seront pas gardés pour des études sur le long terme pour ne pas les laisser en souffrance au-delà des 24 et 48 heures que durent les modèles.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des pathologies de type inflammatoire. L’anatomie et la physiologie de la circulation sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’Homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier les pathologies inflammatoires. Nous utiliserons des souris mâles et femelles adultes (8 semaines), en rapport avec l’âge des animaux utilisés dans les études pilotes précédentes.
Identification de la source de production précoce de GM-CSF lors de la mise en place d’une réponse Th17
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sévères. Elles sont cousues deux à deux par chirurgie de parabiose sous anesthésie générale, pour partager leur système sanguin, puis subissent prélèvements et injections avant d'être tuées environ cinq semaines après l'opération. Le porteur reconnaît que la parabiose est classée sévère en raison de l'inconfort post-opératoire, prévoit une analgésie de 48 heures et fixe comme point limite une perte de poids supérieure à 20 % ou une détresse non soulagée au-delà de 24 heures. Il affirme que ce partage chirurgical du sang est la seule alternative pour identifier la source d'une cytokine dans le modèle murin de la sclérose en plaques.
Objectifs
La sclérose en plaques est une maladie auto-immune qui se caractérise par l'infiltration du système nerveux central (CNS) par des cellules immunitaires conduisant à la destruction de la gaine de myéline qui est à l'origine des désordres moteurs chez les patients. Afin de développer des traitements plus ciblés, il est essentiel de mieux comprendre la physiopathologie de la maladie. Nous avons identifié une nouvelle fonction pour une cytokine pro-inflammatoire, le GM-CSF, en mettant en évidence son rôle crucial dès les premières étapes de la maladie. Nous souhaitons dans ce projet identifier la source cellulaire de cette cytokine.
Bénéfices attendus
L'utilisation d'anticorps antagonistes bloquant le GM-CSF est une piste thérapeutique prometteuse et les premiers résultats testant l'inocuité du traitement chez les patients sont prometteurs. Notre projet permettra d'apporter un nouveau mécanisme d'action du GM-CSF en montrant que l'utilisation d'un anticorps monoclonal bloquant la cytokine agit non seulement au niveau du système nerveux central, mais aussi en périphérie au niveau des organes lymphoïdes secondaires dès les étapes les plus précoces de la maladie, renforçant ainsi la pertinence de son utilisation dans le traitement de la SEP.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie de parabiose sous anesthésie générale. Deux semaines après la chirurgie, un prélèvement sanguin sera effectué dans la veine mandibulaire sous anesthésie gazeuse. Quatre semaines après la chirurgie, les animaux recevront, sous anesthésie gazeuse, une injection sous-cutanée au niveau de la base de la queue ainsi qu'une injection intra-veineuse au niveau de la veine caudale. Les animaux seront euthanasiés aux alentours de 5 semaines après la parabiose.
Impact sur les animaux
Les expériences de parabiose sont des expériences classées sévères du fait de l'inconfort qu'elle crée en post-opératoire. Cependant, nous avons déjà réalisé ce type de chirurgie pour un autre projet, et dès 2-3 jours après la parabiose, les parabiontes se déplacent dans la cage et se suspendent à la grille.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront tous euthanasiés.
Remplacement
L'objectif de notre projet est d'identifier la source de GM-CSF et de distinguer si le GM-CSF est sécrété par une population cellulaire circulante ou une population résidente dans les tissus lors des premières étapes de la mise en place de la réponse inflammatoire mise en place lors d'une encéphalite auto-immune expérimentale, le modèle murin de la sclérose en plaques. C'est un processus complexe et intégré qui nécessite l'implication de plusieurs types cellulaires dans des organes distincts avec une cinétique précise. Ces étapes ne peuvent pas être mimées in vitro. De plus, les expériences de parabiose, à savoir le partage du système sanguin, sont les seules alternatives expérimentales afin de répondre à notre question.
Réduction
Nous avons calculé que le nombre minimum pour obtenir des résultats reproductibles et statistiquement interprétables est de 7 souris/groupe et que les expériences seront reproduites 2 fois. Nous effectuerons le maximum d'analyse sur le même animal : analyse des tissus inflammés par histologie, analyse multiparamétrique en cytométrie en flux ...
Raffinement
Avant la procédure de parabiose, les futurs parabiontes seront isolées dans une cage enrichie (igloo/papier kraft pour nidification) pendant deux semaines afin qu'elles s'habituent l'une à l'autre. Lors de la procédure de parabiose, les souris seront anesthésiées avec un mélande de Kétamine 100 mg/kg/Xylazine 10mg/kg injecté en i.p (aiguille de 26G). A cette dose, l'anesthésie dure environ 60 min. Si les souris devaient se réveiller, une nouvelle injection en i.p. serait réalisée de kétamine seule (25 mg/kg) (aiguille de 26G). Nous nous assurerons de la perte de conscience des animaux avant la chirurgie par une absence de reflexe palpébral et du reflexe du retrait. Durant l'opération, un gel oculaire sera appliqué afin d'éviter tout dessèchement de la cornée. Après la chirurgie et jusqu'à leur réveil, les animaux seront placés sur un tapis chauffant afin de limiter l'hypothermie. En post-opératoire, les animaux seront analgésiés pendant 48h, 2 fois/24h, par des injections souscutanées (aiguille de 26G) de Buprenorphine à 0.1 mg/kg. Durant 10 jours, les animaux recevront des antibiotiques sous forme d'un traitement dans l'eau de boisson. Nous nous assurerons aussi que les animaux aient une prise hydrique et alimentaire correcte en rajoutant dans la cage du gel d'hydratation ainsi que des croquettes sous forme de gel. Une attention particulière sera portée aux sutures cutanées pendant la première semaine. Les animaux seront surveillés et pesés quotidiennement pour détecter des signes de douleur et de détresse (tremblement, léthargie, dos arqué, manque de toilettage...). Une perte de poids sévère (>20% du poids initial) ou des signes de douleur et de détresse >24h et non soulagé par le traitement analgésique constituent des points limites et la mise à mort des animaux. Pour réaliser l'immunisation, les animaux seront anesthésiés sous anesthésie gazeuse (Isoflurane 4%). La procédure n'entraîne pas de douleurs, ni de dommages aux animaux.
Choix des espèces
Du point de vue immunitaire, les souris présentent des caractéristiques proches de l'espèce humaine. Elles nous permettent d'étudier la physiopathologie des maladies auto-immunes telles que la sclérose en plaques, avec son modèle murin l'EAE (encéphalite auto-immune expérimentale). Nous disposons aussi des modèles murins génétiquement modifiés qui nous permettront d'évaluer l'origine du GM-CSF dans la réponse mise de place da réponse immune encéphalitogène. Des souris adultes seront utilisées dans ce projet
Etude de la réponse immunitaire chez la souris lors d’une infection expérimentale par les microsporidies Encephalitozoon cuniculi et Encephalitozoon intestinalis
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
848 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant jusqu'à modéré, certaines menées sous anesthésie sans réveil. Elles sont infectées par des microsporidies (Encephalitozoon cuniculi et E. intestinalis) dans l'oreille ou par gavage, puis observées par imagerie intravitale sous anesthésie, avant d'être tuées pour prélever oreille, ganglion et muqueuse intestinale. Le porteur décrit une réponse inflammatoire locale qu'il qualifie de minime et indique que tout signe de souffrance, poil hérissé ou baisse de motricité, entraîne l'euthanasie immédiate. Il affirme que l'analyse in vitro reste largement insuffisante pour saisir la réponse immunitaire in vivo et renvoie au futur les retombées, des stratégies immunothérapeutiques.
Objectifs
L’immunobiologie des microsporidioses est un domaine encore peu exploré. Parmi les composants cellulaires de la réponse immunitaire anti-microsporidie, les cellules dendritiques et les macrophages représentent des cellules clés qui vont faciliter la transition entre la réponse immunitaire innée et adaptative chez l’hôte infecté. Or, le parasite est capable de moduler cette réponse. Parmi les mécanismes d’échappement immunitaire décrits in vitro, citons l’exemple d’Encephalitozoon avec E. cuniculi qui se réplique à l’intérieur des macrophages par inhibition de l’acidification du phagosome et absence de fusion phagolysosomale. E. intestinalis interfère quant à lui avec différents aspects de la physiologie des cellules dendritiques : leur différenciation, leur maturation, la production de cytokines, induisant ainsi un « priming » aberrant des lymphocytes T. Ainsi, les microsporidies « piratent » le système immunitaire de l’hôte, mais peu de données existent encore sur la mise en place de ces stratégies d’échappement in vivo. Notre projet vise à explorer in vivo, chez la souris, la mise en place de la réponse immunitaire anti-microsporidie, en étudiant en temps réel les interactions entre les microsporidies et les composantes cellulaires de la réponse immunitaire innée (macrophages, polynucléaires neutrophiles, cellules dendritiques). Le modèle du pavillon de l’oreille de la souris comme support pour l’analyse de la dynamique de la réponse immunitaire par imagerie intra-vitale est un des plus utilisés. Un travail récent a étudié les interactions entre les cellules de l’immunité innée et le staphylocoque doré. L’objectif est ici d’adapter ce modèle à l’étude de l’immunobiologie des microsporidioses. Nous proposons également d'étudier la réponse immunitaire anti-microsporidie au niveau de la muqueuse intestinale, dans le modèle de l'anse iléale de la souris. En infectant avec l’espèce E. Cuniculi, puis E. intestinalis plus fréquemment retrouvée chez l’homme, le modèle murin intestinal mis au point mimera au mieux la physiopathologie de l’infection humaine par ce parasite intestinal.
Bénéfices attendus
De façon globale, ce projet nous apportera des connaissances nouvelles pour une meilleure compréhension de la réponse immunitaire dirigée contre les espèces microsporidiennes E. cuniculi et E. intestinalis, un domaine encore peu exploré à ce jour. L’objectif in fine sera de développer des stratégies immunothérapeutiques permettant de mieux contrôler ces infections dans le futur.
Procédures
-Expériences d'imagerie intravitale sur le tissu de l'oreille : le tissu cutané de l'oreille est imagé en microscopie confocale (imagerie intravitale) après inoculation des parasites (spores infectieuses) chez l'animal anesthésié (de quelques heures à 6 jours après l'infection)(durée: 2h, 5 interventions au total). Les animaux sont euthanasiés à la fin de l'expérience. -Expériences avec biopsies de tissu : les tissus (oreille, ganglion) sont prélevés chez des animaux euthanasiés à différents temps après l'infection. -Expériences d'imagerie intravitale de la muqueuse intestinale : la muqueuse intestinale est imagée chez des animaux infectés par gavage (inoculation de spores infectieuses par voie orale) et anesthésiés (durée : 2h, 1 intervention). Les animaux sont euthanasiés à la fin de l'expérience d'imagerie (temps 2-4h ou 24h).
Impact sur les animaux
* Expériences dans le modèle du pavillon de l’oreille : toutes les interventions sont réalisées sur animal anesthésié, ce qui évite tout stress, inconfort ou douleur chez l’animal. Les animaux sont pesés chaque jour après l’injection des spores dans l’oreille, et ce pendant toute la durée de l’expérience. Les expériences sont de courte durée (6 jours maximum) et la réponse inflammatoire observée localement au point d’injection est minime. Toute souffrance apparente de l’animal repérable en surveillance journalière : poil hérissé, baisse de la motricité, mènera cependant à l’arrêt immédiat de l’expérimentation avec euthanasie des animaux. * Expériences dans le modèle de la muqueuse intestinale : toute souffrance apparente de l’animal repérable en surveillance journalière après l'inoculation des spores d’E. cuniculi ou d' E. intestinalis par gavage : poil hérissé, baisse de la motricité, conduira à l’arrêt immédiat de l’expérimentation avec euthanasie des animaux. Toutes les expériences d'imagerie intravitale de la muqueuse intestinale seront réalisées sur animal anesthésié, ce qui évite tout stress, inconfort ou douleur chez l’animal. L'animal est euthanasié à la fin de chaque expérience.
Devenir
Les animaux inoculés avec les spores d’E. cuniculi ou d’E. intestinalis sont gardés en vie (quelques heures ou quelques jours) en vue de l'imagerie de la muqueuse intestinale ou du tissu de l’oreille. A la fin de chaque session d’imagerie et ainsi à la fin du projet, tous les animaux sont euthanasiés en vue des prélèvements de tissus infectés (oreille, ganglion auriculaire, muqueuse intestinale).
Remplacement
Notre approche expérimentale inclut une première analyse in vitro avec des lignées cellulaires et des cultures primaires de cellules immunitaires, mais elle reste largement insuffisante pour connaitre les interactions fines mises en jeu entre parasites et cellules immunitaires. En effet, elle n’englobe que très partiellement la complexité de la réponse immunitaire in vivo, à l'échelle tissulaire.
Réduction
Expériences de microscopie confocale dans le modèle du pavillon de l’oreille (expériences I) ou de la muqueuse intestinale : le nombre d’animaux par lot (n=1) a été défini selon la puissance statistique et la variabilité des paramètres étudiés. Dans le modèle de l’oreille, le même animal est suivi au cours de 6 points de cinétique différents (faible nombre d’animaux utilisés). Dans le modèle intestinal, l’expérience est de courte durée (observation soit au temps 2-4H, soit au temps 24h) et l’animal est euthanasié à la fin de chaque expérience. L’expérience est répétée 20 fois (modèle de l’oreille) ou 30 fois (modèle intestinal) car une grande variabilité de la réponse immunitaire peut être observée d’un individu à l’autre, et selon le modèle utilisé. Ce nombre est justifié par la variabilité des réponses in vivo dues à la variation de l'inoculum parasitaire et à une réponse immunitaire individuelle hétérogène. Une analyse statistique par Anova ou test de Student sera réalisée, une différence au niveau du recrutement cellulaire ou de la charge parasitaire sera généralement considérée comme statistiquement significative lorsque la P value sera inférieure à 0,05.
Raffinement
Les animaux sont stabulés dans une salle climatisée (22 ± 2°C) avec un cycle 12/12 h (jour/nuit, 7h00 à 19h00) et un taux d’humidité maintenu à 55%. Les animaux ont libre accès à la boisson et à la nourriture. Le régime alimentaire est composé de croquettes (A04-Safe, Epinay/Orge, France). Dans les deux modèles d’étude (modèle oreille, modèle intestinal), toutes les interventions sont réalisées sur animal anesthésié, ce qui évite tout stress, inconfort ou douleur chez l’animal. *Modèle du pavillon de l’oreille : Après imagerie du tissu de l’oreille et pendant la phase de réveil, l'animal est placé sur un tapis chauffant thermorégulé pour éviter l'hypothermie, et gardé en observation pendant 2 heures puis remis dans sa cage initiale si tout va bien (pas de poil hérissé, respiration régulière, recouvrement d'une motricité normale, alimentation normale). Les animaux sont pesés chaque jour après l’injection des spores dans l’oreille, et ce pendant toute la durée de l’expérience. Les expériences sont de courte durée (6 jours maximum) et la réponse inflammatoire observée localement au point d’injection est minime. Toute souffrance apparente de l'animal repérable en surveillance journalière : poil hérissé, baisse de la motricité, mènera cependant à l’arrêt immédiat de l’expérimentation avec euthanasie des animaux. Les biopsies de tissus seront toujours réalisées sur des animaux euthanasiés, après dislocation cervicale. Après vérification de la mort de l’animal par arrêt total, rapide et durable des mouvements cardio-respiratoires et par l’absence de réflexes (pincement de la patte), les tissus (oreille ou ganglion lymphatique) sont prélevés très rapidement. * Modèle de la muqueuse intestinale : le recours à l'anesthésie profonde permet d'éviter tout stress ou douleur chez l’animal. Les expériences sont de courte durée (quelques heures). L'animal est sacrifié après observation de la réponse inflammatoire au niveau du sommet des villosités intestinales (anses iléales).
Choix des espèces
La souris est actuellement le modèle de vertébré couramment utilisé pour étudier in vivo la réponse immunitaire anti-microsporidie. Des souris C57BL6 mâles ou femelles de 8 à 12 semaines seront utilisées. Le poids (âge) choisi correspond à celui d’un jeune animal adulte qui a un système immunitaire mature. Les animaux seront utilisés à l'âge de 8 à 12 semaines, ce qui correspond à l'âge d'une souris possédant un système immunitaire mature.
Étude du rejet de greffons modifiés génétiquement pour échapper au système immunitaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une greffe de peau sur le dos sous anesthésie, avec un bandage qui gêne l'auto-toilettage et expose à une infection uro-génitale, avant la mise à mort pour analyser les tissus. Le porteur cherche à imiter dans le greffon un mécanisme de la bactérie Listeria pour échapper au rejet immunitaire, comme alternative aux immunosuppresseurs. Il conclut à la nécessité de la souris, aucun modèle in vitro ne reproduisant selon lui la complexité du rejet de greffe.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de démontrer qu’une alternative aux traitements immunosuppresseurs des patients ayant reçu une greffe d’organe est possible.. Ces traitements à vie présentent des effets secondaires néfastes tels que la sensibilité accrue aux infections et le risque de développement tumoral. Nous proposons d’étudier une stratégie de traitement alternative, consistant à mimer dans le greffon un mécanisme utilisé par la bactérie Listeria monocytogenes pour échapper au système immunitaire. L’induction de cette capacité, de manière localisée au niveau du greffon dans un modèle murin de greffe de peau, devrait permettre de le maintenir à long-terme et d’éviter l’utilisation d’immunosuppresseurs.
Bénéfices attendus
Environ 6.000 patients en France et 130.000 dans le monde reçoivent chaque année une greffe d’organe. De nombreuses autres personnes vivent avec une greffe. Les traitements immunosuppresseurs actuels, indispensables à ces patients, entrainent des effets secondaires importants. Notre projet est une preuve de concept en vue de proposer par la suite une alternative thérapeutique dans laquelle le système immunitaire n’est pas altéré, afin d’améliorer la qualité de vie des personnes greffées.
Procédures
Les souris seront soumises à une greffe de peau au niveau du dos (environ 40 minutes de l’induction de l’anesthésie au placement dans la cage de réveil). Cela implique 2 injections pré-opératoires en sous-cutané de traitements analgésiques (Buprénorphine et Metacam, Lidocaine), une anesthésie par injection intrapéritonéale (Ketamine et Xylazine) et d’éventuelles injections sous-cutanée d’analgésique (Buprenorphine) en cas de persistance des signes de souffrances 3 jours après l’opération. Chaque injection dure 10 secondes environ.
Impact sur les animaux
Les différentes expériences réalisées conduisent à un degré de sévérité modéré. La réalisation de la greffe de peau induit de la douleur chez les animaux. C’est également le cas des injections sous-cutanée ou intra-péritonéales des traitements. La présence du bandage peut aussi être une source de gêne pour l’animal et l’expose à un risque d’infection uro-génitale en empéchant l’auto-toilettage.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever les tissus pour des analyses cytométriques et histologiques.
Remplacement
Ce projet a pour but l’étude des mécanismes immunitaires impliqués dans le rejet de greffes. Il n’existe à l’heure actuelle, aucun modèle in vitro ou ex vivo rendant compte de la complexité de ce mécanisme dans son intégralité. Seuls les animaux, tels que les modèles murins, permettent de comprendre le processus dans sa globalité, avec toutes les interactions que cela implique et c’est pourquoi il est nécessaire d’avoir recours à ces animaux pour atteindre les objectifs de notre projet. De plus, les modèles murins transgéniques utilisés ici permettent d’étudier l’impact d’une voie de signalisation dans le rejet de greffe de façon globale.
Réduction
Les rejets de greffe seront quantifiés par un score entre 0 et 5 et seront comparés entre les groupes à l'aide de tests de comparaison de moyenne. Les effectifs par groupe (n=4) sont associés à des tailles d'effet de 2.05, pour un test de comparaison de 3 moyennes, un risque de 5% et une puissance de 80%. Ceci correspond à des effets forts, compatibles avec la question biologique. Le plan expérimental mis en œuvre est emboîté. Le problème de dépendance statistique des individus appartenant à une même cage sera minimisé lors de l’analyse des données en ayant recours à des modèles statistiques à effets mixtes.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe avec une litière appropriée, à base de cellulose quand les animaux sont greffés, et des matériaux de nidification. Les animaux recevront un traitement antalgique en prévention de la douleur avant l’opération. Ils seront réhydratés par injection en sous-cutané de sérum physiologique, puis auront accès à des gels de réhydratation adaptés. Les animaux seront maintenus au chaud sur une tablette chauffante pendant toute la phase de chirurgie. Celle-ci est réalisée en condition aseptique, et un antispetique en application locale sera utilisée. Les animaux recevront ensuite un antalgique en suspension orale pendant 3 jours après l’opération. Si des signes de souffrance persistent 3 jours après la chirurgie, une injection d’antalgique sous-cutanée, renouvelable si besoin, sera effectuée. Si des signes évidents de souffrance persistent malgré le traitement antalgique, les animaux sont mis à mort. Les animaux sont observés et pesés quotidiennement afin de détecter les signes éventuels de souffrance, vérifier l’intégrité des bandages et nettoyer la partie génitale régulièrement car le bandage empêche l’accès à cet endroit par l’animal pour l’auto-toilettage.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est un modèle de choix pour l’étude de la réponse immunitaire, processus intervenant dans le cadre des rejets de greffes. En effet, un grand nombre d’outils ont été développés pour étudier la réponse immunitaire des souris. Le recours à ces outils permettra de contrôler et de caractériser les processus conduisant au rejet des tissus transplantés de la façon la plus pertinente possible, en prenant en compte les spécificités du modèle murin par rapport à l'homme. De plus, la souris est un modèle qui peut être modifié génétiquement, ce qui nous permet d’étudier l’impact de l’expression de gènes dans le rejet des greffes. Nous utiliserons des souris adultes, d’au moins 8 semaines. Ces animaux sont suffisamment âgés pour avoir un système immunitaire en place mais également pour favoriser la greffe de peau, que ce soit du point de vue de la réalisation de la procédure que de la prise du greffon.
Etude de la colonisation intestinale de Staphylocoques dans un modèle néonatal murin
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
250 souris nouveau-nées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Dès l'âge de deux jours, les souriceaux sont gavés deux fois par jour pendant sept jours avec des staphylocoques, ce qui peut provoquer une inflammation digestive, des diarrhées, une infection généralisée avec fièvre et déshydratation. Le porteur prévoit la mise à mort par décapitation dès une perte de poids supérieure à 15 %, puis une analyse bactériologique des tissus. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité de l'animal et retient le modèle néonatal parce que les infections humaines visées surviennent dans les premiers jours de vie.
Objectifs
Les bactériémies à Staphylocoques chez les nouveaux-nés peuvent-être médiées par le portage digestif. Lors d'une étude préliminaire, nous avons pu montrer une forte présence de Staphylocoques dans les selles des patients atteints de bactériémie. Nos travaux in-vitro se sont donc portés sur la colonisation de différentes espèces de Staphylocoque (aureus, capitis, haemolyticus) au niveau digestif. Nous avons réussi à déterminer que ces pathogènes parvenaient à passer à travers la barrière intestinale en utlisant des cellules appelées entérocytes et cellules M. Pour confirmer nos observations, un modèle in-vivo de souris néonatal nous permettra de (i) confirmer le passage intestinale de ces souches à travers l'épithélium intestinal. Nous pourrons également vérifier (ii) qu'une souche microbiotique (L. lactis) peut avoir un effet protecteur quant à l'implantation de souches pathogènes.
Bénéfices attendus
Nos résulats in-vitro valident nos hypothèses sur un modèle simple. Un modèle animal complexe permettrait de résoudre le mystère de la physiopathologie des Staphylocoques dans l'intestin.
Procédures
Les interventions seront des gavages répétés 2x/jour (20 secondes par gavage, donc 40 secondes par jour de gavage) pendant 7 jours chez des souriceaux âgés entre 2j et 9j. La pesée et le test du pli de la peau du dos prendront environ 30 secondes par jour. Au total, les souriceaux seront exposés à environ 1 minute de procédure par jour pendant 7 jours.
Impact sur les animaux
Le gavage sur souris adulte est une technique maitrisé dans le laboratoire, il faudra cependant adapter notre protocole à des souriceaux. Il est possible que la sonde de gavage puisse provoquer une légère irritation dans la gorge de l'animal. L'induction d'une forte charge bactérienne peut provoquer une inflammation du système digestif avec une apparition de diarrhées. La survenue d'une bactériemie peut provoquer un état infectieux général incluant de la fièvre et de la déshydratation.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour une analyse bactériologique et inflammatoire des tissus.
Remplacement
Nous sommes limités par notre modèle simple in-vitro. Un modèle de récupération de cellules primaires de patients est envisagé mais restera circonscris à un modèle in-vitro. Il est impossible d'envisager de travailler sur un modèle in-vitro reproduisant la complexité d'un animal.
Réduction
Nous n'aurons pas besoin d'effectuer des génotypages et des sélections de génotypes puisque nous travaillerons sur des souris au génotype "sauvage" issus d'éleveurs agréés. Afin de minimiser le nombre d'individus nécessaires, un test statistique ANOVA a permis de défnir le nombre d'animaux nécessaire pour une puissance statistique significative.
Raffinement
Toutes les expérimentations sont réalisées dans une animalerie certifiée. Les souris seront manipulées une fois tous les jours pour être habituées à la présence et à l'odeur de l'expérimentateur. Cela évitera également que la mère délaisse ces petits après les manipulations de l'expérimentateur. Les petits resteront avec leur mère (il ne pourra donc n'y avoir qu'une condition par cage) pour éviter toute souffrance des bébés. Les bébés seront pesés 1 fois par jour avec une balance de précision pour détecter une perte de poids correspondant à l'installation de la maladie. Une perte de poids supérieure à 15% conduira au sacrifice de l'animal par décapitation. Les petits ne seront utilisés qu'à partir de l'âge de 2 jours, les recommandations demandent de laisser généralement la femelle et ses petits tranquilles pendant les premières 24h de vie. Les gants seront changés entre chaque cage, avec un frottage préalable avec de la litière avant de manipuler les petits. Les souriceaux seront manipulés sur une table chauffante (préalablement frottée avec de la litière de la cage) ou dans le creux des mains pour éviter une hypothermie. Les mères seront alimentées avec une nourriture enrichie pour reproducteurs. Les cages seront enrichis (copeaux, matériel de nidification, bâtonnets à ronger). L'eau et la nourriture pour les individus adultes seront mis à disposition "ad libitum". Chaque animal bénéficie d'une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d'assurer un bien-être optimal tout au long de l'étude. Les gavages seront effectués via une sonde flexible spécialement adapté aux souriceaux.
Choix des espèces
La souris est à l'heure actuelle l'animal le mieux adapté pour la modélisation de la colonisation intestinale à Staphylocoques. Il se trouve que cet animal peut-être naturellement colonisé par S. aureus. L'expérimentation sur des animaux de petites tailles permet d'apporter des élements dans un contexte physipathologique impossible à atteindre in-vtro ou en clinique humaine. Les animaux seront utilisés à H+48 par rapport à leur naissance. En effet, les bactériémies observées chez les nouveaux-nés humains se produisent dans les 5 jours suivant la naissance. Il est donc nécessaire de développer un modèle murin néonatal. Les souris adultes ne pourront pas être infectées par le gavage de leurs petits. En effet, les trois espèces bactériennes utilisées sont : - S. capitis pour lequel le risque d’infection est impossible pour une souris adulte en bonne santé (C’est avant tout un germe opportuniste qui profite de l’axenie des nouveau-nés pour s’implanter) - L. lactis qui est une souche commensale sans pouvoir pathogène - S. aureus pour lequel il pourrait exister une faible chance pour les souris adultes d’être inféctées. L’inoculum étant principalement localisé dans les souriceaux, un transfert suffisamment important de l’inoculum des souriceaux à la souris adulte est impossible. Une quantité très importante est généralement nécessaire pour induire un effet direct sur la souris adulte (en gavage direct ou sur une plaie profonde et maintenue induite par l’expérimentateur). Il est impossible que cette dose se retrouve par accident au contact des souris adultes.
Etude de l’impact d’une infection de type sepsis sur le développement tumoral d’un lymphome induit chez la souris.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
895 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules de lymphome, par voie intraveineuse ou par chirurgie de la rate, puis une injection de bactéries provoquant un sepsis, avec un suivi tumoral hebdomadaire par imagerie, pour étudier comment une infection grave modifie la croissance d'un cancer du sang. Le porteur indique que le lymphome et l'infection abdominale peuvent affaiblir les animaux, avec perte de poids, léthargie et dos voûté. Il affirme que ce modèle n'est pas reproductible in vitro et que le recours aux souris est "indispensable", puis euthanasie tous les animaux pour prélever la rate, le foie, les reins, les poumons, les ganglions et la moelle osseuse.
Objectifs
Les patients hospitalisés en réanimation pour choc septique sont caractérisés par une immunosuppression se traduisant par l’acquisition d’infections ainsi que la persistance d’une dysfonction d’organes à l’origine d’une augmentation de la durée de séjour et de la mortalité. Les modifications immunologiques acquises au cours du choc septique vont exposer les patients à ces complications via des modifications profondes de l’immunité. Parmi les patients hospitalisés pour choc septique, de nombreux patients sont déjà porteurs d’une dysfonction immunitaire qui les expose ainsi aux infections graves. En effet, les patients hospitalisés pour un lymphome B sont particulièrement à risque. Le traitement actuel du lymphome B repose sur une chimiothérapie très immunosuppressive, exposant les patients à des complications infectieuses, dont la sévérité nécessite une prise en charge en soins intensifs. L’arrêt du traitement anti-tumoral pendant le séjour en réanimation doit probablement impacter le pronostic de ces patients. Aussi, la fragilité associée à une dénutrition induite par la réanimation est probablement à l’origine de la non reprise du traitement dans les semaines suivantes. De plus, les effets de l’infection sur le système immunitaire pourraient avoir une influence sur la masse tumorale car celle-ci dépend en partie de son microenvironnement cellulaire. C’est pourquoi ce projet de recherche représente l’étape indispensable avant de pouvoir rapidement développer une étude clinique. En effet, ce projet a pour objectif d’étudier l’impact d’un évènement fréquent (infection) au cours de la prise en charge d’une pathologie fréquente (lymphome B). L’aspect innovant de ce projet est l’étude de la combinaison de deux phénomènes (tumoral et infectieux) ayant des bases immunologiques communes. Cette étude pourrait ainsi permettre le développement de thérapeutiques adjuvantes.
Bénéfices attendus
Nos travaux devraient déboucher sur une meilleure compréhension des liens entre infection et cancer dans le cadre des lymphomes B.
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis à une injection de cellules tumorales en intraveineuse via la veine caudale durant environ 1 minute pour induire le développement tumoral. L’injection en intrasplénique des cellules tumorales nécessitera une intervention chirurgicale sous anesthésie gazeuse d’environ 10min. Les animaux recevront au préalable une injection d’analgésique en sous cutané, cette injection durera moins d’une minute. Une fois par semaine, les animaux vigiles seront soumis à une injection en intrapéritonéale d’une solution de luciférine suivie d’une anesthésie gazeuse d'environ 5 minutes afin de suivre le développement tumoral. Un prélèvement sanguin sur animaux vigiles aura lieu une fois toutes les deux semaines afin d'évaluer leur état de santé général, ce geste durera moins d'une minute. Les animaux vigiles recevront une injection unique d’une suspension bactérienne en intrapéritonéale qui induira un sepsis, geste réalisé en moins d'une minute. L’immunonutrition sera réalisée sur animal vigile à l’aide d’une canule pour gavage, ce geste est réalisé en moins d’une minute. Afin de traiter le lymphome les animaux vigiles recevront une injection en intrapéritonéale d’un anticorps anti-mCD20, ce geste sera réalisé en moins d’une minute.
Impact sur les animaux
Le développement tumoral ainsi que l’infection abdominale peuvent engendrer un affaiblissement de l'animal, c'est pourquoi les souris expérimentées seront observées très régulièrement pour détecter l'apparition de signes de lymphome (perte de poids, léthargie, dos courbé...).
Devenir
Le développement d'un lymphome suivi d'une infection intra-abdominale ne permet pas la réutilisation, le replacement ou l'adoption des animaux. De plus la nécessité d'accéder aux organes d'intérêts (rate, foie, reins, poumons, ganglions lymphatiques et moelle osseuse) ne nous permet pas de garder les animaux en vie, ils seront donc euthanasiés à l'issue de chaque procédure.
Remplacement
L'évaluation de l'impact du sepsis sur la croissance tumorale du lymphome nécessite l’accès aux organes d’intérêt pour évaluer les conséquences de cette infection sur l’organisme dans sa globalité. Ceci n’est absolument pas reproductible in vitro car le développement d’un lymphome et/ou l’induction d’un sepsis engendre des modifications cellulaires dans différents organes tels que le foie, la rate, les poumons, mais également le sang périphérique. C’est pourquoi le recours à des animaux est indispensable pour le développement de ce type de modèle.
Réduction
Les procédures expérimentales sont rigoureusement planifiées afin de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, le laboratoire possède déjà une expertise à la fois sur le développement d'infections abdominales et sur le développement de modèle murin de lymphome, ce qui nous permettra d'utiliser moins d'animaux pour la mise en place de cette étude.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées : locaux confinés, portoirs ventilés, eau et nourriture ad libitum, maximum 5 animaux/cage et aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. L'utilisation d’analgésiques permettra d’éviter toute souffrance aux animaux. De plus, l’évaluation régulière du score de grimace des animaux et le suivi de leur poids et de leur comportement permettra d’avoir un contrôle continu sur leur état de santé. Enfin, la technique de suivi non-invasif par imagerie bioluminescente nous permettra de réaliser une caractérisation en cinétique de notre modèle de façon non douloureuse tout en réduisant le nombre d'animaux nécessaire à cette caractérisation.
Choix des espèces
Ce modèle murin permettra de développer un lymphome suivi d'une dysfonction immunitaire induite par un sepsis. Ce modèle nous permettra ainsi de caractériser et de traiter cette dysfonction immunitaire. Le développement d'un lymphome suivi d’une immunodépression post-infectieuse n'est pas reproductible in vitro car il touche le système immunitaire dans son ensemble. L’étude de mesures thérapeutiques afin de diminuer cette immunodépression et ses conséquences infectieuses explique pourquoi le recours à des animaux est indispensable pour le développement de ce type de projet de recherche. De plus, le modèle murin de lymphome par injection de cellules tumorales murines A20 est un modèle animal connu et bien caractérisé et le développement d'infections abdominales est actuellement en cours de caractérisation au sein de notre laboratoire. La très grande majorité des travaux scientifiques réalisés utilise des souris de 7-9 semaines.
Impact des métabolites du lait maternel sur la maturation de l’épithélium intestinal et le développement cérébral du nouveau-né ; Etude pré-clinique dans un modèle mini-porc.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
30 porcelets mini-porcs Yucatan vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Séparés de leur mère à deux jours puis isolés en cage individuelle pendant dix-neuf jours, ils reçoivent par un distributeur automatique un lait infantile enrichi ou non en métabolites du lait maternel, pour améliorer les préparations pour nourrissons. Le porteur reconnaît que la séparation maternelle et l'isolement peuvent être une source de stress, tout en affirmant que les porcelets ne montrent aucun stress au-delà des douze premières heures. Il justifie le recours au porcelet par sa proximité physiologique avec le nouveau-né humain, et prévoit la mise à mort de tous les animaux pour prélever tissus digestifs et cérébraux.
Objectifs
Ce projet a pour enjeu l’amélioration des propriétés fonctionnelles des préparations pour nourrissons (PPN) afin de mimer les effets bénéfiques du lait maternel (LM) et de garantir un développement adéquat du nouveau-né. En effet, il reste à ce jour des différences entre le LM et les PPN, notamment concernant les composés bioactifs retrouvés dans le LM peu ou pas présents dans les PPN. Ainsi, ce projet s’intéresse aux métabolites du LM, afin d'évaluer leurs effets sur le développement du nourrisson, particulièrement au niveau des régions digestives et cérébrales. Plus spécifiquement, nous nous intéressons à des métabolites capables d’être produits par des bactéries et dont l’origine au sein du LM peut être bactérienne, issus de la circulation plasmatique maternelle ou produits in situ au sein du LM par la flore résidente. En effet, l’un des objectifs de ce projet est de pouvoir incorporer ces métabolites dans les PPN par procédés fermentaires. Ainsi, 4 groupes de métabolites ont été sélectionnés : acides gras à chaîne courte, polyamines, dérivés du tryptophane et acides organiques. Ces métabolites ont été préalablement testés in vitro sur des modèles cellulaires d'épithélium intestinal et cérébral afin de sélectionner ceux présentant des intérêts fonctionnels et développementaux. Les métabolites sélectionnés seront ainsi étudiés in vivo dans le modèle mini-porcs Yucatan en les incorporant dans des PPN fournies de façon continue des 2 aux 21 jours des porcelets. Nous disposerons de trois groupes de porcelets, un groupe témoin qui recevra une PPN sans métabolites et deux groupes expérimentaux qui recevront des PPN supplémentées en métabolites, à des concentrations proches du LM, par deux procédés distincts ; une supplémentation par des métabolites achetés dans le commerce et une supplémentation en métabolites apportés par fermentation d'une matrice laitière via des souches de bactéries lactiques et propioniques. Ainsi, nous pourrons évaluer l'impact des métabolites sur le développement physiologique intestinal et cérébral du mini-porc et valider que la fermentation d'une fraction laitière est un procédé fiable pour les apporter.
Bénéfices attendus
L’enjeu de ce projet est d’améliorer la fonctionnalité des PPN en s’intéressant aux métabolites du LM pour mimer au mieux les effets bénéfiques de ce dernier sur la santé et le développement du nourrisson. La sélection des métabolites présentant des intérêts fonctionnels et développementaux est en cours de finalisation et se basera sur les résultats obtenus à partir de modèles in vitro d'épithélium intestinal et de neurones cérébraux. Les métabolites d'intérêts appartiennent aux 4 groupes suivant : acides gras à chaîne courte, polyamines, dérivés du tryptophane et acides organiques. Les métabolites sélectionnés seront incorporés aux PPN à des concentrations proches de celles du LM. L’expérimentation sur porcelet, présentant des caractéristiques physiologiques proches du nouveau-né humain, permettra d’évaluer l'impact de l'apport de ces métabolites par voie orale au cours de la période post-natale précoce au sein d'un système plus complexe et intégré que les modèles cellulaires in vitro et permettant également de prendre en compte la présence du microbiote intestinal et les effets que les métabolites peuvent avoir sur ce dernier. Ce projet contribuera à enrichir les connaissances concernant les métabolites retrouvés au sein du LM en vue d’améliorer la composition des PPN et de se rapprocher des propriétés fonctionnelles du LM. Il permettra également de valider que l'incorporation des métabolites par fermentation bactérienne d’une matrice laitière est un procédé pertinent.
Procédures
Les porcelets seront isolés en cage individuelle durant toute la durée du protocole expérimental, de l'âge de 2 jours à l'âge de 21 jours. Chaque cage individuelle est équipée d'un distributeur automatique de lait par lequel chaque porcelet recevra l'un des trois traitements alimentaires du projet de façon contrôlée et adaptée. Les traitements alimentaires fournis sont les suivant : une PPN témoin sans métabolites et deux PPN enrichies en métabolites, l'une par ajout d'une fraction fermentée de matrice laitière et l'autre par ajout direct des métabolites via des produits achetés dans le commerce. Aucun prélèvement biologique, ni intervention chirugicale ne sera réalisé sur les animaux vivants durant la période d’expérimentation. Les paramètres mesurés concerneront la consommation alimentaire et la croissance des porcelets. Tous les animaux concernés par la procédure (n = 30) seront euthanasiés à la fin de l’expérience pour réaliser des prélèvements post-mortem de tissus et contenus digestifs et de zones cérébrales.
Impact sur les animaux
Les métabolites testés sont naturellement présents dans le LM, les concentrations testées sont proches des concentrations retrouvées dans celui-ci et ne présentent pas de danger pour les porcelets. De plus, ces métabolites ont été testés in vitro à différentes concentrations pour identifier leurs propriétés bénéfiques sur l'épithélium intestinal et le système nerveux central. Enfin, la plupart de ces métabolites ont été étudiés sur différents modèles cellulaires et animaux sans effets toxiques notables dans le cadre de problématiques de recherches différentes. Cependant, l'utilisation de PPN "porcinisées" peut entrainer un effet indésirable sur l’appétit des animaux et possiblement provoquer une perte de poids. Néanmoins, la PPN qui sera distribuée aux animaux dans ce projet est identique à la PPN porcinisée utilisée dans un précédent projet qui s'est déroulé de septembre à novembre 2022 et qui n’a engendré aucun problème d’alimentation, ni de trouble digestif chez les porcelets. La séparation brutale de la mère et l’isolement relatif en cage individuelle pendant une période de 19 jours pourraient constituer une source de stress pour les porcelets. Cependant, les porcelets ne subissent pas de stress répétés (une séparation unique et définitive de la mère), ils seront hébergés dans une salle contenant 5 cages permettant des contacts olfactifs et sonores avec leurs congénères et leur environnement sera enrichi avec des jouets, sources d’interaction avec le milieu environnant.
Devenir
Tous les animaux sont concernés par la procédure décrite (n = 30) et ils seront tous euthanasiés à la fin de l’expérience. L'euthanasie des animaux est nécessaire pour récupérer les tissus et contenus intestinaux ainsi que les tissus cérébraux qui seront analysés par des approches de biologie moléculaire, d'histologie et ex vivo, afin de répondre à notre question scientifique.
Remplacement
Le projet s’intéressant à l’impact de l’alimentation sur les fonctions physiologiques et développementales du nourrisson, l’utilisation d’un modèle animal vivant reste indispensable pour une évaluation globale et intégrée de l’effet des métabolites étudiés et de prendre en compte le rôle du microbiote intestinal, qui sont impossible à reproduire dans leurs complexité dans des modèles in vitro. Le porcelet a été choisi pour sa proximité physiologique avec le nourrisson.
Réduction
L’étape in vitro permet de réduire le nombre de métabolites d’intérêt à fournir aux porcelets, métabolites retrouvés au sein du LM et ne présentant pas d’effets négatifs dans les tests effectués (pas de cytotoxicité, pas de perte d’intégrité de l’épithélium, pas d’activité pro-inflammatoire aigüe). Ils seront additionnés à une PPN reconstituée et distribuée sous forme d’alimentation liquide aux porcelets. L’impact des PPN enrichies en métabolites par apport direct ou par fermentation d'une fraction de PPN ou d'une autre matrice laitière à des concentrations proches de celles du LM sera ainsi étudié. Une PPN ne contenant pas de métabolites sera considérée comme la PPN de référence. Un effectif de 10 porcelets par types de PPN soit 30 porcelets au total a été calculé par un test de puissance sur des paramètres étudiés dans d'autres contextes sur ce même modèle, en lien avec des réponses physiologiques. Les données seront analysées statistiquement par des tests ad hoc (analyse de variance multifactorielle) prenant en compte les facteurs traitement alimentaire, sexe, portée et répétition.
Raffinement
Les métabolites testés sont naturellement présents dans le LM, les concentrations testées sont proches des concentrations retrouvées dans celui-ci et ne présentent pas de danger pour les porcelets. Cependant, l'utilisation de PPN "porcinisée" peut entrainer un effet indésirable sur l’appétit des animaux et possiblement provoquer une perte de poids. Néanmoins, la PPN qui sera distribuée aux animaux dans ce projet est identique à la PPN porcinisée utilisée dans un précédent projet qui s'est déroulé de septembre à novembre 2022 et qui n’a engendré aucun problème d’alimentation, ni de trouble digestif chez le porcelet Yucatan. Néanmoins, le poids des animaux sera surveillé pour s'assurer qu'ils n'accusent aucune perte de poids. Les porcelets seront inclus dans le protocole à 2 jours d’âge. La séparation brutale de la mère et l’isolement relatif en cage individuelle pendant une période de 19 jours pourraient constituer une source de stress pour les porcelets. Cependant, les porcelets ne subissent pas de stress répétés (une séparation unique et définitive de la mère), ils seront hébergés dans une salle contenant 5 cages permettant des contacts olfactifs et sonores avec leurs congénères, leur environnement sera enrichi avec des jouets, sources d’interaction avec le milieu environnant, et leur alimentation répond à leurs besoins nutritionnels. L’ensemble de ces éléments, associé à des interactions régulières avec les animaliers, induit un comportement des porcelets qui ne traduit aucun état de stress au-delà des 12 premières heures post-séparation maternelle. De plus, au cours des 12 premières heures qui suivent leur séparation de la mère, les animaliers sont en permanence présents dans les salles.
Choix des espèces
Le mini-porc Yucatan est un modèle animal proche de l’Homme, plus que ne peuvent l'être les rongeurs sur de nombreux aspects tels que la taille, l'anatomie du cerveau avec la présence de circonvolutions cérébrales notamment, l’anatomie de tube digestif, la physiologie digestive, le système immunitaire et le microbiote. S’intéressant à l’alimentation infantile, il est à noter que la dynamique de croissance et de développement des organes digestifs et du cerveau chez le porc nouveau-né est très proche de celle décrite chez le nouveau-né humain. De plus, il s’agit d’un animal omnivore monogastrique, ce qui en fait un modèle très utilisé pour les recherches en nutrition humaine. Enfin, sa taille et sa maturité à la naissance sont compatibles avec un allaitement avec des PPN dès les premiers jours de vie. S’intéressant à l’alimentation infantile, les porcelets inclus dans le protocole seront des nouveau-nés de 2 jours d’âge. Ils seront suivis pendant les trois premières semaines de vie avec une alimentation lactée.
Implications de la protéine ALCAM dans les accidents vasculaires cérébraux ischémiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système nerveux
190 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées de souffrance sévère. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par injection de thrombine dans l'artère cérébrale moyenne, suivi d'une IRM, de prélèvements de sang, de l'injection d'un anticorps et de tests comportementaux de récupération dont le détail n'est pas précisé, avant la mise à mort pour analyses au microscope. Le porteur reconnaît des douleurs après la chirurgie et un affaiblissement de la patte avant gauche correspondant à la zone du cerveau lésée. Il situe une éventuelle nouvelle stratégie thérapeutique au conditionnel et affirme que les méthodes de remplacement n'apporteraient pas le même niveau d'information.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une pathologie neurologique d’origine vasculaire. Il s’agit d’un déficit aigu soudain qui survient à la suite de l’occlusion ou de la rupture d’un vaisseau cérébral. Nous allons baser notre étude sur ALCAM (Activated Leukocytes Cell Adhesion Molecule). En effet, en contact avec des molécules inflammatoires, les monocytes et lymphocytes circulants dans le sang expriment ALCAM à leur surface, facilitant ainsi leur infiltration à travers la paroi des vaisseaux sanguins. De plus, la concentration d’ALCAM dans le sang des patients est positivement corrélée à la gravité d’un AVC. Les objectifs de ce projet sont les suivants : 1) développer l’IRM ciblant la molécule ALCAM et tester sa sensibilité dans la détection de l’inflammation dans un modèle murin d’AVC; 2) caractériser le rôle d’ALCAM dans la pathologie de l’AVC et 3) évaluer l’efficacité du blocage d’ALCAM dans la récupération des animaux soumis à un modèle d’AVC.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension de l'implication de la protéine ALCAM dans les AVC et pourrait conduire à l'élaboration d'une nouvelle stratégie thérapeutique plus efficace dans la prise en charge des patients touchés par un AVC.
Procédures
-Phase 1: Développement de l’IRM moléculaire ciblant ALCAM. Un modèle d'ischémie cérébrale par injection de thrombine dans l'artère cérébrale moyenne et l'IRM de l'inflammation seront réalisés. -Phase 2: Étude de l’implication de ALCAM dans la physiopathologie des AVC. Un modèle d'ischémie cérébrale par injection de thrombine dans l'artère cérébrale moyenne ainsi qu'un prélèvement sanguin seront réalisés. -Phase 3: Test de l’efficacité d’un anticorps bloquant l’interaction d’ALCAM avec ses ligands dans un modèle d’AVC chez la souris. Un modèle d'ischémie thromboembolique cérébrale par injection de thrombine dans l'artère cérébrale moyenne sera utilisé. Une injection intraveineuse d'anticorps anti ALCAM, d'isotype control ou de médicament thrombolytique sera réalisée, suivie par la réalisation de tests comportementaux de mesure de la récuperation fonctionelle.
Impact sur les animaux
Certains animaux peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures après la chirurgie. Un affaiblissement transitoire de la patte avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée par l'AVC) peut être observé, mais ce dernier disparaît généralement dans la première semaine après l'AVC. De plus, l'injection intraveineuse d'anticorps bloquant ou de radiotraceur IRM nécessite la pose d'un cathéter sur la veine caudale, pouvant occasionner une douleur considérée comme modérée.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses de microscopie.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des AVC. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasive (IRM) permettent de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles. Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur basée sur le grimace scale, une couverture analgésique suffisante en période pré et post opératoire, un accès facilité à la nourriture seront mis en place. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences vasculaires. L’anatomie et la physiologie de la vascularisation cérébrale de la souris sont bien connus et sont semblables à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’homme et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier le rôle d'ALCAM dans les AVC. Les souris Swiss utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de l'AVC.