Système immunitaire

1500 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une greffe de lymphome humain par injection ou après une petite chirurgie, incision de la peau et du péritoine près de la rate ou du rein, puis des prélèvements de sang à la joue toutes les deux semaines, pour constituer une collection de tumeurs greffées appelées PDX servant à tester des molécules antitumorales. Le porteur situe les bénéfices pour les patients à long terme, l'objectif immédiat étant de reproduire chez la souris des lymphomes humains qu'il qualifie de "modèle formidable". Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de maintenir un lymphome humain en culture et juge "indispensable" de générer ces modèles.

Objectifs

Ce projet vise à améliorer les connaissances et la prise en charge des lymphomes chez l’homme. Les lymphomes sont des cancers du système lymphatique. Ils sont responsables du développement de tumeurs au niveau des organes lymphatiques (ganglions, rate, …). Ces lymphomes ont une grande diversité et une classification complexe. Ils proviennent de cellules transformées du système immunitaire, comme les lymphocytes B ou T. Le but de ce projet est de développer des modèles pré-cliniques chez la souris de lymphomes humains, afin de tester de nouvelles molécules antitumorales. Le développement de modèles animaux est indispensable, seules des études in vivo permettent de valider l’effet antitumorale d’une molécule car les effets que peuvent avoir le microenvironnement et l’architecture même de la tumeur d’origine du patient sont pris en compte. Les modèles pré-cliniques développés ici sont des xénogreffes chez la souris de lymphomes provenant de patients. Ces xénogreffes dont l'anglicisme très utilisé est PDX (Patient-derived xenograft) sont la transplantation d'un greffon de lymphome de patient dans une espèce biologique différente ici la souris. Elle s'oppose ainsi à l'allogreffe où le greffon du donneur vient de la même espèce que le receveur. Les greffes sont réalisées dans des souris très immunodéficientes, particulièrement propices à la survie et à multiplication des cellules tumorales des patients, évitant ainsi le rejet de greffe. Un panel représentatif de PDX pour chaque type de lymphome sera développé, afin de tester l’activité antitumorale de molécules à visée thérapeutique. Le nombre de souris impliquées dans le projet est réduit au minimum, grâce à l’étude approfondie des données de la littérature et aux données déjà obtenues lors de projets précédents réalisés in vitro avec des lignées cellulaires, sans toutefois mettre en péril l’obtention d’un panel de PDX représentatifs des lymphomes connus. Les conditions d’hébergement et les soins donnés aux animaux sont faits dans le respect du bien-être animal, ceci afin de limiter au maximum le stress et de garantir le bien-être de chaque animal. Les méthodes utilisées dans les différentes procédures de ce projet ont été étudiées afin réduire au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux. Une définition précise des points limites, associée à une surveillance adaptée des animaux ont été définis afin de limiter toute souffrance animale. Au maximum, 1500 souris seront nécessaires pour ce projet.

Bénéfices attendus

Bénéfices à court terme : ce projet fera progresser la connaissance scientifique dans le domaine du lymphome, car il permettra d’avoir un modèle formidable que sont les PDX, qui permettent de reproduire chez la souris un lymphome possédant toutes les caractéristiques phénotypiques, moléculaires et environnementales de la tumeur du patient. Bénéfices à long terme : grâce à ce projet, de nouvelles cibles thérapeutiques et/ou médicaments pourront être testés afin d’améliorer les traitements actuels, de prévenir la résistance aux médicaments et les rechutes et donc prolonger la vie des patients.

Procédures

Les souris auront pour certaines une greffe par une injection unique d’un fragment d’une biopsie de lymphome humain ou de cellules tumorales humaines, injection réalisée après anesthésie et d’une durée totale de moins de 5 minutes. Certaines autres greffes nécessitent une étape de chirurgie. Les souris recevront donc les médicaments nécessaires pour obtenir une anesthésie et une analgésie préopératoire (médicaments aux propriétés antalgique, antipyrétique et anti-inflammatoire). Il sera fait une toute petite incision de la peau puis du péritoine au niveau de la rate ou du rein afin de réaliser une petite ouverture permettant l’injection des cellules tumorales ou l’introduction d’une biopsie tumorale. Les sutures sont réalisées au niveau du péritoine puis de la peau (durée totale de 10 minutes environ pour l'ensemble de l'intervention). Dans tous les cas, 1 mois post-greffe et ensuite toutes les 2 semaines, il sera réalisé un prélèvement sanguin non invasif (2 gouttes de sang) au niveau de la joue afin de vérifier la présence des cellules tumorales humaines (durée d'une à deux minutes environ pour ce prélèvement).

Impact sur les animaux

Nuisances légères attendues dues au stress de la contention et des piqures réalisées lors des greffes ou des analgésies, durant quelques secondes ou quelques minutes (temps requis pour effectuer les injections). Nuisances modérées attendues dues au stress et à une légère douleur, du fait d'un cumul des piqures, des étapes de petite chirugie et dues au développement du lymphome lui-même.

Devenir

L'ensemble des souris utilisées dans ces différentes procédures seront mises à mort car elles auront été soit remplacées en élevage après 6 mois de vie, soit car elles auront été greffées avec des lymphomes humains. En cas de non prise des greffes, les souris seront quand même mises à mort après 1 an post-greffe car au delà elles développent généralement de façon spontanée des pathologies diverses dues à leur âge avancé.

Remplacement

Il n'existe actuellement pas de modèle in vitro ou ex vivo permettant de maintenir à long terme un lymphome primaire humain en culture. Quelques modèles de PDX de lymphome ont été générés aux USA mais ces modèles restent rares et ne sont pas représentatifs des différentes entitées de lymphome. La demande pour ces modèles pertinents afin de tester l'efficacité de nouvelles thérapies est de plus en plus grande. Il est donc indispensable de générer ces nouveaux modèles précliniques afin d'améliorer la prise en charge clinique des patients atteints de lymphome.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux utilisé dans ce projet : 1/ il a été estimé que la greffe de 3 souris pour chaque voie est suffisante pour permettre l’obtention d’une prise de greffe à T0. De même que la greffe de 2 souris pour les T1 et T2 suffit ; 2/ la génération effective de PDX sera limitée à 10 patients par type de lymphome et donc pour 8 entités différentes ; 3/ quand cela sera possible en fonction du type de lymphome à greffer, la ou les voies utilisées pour réaliser les greffes et générer un PDX seront toujours les voies les moins invasives, avec le moins d'effet indésirables, afin de réduire à son minimum la souffrance ou le stess des animaux ; 4/ les ressources cellulaires post-mortem seront mutualisées au sein de l’équipe de recherche afin qu’un même échantillon puisse être exploité pour différents projets et ainsi éviter l'utilisation itérative de souris.

Raffinement

Élevées dans des conditions d'hygiène strictes, les souris immunodéficientes NSG ne présentent pas de signes de souffrance particuliers (classe légère). Les différentes injections médicamenteuses ainsi que les greffes de lymphome de patients chez ces souris par voie intraveineuse ou par voie sous-cutanée n’induisent pas de souffrance particulière (classe légère). Les souris avec une petite chirurgie pour les greffes par voie S.C.R. et I.S. seront anesthésiées avant l'intervention. L'endormissement sera contrôlé avant l'intervention et surveillé tout au long de la chirurgie. Pendant l'intervention chirurgicale et ensuite, les souris seront laissées sur plaque chauffante pour qu'elles ne se refroidissent pas pendant l’endormissement et surveillées jusqu’aux premiers signes de réveil, puis replacées dans leur cage. Une goutte de gel hydratant sera également appliquée sur chaque œil avant et après l'étape de chirurgie afin d'éviter un dessèchement. Les sutures seront surveillées pendant les deux jours suivant afin de prévenir tout risque d’infection. S'il est constaté une infection cutanée, la plaie sera désinfectée deux fois par jour pendant deux jours jusqu’à disparition des signes d’infection ou l’animal sera mis à mort si l'infection persiste. A ce jour, aucune infection cutanée n'a été observée lors de projets précédents. Ces animaux seront observés trois fois par semaine pendant toute la durée du développement du PDX avec la mise en place d’une grille de score et l’utilisation de points limites adaptés. Si après 1 an post-greffe aucune prise tumorale n’est observée l'expérience de sera pas poursuivi, les animaux seront alors mis à mort afin d'éviter aux animaux des souffrances dues au vieillissement. Les souris qui développeront un lymphome seront mise à mort rapidement selon une grille de score et les points limites définis.

Choix des espèces

Nous avons accès à des modèles de souris très immunodéficientes, présentant des déficits complets en cellules immunitaires de type lymphocytes T, B et NK. Ces souris sont donc un modèle de choix pour greffer des tumeurs humaines telles que des lymphomes chez la souris (xénogreffes) et donc éviter le rejet de greffe des cellules humaines. Les souris immunodéficientes seront utilisées à partir de l'âge de 8 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte de ces animaux. La greffe sur des animaux adultes permet d’avoir un taux idéal de greffe d’après les données de la littérature et d'après nos résultats expériences réalisées précédemment dans le cadre d’un autre projet de recherche.

702 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 90 d'entre elles et modéré pour 612. Elles subissent l'application répétée d'un allergène sur le ventre puis les oreilles, des injections intraveineuses, sous-cutanées et intrapéritonéales et des prélèvements sanguins, avec une mesure quotidienne de l'épaisseur des oreilles, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le porteur décrit une inflammation cutanée et oculaire ainsi que le stress lié aux injections et à l'anesthésie. Les bénéfices se limitent à "mieux comprendre" le rôle d'une protéine dans la mémoire immunitaire de la peau, et le porteur affirme l'étude in vitro "impossible" pour ce phénomène.

Objectifs

Lors d’une réponse immunitaire, les lymphocytes T acquièrent la capacité d'éliminer les cellules endommagées. Une fois le dommage éliminé/réparé, un petit nombre de lymphocytes mémoires se développent, qui vont persister sur le long terme. Les lymphocytes mémoires sont capables de réagir de manière plus rapide et plus efficace en cas de nouvelle agression. Il existe différentes sous-populations de lymphocytes T mémoires. L'une d'entres elles est capable de résider sur le long terme dans le tissu préalablement affecté, il s'agit des Lymphocytes T mémoires résidents des tissus. Ces lymphocytes résidents représentent une des premières barrières de défense immune, dans les tissus comme la peau. Ce projet vise à présent à étudier le rôle d'une protéine spécifique, dans la mise en place d'un compartiment mémoire résident dans la peau, dans un contexte d'allergie cutanée. Pour cela, nous utiliserons un modèle murin d'allergie cutanée qui génère une réponse inflammatoire dans la peau, via les lymphocytes T.

Bénéfices attendus

Les lymphocytes T mémoires qui résident dans la peau représentent la première ligne de défense contre des infections virales et peuvent également participer à des processus inflammatoires (par exemple des allergies). cependant, peu de choses sont connues quant aux facteurs qui assurent leur fonctionnement. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes de réponse inflammatoire par les lymphocytes T

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Injection Intraveineuse (sous brève anesthésie gazeuse) – 1 fois par animal – durée 30 secondes; Application d'allergene sur le ventre - 1 fois par animal - durée 1 mn; Application d'allergene (ou véhicule contrôle) sur les oreilles - 1 fois par animal - durée 2 mn; Injection sous-cutanée - 1 fois par animal - durée 30 secondes; Injection intrapéritonéale pour anesthésie profonde : 1 fois par animal – durée 30 secondes; Prélèvements sanguins - 1 fois par animal – durée 30 secondes; mesure de l'épaisseur des oreilles : 1 fois par jour sur chaque animal, 5 jours sur 7, pendant 15 jours puis 2 fois par semaine pendant 15 jours- durée 30 secondes; anesthesie profonde: 1 fois par annimal - durée 45 minutes; pesée des souris: 1 fois par semaine - durée 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont : i) une légère douleur et le stress générés par les injections intra-péritonéales, intraveineuses et sous cutanée; ii) le stress généré par l’anesthésie et/ou la procédure d’inoculation de l'allergène par voie épicutanée; iii) une légère douleur et le stress généré par les prélèvements de sang; iv) une légère inflammation au niveau de l'oeil suite à l'injection intra-veineuse; v) une légère inflammation au niveau des oreilles ou du ventre, après application de l'allergène.

Devenir

Des prélèvements d'organes seront réalisés sur les animaux mis à mort, afin d'effectuer des analyses cellulaires et microscopiques sur les lymphocytes T.

Remplacement

Les réactions hypersensibilité retardée au niveau de la peau est basée sur la capacité des cellules immunes à circuler dans l'organisme : ainsi, l'application d'un allergène sur la peau du ventre va sensibiliser les animaux, qui vont générer ensuite une réponse inflammatoire lorsque ce même allergène est appliqué à un autre endroit de la peau (ici les oreilles). De plus, la réponse inflammatoire est basée sur le recrutement de lymphocytes T circulants, qui acquièrent la capacité de pénétrer dans le tissu inflammé. Ainsi, la réponse immunitaire est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires et une organisation spatiale qui rend impossible son étude dans des tests in vitro. L’utilisation de modèles murins est donc nécessaire pour comprendre la complexité des mécanismes qui prennent place lors de la réponse immunitaires face a une réponse allergique

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris au maximum: nous utiliserons pas exemple qu’un seul groupe control pour toutes nos approches expérimentales afin de réduire par 2 le nombre de ces animaux. Nous avons aussi calculé par des approches statistiques le nombre minimum d’animaux nécessaire pour pouvoir interpréter les variations expérimentales que nous attendons et nous assurer que nos travaux seront interprétables et ne devrons pas être répétés inutilement sur des animaux complémentaires

Raffinement

Afin de réduire la souffrance, le stress et la douleur de l’animal, l'ensemble des gestes techniques seront réalisés sous anesthésie profonde ou gazeuse. Concernant les anesthésiers profondes, les animaux seront placés sur un tapis chauffant pendant toute la durée de la procédure, pour limiter les risques d'hypothermie, et du gel oculaire sera appliqué sur les yeux, afin de limiter les risques de secheresse oculaire. De plus, nous maintiendrons les animaux en groupes sociaux au sein de chaque cagée (en moyenne 5 animaux par cagée). Enfin, nous assurerons une surveillance adaptée à chacune des procédures ou étape au sein d'une procédure, et des points limites définis pour chaque procédure ont été établis afin d'anticiper toutes souffrances et tout mal être des animaux. De plus, les animaux identifiés avec des signes de douleur seront immédiatement mis à mort pour eviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Le modèle souris a été choisi car il permet de réaliser des expériences dans des animaux génétiquement modifiés et d'étudier les conséquences d'un gène invalidé, sur la génération et la maintenance d'un compartiment mémoire dans le tissu cutané. Ce type d'expériences est nécessaire pour comprendre la mise en place d'une compartiment résident des tissus, au cours des réponses immunes. Les souris utilisées seront des adultes de 6 à 12 semaines: le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant au moment de l’infection et certains animaux seront gardés jusque 6 mois après infection.

3 780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 24 d'entre elles et modéré pour 3 756. Elles reçoivent des administrations intra-trachéales ou intra-vaginales, puis sont infectées par le virus de la grippe ou de l'herpès, avec des lavages vaginaux répétés et une injection rétro-orbitale, pour tester une cytokine comme adjuvant de vaccination muqueuse. Le porteur indique que la grippe provoque une perte de poids importante et que l'herpès peut entraîner des lésions génitales et, dans les cas les plus graves, une paralysie des membres postérieurs. Les retombées annoncées, des essais cliniques humains et des applications vétérinaires, restent conditionnelles, tandis que le porteur affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" à l'animal vivant.

Objectifs

La plupart des agents infectieux (bactéries et virus) pénètrent dans l’individu qu’ils infectent en traversant les muqueuses, barrières naturelles entre le milieu extérieur et l’organisme. Les principales portes d’entrée sont l’appareil respiratoire (muqueuse nasale, bronches et poumons), l’appareil digestif (muqueuse buccale, estomac, intestins), et de l’appareil génital (muqueuse vaginale et du pénis). Induire une immunité muqueuse par vaccination reste un objectif important non encore atteint car les vaccins actuels, administrés par injection dans les muscles ou la peau, ne ciblent pas spécifiquement ces sites d’infection. Or, une immunité robuste aux niveaux des muqueuses devrait permettre de protéger l’organisme de l’infection par les pathogènes dont l’invasion passe par ces muqueuses en induisant la formation d’une barrière immunologique locale capable de bloquer les agents infectieux avant leur entrée dans l’organisme. Néanmoins, les nombreuses tentatives d’induction d’une telle immunité restent, à ce jour, peu satisfaisantes. Il a été montré que l’application d’un médiateur protéique de l’immunité à la surface des muqueuses respiratoires et génitales permet d’attirer rapidement les cellules immunitaires dans ces tissus, préalable indispensable à la mise en place d’une réponse immunitaire locale. Le but de notre projet est donc d’établir la preuve de concept que l'administration de cette molécule à la surface des muqueuses prépare cette muqueuse à répondre plus efficacement à une stimulation antigénique (effet adjuvant), ce qui permettrait la mise en place de réponses immunitaires locales efficaces pour éviter l’infection par ses voies. Cette preuve de concept sera réalisée dans 2 modèles d’infection expérimentale chez la souris : l’infection de l’appareil respiratoire par le virus de la grippe et l’infection vaginale par le virus de l’herpès. En parallèle, nous explorerons les mécanismes immunitaires induits dans les muqueuses suite à cette administration locale et responsables de l’augmentation de la réponse immunitaire locale. Nous évaluerons le recrutement de cellules immunitaires et leur organisation dans les tissus muqueux, ainsi que le développement de la réponse anticorps spécifique dans les muqueuses pulmonaire et vaginale. Cette partie de l’étude permettra d’approfondir nos connaissances sur le développement de l’immunité des muqueuses, encore mal comprise aujourd’hui.

Bénéfices attendus

Par ces études, nous espérons mettre au point des protocoles de vaccination par voie muqueuse qui devraient permettre non seulement de protéger les animaux contre l’effet pathogène d’une infection mais aussi, en stimulant le développement d’une immunité locale spécifique, de protéger les animaux contre l’infection elle-même, ce qui aurait pour conséquence de stopper la transmission à de nouveaux hôtes. Si notre hypothèse est confirmée, cela permettra de proposer l’utilisation de la molécule que nous utilisons comme adjuvant de vaccination muqueuse contre un éventail plus large de pathogènes colonisant l’hôte par voie muqueuse, mais aussi de proposer des essais cliniques chez l’homme, la molécule étant agréée par les agences de santé (AFSAPS et FDA) pour son utilisation dans des protocoles cliniques. La méthode d’immunisation pourrait également être développée dans le domaine vétérinaire, la vaccination des animaux d’élevage étant un facteur important dans la maitrise des épizooties. En outre, quel que soit le succès en termes d’induction d’une immunité muqueuse protectrice, ce projet permettra d’accroitre nos connaissances du système immunitaire muqueux.

Procédures

Dans le protocole, seules les injections sous cutanées et les injections intra-péritonéales seront réalisées sur animaux vigiles. Ces procédures durent moins de 30 secondes. Tous les autres gestes techniques décrits ci-dessous seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse. Pour les expériences de vaccination, les souris seront soumises à 1 à 4 administrations intra-trachéales ou intra-vaginales d’adjuvant et/ou d’immunogènes. Ces administrations seront effectuées soit ensemble, soit à 2 jours d’intervalle. Une administration intratrachéale dure entre 30 secondes et 1 minute. Lorsque les expériences visent à évaluer la protection des animaux vaccinés contre une épreuve virale, les souris seront infectées par voie intra-nasale par des virus de la grippe 1 fois. L’infection par voie intranasale dure environ 1 minute. Les souris immunisées par voie vaginale seront infectées par le virus de l’herpès 1 fois par voie intra-vaginale. L’infection par voie intravaginale dure environ 30 secondes. Dans les procédures qui incluent des administrations vaginales, les souris subiront des lavages de la cavité vaginale avant les infections et entre 1 et 8 fois par animal dans un laps de temps maximum de 49 jours. Cet acte dure environ 1 minute. Dans les procédures de mise au point des immunisations, les souris recevront 1 injection intra-veineuse rétro-orbitale (30 secondes) puis seront maintenues sous anesthésie gazeuse pendant 5 minutes. Pour l’étude des migrations cellulaires induites par les immunisations, les souris recevront 1 injection intra-péritonéale. Cet acte dure moins de 30 secondes.

Impact sur les animaux

La molécule que nous proposons comme adjuvant de vaccination est utilisée en clinique, depuis plusieurs années, dans différents essais thérapeutiques visant à reconstituer les populations lymphocytaires chez les patients. Lors des essais cliniques chez les patients ou d’expérience précédentes chez la souris l’administration de cette molécule n’a pas entrainé d’effet adverse majeur. De même, l’administration de l’antigène que nous utilisons par voie intra-trachéale n’engendre pas d’effet adverse notable. Il est fort probable qu’il en sera de même en administration vaginale. Cependant, il peut arriver que suite aux administrations intra-trachéales, une souris présente des signes de souffrance ou de détresse respiratoire. La vaccination intravaginale est atraumatique et ne présente en tant que tel aucun risque. L’infection par le virus de la grippe est pathogène chez la souris. Aux doses utilisées dans notre protocole, une majorité des souris infectées sans vaccination préalables développe une pathologie principalement marquée par un état grippal et une perte de poids importante. Cependant, même après une perte de poids importante en phase aiguë de l’infection par le virus de la grippe, les souris éliminent généralement l’infection en 10-12 jours et retrouvent leur état initial vers le jour 14. Dans le cas de l’infection par le virus de l’herpès, des signes similaires peuvent être observés. De plus, si l’infection se développe, des lésions vésiculaires peuvent apparaitre au niveau de l’appareil génital. Ces manifestations sont réversibles en quelques jours. Dans les cas les plus graves, on observe des signes de paralysie des membres postérieurs.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les souris seront mises à mort pour nous permettre une étude approfondie des organes cibles de l’immunisation et/ou de l’infection, ainsi que des réponses immunitaires.

Remplacement

Nos expériences concernent la mise en place d’une réponse immunitaire muqueuse suite à une vaccination. Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation d’animaux vivants pour ce type de protocole. En effet, le développement d’une réponse immunitaire muqueuse est un processus complexe qui implique à la fois le tissu muqueux lui-même et le système immunitaire dans son ensemble, combinaison qu’il n’est pas possible de reproduire in vitro. Au préalable des expériences, nous avons réalisé des dosages in vitro du stock viral infectieux de virus de l’herpès que nous allons utiliser in vivo. Ce dosage en quantité de virus et titre infectieux nous permet de réduire le nombre de doses à utiliser pour établir la meilleure dose infectieuse à administrer aux souris, donc de limiter le nombre de souris. Le virus de la grippe que nous utilisons a déjà été titré in vitro et in vivo et est utilisé en routine, in vivo chez la souris. La dose infectieuse étant déjà établie, nous n’avons pas besoin de la doser ici. Le neuropeptide dont nous testons l’effet inhibiteur sur l’infection vaginale ainsi que ses 2 analogues chimiques ont ont été testés in vivo et dans les modèles cellulaires en culture, sans montrer de toxicité particulière.

Réduction

D’après nos études précédentes, l’impact de l’administration de la protéine que nous utilisons comme adjuvant de vaccination muqueuse sur les muqueuses est suffisamment important pour que des groupes de 12 souris soient suffisants pour observer des différences significatives au seuil de 5% dans les expériences de mesure de réponse immune après immunisation par l’antigène modèle. De même, notre étude préliminaire montre que la protection contre la pathologie induite par l’infection par le virus de la grippe devrait être statistiquement significative avec des groupes de 12 souris. Compte tenu des données de la littérature, nous estimons que des groupes de 12 souris devraient également permettre de conclure sur l’efficacité vaccinale dans le modèle d’infection par le virus de l’herpès génital. Cependant, si des différences significatives sont obtenues avec les premières expériences réalisées sur des groupes de 6 souris, nous réduirons les groupes expérimentaux à 6 individus.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abri en papier maché ainsi que de coton et d’une nacelle pour faire leur nid. Pour limiter le stress induit par la manipulation des animaux, toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale, à l’exception des injections sous cutanées et intra-péritonéales. Pour chaque procédure expérimentale, une grille de score adaptée a été mise en place de manière à évaluer l’apparition éventuelle de toute souffrance ou détresse et pouvoir y remédier. Des points limites ont été fixés pour chaque procédure.

Choix des espèces

Le modèle souris, largement utilisé en laboratoire, est utilisé pour sa praticité et la bonne connaissance de son système immunitaire. Ces animaux sont susceptibles à l’infection par le virus de la grippe et le virus de l’herpès et développent une pathologie suite à l’infection par ces virus et peuvent être immunisés contre eux par vaccination. La souris présente également un système immunitaire muqueux proche de celui de l’Homme, les données obtenues grâce à nos expériences pourront alors ouvrir la voie à de nouvelles recherches chez l’Homme. De plus, dans le modèle souris, des lignées dont certains gènes ont été invalidés sont particulièrement intéressantes et seront utilisées pour notre étude. Animaux adultes âgés de 7-8 semaines, âge à partir duquel le système immunitaire est considéré comme mature chez la souris et les souris suffisamment jeunes pour avoir des réponses immunes de bonne qualité.