Système immunitaire

Une ligature est posée chaque semaine autour des molaires supérieures de 90 souris, avec deux injections dans la gencive par semaine pendant quatre semaines, pour leur provoquer une parodontite. Elles reçoivent en parallèle, cinq jours par semaine, une injection d'un agent qui épaissit leur peau et peut fibroser leurs poumons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs organes, l'objet étant de vérifier si une maladie des gencives favorise la sclérodermie systémique, une maladie auto-immune rare dont la cause reste inconnue. Le porteur affirme que ces gestes ne sont pas douloureux et ne justifient donc aucun antalgique, et retient la souris parce que les outils d'analyse immunitaire et parodontale y sont, écrit-il, très développés.

Objectifs

La sclérodermie systémique est une maladie autoimmune rare qui touche près de 10 000 personnes en France, principalement les femmes. La cause n’est pour le moment pas connue. Les patients atteints de sclérodermie systémique présentent fréquemment une parodontite, qui est une pathologie inflammatoire très répandue dans la population mondiale, puisqu’elle touche plus de 50% de la population âgée de plus de 50 ans. Elle est due à une dysbiose du microbiote parodontal et se caractérise par une inflammation des tissus de soutien des dents appelé parodonte, qui comprend la gencive, l’os alvéolaire et le ligament alvéolodentaire. La parodontite aboutit au déchaussement, voire à la perte des dents. Notre hypothèse est que la parodontite pourrait constituer un facteur de risque et avoir un impact sur le développement de la sclérodermie systémique. L’objectif de ce projet est de développer un modèle de souris permettant d'étudier l'impact de la parodontite dans le développement de la sclérodermie systémique.

Bénéfices attendus

La cause de la sclérodermie systémique n’est pour le moment pas connue, mais les facteurs environnementaux, et notamment la dysbiose du microbiote, jouent un rôle dans le déclenchement de la maladie. La mise en évidence de l’implication de la parodontite dans la physiopathologie de cette maladie autoimmune rare permettra ainsi d’améliorer la compréhension de la sclérodermie systémique, ce qui nécessaire pour pouvoir développer de nouveaux traitements dans le futur. Il n’existe en effet pour le moment pas de traitement permettant de guérir cette pathologie, qui a un fort impact sur la qualité de vie et la survie des patients

Procédures

Les animaux recevront une injection d’une molécule induisant une fibrose cutanée permettant de reproduire les caractéristiques de la sclérodermie systémique. Les premières injections seront réalisées sur animal anesthésié, puis, après une phase d’habituation et la mise en place d’un système de récompense, elles seront effectuées sur animal vigile. Ces injections, réalisées cinq jours par semaine, nécessitent moins de deux minutes. Les animaux subiront une pose d’une ligature autour des molaires supérieures (une fois par semaine, durée de 10 minutes) et deux injections gingivales (deux fois par semaine, durée de 5 minutes), toutes réalisées sur animal anesthésié, pendant une période de quatre semaines. Les animaux subiront trois prélèvements de sang, réalisés sur animal anesthésié, d'une durée d’environ 5 minutes chacun.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables liés à l’anesthésie générale sont le refroidissement corporel et une respiration un peu modifiée. Pour limiter ces effets, les souris seront placées sur une plaque chauffante et surveillées en continu jusqu’à leur réveil complet. L’anesthésie gazeuse peut être légèrement désagréable pour les animaux au moment de l’induction (du fait de l’odeur désagréable), mais elle reste moins stressante que de réaliser les gestes alors qu’ils sont éveillés. L’injection de l’agent fibrosant provoquera une fibrose (épaississement de la peau) au niveau du haut du dos, mais cela n’aura pas d’impact sur la mobilité des souris. Une réaction locale peut apparaître juste après l’injection, mais elle est généralement légère et disparaît rapidement. L’agent fibrosant peut également entraîner une fibrose au niveau des poumons, mais les signes cliniques restent en général très faibles. L’induction de la parodontite par la pose de ligatures et des injections gingivales entraînera une inflammation gingivale locale pouvant provoquer un inconfort transitoire. Toutefois, la durée limitée du protocole n’entraînera pas de mobilité ni de perte dentaire, et n’altèrera pas l’alimentation ou l’hydratation des animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux utilisés dans les procédures sera mis à mort à la fin des procédures (prélèvement post mortem de différents organes afin de réaliser les différentes analyses) ou en cas d'atteinte des points limites.

Remplacement

La règle du remplacement n'est pas applicable dans le cas de ce projet. En effet, nous devons avoir recours à un modèle in vivo afin d'étudier l’impact de la parodontite sur l’évolution de la sclérodermie systémique. Nous étudions notamment les réponses immunitaires, qui mettent en jeu la coopération de nombreuses cellulaires dans les organes tels que la rate et les ganglions. Pour ces raisons, nous ne pouvons avoir recours à l'utilisation de modèles in vitro. En ce qui concerne les modèles in vivo, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire ainsi que les mécanismes physiopathologiques parodontaux, car les connaissances et les outils d’analyse chez la souris sont très développés dans les domaines de l'immunité et de la parodontologie.

Réduction

Afin de respecter pleinement le principe des 3R, une réduction du nombre d’animaux utilisés a été mise en œuvre. Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été déterminé à partir de protocoles déjà bien établis dans la littérature et sur la base de calculs de puissance statistique. Ce travail a permis de définir, pour chaque question scientifique, le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats robustes.

Raffinement

Nous porterons une attention particulière au bien-être animal notamment via le raffinement des conditions d’hébergement. Les souris seront maintenues en groupes sociaux dans des cages expérimentales équipées d’un couvercle filtrant avec enrichissement (tubes en polycarbonate rouge translucides, nids, frisures de carton...) sur des portoirs ventilés deux semaines avant le début des procédures, afin de réduire au maximum le stress animal. Une habituation à la manipulation sera réalisée de façon quotidienne après la première semaine d’acclimatation, jusqu’au début de la procédure. La plupart des gestes sera réalisée sous anesthésie générale. Des soins péri- et post-opératoires seront également réalisés. Les souris anesthésiées seront placées sur une plaque chauffante afin de maintenir leur température corporelle jusqu’à leur réveil de l'anesthésie. Une application de gel ophtalmique sera réalisée à intervalles réguliers jusqu’au réveil pour lubrifier la surface des yeux et de prévenir la déshydration. La pose des ligatures au niveau des molaires doit être réalisée sous anesthésie générale car elle nécessite le maintien d’une ouverture buccale de la souris pendant quelques minutes. Les gestes réalisés ne sont pas des gestes douloureux et ne nécessitent pas la mise en place d'un traitement antalgique. Les animaux seront pesés et évalués cliniquement à l'aide d'une grille de scores définissant des points limites, afin de les soustraire à la souffrance.

Choix des espèces

La souris est un modèle couramment utilisé en immunologie, en particulier dans le domaine de l'auto-immunité, le système immunitaire des souris étant proche du système immunitaire humain. Nous disposons de nombreuses techniques d'analyse du système immunitaire chez la souris et de l'expérience requise pour le suivi des réponses immunitaires chez la souris, ce qui nous permet de limiter le nombre d'animaux utilisés. Nous utiliserons des souris âgées entre 8 et 12 semaines, qui sont des souris avec système immunitaire complètement mature et chez qui la croissance osseuse du maxillaire et la physiologie du parodonte sont établies.

Toutes tuées pour prélever leur foie et d'autres organes, 1 749 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une opération au cours de laquelle des cellules tumorales lui sont injectées dans la rate, dont la moitié est parfois retirée, la peau du flanc étant refermée par des agrafes gardées sept à dix jours. Suivent jusqu'à vingt et un traitements intraveineux, quinze séances d'imagerie sous anesthésie précédées chacune d'une injection de luciférine, et neuf prises de sang à la queue sur animal maintenu éveillé. Le porteur renvoie l'amélioration de la prise en charge des malades du cancer colorectal au long terme, et annonce comme retombée immédiate des "données de haute qualité" sur l'ingénierie cellulaire in vivo.

Objectifs

Lorsque les cancers métastasent, ils deviennent beaucoup plus difficiles à traiter et la mortalité augmente. Le foie est un site fréquent de métastases et 30 à 50 % des patients atteints d'un carcinome colorectal présenteront des métastases hépatiques. Le cancer colorectal est la deuxième cause de décès par cancer dans le monde, et son incidence est en augmentation. Lorsque le cancer colorectal se propage au foie, la résection des lésions est une bonne option thérapeutique, mais seuls 10 à 20 % des patients sont éligibles. Pour ceux qui ne sont pas éligibles à la chirurgie, le taux de survie à 5 ans est inférieur à 10 %, ce qui indique que les options thérapeutiques actuelles ne sont pas suffisamment efficaces. Par conséquent, les métastases hépatiques du cancer du côlon restent un enjeu médical majeur non satisfait qui nécessite des recherches supplémentaires. Grâce aux récentes avancées dans le domaine de la technologie de l'ARN messager (ARNm), de nouvelles options thérapeutiques voient le jour. L'administration d'ARNm à des cellules spécifiques permet de modifier les cellules immunitaires ou même les cellules tumorales à l'intérieur de l'organisme, ce que l'on appelle également l'ingénierie cellulaire in vivo. Nous souhaitons ici explorer différentes possibilités d'ingénierie cellulaire in vivo afin d'améliorer l'activité antitumorale des cellules effectrices immunitaires, telles que les cellules NK et les cellules T. À des fins d'ingénierie in vivo, nous utiliserons des nanoparticules lipidiques (LNP), dans lesquelles l'ARNm peut être encapsulé et délivré spécifiquement aux cellules tumorales ou immunitaires, respectivement. En résumé, notre objectif est de développer des approches pour traiter le cancer du côlon métastatique, une maladie difficile à traiter et dont le pronostic est mauvais, en utilisant l'ingénierie cellulaire in vivo avec des LNP ciblées à ARNm.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait apporter de nouvelles perspectives dans le domaine des traitements innovants contre les métastases hépatiques du cancer du côlon, qui font cruellement défaut. L'ingénierie cellulaire in vivo offre des possibilités que les traitements conventionnels ne permettent pas, comme la modification spécifique des cellules tumorales afin d'altérer leur immunogénicité. Nos recherches pourraient donc améliorer à long terme la prise en charge des patients atteints de cancer, mais elles aideront également la communauté scientifique en fournissant des données de haute qualité sur l'ingénierie cellulaire in vivo à court terme.

Procédures

Tous les animaux subiront une intervention chirurgicale au cours de laquelle des cellules tumorales seront injectées dans la demi-rate (cellules tumorales MC38) ou dans la rate (cellules tumorales AKTPF). Dans le cas de la procédure sur la demi-rate, la moitié de la rate sera retirée, tandis que l'autre moitié restera en place pour continuer à remplir sa fonction. Afin de mesurer la charge tumorale, les souris seront imagées par bioluminescence, ce qui comprend une injection péritonéale de luciférine sur animaux vigiles et une anesthésie gazeuse pour immobiliser les souris pendant l'imagerie (2x/ semaine). Pour les groupes témoins, le jour prévu pour l'euthanasie est le jour 28, ce qui correspond à 7 imageries. Pour les souris ayant reçu une injection de ARNm-LNP, le jour maximum pour l'euthanasie est le jour 56, ce qui correspond à un nombre maximum de 15 imageries. Le traitement par ARNm-LNP ou les traitements témoins seront administrés par injection intraveineuse (3x/ semaine). Le nombre prévu est 10 injections intraveineuses pour les groupes témoins (PBS, ARNm-LNP constructions contrôles) et un nombre maximal de 21 traitements ARNm-LNP pour les groupes traités par ARNm-LNP. Les animaux vigiles subiront un prélèvement sanguin dans la veine caudale (100 µl 1 fois par semaine) en contention. 5 prélèvements sanguins pour les groupes témoins et un nombre maximum de 9 pour les groupes traités ARNm-LNP seront ainsi réalisés.

Impact sur les animaux

L'injection de cellules tumorales sera effectuée dans l'hémi-rate (MC38) ou la rate (AKTPF). Cette injection est réalisée au cours d'une intervention chirurgicale, ce qui constitue une contrainte importante, mais de courte durée. L'intervention chirurgicale peut être douloureuse pour les animaux ; elle est donc réalisée sous anesthésie gazeuse et les souris recevront des analgésiques avant, pendant et après l'intervention. Le développement de métastases hépatiques est une contrainte qui peut entraîner des douleurs ou une perte de poids. Après l'intervention chirurgicale, la peau du flanc droit est refermée à l'aide d'agrafes, ce qui peut causer une gêne aux animaux. Les agrafes seront retirées une fois l'incision cicatrisée (entre le 7e et le 10e jour après l'intervention). Les ARNm-LNP ou les traitements témoins seront injectés par voie intraveineuse (3 fois par semaine) sur animaux vigiles en contention, ce qui peut engendrer un stress et une douleur modérée de courte durée. Afin de mesurer la charge tumorale des cellules tumorales exprimant la luciférase (2 fois par semaine), les souris recevront une injection intrapéritonéale de luciférine. Ensuite, les souris seront anesthésiées à l'isoflurane et imagées par bioluminescence. Cette procédure peut entraîner une douleur et un stress modérés de courte durée. Pour le prélèvement sanguin dans la veine caudale (1 fois par semaine) réalisé sur animaux vigiles en contention, les animaux pourront ressentir un stress et une douleur modérée de courte durée. Pour induire l'expression transgénique de lignées cellulaires tumorales transduites in vitro (système d’expression inductible activable par ajout d’un antibiotique), les souris recevront l’antibiotique dans leur eau de boisson, ce qui peut générer un goût amer.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure ou lorsque les critères terminaux seront atteints. L'euthanasie est nécessaire pour prélever le foie et autres organes des animaux.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, nous souhaitons modéliser les métastases hépatiques, mais également le ciblage de cellules spécifiques par les LNP. Le microenvironnement tumoral des métastases hépatiques est complexe et se compose d'une variété de cellules parenchymateuses ainsi que de cellules immunitaires résidentes et infiltrantes. Bien que des modèles in vitro avancés tels que les organoïdes puissent modéliser certains aspects des métastases hépatiques, la complexité des cellules impliquées et d'autres facteurs nécessite un modèle animal. En ce qui concerne le ciblage des LNP sur des types de cellules spécifiques, nous réaliserons des expériences in vitro initiales afin d'optimiser autant de facteurs que possible avant de passer aux expériences in vivo, afin d'éviter des expériences in vivo inutiles. Cependant, des expériences in vivo sont nécessaires pour évaluer la toxicité, la biodistribution et la spécificité des types de tissus et de cellules.

Réduction

Nous réalisons des expériences d'optimisation in vitro initiales afin d'identifier les constructions de protéines thérapeutiques et les formulations LNP les plus prometteuses avant de passer aux expériences in vivo. Avant l'évaluation expérimentale des traitements avec les candidats ARNm-LNP, nous réalisons des expériences de recherche de dose. Grâce à cette approche, nous pouvons éviter d'appliquer plusieurs doses dans les expériences d'évaluation expérimentale, ce qui participe à la réduction du nombre de souris utilisées.

Raffinement

Les souris bénéficient d'une période d'adaptation au minimum de 7 jours après leur arrivée dans l'animalerie avant le début des expériences. Les animaux sont hébergés conformément aux normes requises par la réglementation, en groupes sociaux, dans un environnement approprié et enrichi. Les souris seront manipulées à l'aide de la méthode « cup handling » dans la mesure du possible. Les souris sont surveillées régulièrement par le personnel selon la fiche de score. Cela permet de détecter rapidement les signes de douleur ou de souffrance et de mettre en place les traitements appropriés (analgésique pré et post opératoire, traitement analgésique si signe de douleur, nourriture humide si perte de poids importante, administration de sérum physiologique si déshydratation, ponction de l’ascite si trop important). L’antibiotique est administré dans l'eau de boisson plutôt que par injection afin de réduire le stress et la douleur et pour atténuer générant son goût amer, du saccharose sera ajouté à l'eau. Dans les procédures impliquant des tumeurs, les cellules tumorales sont porteuses de luciférase afin de permettre le suivi in vivo de la charge métastatique hépatique par bioluminescence, ce qui permet d'acquérir des points de données sans avoir à euthanasier les animaux.

Choix des espèces

Les souris sont un modèle très couramment utilisé pour étudier l'immunologie en raison de la grande similitude entre les systèmes immunitaires murin et humain. Malgré les différences entre les systèmes immunitaires des deux espèces, les souris ont été d'une aide précieuse pour de nombreuses découvertes qui ont pu être transposées à l'être humain. Les outils que nous utilisons, tels que les cellules murines MC38 et la génération de métastases hépatiques, sont très bien établis et caractérisés. Les souris seront utilisées dans les expériences entre 7 et 16 semaines. À cet âge, leur système immunitaire est pleinement développé.

Les souris utilisées portent une mutation déclenchée par gavage, sur une lignée déjà détenue par l'établissement. 2 496 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un perturbateur endocrinien par voie orale, puis deux injections sous anesthésie leur déclenchent une thyroïdite ou une myasthénie auto-immune, avant cinq prises de sang sur animal éveillé, cinq tests cliniques et une évaluation de la fonction musculaire. Le porteur indique que le gavage répété peut blesser l'œsophage et faire perdre du poids, et que ces modèles entraînent une perte de mobilité, les tissus étant prélevés après la mise à mort pour des analyses biochimiques et histologiques.

Objectifs

Dans les pays développés, les maladies auto-immunes touchent 5 à 10 pour cent de la population et représentent la troisième cause de morbidité. Elles sont dues à une déregulation du système immunitaire, qui ne discrimine plus le soi du non soi. L'exposition (via alimentation, air, eau) à des perturbateurs endocriniens s'accroit. Ce projet a pour but de comprendre le rôle joué par ces molécules dans le développement de pathologies auto-immunes. Ce projet va décrypter, au sein du thymus, les modulations cellulaires et moléculaires induites par ces molécules qui participeraient à altérer la tolérance immunitaire au soi et au développement de pathologies auto-immunes.

Bénéfices attendus

Les maladies auto immunes telle que la myasthénie sont des maladies chroniques invalidantes. Les causes de développement de ces pathologies demeurent inconnues. Dans ce projet, nous souhaitons démontrer qu’un facteur de l’environnement peut induire des perturbations au niveau de la mise en place de la tolérance immunitaire et par conséquence serait à l’origine de dysfonctionnement thymique conduisant au développement d'une pathologie auto-immune. Aussi, la compréhension des mécanismes étiologiques est donc importante pour proposer des mesures de prévention et adapter les traitements des personnes affectées par une pathologie auto-immune.

Procédures

Des animaux seront soumis à une induction de la mutation génique par voie orale (3 fois, 1 minute sur 5 jours). Des animaux seront exposés à l’état vigile au perturbateur endocrinien ou une solution contrôle par voie orale (1 fois, 1 minute). Les animaux seront soumis à une induction de la pathologie par des injections sur animal anesthésié (2 fois par animal sur 21 à 30 jours, 10-15 minutes pour les injections). Des prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile (5 fois pendant le projet, moins d’une minute). Les tests cliniques de suivi des pathologies seront réalisés sur animal vigile (5 fois -15 minutes). L’évaluation de la fonction musculaire se fera sur animal anesthésié (1 fois-15 minutes)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont : Premièrement, pour le gavage, a- une possible douleur au niveau de l’œsophage due à l’insertion répétée de la sonde dans le système digestif. b- Une perte de poids pour les animaux recevant le perturbateur endocrinien. Deuxièmement : Les animaux incluent dans le modèle de pathologie auto-immune pourraient subir a-Un risque d’hypothermie ou de détresse respiratoire suite à l’anesthésie générale pour l’immunisation. b-sensation d’irritation ou la gêne induite par le produit immunisant. c-un risque de douleur et un inconfort post-immunisation. d-Un stress lié à l’analyse comportementale et une perte de mobilité inhérente aux modèles. Troisièmement : une légère et brève douleur lors du prélèvement sanguin et une perte de sang ainsi qu’un stress lors des manipulations nécessitant une contention des animaux.

Devenir

A l’issue de l’expérience, les animaux sont euthanasiés par une euthanasie réglementaire et les tissus d’intérêt seront prélevés pour des analyses biochimiques, histologiques et moléculaires.

Remplacement

Des etudes, au préalable, sur des modèles cellulaires ont été ménées. Nous souhaitons valider nos observations avec des modèles in vivo, afin de démontrer l’impact d’une exposition aux molécules identifiées comme perturbateurs endocriniens sur la physiologie thymique et les conséquences sur la susceptibilité au développement de pathologie auto-immunes.

Réduction

Le nombre total d'animaux dans ce projet est 2496. Pour chaque procédure 1248 animaux seront utilisés pour permettre une analyse statistique des données tout en utilisant le minimum d'animaux. Le nombre de souris par condition expérimentale est déterminé pour permettre une bonne analyse statistique des données tout en utilisant le minimum d'animaux. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Nous analyserons les variances et différences entre les groupes testés.

Raffinement

Les animaux obtenus par le fournisseur agrée observeront une période d’acclimatation/adaptation de 7 jours. Tous les animaux sont hébergés dans des cages de stabulation avec enrichissement (cotons, tunnel en carton, bâton en bois) et un accès à l’alimentation et un abreuvement à volonté. Une litière en aoute pour limiter l’inconfort des animaux au niveau des coussinets plantaires. Lorsqu'il y a apparition de signe clinique de la maladie, de la nourriture humidifiée est mise dans la cage pour éviter aux souris, si elles sont faibles, d'aller chercher la nourriture en hauteur. Les animaux bénéficieront d’une anesthésie et d'une analgésie pré et post immunisation. Les souris sont surveillées quotidiennement par les animaliers. Les souris sont pesées 2 à 3 fois par semaine et regardées attentivement par la personne menant le projet. Les points limites ont été préalablement définis pour limiter la contrainte et permettre une prise de décision rapide en cas de nécessité.

Choix des espèces

Nous avons choisi le modèle murin car il est bien caractérisé pour les maladies auto-immunes. Il permet d’étudier dans un organisme global, les effets de composés sur les différentes populations cellulaires immunes et leur interaction et conséquence sur la physiologie globale de manière fiable. Ces observations sur organisme entier ne sont pas possibles sur des modèles in vitro ou ex vivo. De plus, une lignée murine pour le gène d’intérêt est disponible à l'établissement. Les modèles de thyroïdite et myasthénie auto-immune sont maitrisés par l’équipe et reconnus par la communauté scientifique. Ces modèles sont comparables sur certains points avec la pathologie humaine. Les expériences seront effectuées sur des souris ayant 4 à 7 semaines et 10 à 12 semaines au début de l’expérience ce qui correspond à l’adolescence et au stade adulte, périodes d’apparition des maladies auto-immunes chez l’homme.

Infectées par le virus de la grippe directement dans la mamelle ou par une seconde voie d'administration, 12 brebis en lactation développent une inflammation mammaire et une montée de température. Elles portent un capteur télémétrique implanté par une petite chirurgie et sont traites deux fois par jour pour rester en lactation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées en fin de projet, du fait de l'infection expérimentale. Le porteur justifie six animaux, trois par lot pour deux souches ou deux voies d'inoculation, et prévoit de recommencer l'infection en l'absence de signes, sans expliquer d'où viennent les six autres brebis déclarées.

Objectifs

Contexte et objectif : Jusqu'à récemment, les ruminants n'étaient pas considérés comme des hôtes sensibles aux virus de la grippe aviaire. Cette vision a toutefois changé à la suite d’études récentes faisant état d'infections par le virus de la grippe aviaire hautement pathogène chez des vaches laitières aux États-Unis. Ces infections se caractérisent par une réplication virale massive dans la glande mammaire, entraînant une propagation du virus au sein des troupeaux et entre ceux-ci, ainsi qu'une transmission de la vache à l'homme par le lait infecté. Un cas d'infection par le virus chez une chèvre a également été documenté aux États-Unis début 2024. Des enquêtes sérologiques démontrant la présence d'anticorps chez les caprins, les ovins et les bovins suggèrent que les espèces ruminantes sont des hôtes sensibles et peuvent agir comme des réservoirs facilitant l'émergence de nouveaux virus grippaux aviaires présentant un potentiel zoonotique (voire pandémique) accru. Cependant, le tropisme viral pour la glande mammaire, ainsi que les mécanismes impliqués dans la réponse immunitaire des mamelles des ruminants aux infections par le virus grippal aviaire, sont mal compris. Pour répondre à ces questions, cette proposition rassemble l'expertise de cinq équipes dans le but de : 1/ Évaluer la capacité de souches du virus Influenza A faiblement pathogène à infecter de manière productive les cellules épithéliales mammaires primaires ovines; 2/Mettre en place un modèle d'infection in vivo chez l'ovin afin d'étudier les intéractions entre le virus de la grippe et son hôte, ainsi que les défenses antivirales dans la glande mammaire des ruminants. La demande d’autorisation de projet formulée ici concerne donc le point 2.

Bénéfices attendus

Le consortium bénéficiera du partage des connaissances, des outils et des ressources afin d'anticiper le développement de solutions pour un problème émergent en matière de santé animale. Ce projet représente également une opportunité pour les équipes disposant de compétences complémentaires de nouer des collaborations et de produire des travaux préliminaires qui pourraient ouvrir la voie à des projet scientifiques plus ambitieux. Il sera tiré parti de ce projet pour mettre en œuvre et valider des modèles d'infection par Influenza chez les petits ruminants qui pourront être mis à disposition des scientifiques et d’autres parties prennantes du secteur de la santé animale. La mise en œuvre de ce projet représente ainsi une précieuse opportunité de formation pour le personnel. Enfin, le programme scientifique proposé de tester de nouveaux outils de surveillance clinique chez les moutons (capteurs de température et caméra thermique infrarouge) et de mettre en place un modèle animal original (et plus abordable) pour reproduire les infections par le virus chez les bovins ou d'autres ruminants, qui pourrait être exploité pour le dépistage de vaccins/traitements.

Procédures

Pose des capteurs télémétriques : 20 minutes par animal 2 voies d'infection : 5 minutes par animal Prises de sang : 5 minutes par animal Ecouvillons nasaux : 1 à 2 minutes par animal

Impact sur les animaux

Les animaux vigiles seront soumis soit à une administration de deux souches de virus, dans un des deux quartiers sous contention, soit à deux voies d'administration d’une souche de virus, sous contention. Il est attendu que les animaux soient atteints par la maladie. Les symptômes attendus sont une inflamation localisée de la mamelle accompagnée d’une montée en températue localisée ou systémique. Il peut y avoir un stress supplémentaire lié aux des différentes interventions (traite ou contention pour observation clinique).

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de projet, étant donné qu’ils seront soumis à une infection expérimentale.

Remplacement

Travail in vitro : depuis plus de 20 ans, des études ont été réalisées in vitro pour mieux comprendre les mécanismes de défense de la mammelle des ruminants. Au vu de la complexité des mécanismes de la réponse immunitaire, pas reproductibles en laboratoire, la mise au point du modèle doit être réalisée chez l’espèce cible(la brebis, dans ce cas particulier). Concenant la pertinance des modèles murins comme modèle, des différences majeures entre les cycles de lactation chez les rongeurs et chez les ruminants sont amplement décrites dans la littérature. Ces différences limitent l’utilisation de la souris pour aborder des questions précises, comme la réponse innée de la mamelle contre les infections. Outre les principales différences entre la souris et la brebis, il est pertinant de souligner que chez la souris, au retrait des souriceaux, la glande mammaire entre en tarissement/involution. Ainsi, la souris doit continuer d’allaiter afin de maintenir ses glandes mammaires en lactation. Lors des infections expérimentales, la présence de souriceaux genererait leur infection par l’ingestion du lait contaminé et rendrait l’étude inviable.

Réduction

Dans le cadre de ce projet, un criblage in vitro de souches sera réalisé afin de tester leurs capacités à se répliquer de manière productive dans des cellules épithéliales mammaires primaires ovines. Les résultats de ces travaux permettront ainsi de réduire le choix à 1 ou 2 souches qui seront utilisées dans les infections in vivo. Le projet visant à mettre en place un modèle d'infection in vivo chez l'ovin, nous estimons qu’il faut à minima 3 animaux par lot pour tester soit 2 souches virales, soit 2 voies d’inoculation, donc 6 animaux au total. Etant dans une démarche de preuve de concept, nous prévoyons de pouvoir reconduire l’infection au bout de quelques jours si nous ne constatons pas de signes d’infection lors de la première série d’inoculations. Ce projet constitue une étude pilote visant à évaluer pour la première fois la faisabilité du modèle expérimental proposé. Compte tenu de la taille limitée des effectifs, aucune analyse statistique n’est envisagée. Des analyses comparatives des paramètres avant et après infection seront effectuées pour chaque animal et les données individuelles seront présentées sous forme de graphiques de dispersion, afin de visualiser la variabilité interindividuelle et d’évaluer la cohérence des réponses observées. L’objectif principal de cette étude est d’évaluer la mise en œuvre pratique du modèle, sa tolérance par les animaux et la pertinence des procédures expérimentales, afin d’ajuster si nécessaire le protocole avant toute étude ultérieure de plus grande ampleur

Raffinement

A partir de la période d'acclimatation, les brebis seront équipées d’un dispositif télémétrique afin de suivre la température corporelle, dispositif couramment utilisée dans nos installations. Une petite chirurgie sera necessaire pour l’implantation du capteur sur la brebis. Les données de température seront transmises à une base positionnée à proximité des animaux. Cette base est équipée d’un écran pour permettre de relever les températures enregistrées. Elle pourra également être connectée ultérieurement à un système informatique pour récupérer l’ensemble des données de températures acquises tout au long du projet. Ces données permettront de visualiser très précisement les changements de température liés à l’infection. La technologie de thermographie infrarouge (caméra thermique) sera testée pour assurer le suivi de l’inflammation et de la température au niveau de la glande mammaire. Cette approche serait une alternative moins invasive et moins contraignante pour les animaux. En effet, lors d’une mammite, une augmentation de la température au niveau local est attendue et pour l’analyser, nous devons utiliser des approches complémentaires comme la thermographie infrarouge. Cette analyse nous permettra ainsi d’évaluer la faisabilité de cette approche dans le cadre d’une inflammation contrôlée et les données générées pourrons nous aider à raffiner nos futurs modèles de mammite. Il est prévu également d’effectuer un travail de conditionnement et de renforcement positif pour les interventions prévues lors de la traite. Les animaux étant déjà présents dans notre élevage, ce travail sera mis en place et initiée sur ces animaux pour les préparer notamment aux interventions lors de la traite. Plusieurs agents de l’unité se sont formés à cette méthode. Enrichissement social : Les animaux seront hébergés en groupes. Une visite régulière des animaliers sera assurée. Une récompense alimentaire sera fournie aux animaux après les interventions.

Choix des espèces

Des enquêtes sérologiques démontrant la présence d'anticorps chez les caprins, les ovins et les bovins suggèrent que les espèces ruminantes sont des hôtes sensibles et peuvent agir comme des réservoirs facilitant l'émergence de nouveaux virus grippaux présentant un potentiel zoonotique (voire pandémique) accru. La mise en place d’un modèle infectieux sur petits ruminants est le plus pertinent et plus adapté à notre capacité actuelle de travail et d’hébergement en confinement biologique. Pour ce projet, nous avons decidé de travailler sur l’espèce ovine en tant que modèle plus abordable que l’espèce bovine pour sa facilité d’hébergement sous confinement biologique et d’approvisionnement. Cela nous permettra également d’effectuer un travail d’acclimatation et de conditionnement renforcé des animaux avant le démarrage de la procédure expérimentale. Le projet portant sur la mise en place d’un modèle d'infection in vivo chez la brebis afin d'étudier les mécanismes de défense antivirale dans la glande mammaire, les animaux utilisés seront des brebis en lactation. Les brebis seront soumises à une traite biquotidienne pour être maintenues en lactation.

Une artère cérébrale bouchée pour provoquer un AVC, une thrombolyse vingt minutes plus tard, une injection de traitement au bout de 24 heures : 96 souris subissent cette séquence, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent ensuite une ou deux séances d'IRM et des tests de récupération fonctionnelle de cinq minutes, avant d'être tuées pour prélever leur cerveau. Le porteur ramène les nuisances attendues à des signes de douleur dans les premières heures et à un affaiblissement passager de la patte avant gauche. Il justifie le choix de la souris par la proximité de sa circulation cérébrale avec celle de l'humain et, autant, par le volume de travaux déjà publiés sur ce modèle.

Objectifs

L'accident vasculaire cérébral (AVC) est l'une des principales causes d'invalidité et de décès dans le monde. L’AVC ischémique (AI) représente environ 85% des AVC, il est majoritairement causé par une thrombose ou une embolie entrainant une diminution de l’afflux sanguin vers le cerveau. Peu après l'apparition de l'AI, des phénomènes d’hypoxie et inflammatoires entrainent une dégénérescence neuronale et l’ouverture de la barrière hématoencéphalique (BHE), responsable de l’infiltration des cellules immunitaires dans le parenchyme cérébral. La cortistatine (CST) est un neuropeptide avec des effets inhibiteurs sur l'activité neuronale. Elle est principalement exprimée dans le système nerveux central, où elle joue un rôle dans la modulation de l'excitabilité neuronale, du sommeil et de l'inflammation. Dans le contexte de l’AVC ischémique, la CST présente un intérêt particulier en raison de ses propriétés neuroprotectrices et anti-inflammatoires. Elle pourrait atténuer les lésions cérébrales en limitant la réponse inflammatoire et en réduisant l’excitotoxicité. Étudier son rôle dans l’AVC ischémique pourrait donc ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les cascades de dommages secondaires. Dans ce projet, nous examinerons les effets de l’administration de la CST sur le volume de lésion, les déficits comportementaux, les phénomènes d’activation endothéliale et d’ouverture de la BHE à la phase aiguë (2 jours) et subaiguë (7 jours) post-AVC.

Bénéfices attendus

Étudier le rôle de la cortistatine dans l’AVC ischémique, ce qui pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les cascades de dommages secondaires.

Procédures

Tous les animaux subiront une ischémie cérébrale +/- Thrombolyse à 20 minutes +/- Traitement (injection intrapéritonéale) à 24 heures après l’occlusion artérielle. Les animaux utilisés pour la procédure 1 (48 souris) auront à J2 et J7 une évaluation par IRM (durée

Impact sur les animaux

Chirurgie AVC : Certains animaux peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures après la chirurgie. Un affaiblissement transitoire de la patte avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée par l'AVC) qui disparaît dans la première semaine après l'AVC.

Devenir

A l'issue de toutes les procédures, les animaux seront mis à mort pour récupération de leur cerveau pour analyses ultérieures.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans l'étude de la réponse immunitaire en post-AVC au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, de nos travaux précédemment publiés, de la littérature et de tests statistiques de puissance avec calcul de la taille d’effet par un test d de Cohen. Le calcul du nombre de souris comprend un pourcentage de perte (15%). De plus, l'utilisation de techniques d'imagerie non invasives permet de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. Nous avons indiqué pour chaque procédure expérimentale les points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter la douleur à son minimum. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par l’expérimentateur pendant toute la durée du projet. Nous avons raffiné dans notre laboratoire nos techniques et nos protocoles pour pouvoir suivre les souris de façon longitudinale, ce qui rajoute de la robustesse à nos résultats car chaque animal est son propre contrôle et permet, à long terme, de réduire le nombre de souris utilisées. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l'accès à l'eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose et des carrés de cotons seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l'angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu'à la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences vasculaires et en immunologie. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’homme et la souris. Le fonctionnement du système immunitaire de la souris se rapproche de celui de l'homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la dynamique de microglie dans les AVC ischémiques. Les souris utilisées seront âgées de 8 à 12 semaines et auront un poids d'environ 30 g. Nous réaliserons nos modèles sur des adultes afin de pouvoir pratiquer sur des animaux du même stade de développement que ceux utilisés en majorité dans les modèles d’AVC. Les animaux (souris C57Bl/6) utilisés seront âgés de 8 à 12 semaines et auront un poids d'environ 20 g. Nous réaliserons nos modèles sur des adultes afin de pouvoir pratiquer sur des animaux du même stade de développement que ceux utilisés en majorité dans les modèles d’AVC.