Système immunitaire

Le mode d'administration, le nombre de prélèvements et le rythme des doses dépendent ici de l'appréciation du client. 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Les expérimentateurs leur injectent des anticorps IgE, puis l'allergène vingt-quatre heures plus tard pour déclencher une réaction anaphylactique, qui provoque une chute de la température corporelle, de fortes démangeaisons et parfois un gonflement du museau. Aucun anti-inflammatoire ni analgésique ne leur sera administré, un tel traitement faussant la mesure de la réaction, et le porteur ajoute qu'une molécule doit avoir été testée chez l'animal pour obtenir une autorisation de mise sur le marché.

Objectifs

Quel que soit l’âge du patient, l’anaphylaxie est une réaction allergique grave qui apparait rapidement et peut être mortelle même en cas de prise en charge rapide. Elle est imprévisible et peut être déclenchée par différents types d'allergènes (l’ovalbumine contenue dans les œufs, le venin d’abeille…). Les patients qui déclenchant l’anaphylaxie ont été en contact une première fois avec l’allergène ce qui a induit une réponse de leur système immunitaire qui, lors d’un deuxième contact, va réagir de manière excessive pour combattre l’allergène. L’anaphylaxie peut alors déclencher une baisse de la pression artérielle, des douleurs abdominales, des démangeaisons autour de la bouche…amenant jusqu’à la mort du patient en quelques heures ou minutes. À ce jour, il est donc impératif d’améliorer le suivi des patients et de diminuer le risque de décès. Pour ce faire, il est nécessaire de disposer de modèles animaux fiables mimant la physiopathologie de l’anaphylaxie. L’objectif scientifique de ce projet est d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques sur la récupération des souris suite à l’induction d’une anaphylaxie générale ou d’une anaphylaxie locale cutanée. Les animaux seront d’abord mis en contact avec l’allergène une première fois par injection, puis une deuxième fois avec une deuxième injection qui déclenchera alors la réaction anaphylactique. Les animaux recevront la molécule thérapeutique à tester avant, pendant ou après l’induction de l’anaphylaxie, dépendamment du mode d’action et de la connaissance que possèdent nos clients sur l’efficacité potentielle de leur molécule. Le sang et les organes prélevés dans les études inclues dans ce projet permettront de répondre à l’objectif de caractérisation et de quantification de l’inflammation et d’évaluer l’efficacité de la molécule testée. L’objectif général de ce projet est de contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour une meilleure prise en charge des patients et réduire leur risque de mourir.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu à court et moyen termes réside dans l’identification des mécanismes impliqués dans l’atténuation des symptômes de l’anaphylaxie. Le bénéfice attendu à long terme de ce projet est l’identification de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant une meilleure prise en charge des patients sujets à l’anaphylaxie et une réduction de la mortalité associée.

Procédures

Plusieurs interventions pourront être mises en place sur les animaux. L’induction de la pathologie (une seule fois par animal) pourra se faire par injection intraveineuse ou intrapéritonéale des IgE (anticorps produits en cas de réponse allergique) et de l’allergène correspondant 24h plus tard (allergène de synthèse). Pour cela, les souris seront anesthésiées (5minutes) à l’aide d’un gaz anesthésiant et recevront l’injection intraveineuse (1 minute) pour la voie intraveineuse. L’injection se fera sans anesthésie pour la voie intrapéritonéale (30 secondes). L’induction de la pathologie pourra aussi se faire par injection sous-cutanée des IgE (anticorps produits en cas de réponse allergique) puis injection intraveineuse de l’allergène correspondant 24h plus tard. Pour cela, les souris seront anesthésiées (5minutes) à l’aide d’un gaz anesthésiant et recevront l’injection sous-cutanée (1minute) puis, 24h plus tard, les souris seront de nouveau anesthésiées à l’aide du gaz anesthésiant et recevront l’injection intraveineuse (1 minute). Au cours de la procédure, les souris recevront des administrations répétées de composés client : les modes d’administration possibles incluent l’alimentation, l’eau de boisson, le gavage, les injections intrapéritonéale, sous-cutanée, intravasculaire, intradermique (environ une minute par animal : saisie de l’animal, pesée de l’animal pour adapter la dose, puis administration de la substance). Selon l’appréciation du client, un ou plusieurs prélèvements de sang pourrons être effectués. Les prélèvements de sang n’excèderont pas 12 % du volume de sang total de l’animal et seront suivis d’une semaine minimum de récupération avant le prochain prélèvement. Le volume prélevé est dépendant du poids de l’animal.

Impact sur les animaux

L’anaphylaxie généralisée provoque comme effets indésirables : une baisse de la température corporelle et une sensation de démangeaison importante. Parfois, un gonflement du museau peut être observé. L’anaphylaxie cutanée provoque comme effets indésirables : une sensation de démangeaison localisée à l’oreille ainsi qu’un léger gonflement de l’oreille. La réalisation de prélèvements sanguins et les administrations (uniques ou répétées, selon les études) pourront également générer un stress chez l’animal. Les modes d’administration considérés comme nuisibles (pouvant induire une gène ou une douleur) incluent tous les modes d’injection.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort à l'issue des procédures afin de pouvoir procéder aux prélèvements d'organes et à la caractérisation du statut inflammatoire terminal.

Remplacement

Lorsque cela sera possible, les composés de nos clients seront préalablement testés sur culture cellulaire ou organes isolés permettant ainsi de mieux définir les doses à administrer par exemple. Cependant, l’utilisation des animaux sera nécessaire car les modifications physiopathologiques liées à l’anaphylaxie sont très complexes, doivent être mesurées dans un organisme entier. De plus, pour obtenir une autorisation de mise sur le marché, une molécule doit avoir été testée chez l’animal afin d’engranger des preuves d’efficacité fonctionnelle et de détecter d’éventuels effets indésirables. Nous devons donc être en mesure de prévoir l’apparition d’effets secondaires dans l’éventualité de l’utilisation future des candidats médicaments en clinique. Les effets indésirables ne peuvent s’observer que sur un animal vivant car ils peuvent impliquer plusieurs organes et plusieurs régulations physiologiques. L’utilisation des animaux sera donc essentielle à nos études mais nous nous efforcerons de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés en effectuant des tests préliminaires sur d’autres modèles n’impliquant pas les animaux.

Réduction

Au sein de cette étude, nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés au maximum pour une étude statistique soit 8 animaux par groupes. La comparaison des groupes entre eux sera faite à l'aide de test statistiques. Le nombre d’animaux nécessaires pour répondre aux différentes problématiques scientifiques exposées dans ce projet a été déterminé en se basant sur des travaux préliminaires ainsi que sur l’expertise de notre société sur l’utilisation de ces modèles animaux. Les doses à tester seront au préalable, systématiquement évaluées après documentation dans la littérature ou par retour d’expérience du client. Par ailleurs, compte tenu de la variabilité des paramètres observés au sein d’un groupe homogène, une analyse sur des groupes de 8 animaux sera nécessaire afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Les tests statistiques seront réalisés sur un ligiciel spécifique afin de vérifier les différences obtenues entre les groupes.

Raffinement

Les procédures seront réalisées en respectant le bien-être animal, afin de limiter souffrance, douleur et angoisse. Les souris seront hébergées conformément à la réglementation avec enrichissement environnemental (igloo, carrés de ouate systématiquement et, si nécessaire, tunnel en carton, buchettes et boulettes en bois). Après induction de la pathologie, un suivi régulier sera effectué (score 1 et/ou score 2). Le score 1, reportera l’aspect général de l’animal et sera mis en place dans les deux modèles. Le score 2 reportera la réponse clinique à l’induction de la pathologie. L’atteinte d’un score trop important induira la sortie de l’animal de l’étude et sa mise à mort s’il ne récupère pas dans les heures qui suivent. Étant donné que l’anaphylaxie est basée sur l’inflammation, aucun traitement anti- inflammatoire ou analgésique ne sera administré, car cela compromettrait les résultats en agissant sur les voies de signalisation ciblées ainsi que sur le comportement et l’état physique, paramètres clés de l’évaluation. De plus, des interactions possibles entre le traitement testé et les médicaments anti-inflammatoires ne peuvent être exclues. Les prélèvements et administrations répétées pouvant induire du stress, un enrichissement sera maintenu. Les aiguilles et sondes de gavage seront adaptées au poids et au mode d’administration. Par ailleurs, lorsque cela sera nécessaire, des anesthésiques pourront être utilisés.

Choix des espèces

L’utilisation de souris dans la modélisation de pathologies présentes chez l’Homme a longuement été décrite et justifiée de par leur proximité avec l’Homme. Par ailleurs, la souris est largement décrite comme une espèce de choix dans les modèles de développement de maladies inflammatoires telles que l’anaphylaxie compte tenu des outils cellulaires et moléculaires existants. Il s’agit en effet d’un modèle bien établi et bien documenté dans la littérature pour l’analyse de la fonction immunitaire. Par ailleurs, l’étude de l’anaphylaxie nécessite des animaux ayant un système immunitaire mature, c’est-à-dire âgées de 7 à 12 semaines.

Une partie des souris utilisées développe spontanément une maladie auto-immune dès vingt-cinq semaines d'âge, et le projet cherche à accélérer ce développement par une infection. 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin de protocole ou plus tôt si elles atteignent un point limite. Les expérimentateurs leur injectent des bactéries dans l'abdomen pour provoquer un sepsis, les traitent aux antibiotiques deux heures après, puis prélèvent leur sang derrière l'œil sous anesthésie jusqu'à cinq fois, avec cinq à dix semaines entre deux prélèvements. Une partie d'entre elles sera gardée jusqu'à quarante semaines après l'infection, le porteur indiquant ne pas pouvoir prédire les symptômes qui apparaîtront.

Objectifs

Les maladies auto-immunes à autoanticorps sont des maladies où le système immunitaire, qui est censé protéger le corps, se met à produire des anticorps contre l’organisme lui-même (autoanticorps), et à attaquer certains organes voire tout le corps (on dit alors que c’est systémique). Ces maladies sont rares (moins d’une personne sur 2000) et peuvent être causées par l’environnement (comme la pollution ou l’alimentation), des hormones (elles touchent plus souvent les femmes), et/ou des prédispositions génétiques, c’est-à-dire que certaines personnes sont plus à risque à cause de leurs gènes. On a remarqué que les personnes qui font une infection grave (comme un sepsis, qui est une infection très sévère) et qui vont en réanimation ont un risque cent fois plus élevé que les autres de développer une maladie auto-immune dans les six mois qui suivent leur sortie de l’hôpital. On ne comprend pas pourquoi, après une infection très grave, certains patients développent une maladie auto-immune et d’autres non. Si on arrive à prédire quels patients risquent de développer ce genre de maladies dans ces conditions, on pourra mieux les soigner et essayer d’empêcher que la maladie auto-immune ne se développe, car ces maladies diminuent la qualité de vie des patients et coûtent très cher à la société. Notre projet a pour but de comprendre comment une infection grave peut déclencher une maladie auto-immune, en utilisant des souris pour faire des expériences et observer ce qu’il se passe. On veut répondre à deux questions principales : 1) Est-ce qu’une infection sévère peut déclencher une maladie auto-immune chez des souris déjà à risque ? 2) Est-ce qu’une infection sévère peut aussi déclencher une maladie auto-immune chez des souris normales qui ne sont pas à risque ? En comprenant mieux ces mécanismes, on espère trouver de nouvelles façons d’identifier les individus à risque et ainsi améliorer leur prise en charge et mettre en place des stratégies de prévention.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet se situent à deux niveaux. Le premier niveau concerne les connaissances scientifiques car le projet permettra d’accroître la compréhension des mécanismes du lien entre infection sévère et développement de l’auto-immunité. Les cellules et molécules impliquées dans cette induction auto-immune seront ainsi identifiées. Le deuxième niveau concerne la santé humaine. En effet, la compréhension de ces mécanismes et l’identification des biomarqueurs (marqueurs de maladie faciles à détecter dans le sang ou les urines) associés à cette évolution de l’inflammation aiguë vers l’auto-immunité permettront de pouvoir identifier les patients à risques et de prévenir le développement de telles affections chroniques.

Procédures

Les animaux utilisés dans ce projet seront soumis à 3 types d’interventions : des injections dans le ventre (« intrapéritonéales ») et sous la peau (« sous-cutanées), des contentions (attrapés et immobilisés dans une main) et les animaux seront soumis au prélèvement d’un petit volume de sang sous anesthésie générale. Les gestes réalisés durent moins de 30 secondes chacun. L'anesthésie générale dure entre 1 et 2 minutes. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale avec des bactéries une seule fois pour imiter une infection sévère. 2 heures plus tard, elles seront traitées avec des antibiotiques par injection sous-cutanée quatre fois sur une période de 24h dans le but de les guérir de l’infection, comme les patients en réanimation. Ces souris auront un prélèvement sanguin sous anesthésie générale avant l’infection, puis certaines seront à nouveau prélevées 4 fois avec 5 à 10 semaines entre deux prélèvements. Cela nous permettra de comparer les paramètres sanguins des souris avant et après infection pour voir si elles ont développé une maladie auto-immune.

Impact sur les animaux

Certaines souris utilisées ici développent une maladie auto-immune légère mais quantifiable dès 25 semaines d’âge. Ces animaux entreront en procédure à l’âge de 10 semaines (+/- 2 semaines), c’est-à-dire à l’âge adulte, et ne seront conservés que deux semaines supplémentaires après l’infection sévère traitée par antibiotique. Nous nous attendons à cette procédure entraîne une accélération du développement de la maladie avec des signes d’auto-immunité à 12 semaines d’âge équivalents à ceux d’animaux non-infectés de 25 semaines. Une autre procédure utilisera des animaux normaux qui seront conservés sur un maximum de 40 semaines après l’infection sévère afin de déterminer s’ils développent une maladie auto-immune ou non, sans que nous puissions prédire concrètement les symptômes éventuels induits. Une grille d’évaluation clinique sera utilisée sur toute la durée de l’expérience afin d’éviter les éventuelles nuisances sur le bien-être des animaux. Lors des procédures, les souris seront soumises à quatre types de nuisance. 1) les contentions nécessaires à la réalisation des actes (injections et prélèvements d’urine) entraîneront un stress léger et bref pour les animaux (moins de 30 secondes chacun). 2) les injections intrapéritonéales (ip) et sous-cutanées (sc) (1 ip et 4 sc/animal réparties sur 24 heures) entraineront des douleurs brèves de piqure à chaque occurrence (moins de 30 secondes). 3) les prélèvements sanguins de faible volume par voie rétro-orbitale sous anesthésie générale gazeuse (1 à 2 minutes) pourront entraîner ensuite un inconfort à l'orbite le temps que la cicatrisation soit complète (24 heures). 4) l’infection entraînera une gêne pour les souris (fièvre et inconfort) durant les deux premières heures. Le traitement antibiotique sera alors réalisé ce qui soulagera les souris rapidement.

Devenir

Les animaux seront systématiquement euthanasiés en fin de procédure pour analyse ou avant dans le cas d’atteinte de points limites.

Remplacement

Les études des maladies de systèmes (impactant différents organes) et de leurs traitements (validés ou expérimentaux) nécessitent de pouvoir tester les hypothèses sur des organismes entiers vivants avant de pouvoir passer chez l’humain. La localisation et l’activation des cellules d’intérêt au cours du développement des maladies étudiées ne peuvent être observées que dans des organismes entiers. Les études in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité des organismes, ni des maladies étudiées, ni de la séquence infection/auto-immunité à l’échelle d’un organisme. Malheureusement, aucune des technologies actuelles ne peut se substituer aux modèles animaux dans ce domaine. Nous ne pouvons donc pas utiliser d’autre approche que l’expérimentation animale pour ces études visant à améliorer la prise en charge des patients.

Réduction

Dans notre laboratoire, on a déjà fait le modèle de péritonite avant, ce qui nous permet d’utiliser seulement le nombre de souris nécessaire. Il y aura 10 souris par groupe pour bien prendre en compte les différences entre chaque animal et voir comment ils réagissent à l’infection et au risque de maladies auto-immunes. Cela nous aide à être sûrs que nos résultats sont fiables et qu’on peut vraiment voir s’il y a une différence entre les groupes, sans utiliser plus d’animaux que nécessaire. Les souris qui servent de contrôles seront juste traitées avec des antibiotiques et on n’ajoutera pas d’autres groupes pour ne pas en utiliser trop. Après les expériences, on gardera des échantillons pour pouvoir répondre à d’autres questions plus tard, toujours dans l’idée d’utiliser le moins d’animaux possible. Enfin, pour prouver que nos résultats sont solides et que l’expérience peut être refaite par n’importe quel autre laboratoire avec le même résultat, on fera chaque test trois fois, ce qui est le minimum demandé pour que ce soit accepté scientifiquement.

Raffinement

Avant et pendant les expériences, les souris vivent dans de bonnes conditions pour éviter qu’elles soient stressées. Elles ne sont jamais seules, ont toujours des objets pour s’occuper (comme du coton pour faire leur nid ou des petites maisons pour se cacher) et sont observées tous les jours. Pendant les expériences, on fait tout pour que les souris souffrent le moins possible. Après l’infection, on les surveille toutes les 6 heures pendant 24 heures et il n’y a que quelques souris à la fois pour pouvoir bien toutes les observer. Le traitement avec des antibiotiques commence 2 heures après que les souris ont reçu les bactéries, et donc aucune ne mourra à cause de cela. Si une souris est trop malade, elle sera euthanasiée tout de suite, sans attendre la fin de l’expérience. L’état de santé des souris est suivi grâce à une grille d’évaluation. On regarde à chaque fois trois choses : sa posture, sa façon de bouger et l’état de ses poils. À chaque critère, on donne un score de 0 à 3. Si la souris a 6 points ou plus au total, ou si elle a 3 points dans la posture ou la mobilité, elle sera euthanasiée. Après le traitement, en plus de surveiller les souris chaque jour, on continue de calculer les scores des souris chaque jour pendant 3 jours, puis une fois par semaine pendant 40 semaines, pour vérifier si elles restent en bonne santé. On regarde aussi leur poids et si elles n’ont pas de problèmes de peau, de poumons ou d’articulations. Si une souris atteint certains scores qui montrent qu’elle va trop mal, elle est euthanasiée et analysée immédiatement.

Choix des espèces

Notre projet s’inscrit dans l’objectif de définir des mécanismes de développement de maladies d’intérêt pour la santé humaine afin de pouvoir améliorer la prise en charge des patients. Les procédures et les souris utilisées dans le présent projet nous permettront d’atteindre cet objectif. L’espèce Mus musculus domesticus est le seul modèle de mammifères disposant des lignées modifiées génétiquement pertinentes pour les objectifs scientifiques de notre projet et dont la biologie se rapproche suffisamment de la biologie humaine pour que son étude puisse y être transférée. De plus les outils d’analyse disponibles et l’expertise acquise des modèles utilisés ici justifient l’utilisation de ce modèle. Les animaux entrant en procédure auront tous un âge supérieur ou égal à 10 semaines (stade adulte). Ce stade adulte correspond au stade de la population de patients concernés par la présente investigation.

Soumises à un régime riche en lipides pendant quatorze semaines, à cinq prélèvements sanguins sur animal éveillé, à deux jeûnes de six heures et à un gavage, 528 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyses post-mortem. Le porteur qualifie lui-même de modérément douloureux le prélèvement de sang réalisé sans anesthésie. L'objet du projet tient en une phrase, comprendre le rôle d'un gène dans les cellules immunitaires du tissu adipeux, et les retombées contre l'obésité et le diabète sont renvoyées au long terme. Sur les 528 animaux, il écrit seulement que leur nombre a été calculé pour obtenir une puissance statistique suffisante.

Objectifs

L'objectif du projet est de comprendre le rôle d'un gène particulier dans les cellules immunitaires associées au tissu adipeux, dans des conditions normales et lors d'un régime riche en lipides qui induit de l'obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de faire avancer de manière conséquente notre connaissance des cellules immunitaires associées au tissu adipeux, et qui contribuent au développement de l'obésité. Ce projet permettra à plus long terme d'identifier des cibles moléculaires pour envisager de nouvelles thérapies contre l'obésité et les maladies métaboliques telles que le diabète.

Procédures

Prélevement sanguin : maximum 5 fois par animal, 3 secondes; Régime alimentaire spécifique : 14 semaines; Injection intrapéritonéale : maximum 1 injection par animal, 3 secondes; Mise à jeun : une fois pendant 6h et 3 jours après une deuxième fois pendant 6h; Gavage : maximum 1 fois par animal, 5-10 secondes.

Impact sur les animaux

Le régime riche en lipides est susceptible d'engendrer divers effets métaboliques, et conduit généralement à une prise de poids significative et à une réduction de l'activité. Prélèvement de sang sur animal vigile : douleur modérée au moment de la réalisation du geste. Injection intrapéritonéale : douleur légère de courte durée. Mise à jeun : Jeune de courte durée: stress et sensation de faim. Gavage : stress de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative pour réaliser ce travail qui nécessite l’analyse de tissus entiers. Le tissu adipeux est un tissu complexe qui comporte de nombreuses cellules qui interagissent afin de maintenir un équilibre. La dynamique du tissu adipeux, des cellules immunitaires qu’il abrite ainsi que les interactions et le recrutement potentiel de cellules d’autres organes sont des conditions qui ne peuvent pas être adéquatement reproduites in vitro.

Réduction

Le nombre de souris à utiliser a été calculé afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Un suivi de score clinique sera effectué pour éviter toute souffrance inutile des animaux.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix car la physiologie de la souris est proche de celle de l’homme. D’autre part les mécanismes immunitaires sont bien caractérisés chez la souris, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté pour étudier les cellules immunitaires. Nous utiliserons des souris adultes pour que leurs tissus soient pleinement développés.

504 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune hébergée seule et nourrie trois jours d'un régime hypercalorique avant d'être tuée pour prélèvement de tissus. La nuisance principale que le porteur identifie est le stress de l'isolement, qu'il compte compenser par du coton, des tunnels et de la litière prise chez les congénères. L'objet réel se limite à décrire la phase précoce de l'inflammation de l'hypothalamus chez des souris rendues obèses, les retombées thérapeutiques étant renvoyées au long terme. Vingt et un mâles et vingt et une femelles par groupe sont déclarés nécessaires, ce qui porte l'effectif à 504 animaux pour une expérience de trois jours.

Objectifs

Pour développer de nouvelles thérapies contre l'obésité et ses complications, il est important de mieux comprendre les mécanismes biologiques qui contrôlent l'appétit et le poids corporel. Une petite zone du cerveau appelée hypothalamus médio-basal (MBH) joue un rôle clé dans la gestion de l'énergie du corps. Un régime riche en graisses provoque une inflammation dans cette zone, appelée neuro-inflammation. Les cellules immunitaires du cerveau et des méninges participent à cette inflammation dans le MBH en réponse à ce régime riche. Mais nous ne connaissons pas le rôle exact joué par les cellules immunitaires méningées. En comprenant mieux ces mécanismes, nous pourrions trouver des moyens de limiter l'inflammation et prévenir la prise de poids. Pour cette étude nous utiliserons un modèle animal d’obésité, des souris nourries avec un régime hypercalorique favorisant la prise de poids pendant trois jours . Le projet comprend une seule procédure expérimentale.

Bénéfices attendus

Les informations tirées de la réalisation de ce projet permettront de mieux comprendre les changements inflammatoires des cellules immunitaires des méninges et du cerveau dans le développement de l’obésité en lien avec l’inflammation du MBH. Dans une perspective thérapeutique à long terme, ces données seront utiles pour tenter de moduler la réponse inflammatoire liée à un régime hypercalorique.

Procédures

La nourriture hypercalorique peut induire un stress digestif pendant les 24 premières heures. Le stress dû à l'hébergement individuel est la nuisance principale rencontrée. Nous essaierons de limiter ce stress en ajoutant cotons et tunnels supplémentaires, et litière provenant de ses congénères (avant hébergement individuel). Cependant si le stress est trop intense, nous la replacerons avec ses congénères au bout de 48h. L’animal sera sorti de l’expérience.

Impact sur les animaux

Le stress induit par l'hébergement individuel et le changement de nourriture (régime alimentaire hypercalorique sera de courte durée (3 jours phase précoce de la réponse inflammatoire). Les animaux contrôles seront eux nourris avec la nourriture standard et hébergés individuellement également.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux sont mis à mort selon les méthodes réglementaires pour prélever les tissus pour analyse.

Remplacement

L’utilisation du modèle animal murin est essentielle dans ce projet, car dans l’état actuel des connaissances, il est impossible de recréer in vitro les multiples interactions cellulaires d’un système complexe en développement (méninges, cerveau et système immunitaire).

Réduction

Nous tenterons de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en effectuant des expériences pertinentes et complètes. Une approche statistique solide requiert 21 animaux par groupe. Des exemples de données publiées ainsi que nos précédents travaux non publiés prévoient un effet sexe en particulier lors des interactions cellules immunitaires et système nerveux. Nous aurons donc des groupes de 21 males et 21 femelles par expérience.

Raffinement

Les souris seront suivies régulièrement et des points limites adaptés et précoces permettront en cas de souffrance avérée de prendre des mesures adéquates en concertation avec notre vétérinaire référent ou notre structure SBEA (surveillance renforcée, analgésie, enrichissement, etc.). Afin de compenser le manque d’interactions sociales et le possible stress de l'hébergement individuel, nous procèderons à un enrichissement double de la cage,et mettrons dans la cage de la litière de ses congénères. La souris sera habituée à l’expérimentateur une semaine avant afin de limiter son stress lors des pesées quotidiennes.

Choix des espèces

La souris est un mammifère où les processus qui régissent le développement du système nerveux central sont similaires à l'Homme. La régulation du poids corporel, le comportement alimentaire et le métabolisme glucidique sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. La maturation du cerveau et des méninges est terminée à 8 semaines c’est pourquoi nous utiliserons ce stade de développement. la consommation d’un régime gras induit une réponse neuro-inflammatoire dimorphique (plus importante chez les mâles). Nous obtiendrons une observation la plus réaliste possible des influences hormonales en lien avec l’inflammation en utilisant les deux sexes. Nous utiliserons des souris C57BL6J de type sauvage âgées de 8 semaines pour lesquelles la croissance est terminée.

Pour classer six peptides selon qu'ils freinent ou stimulent le système immunitaire, 160 souris subissent une réaction allergique provoquée sur l'oreille, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le protocole tient en huit jours : rasage de l'abdomen sous anesthésie, dépôt d'un produit allergisant sur la peau, deux injections des peptides à tester, puis application du même produit sur l'oreille droite pour déclencher un gonflement, mesuré à l'épaisseur. Toutes sont tuées le lendemain de la dernière mesure pour prélever leurs oreilles. Le porteur affirme que l'étude chez l'animal est "indispensable" pour valider ces molécules, après un tri de plus de cinquante peptides sur cellules en culture, et indique qu'aucune des plus de 200 souris déjà utilisées dans ce modèle n'a nécessité de mise à mort anticipée.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer l'efficacité de nouvelles molécules (appelées peptides) capables de réguler le système immunitaire, c'est-à-dire notre système de défense contre les infections et les maladies. Notre système immunitaire possède des mécanismes de contrôle comparables aux freins et accélérateurs d'une voiture. Parfois, ces mécanismes sont déréglés : le système immunitaire peut être trop actif (causant des maladies auto-immunes comme la polyarthrite ou des allergies) ou pas assez actif (permettant aux cancers de se développer). Nous testerons six molécules différentes : - Quatre molécules « freins » qui pourraient calmer un système immunitaire trop actif - Deux molécules « accélérateurs » qui pourraient stimuler un système immunitaire insuffisant Pour évaluer ces molécules, nous utiliserons un modèle de réaction allergique cutanée chez la souris. Ce modèle reproduit ce qui se passe lors d'un eczéma de contact chez l'homme : la peau devient rouge et gonflée au contact d'une substance à laquelle l'organisme a été préalablement sensibilisé. En mesurant l'intensité de cette réaction inflammatoire, nous pourrons déterminer si nos molécules sont capables de la diminuer (pour les « freins ») ou de l'augmenter (pour les « accélérateurs »), et ainsi identifier les candidats les plus prometteurs pour le développement de futurs traitements.

Bénéfices attendus

Bénéfices scientifiques : Cette étude permettra de mieux comprendre comment réguler le système immunitaire avec de nouvelles molécules, ouvrant des pistes pour traiter des maladies actuellement difficiles à soigner. Bénéfices médicaux potentiels : Pour les molécules « freins » : elles pourraient aider à traiter des maladies où le système immunitaire attaque l'organisme par erreur (maladies auto-immunes comme la polyarthrite rhumatoïde, le lupus, la sclérose en plaques) ou pour prévenir le rejet après une greffe d'organe. Pour les molécules « accélérateurs » : elles pourraient renforcer les traitements contre le cancer (immunothérapie) ou améliorer la réponse aux vaccins chez les personnes dont le système immunitaire est affaibli. Avantages de ces nouvelles molécules par rapport aux traitements existants : - Coût de fabrication plus faible - Administration plus simple (injection sous la peau plutôt que perfusion à l'hôpital) - Meilleure diffusion dans les tissus.

Procédures

Le protocole s'étend sur 8 jours. Par convention, le jour du challenge (application sur l'oreille) est désigné Jour 0. Les étapes préalables de sensibilisation sont numérotées en jours négatifs (J-7, J-6, J-2, J-1), indiquant le nombre de jours avant le challenge. Les souris subiront les interventions suivantes sur une durée totale de 8 jours : 1. Rasage de l'abdomen (Jour -7, durée : 5 min) : réalisé sous anesthésie gazeuse brève (2-3 min) pour éviter le stress de contention. Récupération complète en moins de 5 minutes. 2. Sensibilisation cutanée (Jour -6, durée : 30 sec) : application d'une goutte de produit allergisant sur l'abdomen rasé. Ce geste est réalisé sur animal éveillé avec contention manuelle douce. Cette étape prépare le système immunitaire à réagir au produit. 3. Injections sous la peau (Jours -2 et -1, durée : 20 sec par injection) : deux injections des molécules à tester dans le haut du dos. Ces gestes sont réalisés sur animal éveillé avec contention manuelle douce. 4. Application sur l'oreille (Jour 0, durée : 30 sec) : application du même produit allergisant sur l'oreille droite pour déclencher la réaction allergique localisée. Ce geste est réalisé sur animal éveillé. 5. Mesures (Jours 0 et +1, durée : 2 min par souris) : mesure de l'épaisseur de l'oreille avec un instrument de précision pour quantifier l'inflammation. Ces mesures sont réalisées sur animal éveillé. À l'issue des mesures (Jour +1), les animaux sont euthanasiés et les oreilles sont prélevées pour des analyses au microscope.

Impact sur les animaux

Effets attendus : Rasage (Jour -7) : stress bref lié à l'anesthésie (quelques minutes), récupération rapide. Sensibilisation cutanée (Jour -6) : possibilité d'une légère rougeur temporaire sur l'abdomen, sans gêne notable pour l'animal. Injections (Jours -2 et -1) : stress bref lié à la contention (moins de 20 secondes). Possibilité d'une petite bosse sous la peau au point d'injection, disparaissant en 1-2 jours. Réaction allergique sur l'oreille (Jour 0 à Jour +1) : c'est la phase où les effets sont les plus visibles : - Gonflement de l'oreille traitée (augmentation d'épaisseur de 0,1 à 0,3 mm) - Rougeur et légère chaleur de l'oreille - Ces effets restent strictement localisés à l'oreille traitée État général : les souris conservent un comportement normal (alimentation, déplacements, interactions avec leurs congénères). Pas de perte de poids significative attendue. Signes pouvant nécessiter une euthanasie anticipée (observés chez moins de 2% des animaux selon notre expérience) : - Perte de poids importante - Extension des lésions cutanées au-delà de la zone traitée - Grattage excessif ou automutilation - Prostration ou isolement du groupe - Signes de douleur non contrôlée. Sur plus de 200 souris utilisées dans ce modèle dans notre laboratoire, aucun animal n'a nécessité d'euthanasie anticipée.

Devenir

Aucun animal ne sera maintenu en vie à l'issue de la procédure. Tous les animaux (160 souris) seront euthanasiés à la fin de l'étude, le protocole nécessitant le prélèvement des oreilles pour analyses microscopiques.

Remplacement

Avant de recourir à l'expérimentation animale, des tests sur cellules en culture ont été réalisés pour sélectionner les candidats les plus prometteurs parmi plus de 50 peptides. Cependant, ces méthodes ne permettent pas de reproduire le fonctionnement complet du système immunitaire : elles ne peuvent pas évaluer le devenir des peptides dans l'organisme, les interactions entre les différents types de cellules immunitaires, ni le recrutement de ces cellules vers le site d'inflammation. L'étude chez l'animal est donc indispensable pour valider l'efficacité de ces molécules avant tout développement thérapeutique.

Réduction

Le nombre d'animaux a été calculé mathématiquement au minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Sur plus de 50 molécules conçues initialement, seules les 6 plus prometteuses — présélectionnées par des tests en laboratoire — sont testées chez l'animal. Chaque souris fournit plusieurs mesures (épaisseur de l'oreille, poids de la biopsie, analyses microscopiques), ce qui maximise les informations obtenues par animal. Les résultats seront publiés et rendus accessibles à la communauté scientifique afin d'éviter toute duplication inutile de ces expériences.

Raffinement

De nombreuses mesures sont prises pour assurer le bien-être des animaux et minimiser leur inconfort : Hébergement adapté : - Souris hébergées en groupe (4-5 par cage) pour préserver les contacts sociaux - Cages enrichies avec matériel de nidification (papier, coton), abris et litière abondante - Conditions de température, humidité et lumière contrôlées - Période d'acclimatation de 7 jours avant le début des manipulations Réduction du stress lors des manipulations : - Rasage réalisé sous anesthésie gazeuse brève - Manipulations douces et rapides - Surveillance et prise en charge de la douleur : - Observation quotidienne de tous les animaux, renforcée (2 fois par jour) pendant la phase de réaction allergique - Utilisation d'une grille d'évaluation standardisée avec des critères objectifs (poids, aspect du pelage, comportement, aspect des lésions) - Points limites définis : si un animal montre des signes de souffrance importante, il est immédiatement euthanasié - La surveillance est renforcée lors de la phase de réaction, et que l'euthanasie est immédiate en cas de signes de souffrance (score 3) Durée limitée : - Protocole de 8 jours seulement - Euthanasie réalisée à la fin de l'étude, avant que l'inflammation ne devienne inconfortable, sous anesthésie profonde (méthode rapide et sans douleur)

Choix des espèces

Choix de l'espèce : La souris a été choisie pour les raisons suivantes : 1. Modèle validé : le modèle d'allergie cutanée utilisé est un standard international pour évaluer des molécules modulant le système immunitaire. Il existe de nombreuses données publiées permettant de comparer nos résultats. 2. Sensibilité adaptée : la souche de souris choisie présente une bonne sensibilité aux réactions allergiques cutanées, ce qui permet de détecter efficacement l'effet de nos molécules. 3. Pertinence pour l'homme : les mécanismes immunitaires ciblés par nos molécules sont très similaires chez la souris et chez l'homme (plus de 70% de ressemblance), ce qui permet d'envisager une application future chez l'homme. 4. Disponibilité : ces souris sont facilement disponibles auprès de fournisseurs agréés, avec des caractéristiques génétiques standardisées garantissant la reproductibilité des expériences. Stade de développement : Les souris utilisées seront des adultes jeunes (7-9 semaines), car : 1. À cet âge, le système immunitaire est pleinement mature, garantissant des réponses représentatives. 2. C'est l'âge standard utilisé dans la littérature scientifique, facilitant la comparaison des résultats. 3. Les souris sont suffisamment développées pour bien tolérer les manipulations.

Exposées in utero aux polluants, puis allaitées par des mères elles-mêmes exposées, certaines souris respirent ensuite la fumée de cigarette deux heures par jour pendant trois mois avant d'être tuées à six mois. 1 464 souris vont être utilisées au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent aussi un prélèvement de queue dans les dix jours suivant la naissance pour le génotypage, et pour une partie une chirurgie suivie de plusieurs heures d'imagerie pulmonaire sous anesthésie, sans réveil. Le porteur écrit que les souris peuvent apparaître prostrées pendant l'exposition quotidienne à la fumée mais retrouvent leur activité dès la sortie de l'enceinte, et qu'au-delà de cette prostration transitoire aucun signe de souffrance n'est attendu.

Objectifs

La présente demande d'autorisation de projet repose sur l'étude des conséquences respiratoires de l’exposition aux polluants aériens sur la maturation du système immunitaire pulmonaire précoce et les risques d’incidence de bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) à plus long terme. L'une des premières prises de conscience des effets majeurs de la pollution atmosphérique sur la santé a eu lieu lors d'un épisode survenu à Londres pendant l'hiver 1952 : durant 4 jours, un épais brouillard s'est abattu sur la ville, et 4000 décès supplémentaires (par rapport à la même période les années précédentes) ont été enregistrés, plus de la moitié étant pour causes respiratoires. La pollution atmosphérique est maintenant reconnue comme étant la principale cause environnementale de maladies et de décès prématurés dans le monde selon l’organisation mondiale de la santé. L'hypothèse est ici que l’exposition aux polluants au cours de différentes phases de la vie (périnatale / adolescence / adulte) impacte durablement le système immunitaire pulmonaire générant une sensibilité accrue aux risques de développer une pathologie respiratoire à long terme comme la BPCO dont la cause principale est le tabagisme. Ainsi l'étude a pour objectif d'évaluer les effets de la pollution dans l’induction des maladies respiratoires chez l’animal au-delà de la BPCO. Le projet vise à répondre aux questions suivantes : 1/ Quel est l’impact de l’exposition aux polluants atmosphériques sur le compartiment immunitaire dans les poumons à court et long terme ; 2/ Quelles sont les populations immunitaires qui ont un rôle dans le développement des troubles respiratoires à plus long terme.

Bénéfices attendus

Nous nous intéressons à étudier le lien entre l’impact de l’exposition aux polluants sur la maturation et l’activation du système immunitaire pulmonaire et le risque d’incidence de pathologies chroniques respiratoires en particulier la broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO). Cette pathologie correspond à une atteinte progressive et irréversible de la fonction respiratoire, présentent une variabilité très importante chez les patients atteints, et dont les déterminants notamment précoces restent largement méconnus à l'heure actuelle, alors même que cette variabilité impacte grandement la qualité de la prise en charge thérapeutique des patients atteints. Bien que l'exposition tabagique soit le principal facteur de risque, il apparait que l’historique de l’exposition aux polluants représente aussi un facteur déterminant du risque de développer des maladies à plus long terme. Ce projet a pour objectif principal d'identifier les effets des polluants atmosphériques sur le système immunitaire, garant de l'intégrité tissulaire et du bon fonctionnement du système respiratoire. Ce domaine fait partie d'une problématique de santé publique très actuelle au-delà des effets du tabagisme et pour laquelle encore trop peu d'études sont mises en place. Ces études ont pour vocation de permettre une meilleure prise en charge thérapeutique des patients en ciblant la régulation du système immunitaire, et ainsi une amélioration certaine de leur qualité de vie.

Procédures

Prélèvement tissulaire (extremité de la queue) dans les 10 jours suivant leur naissance ou de sang en sous mandibulaire au sevrage après 1 mois d'âge, pour le génotypage procédure de 1 minute.- Exposition aux polluants atmosphériques pendant 7 jours directement dans leur cage d'origine.-Exposition quotidienne aux fumées de cigarette à raison de (2h/jour) pendant 3 mois à la fumée de cigarettes à l'aide d'une machine permettant là encore d'exposer les animaux sans les sortir de leur cage.-Injection retroorbitale sous anésthésie 1 minute par animal sans réveil-Procédure chirurgicale pour imagerie intravitale: 4h par animal : chirurgie 30 min et imagerie entre 2h et 3h30 (anesthésie générale max 4h).

Impact sur les animaux

Les prélèvements tissulaires pour génotypage engendrent des douleurs de courte durée et un stress chez l’animal. Les expositions aux polluants peuvent engendrer un stress chez l’animal de par le changement d'environnement, cependant aucun signe particulier n’a été observé lors des différentes campagnes d'exposition déjà réalisées au laboratoire. Pour l’exposition à la fumée de cigarettes, certaines souris peuvent apparaitre prostrées pendant la durée de l'exposition quotidienne, mais récupèrent leurs activités normales dès la sortie de l'enceinte d'exposition. Au-delà de la possible prostration transitoire, aucun signe de souffrance n’est attendu par ces approches. L’imagerie pulmonaire se fait sous anesthésie complète sans réveil de l’animal. D’expérience, le moindre signe de souffrance de l’animal sous anesthésie sera immédiatement détecté lors de la chirurgie (trouble respiratoire, sursaut musculaire, mobilité moustache) et pendant l'imagerie grâce au suivi continu de l'acquisition des images extrêmement sensible au moindre mouvement de l’animal (témoin de la moindre sensation de douleur). Au moindre cas, une adaptation du dosage en anesthésie sera réalisée en première intention, et sans amélioration dans les 5 minutes, une mise à mort anticipée sera pratiquée. Ainsi pour toutes ces procédures tous les gestes invasifs sont pratiqués sous anesthésie.

Devenir

La totalité des animaux seront mis à mort à la fin des procédures. L'ensemble de l'étude repose sur le prélèvement d'organe ne permettant pas le maintien en vie des animaux ou des approches d'imagerie trop invasives pour permettre un rétablissement sans souffrance de l'animal.

Remplacement

La question de l'impact des expositions aux polluants atmosphériques sur les risques de développer des pathologies pulmonaires a plus long terme rend les modèles animaux incontournables. La réponse in vivo du système immunitaire est au coeur de nos questions. Néanmoins nous utilisons des approches in vitro d'exposition aux polluants sur lignées de cellule qui permettent de cibler les facteurs polluants les plus importants et ainsi réduire les combinaisons à tester in vivo. La modélisation des atmosphères polluants repose aussi sur des analyses épidémiologiques. Nous développons aussi des approches par organoïdes pour ces questions.

Réduction

Le modèle animal généré nous permet d’utiliser les mêmes animaux pour plusieurs approches analytiques. Le regroupement dans le même animal de plusieurs transgènes est un outil majeur pour identifier les différentes populations de cellules en même temps et ainsi réduire le nombre d’animaux. Nous limiterons ainsi le projet aux seules expériences indispensables, tout en tenant compte des contraintes liées à l'utilisation de l'enceinte d'exposition. En effet, un seul type d'atmosphère ne peut être généré en même temps, ce qui implique la répétition des groupes "Air non pollué-référence" pour chaque lot expérimental. Au-delà de l’analyse des poumons nous étendrons notre analyse sur plusieurs autres organes pour anticiper les questions futures. Nous basons notre échantillonnage par groupe sur la variabilité possible des réponses et les besoins rigoureux de reproductibilité afin d’atteindre les différences statistiques minimales. En études longitudinales les tests statitistiques seront réalisés pour comparer dans le temps et entre les groupes et pour des comparaisons deux à deux. Enfin mâles et femelles sont utilisés indépendamment. Bien que l'uniformisation du sexe puisse améliorer l'homogénéité des lots, l'utilisation des deux sexes permet de réduire la génération d'animaux qui ne seraient jamais utilisés et en particulier dans le cas des expositions in utero. Le projet prévoit le recours à un nombre d'animaux aussi limité que possible : 1464 souris au total seront réalisées sur 5 ans

Raffinement

Les animaux sont hébergés avec température et hygrométrie contrôlée, cycle jour/nuit 12/12, avec au maximum 5 animaux par cages. Chaque cage contient plusieurs types d'enrichissements : du papier kraft, des carrés de coton et une maison en cellulose pour le confort des animaux leur permettant d’exprimer leurs besoins naturels de nidification. La surveillance quotidienne du bien-être animal est prise en charge par un personnel dédié au soin et à l’expérimentation. L’exposition aux polluants est une procédure légère sans aucun geste technique réalisé, au-delà du stress possible causé par les changements transitoires des conditions d’hébergement Néanmoins la surveillance des animaux dans ces différents contextes est maintenue et tout animal blessé ou montrant des situations d'inconfort sera mis à mort si aucun traitement n’est envisageable. Pour l’imagerie intravitale, les animaux bénéficient d'une anesthésie gazeuse et sont mis à mort avant le réveil ne nécessitant pas de soin post opératoire. Dans tous les cas la mise à mort se fera faite sous anésthésie.

Choix des espèces

La physiologie pulmonaire de la souris est suffissement proche de celle de l'homme et nous disposons de modèles transgéniques uniques pour cette étude. Les modèles d'exposition aux polluants sont validés pour ce modèle avec des données utiles déjà générées. L'exposition adulte aux polluants sera en partie réalisée sur des souris de 3 à 6 mois d’âge L'exposition in utero sera faite sur souris gestante L'exposition juvénile sera faite sur souris allaitantes et souriceaux entre 0 et 7 jours- Dans certains cas, les souriceaux seront utilisés à J14, J21 et J60 pour étudier les différents stades du développement pulmonaire. Dans d'autres cas, les souriceaux seront exposés à partir de 3 mois d’âge aux fumées de cigarette pendant 3 mois et mis à mort à 6 mois pour étudier les prémisses de la BPCO.