Système immunitaire

Une biopsie de la queue, quatre prélèvements sanguins et jusqu'à sept injections par animal, puis un diabète déclenché par une molécule synthétique : 3 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les manipulations commencent dès l'âge de dix jours, et les animaux qui présentent déjà des signes de la maladie sont mis à mort. L'objectif déclaré est une thérapie cellulaire, des cellules injectées venant compenser un défaut immunitaire. La maladie n'est nommée nulle part dans la description, réduite à "la maladie métabolique d'intérêt", pas davantage que les cellules thérapeutiques ou la molécule qui déclenche l'hyperglycémie.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer une thérapie cellulaire contre contre le diabète, une maladie métabolique pour laquelle il n’existe actuellement pas de traitement permettant une guérison des patients. Le développement d’une thérapie pour cette maladie est important car elle est de plus en plus fréquente, en particulier chez les enfants, et affecte très négativement la qualité de vie des individus atteints. Il a été montré que certaines cellules fonctionnaient de manière anormale dans cette maladie. Il est donc possible que l’injection de cellules compensant pour ces défauts puissent guérir cette maladie. Dans ce projet, nous utiliserons un modèle de souris développant cette maladie pour mieux caractériser les mécanismes impliqués dans cette maladie, et pour développer une thérapie cellulaire. Les résultats obtenus doivent permettent de développer une thérapie cellulaire pour cette maladie chez l’humain.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est le développement d'une thérapie cellulaire pour la maladie métabolique d'intérêt.

Procédures

Identification d'un animal : 1 fois ~10 secondes et 1 fois ~5 secondes. Prélèvement sanguin : 4 fois ~15 secondes. Anesthésie (lors de la mise à mort): 1 fois ~15 minutes. Injections de deux types: répétées (7 fois) ~10 secondes/injection ou 1 fois ~45 secondes. Ces interventions se font sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Injection intra-péritonéale = douleur légère, de courte durée et localisée. Injection intra-veineuse = douleur légère, de courte durée et localisée. Contention dans un tube adapté à la taille de la souris pouvant induire un léger stress de manière transitoire. Prélèvement sanguin = douleur légère, de courte durée et localisée. Biopsie caudale = douleur modérée, de courte durée et localisée. Identification = douleur légère, de courte durée et localisée. Nuisance liée au modèle : développement du diabète immuno-dépendant: hyperglycémie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour collecte des tissus d'intérêt.

Remplacement

Pour étudier la physiopathologie du de la maladie métabolique d'intérêt, seuls les modèles souris sont capables de refléter la complexité de la maladie et notamment les interactions entre les cellules circulant dans le sang et l'organe métabolique cible. Une veille bibliographique sera mise en place pour éviter toute répétition d’expérimentation bien menée sur les plans scientifiques et méthodologiques. Les molécules qui seront utilisées pour produire les cellules thérapeutiques ont été soumises à de nombreux tests pour sélectionner les plus prometteuses. Le protocole de production de ces cellules thérapeutiques a été optimisé.

Réduction

Des prélèvements auront lieu pour des analyses histologiques, de biologie cellulaire et moléculaire afin d’extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Des approches sophistiquées d’analyse ont été établies pour réduire le nombre d’animaux à utiliser pour obtenir un maximum d’information. Un nombre minimal et homogène d’animaux par étude est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique. Nos effectifs seront déterminés et nos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Le protocole d'induction de la maladie métabolique été raffiné et permet de ne pas utiliser d'immunisation mais seulement une injection de molécule synthétique afin de réduire la souffrance des souris. Dans ce projet, ce protocole sera raffiné davantage pour minimiser la dose de molécule synthétique à injecter. L’induction simultanée de la maladie chez les animaux permet un suivi plus précis des animaux en cours de procédure et permet une détection précoce pour éviter toute souffrance. Nous avons établi pour chaque procédure des points limites qui permettent d'éviter toute souffrance indésirable des souris. Les animaux sont hébergés par groupe de 5 par cage maximum et ne sont jamais isolés. Des objets sont ajoutés dans leurs cages pour enrichir leur environnement. Ils sont observés tous les jours par le personnel de l'animalerie formé au bien-être animal, et les expérimentateurs.

Choix des espèces

La souris est le plus petit mammifère permettant d’étudier le développement de la maladie métabolique d’intérêt. C’est également l’espèce dont la connaissance génétique approfondie permet les modifications nécessaires à la création d’un modèle présentant des caractéristiques biologiques proches de celles de l’humain. Ce modèle expérimental permet de tester une approche thérapeutique pouvant être rapidement appliquée chez l’Homme. Par ailleurs, la large gamme d’outils disponibles pour analyser précisément les réponses observées fait de la souris l’espèce la plus appropriée pour ces recherches. Les animaux sont utilisés à partir de l’âge de dix jours pour réaliser les gestes d’identification ainsi que les prélèvements nécessaires à certaines analyses. À partir de quatre semaines, un prélèvement sanguin est effectué afin de confirmer les caractéristiques génétiques des individus. Cet âge est choisi pour garantir que les animaux aient une taille suffisante et que ces manipulations puissent être réalisées sans compromettre leur bien-être. Entre sept et quatorze semaines, les souris peuvent recevoir un traitement destiné à induire la maladie étudiée, période correspondant à une phase de maturité adaptée à l’analyse des mécanismes impliqués. Les animaux présentant déjà des signes de la maladie seront mis à mort.

1 530 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une ou deux injections provoquant la présence de bactéries dans le sang, puis cinq prélèvements sanguins étalés sur quatre à dix jours selon la procédure, avant récupération de leurs organes. Le bénéfice annoncé, l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques face à la résistance aux antibiotiques, reste au conditionnel, quand les atteintes décrites sont l'inconfort des injections et des prélèvements répétés et une perte de poids liée aux infections. L'effectif de 1 530 animaux tient en une phrase, justifié par des "calculs statistiques" dont le détail n'est pas donné.

Objectifs

Les maladies infectieuses sont responsables d’un grand nombre de décès dans le monde et représentent la troisième cause de mortalité en France, avec un impact sanitaire et économique majeur. Les bactéries dites « pathogènes » sont à l’origine de la majorité de ces maladies, soit par leur simple présence dans les tissus infectés, soit par la production de molécules qui déclencheront une réponse immunitaire. L’inflammation est un mécanisme naturel qui permet à l’organisme de se défendre contre les infections. Mais lorsqu’elle est mal contrôlée ou excessive, elle peut contribuer à des déficits immunitaires et des cancers. Une bonne connaissance des phénomènes de contrôle de cette inflammation est donc indispensable pour la protection de l’hôte contre les microbes. L’objectif de ce projet est d’identifier les systèmes impliqués dans la défense de l’organsime contre l’infection. Une étude de la littérature, ainsi que des résultats préliminaires obtenus in vitro sur cellules, ont mis en évidence le rôle de certaines protéines dans la réponse immunitaire contre les bactéries. Nous souhaitons donc confirmer le niveau d’implication de ces protéines dans la bactériémie (présence de bactéries dans le sang) induite chez la souris.

Bénéfices attendus

Du fait de l’étendue actuelle et à venir de la résistance aux antibiotiques, le développement de nouveaux médicaments dans le traitement des maladies infectieuses est crucial. Une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeu dans ces échanges entre l’hôte et le pathogène devrait permettre d’identifier de nouvelles cibles pour de nouvelles applications thérapeutiques dans la prise en charge des patients atteints d’infections bactériennes.

Procédures

Les animaux subiront des injections : selon les procédures 1 injection, ou 2 injections espacées de 15 jours. Ils subiront également des prélèvements sanguins à différents temps post injection : 5 prélèvements étalés sur 4 jours ou 5 prélévements étalés sur 10 jours en fonction de la procédure. La durée de chaque intervention n’excède pas une dizaine de secondes. A la fin de l'expérimentation, tous les animaux seront mis à mort.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont : un léger inconfort produit par les injections intra-veineuses et les prélèvements de sang répétés, et une perte de poids possible liée aux infections.

Devenir

Les animaux utilisés dans cette demande seront infectés, et leurs organes récupérés après leur mise à mort. Ils ne pouront donc pas être réutilisés.

Remplacement

Des expériences préliminaires ont été réalisées in vitro afin d’identifier au préalables les acteurs du dialogue entre la bactérie et l’hôte. Ces résultats doivent maintenant être confirmés in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de ce projet est basé sur des calculs statistiques permettant de déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser pour avoir des résultats robustes et fiables.

Raffinement

Après infection et/ou toute intervention, ils seront surveillés quotidiennement par les responsables du projet afin de détecter toute apparition de signes de souffrance durables non reliés à l’infection. Le cas échéant les animaux seraient plus particulièrement surveillés et si les symptômes se prolongeaient au-delà de 24 heures, les animaux concernés seraient mis à mort.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement décrit dans la littérature comme modèle d'étude pertinent de l'infection in vivo. De plus, les systèmes de défense contre les bactéries pathogènes sont très conservés de la drosophile aux mammifères, et en particulier, les réponses cellulaires de l'hôte vis-à-vis du pathogène sont très similaires entre la souris et l'homme. Nous utiliserons des animaux âgés de 6 à 8 semaines.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de cellules tumorales sous anesthésie générale, puis cinq ou neuf injections sous anesthésie locale, la tumeur étant mesurée au pied à coulisse ou suivie par imagerie tous les trois jours. La croissance des tumeurs sous la peau provoque des douleurs locales modérées, et les traitements une perte d'appétit et de poids. Le porteur retient la souris parce que sa génétique est la mieux connue, que l'oncologie en fournit déjà beaucoup de données, et que son équipe a "acquis une pratique expérimentale sur cette espèce".

Objectifs

Les inhibiteurs de la tyrosine kinase ont été approuvés pour le traitement de routine des patients atteints de cancer. Ils agissent de façon autonome uniquement sur la croissance de cellules cancéreuses génétiquement modifiées. Cependant, cette fonction a récemment été remise en question par des découvertes montrant des effets immunostimulateurs directs de ces molécules. Il a été montré que certaines sont dotées de la capacité d'induire la mort cellulaire immunogène dans les cellules cancéreuses, stimulant ainsi les cellules cancéreuses à émettre des signaux qui les rendent détectables par le système immunitaire. De plus, il existe des preuves précliniques solides selon lesquelles ces molécules peuvent être avantageusement combinés avec une chimiothérapie et une immunothérapie standard, pour traiter le cancer du poumon non à petites cellules. Plus globalement, nous disposons donc de preuves solides selon lesquelles certaines ont la capacité d'agir comme inducteurs de la mort cellulaire immunogène sur les cancers, agissant ainsi, aussi, comme des activateurs de la mort cellulaire. Dans un précédent projet, un de ces produits, a été testé seul ou en combinaison avec une chimiothérapie et/ou une immunothérapie standard dans des modèles précliniques immunocompétents ou immunodéficients. Les résultats étant prometteurs, nous souhaitons aller plus loin en déterminant quelles cellules immunitaires sont importantes pour permettre la traduction des présents résultats en applications cliniques.

Bénéfices attendus

Si ce projet confirme nos résultats in vitro et in vivo précédents, ces inhibiteurs de tyrosine kinase permettront de proposer de nouvelles combinaisons de traitements anti-tumoraux beaucoup plus performantes pour les patients.

Procédures

Les animaux recevront une injection sous anesthésie générale (2min) puis cinq injections sous anesthésie locale (vigile,

Impact sur les animaux

Les nuisances découleront des interventions et des greffes de cellules tumorales sous anesthésie générale, des injections de traitements, des suivis de croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse ou d’imagerie tous les trois jours. Ces différentes manipulations peuvent entraîner du stress chez l’animal et les croissances tumorales en sous- cutanées peuvent entraîner des douleurs locales , transitoires et modérées. Une perte d’appétit modérée et donc une perte de poids modérée peut apparaître chez la souris suite aux traitements médicamenteux.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées pour analyse des tumeurs et des cellules immunitaires après traitement, post-mortem.

Remplacement

Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez la souris afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude de l’activation du système immunitaire dans l'organisme entier et son effet sur la croissance tumorale.

Réduction

Une analyse statistique a été effectuée afin de calculer le nombre d'animaux nécessaires. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail. Les résultats seront analysés avec des outils statistiques.

Raffinement

Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (examen clinique quotidien, utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne). Des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tout changement.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par plusieurs raisons. Tout d’abord, la souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. Par ailleurs, il s’agit d’un animal très utilisé en oncologie, de nombreuses données sont déjà accessibles et utilisables ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire. Enfin, la méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux sont utilisés au stade adulte afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé, correspondant à la population de patients.

Dix-huit vaccins croisés avec et sans adjuvant et selon six voies d'administration : 3 612 souris reçoivent deux à trois injections aux semaines 0, 3 et 5, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les injections passent par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, intradermique, intranasale, intramusculaire ou intravaginale, et sept prélèvements sanguins échelonnés complètent le suivi de chaque animal. Toutes les souris sont tuées pour analyser la moelle osseuse, la rate, les ganglions et les muqueuses par lesquelles entrent les pathogènes. L'effectif découle du criblage lui-même, sept souris par groupe multipliées par le nombre de combinaisons, et le porteur affirme que "la réponse immunitaire générée est sans conséquence sur l'animal".

Objectifs

Les objectifs du projet sont de tester la capacité de vaccins à activer des réponses immunitaires dans les infections comme l’infection à SARS-CoV-2 (nouveaux variants), à Nipah virus (un virus léthal qui émerge contre lequel il n'existe pas de vaccin), HBV (le virus de l'hépatite B contre lequel il n'existe pas de vaccin), Chlamydiae trachomatis (CT, une bactérie sexuellement transmissible contre laquelle il n'existe pas de vaccin), Bordetella pertussis (responsable de la coqueluche dont les cas sont en nette augmentation du fait d'une diminution de la protection induite par le vaccin acellulaire) ou encore Tuberculosis mycobacterium (afin de traiter les formes latentes de la tuberculose) et d’identifier pour chaque vaccin la meilleure voie d’administration et le meilleur adjuvant afin d’obtenir des réponses immunitaires optimales et adaptées à chaque pathogène. Les vaccins que nous évaluons dans ce projet ont démontré leur innocuité dans une précédente étude. Ce qui change ici ce sont les antigènes (petits morceaux de microbes qui ne donnent pas la maladie) véhiculés par ces vaccins. Nous devons nous assurer que ces antigènes sont bien capables d'activer des réponses immunitaires dans un organisme vivant. Cette évaluation préclinique est primordiale avant de pouvoir tester ces vaccins chez l'homme dans des essais cliniques. Certains de nos vaccins sont des anticorps associés à des petits fragments de microbes. Ces anticorps reconnaissent des protéines humaines à la surface des cellules clefs pour activer le système immunitaire. Pour tester ces vaccins, nous devons utiliser des souris génétiquement modifiées qui expriment ces protéines humaines. Le projet vise également à déterminer la persistance de la réponse immunitaire induite par les vaccins après avoir choisi les plus efficaces et l’adjuvant le plus efficace pour chaque vaccin.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont le développement de nouveaux vaccins dans des maladies infectieuses avec un impact sur la santé humaine.

Procédures

Les interventions effectuées seront des injections de vaccins (durée: 30 secondes) par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, intradermique, intranasale, intramusculaire ou intravaginale selon les procédures ( à semaine 0, 3 et 5) et un prélèvement périodique de sang (durée 30 secondes) pratiqué sur les souris (Semaine (S)-1, S0+1 jour, S2, S3+1jour, S4, S5+1 jour, et le jour de la mise à mort) après la vaccination.

Impact sur les animaux

Les animaux recevront 2 à 3 injections de vaccin et seront soumis à des prélèvements sanguins réguliers. La réponse immunitaire générée est sans conséquence sur l’animal tout le long de la cinétique expérimentale. Les effets indésirables pourraient être une infection après l'utilisation d'aiguilles au moment de l'injection des vaccins ou des prélèvements de sang. Les aiguilles sont changées entre chaque animal pour limiter cet effet indésirable.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin d'évaluer les réponses immunitaires induites par les vaccins dans les organes lymphoïdes primaires (moelle osseuse) et secondaires (rate et ganglions lymphatiques) et dans les tissus périphériques portent d'entrée des pathogènes.

Remplacement

Les vaccins utilisés dans ce projet ont déjà été évalués dans un précédent projet. Ce qui change ici se sont les antigènes (petits fragments de microbes qui ne provoquent pas la maladie) véhiculés par nos vaccins. Nous devons nous assurer que ces antigènes sont bien capables d'activer des réponses immunitaires dans un organisme vivant. Cette évaluation préclinique est primordiale avant de pouvoir tester ces vaccins chez l'homme dans des essais cliniques. Les nouvelles versions de vaccins que nous allons tester dans ces modèles animaux ont été présélectionnés sur la base de plusieurs tests in vitro sur des cellules en culture. Ainsi seuls les vaccins candidats qui auront donné les meilleurs résultats seront ensuite utilisés chez l’animal. Nous nous proposons ici de tester l’efficacité de ces vaccins pré-sélectionnés dans des modèles de souris (induction de réponses immunitaires systémiques, muqueuses et de longue durée). Les réponses immunitaires sont des processus complexes dont la mise en place est conditionnée par des interactions dynamiques impliquant de nombreux partenaires cellulaires présents dans différents compartiments de l’organismes (site d’entrée du pathogène/antigène, ganglion drainant, site effecteur). A l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de façon satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans l’initiation des réponses immunitaires dans le cadre d’une infection naturelle ou après une vaccination. C’est pourquoi nous avons besoin de travailler avec ces modèles animaux.

Réduction

Dans le cadre de la « Réduction », nous avons calculé le nombre minimal de souris (n=7 par groupe) nécessaires pour que les résultats soient significatifs et selon nos précédents travaux. Il s'agit ici de tester 18 vaccins avec et sans adjuvant et injectés selon différentes voies afin de trouver les meilleures conditions d'utilisation de ces vaccins c'est-à-dire l'adjuvant et la voie d'administration qui induiront les réponses immunitaires optimales. Ce nombre est estimé à 3612 souris et est calculé sur la base d’une formule statistique couramment utilisée dans l'expérimentation animale afin de calculer au plus juste le nombre d'animaux par procédure.

Raffinement

Les souris sont élevées avec soin et respect, en présence d’éléments d’enrichissement (bandelette de coton et neslets pour faire un nid et un tunnel en carton pour se réfugier et jouer) afin de réduire au maximum la souffrance animale, qu’elle soit physique ou psychique. Nous avons ainsi établi une grille de bien-être des animaux qui comprend l'évaluation de 10 signes cliniques et prend en compte des points limites. Les animaux sont toujours manipulés par une personne expérimentée.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler chez la souris car notre projet nécessite d’étudier les réponses immunitaires chez des animaux génétiquement modifiés afin de d'exprimer un gène humain dans un type cellulaire donné. En effet, certains de nos vaccins sont des anticorps associés à des petits fragments de microbes. Ces anticorps reconnaissent des protéines humaines à la surface des cellules clefs pour activer le système immunitaire. Pour tester ces vaccins, nous devons utiliser des animaux génétiquement modifiées qui expriment ces protéines humaines. Ces modifications génétiques sont possibles chez la souris. D’autre part, les modèles murins de vaccination ont déjà été mis au point et sont largement décrits dans la littérature. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (après 8 semaines afin de minimiser l’impact des perturbations endocriniennes observées avant cette tranche d’âges).

Les 88 souris subissent une biopsie de queue pour génotypage, unique procédure décrite, dont le porteur indique qu'elle peut provoquer une légère douleur. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures classées à un niveau de souffrance modéré. Elles portent des mutations identifiées chez des patients atteints de déficits immunitaires, et doivent permettre de décrire l'effet de ces mutations sur le développement du système immunohématologique. Rien n'est dit de ce que ces mutations font subir aux souris elles-mêmes, ni de ce qui justifie le classement en souffrance modérée quand seule une biopsie de queue est mentionnée, le porteur se limitant à affirmer que l'étude ne peut être reproduite hors d'un "organisme vivant entier".

Objectifs

Certaines maladies génétiques associées causent des défauts de réparation de l’ADN qui provoquent des déficits immunitaires. Dans ce cadre, nous avons récemment identifié chez des patients des mutations dans 2 gènes impliqués dans la stabilité du génome. L'objectif du projet est de déterminer précisément l'impact de ces mutations dans des modèles de souris. En particulier en nous focalisant sur le développement du système immunohématologique qui est particulièrement affecté dans ces pathologies. Par ailleurs nous génèreront des fibroblastes embryonnaires de souris afin d'en étudier le phénotype en nous focalisant sur la stabilité du génome.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'apporter de nombreuses informations originales et fondamentales sur les conséquences fonctionnelles de ces mutations et plus largement sur le rôle des facteurs analysés dans la stabilité du génome. Les résultats obtenus devraient permettre d'ouvrir des pistes à des approches thérapeutiques chez les patients porteurs de mutations dans ces gènes.

Procédures

Les animaux seront soumis à des biopsies pour génotypage.

Impact sur les animaux

La réalisation des biopsies de queues nécessaires au génotypage des animaux peut provoquer une légère douleur.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront mis à mort.

Remplacement

L'étude de l'effet des mutations sur le développement du système immunitaire ne peut pas être reproduite dans des systèmes autres que des organismes vivants entiers.

Réduction

Des tests statistiques seront réalisés afin de minimiser le nombre d'animaux produits et analysés.

Raffinement

Des points limites stricts spécifiques au projet on été élaborés. Les animaux seront observés de façon hebdomadaire par le personnel formé et compétent de l’animalerie EOPS selon l'obligation réglementaire en vigueur. Les animaux sont au nombre maximum de 5 par cage. Les cages disposent par ailleurs de matériel d'enrichissement (bouts de coton, tunnels colorés, morceaux de bois). Le maintien des animaux dans une zone exempte de pathogène devrait les préserver d'infections opportunistes.

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle de choix pour mener des études sur le développement du système immunohématopoiëtique, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement de ce système entre les rongeurs et l’humain. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce pour la réalisation de ce projet tels que des anticorps pour les immuno-marquages. Enfin, la souris est un modèle animal dans lequel les techniques de mutagénèse permettent facilement l'introduction des mutations d'intérêt. Lot 1 et 2. Pour les croisements des souris ayant atteint la maturité sexuelle seront utilisées (à partir de 6 semaines) Lot 3. Le phénotype sera analysé dans des animaux adultes (8-10 semaines ), stade dans lequel le système immunitaire est mature.

Tués à l'issue du projet pour prélever leurs organes, sauf s'ils en sont retirés sur avis vétérinaire, 4 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun porte un collier de capture posé sous tranquillisation, une puce de température et une chambre implantée sous la peau, apprend à rester en chaise de contention pendant au moins trois semaines, puis traverse six à neuf études de 72 heures ponctuées de huit prélèvements sanguins le premier jour. L'objet est de mesurer combien de temps des vecteurs censés faire franchir la barrière hémato-encéphalique à un médicament survivent dans le sang, avant d'en retenir un pour y coupler un oligonucléotide. Le porteur décrit cette étape comme "incontournable" dans le développement préclinique, et indique qu'elle vise à proposer la technologie à l'industrie pharmaceutique.

Objectifs

Ces dix dernières années, notre société et ses partenaires académiques ont réussi à identifier et à développer des petites entités, dénommées vecteurs, pour faire pénétrer dans le cerveau des médicaments dont l’accès est proscrit par la présence d’une barrière biologique appelée Barrière Hémato-Encéphalique (BHE). Cette barrière est constituée par une paroi extrêmement étanche des vaisseaux sanguins du cerveau. Cette barrière laisse passer uniquement les composés du sang nécessaires au fonctionnement cérébral et le protège des agressions extérieures mais, ce faisant, en empêche l’accès à certains médicaments. Il existe un système de transport naturel de molécules au niveau des vaisseaux sanguins et nos vecteurs sont capables de s’y attacher pour être amenés vers le cerveau. Couplés à des médicaments ces vecteurs leurrent se système de transport comme un cheval de Troie. Cette thématique de recherche a donc un potentiel révolutionnaire pour le traitement des pathologies du cerveau comme Parkinson et Alzheimer. Nous venons d’optimiser une série de nouveaux vecteurs et dans ce projet nous souhaitons dans un premier temps étudier leur durée de vie dans le sang pour sélectionner celui qui aura le potentiel à amener le plus efficacement un médicament dans le cerveau. Le succès de ces travaux et les dernières études chez le primate non-humain ont démontré l’innocuité de nos composés et tout le potentiel de notre technologie sur le développement de nouveaux traitements. C’est dans ce contexte que nous souhaitons relever de nouveaux défis et optimiser notre technologie pour améliorer ou prolonger l’effet de cette stratégie chez le macaque. Nous comptons tout d’abord étudier la durée de vie dans le sang de 6 à 9 candidats vecteurs seul (sans impact pour les animaux) pour sélectionner le meilleur puis le coupler à une molécule thérapeutique pour évaluer son efficacité pharmacologique. Ce projet est une étape essentielle vers le développement d’un futur médicament et c’est pour cela qu’il s’effectue chez le primate non-humain.

Bénéfices attendus

Grâce à ces études nous pourrons envisager de meilleurs effets thérapeutiques dans le traitement de nombreuses pathologies du cerveau (neurodégénératives notamment) et d’optimiser ces traitements pour des maladies rares ou pour la médecine personnalisée. La molécule thérapeutique utilisée ici appartient à la classe des acides nucléiques ou oligonucléotides thérapeutiques. Dans notre cas c’est une molécule qui va permettre l’inhibition de la synthèse d’une protéine par les cellules du cerveau responsable dans notre cas du syndrome Lesch-Nyhan mais cette technologie peut-être couplé à n’importe quel oligonucléotide permettant de corriger à la baisse ou à la hausse n’importe quel type de protéines et donc de pathologies.

Procédures

Les 4 animaux seront dotés d'un collier de capture sous tranquillisation chimique. Durée pose inférieure à 1 minute. Ils seront ensuite habitués à être manipulés en chaise (au minimum 3 semaines). S'en suivra l’implantation d'une puce pour mesurer leur température corporelle et de port-à-cath (chambre d'administration et de prélèvement sanguin sous la peau) sous anesthésie générale (1h d’anesthésie générale par individu). Une série de 6-9 études débutera ensuite en vigile pour évaluer la durée de vie dans le sang des différents vecteurs (durée de chaque étude 72h) suivie d’une pause de 15 jours post administration. Au cours de ces études un vecteur sera administré (1 min) et des prélèvements sanguins auront lieu le 1er (8 prélèvements de 5 min chacun), le 2eme (1 prélèvement de 5 min) et le quatrième jour (1 prélèvement de 5 min) suivit d’une période de “rinçage” (élimination naturelle) par l’organisme pendant 10 jours. Enfin un entretien des chambres sera réalisé dans la 2eme semaine post administration (20 min par dispositifs). Après cette série d’étude, nous sélectionnerons le meilleur vecteur pour y coupler la molécule thérapeutique. Ce composé sera alors administré (1 min) aux animaux et le même nombre de prélèvements sanguins et d’entretien des dispositifs implantables seront effectués (actes de mêmes durées qu’explicité ci-dessus). Mais ici après les 2 semaines post-administration, les animaux seront mis à mort sous anesthésie générale (induction anesthésie 15 min et administration euthanasiant : 5 min pour confirmer l’arrêt cardiaque) pour procéder à la récupération des tissus et ainsi évaluer l'efficacité thérapeutique.

Impact sur les animaux

Acclimatation et entraînement à la contention : source de stress générée par le changement d’environnement qui sera réduit au fur et à mesure par l’habituation aux expérimentateurs et par l’apport de récompenses. La pose de colliers, d’une puce de monitoring de la température et l’implantation des ports à cath se fera sous anesthésie générale. Un stress sera notable à l’induction de l’anesthésie, de même que lors du réveil en phase post-opératoire et accompagné d’antalgiques pour réduire la souffrance. L’entretien des port-à-cath : les interventions se feront en vigiles, sans douleur ni stress notables. Le seul geste invasif sera la piqûre de l’aiguille à travers la peau qui sera accompagnée par une analgésie de la peau si nécessaire. La procédure de nettoyage de la peau peut engendrer irritation. Malgré les procédures d’entretien, le dispositif peut se boucher. A cette occasion une et une seule réimplantation par dispositif sera envisagée Suivi de la durée de vie dans le sang : les prélèvements et administration sont réalisés avec une seule insertion de l’aiguille dans les dispositifs par jour. Aucun effet délétère n’est attendu à l’issue des administrations, de même qu’aucune toxicité d’origine pharmacologique (données de toxicité antérieures). L’administration des composés peut engendrer une légère augmentation de température et une modification très transitoire d’un type cellulaire sanguin, les réticulocytes. Selon nos données antérieures chez cette espèce cela reste sans impact sur les animaux. Etude terminale d’efficacité : Ici pas de nouvelles sources de stress, ni d’effets indésirables supplémentaire étant donné que la molécule thérapeutique supplémentaire a déjà été testée avec succès chez cette espèce lors d’une précédente étude.

Devenir

Si le projet arrive à son terme, les 4 animaux seront mis à mort pour prélèvement des organes/tissus d’intérêt. Si les animaux sont sortis du projet sur avis vétérinaire (en relation avec les points limites), ils seront soit Réutilisés ou Replacés par la structure d'accueil (si l'avis vétérinaire y est favorable), soit Adoptés (en cas d'avis vétérinaire contredisant une Réutilisation/Replacement).

Remplacement

L’évaluation de l’efficacité et de la sécurité des produits de santé destinés à l’humain doit être réalisée chez une espèce « rongeur » et une espèce « non rongeur » avant de faire une demande d’investigation chez l’humain en clinique. La capacité de nos vecteurs conjugués à amener un médicament dans le cerveau a déjà été démontrée sur différents modèles cellulaires in vitro puis confirmée in vivo chez le rongeur ainsi que chez le rongeur humanisé pour le récepteur ciblé. Afin de pouvoir proposer à l'industrie pharmaceutique cette technologie, nous devons maintenant établir la preuve de son efficacité et innocuité chez une large espèce non rongeur proche de l’humain, le macaque. Ce projet s’inscrit donc dans une étape incontournable de développement préclinique.

Réduction

La conception de ce projet a non seulement visé à réduire au maximum le nombre d’animaux inclus (4) tout en optimisant le nombre d’études et de prélèvements pour réduire au maximum le stress occasionné, mais aussi pour limiter les interventions à des manipulations transitoires, peu invasives. L’expérience acquise chez la souris permet de réduire le nombre de primate dans chaque groupe à n=3 pour les études de durée de vie dans le sang (nombre défini en amont par nos modélisateurs), puis à n=4 (3+1) pour l’étude d’efficacité en point final. Sur cette dernière étude, nous resterons sur un groupe extrêmement restreint de 4 animaux (n=2 : composé testé et n=2 : groupe contrôle). D’après nos données internes sur cette espèce c’est le plus petit n permettant d’obtenir des résultats interprétables. Fort de cette expérience et de la reproductibilité de nos résultats nous avons donc décidé de passer à un n=2 par groupe.

Raffinement

- Hébergement : Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales pendant toute la durée du projet. Pendant toute cette période, les animaux seront logés dans des enclos avec d’autres congénères. Une grande volière ensoleillée munie de perchoirs sera également en accès libre hors périodes de manipulation. - Alimentation : un régime alimentaire spécifique adapté pour primates sera délivré sans restriction. – Enfin, au cours de toutes les étapes du projet, des récompenses ainsi que des enrichissements (jouets, dispositifs de recherche de nourriture et enrichissements audio-visuels) seront délivrés de façon quotidienne aux animaux. - Enfin, une attention toute particulière portera sur l’anesthésie et l’analgésie avec des méthodes extrêmement conservatives en tout point similaires à l’homme et en relation avec le respect strict des points limites énoncés.

Choix des espèces

Ce projet s’inscrit dans une démarche de fin de développement chez le modèle animal avant une transposition à l'humain, un modèle de large espèce est donc requis. Le modèle Primate Non-Humain est préconisé par rapport à d’autres modèles, comme le chien/cochon. En effet les paramètres d'appariement de nos vecteurs au récepteur présent au niveau des vaisseaux sanguins cérébraux est optimal chez cette espèce. Cette "affinité" est de plus similaire à celle de l'humain pour une meilleure transposabilité (ce qui n'est pas le cas pour d'autres comme le ouistiti). Les animaux utilisés dans cette étude seront tous de jeunes adultes, >2 ans et d’environ 6-7kg. L’utilisation de jeunes adultes s’explique par le compromis entre le poids de l’animal, la quantité de molécule à administrer, ainsi que par le volume total sanguin permettant de réaliser les prélèvements sanguins sans impact pour l'animal.

Une irradiation de huit minutes détruit la moelle osseuse des souris receveuses, qui reçoivent ensuite par injection derrière l'œil la moelle prélevée sur des souris donneuses. 490 souris au total vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objectif déclaré est de vérifier si deux lignées modifiées pour produire des molécules anti-inflammatoires vieillissent mieux, et si cette résistance se transmet par greffe de moelle. Le porteur écrit que les animaux, anesthésiés pendant l'opération, ne ressentent donc aucune douleur, tout en indiquant que leur système immunitaire restera affaibli une quinzaine de jours et qu'elles pourraient présenter des blessures légères ou une irritation de la peau.

Objectifs

Ce projet cherche à comprendre comment on peut vieillir en meilleure santé en réduisant une inflammation qui s'installe avec l'âge. Quand on vieillit, notre corps reste souvent dans un état d'inflammation légère et continue, un peu comme une petite blessurequi ne guérit jamais vraiment. On appelle ça l'inflammaging. Pour étudier cela, nous avons créé deux types de souris spéciales : - Les premières produisent une substance anti-inflammatoire à la place d’une autre qui provoque l’inflammation. - Les deuxièmes produisent non seulement cette même substance apaisante, mais aussi une autre qui aide à réparer les tissus du corps. En résumé, ces souris sont conçues pour calmer naturellement l’inflammation au lieu de l’entretenir. Nous pensons que ces souris vieilliront plus lentement et en meilleure santé, car leur corps devrait mieux se défendre contre les effets négatifs de l’âge. Pour le vérifier, nous allons les observer tout au long de leur vie — de leur jeunesse à leur vieillesse — et analyser régulièrement leur sang pour voir comment leur organisme réagit. Enfin, nous ferons aussi des transferts de moelle osseuse (la partie du corps qui fabrique les cellules du sang et du système immunitaire) vers des souris normales, pour voir si cette modification peut aussi rendre d’autres souris plus résistantes au vieillissement.

Bénéfices attendus

Ce projet cherche à comprendre pourquoi notre corps s’enflamme doucement en vieillissant, et surtout comment calmer cette inflammation. Avec l’âge, une inflammation permanente s’installe dans notre organisme. Elle ne fait pas mal, mais elle use nos cellules petit à petit. On sait aujourd’hui qu’elle est impliquée dans près de 80 % des maladies liées au vieillissement : comme l’arthrose, le diabète, l’ostéoporose ou encore les maladies du cerveau comme Alzheimer. Elle joue aussi un rôle important dans le vieillissement de la peau. Notre idée est de transformer les cellules « malades », qui fabriquent des substances inflammatoires, en cellules « réparatrices », qui produisent au contraire des molécules apaisantes et protectrices. En d’autres mots, nous voulons rééduquer le système immunitaire pour qu’il aide le corps à se soigner au lieu de l’abîmer. En d’autres termes, notre stratégie est novatrice et ce projet constituera la preuve de concept de sa faisabilité et de son intérêt. A court terme, cette étude permettra de valider notre hypothèse de travail sur le modèle murin. A plus long terme, elle a vocation à être applicable chez l’homme.

Procédures

Les souris receveuses subiront, sous anesthésie chimique, une irradiation quasi-totale pendant 8 minutes afin d'éliminer leur moelle osseuse. Ensuite, elles recevront une injection de moelle osseuse provenant des souris donneuses. Cette injection, d’une durée d’environ 1 minute, sera effectuée par voie oculaire, c'est-à-dire via une injection dans la zone située derrière l'œil, ce qui permet un accès rapide au système sanguin. Enfin, toutes les souris subiront un prélèvement sanguin de courte durée (environ 1 minute par souris) selon les procédures standard de l'animalerie.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, certains gestes nécessaires peuvent provoquer un peu de stress ou d’inconfort chez les animaux. Les prises de sang, par exemple, sont rapides mais peuvent provoquer un léger stress chez les souris. Lors des expériences de greffe de moelle osseuse, les souris sont d’abord soumises à une irradiation pour supprimer temporairement leurs cellules sanguines et elles reçoivent, ensuite, une injection intraveineuse, afin d’introduire la nouvelle moelle osseuse. Pendant toute cette procédure, les animaux sont endormis (anesthésiés) : ils ne ressentent donc aucune douleur. L’anesthésie peut provoquer un léger stress passager au réveil. Après l’irradiation, leur système immunitaire sera affaibli pendant environ 15 jours, les rendant plus vulnérables aux infections. Elles pourraient également présenter des blessures légères ou une irritation de la peau.

Devenir

Les animaux de nos groupes d’étude seront eutanasiés pour prélèvement post-mortem de multiples organes.

Remplacement

Ce projet vise à déterminer si les mutations portées par nos souris leur confèrent une protection contre l’inflammation qui apparaît avec l’âge. Cette inflammation est très complexe, car elle touche tout le corps : plusieurs organes, des hormones et des cellules du système immunitaire qui agissent ensemble, etc… qui ne peuvent pas être mimées avec des méthodes alternatives dans l’état actuel des connaissances.

Réduction

Afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés et de garantir des résultats exploitables, le nombre d'animaux nécessaires pour l'étude a été calculé à l’aide d’un logiciel statistique. Des tests statistiques appropriés seront utilisés pour les analyses des données.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes dans des environnements enrichis pour qu'elles puissent vivre dans des conditions favorisant leur comportement naturel et les interactions sociales. Les cages peuvent contenir jusqu'à 5 souris adultes. Chaque cage sera enrichie avec du matériel pour la nidification. Les conditions dans les animaleries, telles que la température, l'humidité et l’éclairage, sont soigneusement contrôlées. De plus, notre animalerie est exempte d'agents pathogènes spécifiques pour minimiser les infections et le stress. Après certaines procédures comme l’irradiation, les animaux recevront des antibiotiques dans leur eau de boisson pour éviter les infections pendant la période où leur système immunitaire est affaibli. Si une souris perd du poids, elle recevra de la nourriture spéciale en gelée, puis, si nécessaire, des soins supplémentaires (comme des injections de réhydratation). En cas de blessures légères, elles seront désinfectées quotidiennement jusqu’à guérison. Les signes de douleur ou d’inconfort (par exemple poils ébouriffés ou attitude apathique) entraîneront une surveillance renforcée et l’administration d’un antidouleur. Toutes ces mesures visent à assurer le bien-être des animaux tout au long de l’étude, en limitant au maximum la douleur, le stress et la souffrance.

Choix des espèces

L’espèce murine a permis de développer de nombreux modèles génétiquement modifiés, et son utilisation dans ce projet est cruciale pour répondre aux questions scientifiques posées. Cette étude porte sur des souris utilisées à partir de 3 mois, car elles sont alors jeunes adultes, avec un organisme stable et comparable entre individus. Cela permet de suivre les animaux sur une longue période pour étudier l’évolution de l’inflammation chronique et du vieillissement, tout en évitant les variations liées à la croissance observées chez des animaux plus jeunes.

Les souris utilisées ici sont dépourvues de globules blancs, condition posée pour que des cellules immunitaires humaines s'implantent dans leur organisme. 4 038 d'entre elles, nouveau-nées ou adultes, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, un gavage quotidien pendant trois semaines, deux séances d'imagerie par semaine sous anesthésie et des prélèvements sanguins derrière l'œil, la tumeur étant mesurée au pied à coulisse trois fois par semaine. Toutes sont tuées en fin d'expérience pour que leurs organes soient prélevés, le porteur jugeant le recours à la souris "indispensable" faute de méthode de laboratoire donnant des cellules immunitaires pleinement fonctionnelles.

Objectifs

Les cellules utilisées dans ce projet sont des globules blancs humains, modifiés en laboratoire afin de leur permettre de reconnaître et d’éliminer les cellules cancéreuses. Bien que cette approche ait déjà montré des résultats encourageants, certaines limites peuvent apparaître, comme la réapparition de la maladie ou une diminution des défenses immunitaires, ce qui peut rendre les patients plus vulnérables aux infections. Le présent projet vise à évaluer une nouvelle stratégie utilisant des cellules capables de persister plus longtemps dans l’organisme, dans le but de renforcer durablement les défenses immunitaires et d’améliorer la protection du patient sur le long terme.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider une nouvelle approche de thérapie cellulaire fondée sur l’utilisation de cellules immatures, en tant que stratégie innovante pour le traitement du cancer. Les données générées permettront de consolider les bases scientifiques nécessaires au développement d’une plateforme de thérapie cellulaire/génique en vue d’une application clinique. Cette approche présente un fort potentiel translationnel, en offrant des réponses antitumorales durables et efficaces, tout en contournant certaines limites majeures des thérapies actuelles.

Procédures

Durant cette étude, nous procéderons à : 1. Injection sous anesthésie générale ou animaux vigiles en contention (1x ; durée < 1 minute/animal). 2. Gavage, 1x par jour pendant 3 semaines, durée < 1 minute/ animal. 3. Un prélèvement sanguin au niveau du sinus orbital sous anesthésie générale, durée < 1 minute/ animal. 4. Une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie générale (15 sec/souris). 5. Mesure de la croissance tumorale par imagerie sous anesthésie générale 2x par semaine durant 21 jours maximum (5 minutes par souris). 6. Mesure de la croissance tumorale à l’aide d’un pied à coulisse trois fois par semaine (30 sec/souris) jusqu’à la fin de l’expérimentation. 7. Un prélèvement sanguin avant la mise à mort en phase terminal au niveau du sinus orbital sous anesthésie générale, durée < 1 minute/ animal.

Impact sur les animaux

Les souris seront hébergées en groupe dans des cages ventilées et manipulées par du personnel formé, afin de limiter les risques d’infection liés à leur système immunitaire fragile. L’injection de cellules tumorales ou de traitements peut entraîner certains effets comme une perte de poids ou une anémie. Les différentes techniques d’injection ou le gavage peuvent provoquer une gêne passagère ; en cas de complication, l’animal sera immédiatement mis à mort pour éviter toute souffrance. La croissance de la tumeur peut aussi générer un inconfort, et les examens nécessaires (imagerie, mesures) peuvent induire un stress ponctuel. L’anesthésie peut entraîner une diminution de la température corporelle. Le prélèvement sanguin peut provoquer un inconfort passager ainsi qu’un stress temporaire. Le bien-être des animaux sera suivi de près tout au long de l’étude, notamment par le contrôle régulier du poids et de l’évolution tumorale.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin d'expérience pour le prélèvement et l’analyse des organes nous permettant de conclure sur l'efficacité du traitement.

Remplacement

À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode en laboratoire permettant d’obtenir des cellules immunitaires pleinement fonctionnelles sans passer par l’animal. Les systèmes de culture disponibles permettent seulement une maturation partielle, insuffisante pour reproduire les conditions naturelles. L’utilisation de la souris reste donc indispensable, car elle seule permet aux cellules humaines de se développer complètement dans un environnement physiologique. Les expériences proposées interviennent après un long travail de mise au point en laboratoire et visent à confirmer, chez l’animal, le potentiel thérapeutique des cellules avant toute application chez l’homme.

Réduction

L’utilisation des souris immunodéficients a été retenue car elle est particulièrement efficace pour recevoir des cellules humaines, avec un taux d’échec très faible. Ce modèle permet donc d’obtenir des résultats fiables. Ce projet vise à évaluer l’effet d’un produit de thérapie cellulaire dans un modèle tumoral. Ces cellules, issues du système immunitaire (les globules blanc) et génétiquement modifiées, apprennent à identifier les cellules cancéreuses et peuvent ensuite se transformer en un système de défense plus stable et durable. Le déroulement expérimental suivra une approche séquentielle : la poursuite de chaque étape dépendra de la lisibilité et de la pertinence des résultats obtenus à l’étape précédente. Cette démarche progressive, associée au regroupement des tests quand cela est possible, permet de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la solidité scientifique des résultats.

Raffinement

Les souris immunodéficients seront élevées dans des conditions d’hygiène strictes afin de protéger leur santé fragile liée à leur système immunitaire déficient. Elles seront hébergées par groupes de cinq dans des cages ventilées, avec un accès libre à la nourriture et à l’eau. Chaque cage sera enrichie avec un tunnel rouge pour réduire le stress, du matériel de nidification et un bâtonnet en bois pour répondre à leurs besoins naturels. Aucune souffrance particulière n’est attendue à la suite des greffes. Un suivi attentif et des observations régulières seront assurés tout au long de l’étude. Si des signes de douleur ou d’inconfort apparaissent, des mesures adaptées seront prises dans le respect des points limites définis pour chaque procédure. En cas de souffrance avérée et selon la définition des points limites, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris a été choisie comme modèle expérimental en raison de la connaissance approfondie de sa biologie, de sa génétique et de son comportement, ce qui facilite son élevage et le suivi de son état de santé et de bien-être. La lignée utilisée n’a pas de globules blancs, ce qui permet aux cellules humaines de s’implanter facilement. Cela aide à étudier certaines maladies et à tester de nouvelles approches thérapeutiques. Dans ce projet, deux stades d’âge seront utilisés, des souriceaux nouveau-nés et des souris adultes âgées de 6 à 12 semaines.