Système immunitaire

Traitées par voie orale à trois reprises, piquées jusqu'à quatre fois et contenues à chaque mesure de leur tumeur, jusqu'à dix fois, 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort à l'issue. La douleur attendue tient à la présence de la tumeur, les autres gestes étant décrits comme légers et rapides. Le projet cherche à comprendre pourquoi une cible identifiée au laboratoire améliore la réponse à une immunothérapie, et à savoir si le résultat vaut pour d'autres cancers. Sur les 720 souris, le porteur écrit seulement que les effectifs "sont déterminés et les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés", sans donner un chiffre par groupe ni la méthode qui y conduit.

Objectifs

Les traitements contre le cancer de type "immunoth?rapie" s'appuient sur la manipulation du syst?me immunitaire du patient pour combattre la tumeur. Cependant, ce type de traitement n'est pas efficace contre tous les cancers ou une partie seulement des patients r?pondent au traitement. Dans notre laboratoire, nous avons identifi? une cible th?rapeutique potentielle qui permet d'obtenir des r?ponses plus efficaces ? une immunoth?rapie anti-tumorale dans un mod?le pr?-clinique chez la souris. Les objectifs de ce projet sont 1- d'?lucider les m?canismes mol?culaires mis en jeu, 2- d'?valuer si nos r?sultats peuvent ?tre g?n?ralis?s ? d'autres types de cancer. Pour atteindre ces objectifs, il est n?cessaire d'utiliser un mod?le animal repr?sentant un organisme entier et autonome.

Bénéfices attendus

Gr?ce ? ce projet, nous pourrons faire avancer de mani?re cons?quente le d?veloppement de nouvelles approches th?rapeutiques afin d'am?liorer l'efficacit? des th?rapies anti-cancer, et nous pourrons r?aliser une preuve de concept qui sera la premi?re ?tape pour permettre l'utilisation de nos d?couvertes pour la clinique.

Procédures

Dans le projet, les animaux vigiles seront soumis ? un traitement par voie orale trois fois (dur?e 10 secondes). Les animaux vigiles seront soumis ?galement ? un maximum de quatre injections (dur?e 3 secondes). Les animaux vigiles seront soumis ?galement ? une contention ? chaque mesure de la tumeur (dur?e 10 secondes), maximum 10 fois.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont : stress li? ? l'administration orale (l?ger et rapide), stress li? ? la pr?hension lors des mesures de tumeur (l?ger et rapide), douleur li?e ? la piqure (l?g?re et rapide). Les autres nuisances attendues sont une douleur mod?r?e li?e ? la pr?sence de la tumeur.

Devenir

Tous les animaux seront mis ? mort.

Remplacement

Il n?existe pas de m?thode alternative pour r?aliser ce travail qui n?cessite l?analyse de tissus entiers en conditions saines ou inflammatoires. De plus, le syst?me immunitaire est un syst?me dynamique dont les acteurs ?voluent entre diff?rentes localisations au sein de l?organisme selon des flux tr?s pr?cis. Ni les mod?lisations math?matiques, ni les syst?mes de culture en laboratoire ne permettent de reproduire cela. Des exp?riences chez l'animal sont donc n?cessaires pour compl?ter les d?couvertes obtenues en culture. De plus, l?utilisation de mod?le animal reste indispensable pour pouvoir aborder la phase d?application de nos d?couvertes en clinique.

Réduction

Les effectifs sont d?termin?s et les r?sultats seront analys?s avec des tests statistiques adapt?s.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les animaux seront pes?s et ?valu?s plusieurs fois par semaine gr?ce ? une grille de score pour ?viter la souffrance des animaux. Des aiguilles et des sondes adapt?es seront utilis?es pour minimiser la douleur.

Choix des espèces

La souris est le mod?le de choix car la physiologie de la souris est proche de celle de l?Homme. D?autre part les m?canismes immunitaires sont bien caract?ris?s chez la souris, ce qui en fait un mod?le particuli?rement adapt? pour ?tudier les cellules immunitaires. Les souris seront utilis?es ? l'?ge adulte (de 8 ? 12 semaines) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les r?sultats ne soient pas affect?s ? cause de modifications dues ? un ?ge trop avanc? des animaux.

Gavées jusqu'à dix-huit fois, opérées une fois sous anesthésie, puis passées trois fois à l'échocardiographie et piquées jusqu'à six fois, 1 344 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La chirurgie provoque une insuffisance cardiaque durable, dont le porteur reconnaît l'inconfort, en plus de la douleur postopératoire et de l'isolement de courte durée après chaque intervention. L'objet est d'observer le rôle des macrophages dans la rigidification du muscle du cœur, sur des souris rendues malades pour cela. Toutes sont mises à mort.

Objectifs

L'insuffisance cardiaque est une maladie qui cause plus de 24 000 d?c?s et plus de 180 000 hospitalisations chaque ann?e en France. Une des causes de cette maladie est la fibrose cardiaque : c'est un ph?nom?ne o? le muscle du c?ur devient progressivement plus rigide, ce qui l'emp?che de bien fonctionner. L'inflammation joue un r?le dans ce processus, mais les cellules inflammatoires et les m?canismes biologiques en cause sont m?connus. L'objectif de ce projet est d'?tudier le r?le de certaines cellules inflammatoires, appel?es macrophages, dans l'apparition de cette fibrose du c?ur. Pour cela, une insuffisance cardiaque avec fibrose sera induite de fa?on contr?l?e chez des souris. Le fonctionnement du c?ur des souris sera ?valu? gr?ce ? une ?chographie cardiaque, et l'?tat de la fibrose sera analys?. Ce projet pourrait permettre de mieux comprendre quels acteurs de l'inflammation favorisent la fibrose cardiaque, et ouvrir la voie ? de nouveaux traitements pour lutter contre l'insuffisance cardiaque.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre une meilleure compr?hension des m?canismes de la fibrose conduisant ? l?insuffisance cardiaque, ce qui constitute une ?tape essentielle pour le d?veloppement de nouvelles approches th?rapeutiques visant ? limiter la fibrose cardiaque et par cons?quent, limiter le d?veloppement de l?insuffisance cardiaque.

Procédures

Gavages (jusqu'? 18 fois, quelques secondes) ; Intervention chirurgicale sous anesth?sie (1 fois, 15 minutes); Echocardiographie sous anesth?sie (3 fois, 15 minutes); Injections (jusqu?? 6 fois, quelques secondes); pr?l?vement sanguin sous anesth?sie (1 fois, quelques secondes)

Impact sur les animaux

Effets ind?sirables li?s ? l?exp?rimentation : inconfort li? ? la pr?hension et contention des animaux, inconfort li? au gavage, potentielle douleur au point d'injection, stress et hypothermie li?s ? l'anesth?sie, stress li? ? l?isolement de courte dur?e dans la phase post-op?ratoire et post-?chocardiographie ; Effets de la chirurgie : douleur postop?ratoire. Inconfort li? au d?veloppement d'une insuffisance cardiaque.

Devenir

Tous les animaux sont mis ? morts

Remplacement

Bien que des ?tudes bio-informatiques et de culture cellulaire soient men?es en parall?le, l?insuffisance cardiaque implique l?interaction complexe de diff?rents types cellulaires et une interaction entre diff?rents organes qui ne peut ?tre ?tudi?e de fa?on compl?te que sur des animaux entiers, rendant le mod?le animal indispensable

Réduction

Le nombre d?animaux n?cessaires ? la r?alisation de ce projet est d?termin? par d?utilisation d'outils statistiques adapt?s. Des tests statistiques appropri?s pour l?analyse des donn?es obtenues ont ?t? pr?d?finis. Des mesures sp?cifiques sont mises en ?uvre pour ?viter les biais exp?rimentaux. L'information qui peut ?tre r?cup?r?e ? partir d'un seul animal est optimis?e.

Raffinement

Lors des exp?riences, la souffrance animale sera r?duite au maximum par l'utilisation de protocoles d?anesth?sie et anti-douleurs adapt?s et l??tablissement de points limites stricts et adapt?s aux exp?riences. Pour la chirurgie et l??chographie, les animaux sont plac?s sur une plaque chauffante ? 37?C d?s l?induction de l?anesth?sie pour maintenir la temp?rature corporelle puis plac?s dans une cage de r?veil chauff?e et enrichie, sous surveillance jusqu?au r?veil complet. Ensuite, les animaux retournent avec leurs cong?n?res, dans une cage d?h?bergement enrichie. La strat?gie anti-douleur sera syst?matiquement poursuivie en post-op?ratoire pendant 48 heures, avec administration d'anti-douleurs. Tout au long des exp?riences, les animaux feront l?objet d?une surveillance continue par les exp?rimentateurs, pour rep?rer l??ventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-?tre et des anti-douleurs pourront ?tre administr?s si n?cessaire.

Choix des espèces

La souris est le mod?le de r?f?rence pour ?tudier les m?canismes cellulaires et mol?culaires de la fibrose cardiaque li?e ? l?insuffisance cardiaque dans un organisme biologique complexe. Le mod?le d?insuffisance cardiaque utilis? dans ce projet repr?sente un mod?le commun?ment utilis? dans ce domaine de recherche, permettant une int?gration et comparaison des r?sultats obtenus ? la litt?rature scientifique existante L?insuffisance cardiaque se manifeste ? l'?ge adulte : des souris ?g?es entre 8 et 16 semaines, chez lesquelles le syst?me cardio-vasculaire est ? maturit?, seront donc utilis?es.

Perte de poids excessive, incapacité fonctionnelle ou douleur persistante non soulagée déclenchent l'arrêt de l'expérience et la mise à mort anticipée. 1 050 rongeurs, 525 souris et 525 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue par prélèvement intracardiaque sous anesthésie profonde. Une lésion du genou leur est infligée sous anesthésie générale, par voie mécanique, par collagénase ou par arthrite infectieuse, puis viennent jusqu'à douze semaines d'administrations répétées, deux sessions d'imagerie toutes les deux semaines et des prélèvements sanguins hebdomadaires. Les traitements testés visent à protéger ou réparer le cartilage, et le porteur revendique une réduction des effectifs par le suivi d'un même rongeur dans le temps, sans donner le chiffre auquel cette réduction se compare.

Objectifs

Les l?sions du cartilage articulaire repr?sentent une probl?matique majeure en m?decine r?g?n?rative et en rhumatologie, en raison de la faible capacit? de r?paration intrins?que de ce tissu. L?alt?ration progressive ou aigu? du cartilage peut conduire ? une perte de fonction articulaire, ? la douleur chronique et, ? terme, ? l?arthrose. ? ce jour, les options th?rapeutiques disponibles restent essentiellement symptomatiques ou palliatives et ne permettent pas de restaurer de mani?re durable l?int?grit? structurelle et fonctionnelle du cartilage. Les traitements actuels soulagent les sympt?mes mais ne r?parent pas le cartilage. Ce projet teste, chez la souris et le rat, de nouveaux traitements dans trois situations : une atteinte du cartilage due ? une blessure, une atteinte due ? une infection de l'articulation ou une usure progressive du cartilage.

Bénéfices attendus

Les l?sions du cartilage articulaire repr?sentent un enjeu majeur de sant? publique en raison de leur fr?quence, de leur ?volution souvent irr?versible et de l?absence de traitements r?ellement r?parateurs. Aujourd'hui, les traitements disponibles ne font que soulager la douleur sans r?parer l'articulation. Ce projet cherche des traitements capables de prot?ger ou r?parer le cartilage. Nous testerons plusieurs m?dicaments, et diff?rentes fa?ons de les pr?parer et de les administrer, pour trouver ceux qui agissent le plus efficacement. Les r?sultats pourraient d?boucher sur de nouveaux traitements pour les maladies articulaires.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux seront soumis ? plusieurs types d?interventions exp?rimentales r?p?t?es et compl?mentaires, r?alis?es sur souris et rats et r?parties sur une dur?e maximale de 12 semaines. Les trois proc?dures reposent sur des interventions intra-articulaires r?alis?es au niveau d?un genou sous anesth?sie g?n?rale. Elles comprennent une unique induction de l?sion au niveau du genou (dur?e totale de 15 minutes maximum). Au cours de l??tude, les animaux recevront des administrations r?p?t?es de compos?s exp?rimentaux via diff?rentes voies. Ces administrations peuvent ?tre quotidiennes ou espac?es selon les sch?mas exp?rimentaux, sur toute la dur?e du suivi (jusqu?? 12 semaines). Une imagerie de fluorescence sera r?alis?e de mani?re r?p?t?e, ? raison de deux sessions toutes les 2 semaines, sous anesth?sie. Ces sessions permettent le suivi de la r?paration tissulaire et de l'?volution du mod?le. Chaque session implique une br?ve anesth?sie g?n?rale. Les animaux feront l?objet de pr?l?vements sanguins hebdomadaires sous anesth?sie respectant les conditions physiologiques et le bien ?tre animal. Ces pr?l?vements sont effectu?s ? intervalles r?guliers sur toute la dur?e exp?rimentale. Enfin, ? l?issue de l??tude, les animaux seront soumis ? un pr?l?vement terminal intracardiaque r?alis? sous anesth?sie profonde, imm?diatement suivi de la mise ? mort conform?ment aux proc?dures r?glementaires. L?ensemble des proc?dures est r?alis? sous anesth?sie et analg?sie appropri?es afin de limiter toute douleur, souffrance ou d?tresse.

Impact sur les animaux

Les proc?dures de ce projet peuvent induire des effets ind?sirables li?s aux mod?les de l?sions articulaires. Les animaux peuvent pr?senter une douleur post-proc?dure l?g?re ? mod?r?e, surtout en phase aigu?. Cette phase aigu? est g?n?ralement limit?e aux premiers jours. Une diminution temporaire de la mobilit? articulaire et de l?activit? spontan?e est attendue, principalement durant les premiers jours, avec une am?lioration progressive au cours de la premi?re semaine. Les animaux peuvent pr?senter un gonflement articulaire, une mobilit? r?duite et une diminution de la prise alimentaire. Une alt?ration de l??tat g?n?ral, incluant perte de poids et baisse d?activit?, peut survenir. Une surveillance rapproch?e permet de d?tecter toute aggravation. Des crit?res d?arr?t pr?d?finis sont appliqu?s afin de pr?venir toute souffrance prolong?e, notamment en cas de perte de poids excessive, d?incapacit? fonctionnelle ou de douleur persistante non soulag?e.

Devenir

L'ensemble des animaux utilis?s seront mis ? mort ? l'issue des proc?dures de ce projet.

Remplacement

La strat?gie de remplacement a ?t? int?gr?e ? la conception du projet, conform?ment au principe des 3Rs. Malgr? une analyse approfondie des alternatives, l?utilisation d?animaux reste n?cessaire en raison de la complexit? des pathologies ?tudi?es et du besoin d??valuer des r?ponses biologiques int?gr?es ? l??chelle de l?articulation, notamment les interactions entre le cartilage et les tissus peri-articulaires ainsi que les ph?nom?nes inflammatoires, immunitaires, le remodelage osseux et la r?paration tissulaire. Les m?thodes alternatives sont utilis?es en amont pour optimiser la s?lection des candidats et r?duire le recours ? l'animal : cultures de chondrocytes et d'explants cartilagineux, mod?les 3D/organo?des articulaires et tests de cytotoxicit? pour le criblage pr?liminaire des mol?cules et des doses ; exploitation des donn?es bibliographiques et in silico pour hi?rarchiser les hypoth?ses. Cependant, ces mod?les pr?sentent des limites importantes : ils ne reproduisent pas la complexit? des interactions entre cartilage, synovie et os sous-chondral, ni les contraintes m?caniques, la vascularisation ou les r?ponses immunitaires et inflammatoires syst?miques. Ils ne permettent pas non plus d??valuer de mani?re fiable la dynamique globale de d?gradation et de r?paration du cartilage. Les objectifs du projet n?cessitent l??tude de strat?gies th?rapeutiques dans des mod?les int?gr?s de l?sion m?canique, d?arthrite infectieuse et de d?gradation enzymatique. Ces situations impliquent des interactions tissulaires et immunitaires complexes ainsi que des r?ponses locales et syst?miques qui ne peuvent ?tre reproduites in vitro.

Réduction

Le nombre d?animaux a ?t? d?termin? par des analyses de puissance bas?es sur la litt?rature et des donn?es internes, en tenant compte de la variabilit? des mod?les. Plusieurs mesures sont mises en ?uvre pour limiter les effectifs. Une phase pilote permet de valider les mod?les et d?affiner les param?tres exp?rimentaux, r?duisant les r?p?titions inutiles. L?imagerie in vivo constitue un levier majeur de r?duction. Des techniques non invasives (fluorescence ciblant le cartilage ou l?inflammation, bioluminescence bact?rienne) permettent un suivi longitudinal des l?sions et des traitements chez un m?me animal. Cette approche r?duit le recours ? des sacrifices interm?diaires et transforme des comparaisons interindividuelles en comparaisons intra-individuelles, augmentant la puissance statistique tout en diminuant les effectifs. D?autres mesures incluent l?exploitation maximale des tissus pr?lev?s pour des analyses multiples. Le partage des ?chantillons permet d?optimiser l?utilisation de chaque animal. En amont, des donn?es issues de mod?les in vitro ou de mod?lisation sont utilis?es pour affiner les hypoth?ses et limiter le nombre de conditions test?es. Les analyses statistiques seront effectu?es sur la dur?e sur chaque animal. L?ensemble de ces mesures permet de r?duire significativement le nombre d?animaux tout en garantissant la robustesse et la reproductibilit? des r?sultats.

Raffinement

Conform?ment ? la r?glementation en vigueur, ce projet est con?u afin de r?duire au maximum la douleur, la souffrance, l?angoisse et toute nuisance durable inflig?es aux animaux, tout en garantissant la validit? scientifique des r?sultats. Les animaux sont h?berg?s dans des conditions r?glementaires. Toutes les proc?dures invasives (chirurgie, injections intra-articulaires) sont r?alis?es sous anesth?sie g?n?rale ? l'isoflurane (4 % induction, 2 % maintien) sur tapis chauffant, avec contr?le de l'absence de r?flexe nociceptif (retrait de la patte au pincement). Un traitement analg?sique est administr? en pre- & post-op?ratoire pour limiter la douleur aigu?, ? l'aide de bupr?norphine 0,05 mg/kg SC administr?e avant l'incision/l'injection intra-articulaire, puis toutes les 8?12 h pendant au moins 48 h, et au-del? selon l'?valuation clinique. Ce protocole s'applique aux trois proc?dures. Des grilles de score standardis?es et points limites pr?coces sont d?finis (?tat g?n?ral, poids corporel (r?f?rence = poids basal initial), mobilit?/boiterie, posture, toilettage, prise alimentaire/hydrique et aspect de l'articulation (rougeur, gonflement, ?coulement, aspect de la plaie), pouvant conduire ? une prise en charge adapt?e ou ? une mise ? mort anticip?e (cf annexe grille de scoring). Les soins post-op?ratoires incluent une surveillance rapproch?e, le maintien au chaud, la r?hydratation si n?cessaire et un suivi jusqu?? r?cup?ration fonctionnelle. L?utilisation de m?thodes non invasives, comme l?imagerie in vivo, permet de limiter les interventions.

Choix des espèces

La souris et le rat constituent les mod?les les plus pertinents pour ce projet en raison de la disponibilit? de mod?les bien caract?ris?s de l?sions cartilagineuses incluant les d?fauts m?caniques, la d?gradation enzymatique par collag?nase et l?arthrite infectieuse. Ces esp?ces pr?sentent une physiologie articulaire et des processus de r?paration du cartilage suffisamment proches des m?canismes humains pour permettre l??tude des pathologies d?g?n?ratives et inflammatoires. Elles offrent ?galement une grande richesse d?outils mol?culaires, immunologiques et g?n?tiques facilitant l?analyse des m?canismes d?action des candidats th?rapeutiques. Le recours au rat, en compl?ment de la souris, est justifi? lorsque la taille de l'articulation est un facteur limitant : la plus grande taille du genou du rat facilite la reproductibilit? de l'induction chirurgicale de la l?sion focale, les injections intra-articulaires pr?cises et le pr?l?vement de volumes sanguins suffisants pour certains dosages. Les animaux utilis?s dans ce projet seront des souris ou des rats adultes, ?g?es de 6 ? 12 semaines au moment de l?induction. Ce stade de d?veloppement correspond ? des animaux immunologiquement matures, physiologiquement stables, et adapt?s ? l??tablissement reproductible des mod?les d?atteinte du cartilage dans cette ?tude.

Une plaie est ouverte dans la peau sous anesthésie, puis une tumeur cutanée est laissée se développer, chez 5 040 souris utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur chiffre les gestes en secondes, cinq secondes de préhension, trois secondes par injection, dix secondes par administration orale, et situe la douleur de la blessure cutanée à quatre heures environ. La douleur liée à la présence de la tumeur figure pourtant dans la même liste, sans durée ni seuil, alors qu'elle court jusqu'à la fin du suivi. Aucune souris ne sera maintenue en vie, toutes étant tuées en fin de suivi ou pour des analyses postmortem.

Objectifs

La m?moire immunologique permet au syst?me immunitaire de r?agir plus efficacement ? des pathog?nes sp?cifiques lors d'une seconde rencontre. Un autre type de m?moire existe dans certaines cellules immunitaires : la ? m?moire inflammatoire ?, qui permet une r?ponse amplifi?e lors d'une exposition ult?rieure ? un pathog?ne diff?rent du pathog?ne initial. On ignore encore si ce type de m?moire se d?veloppe ?galement suite ? une inflammation post-traumatique, par exemple dans le cas d'une blessure. Dans le cadre de ce projet, nous explorerons cette question au niveau cutan?, ? l'aide d'un mod?le de plaie de la peau. Nous nous int?resserons plus particuli?rement ? l'impact potentiel de ce ph?nom?ne sur l'efficacit? de la r?ponse immunitaire contre le d?veloppement ult?rieur d'un cancer de la peau.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche permettra de mieux comprendre l'impact de cette ? m?moire inflammatoire ? sur les cancers de la peau. ? plus long terme, les r?sultats de ce projet devraient ?galement ouvrir de nouvelles perspectives pour am?liorer la pr?vention et le traitement des cancers cutan?s.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie de la peau (une seule fois, sous anesth?sie), avec une douleur mod?r?e (dur?e 15 min). Les animaux sous anesth?sie subiront ?galement une injection (1 fois, 5 secondes, sous anesth?sie). Certains animaux vigiles subiront une administration orale (2 jours cons?cutifs, 10 secondes). Les animaux vigiles seront soumis ?galement ? un maximum de trois injections (dur?e 3 secondes).

Impact sur les animaux

Les effets ind?sirables pr?vus sont : stress de l'anesth?sie (l?g?re et rapide, 15 min maximum), risque d'hypothermie (l?g?re et rapide, 15 min maximum) et douleur li?e ? une blessure cutan?e (mod?r?e et de moyenne dur?e, environ 4 heures), stress li? ? la pr?hension (l?g?re et rapide, 5 secondes) et douleur l?g?re li?e ? la piqure (1 fois, 2 secondes), stress li? ? l'administration orale (l?g?re et rapide, 2 fois 10 secondes) et risque de fausse route, douleur mod?r?e li?e ? la pr?sence de la tumeur.

Devenir

Aucun animal ne sera maintenu en vie. Les animaux seront mis ? mort ? la fin du suivi ou pour des analyses postmortem.

Remplacement

Il n?existe pas de m?thode alternative pour r?aliser ce travail qui n?cessite l?analyse de tissus entiers. La peau est un tissu complexe qui comporte de nombreuses cellules qui interagissent afin de maintenir un ?quilibre. La dynamique du tissu cutan?, des cellules immunitaires qu?il abrite ainsi que les interactions et le recrutement potentiel de cellules d?autres organes sont des conditions qui ne peuvent pas ?tre ad?quatement reproduites in vitro. De plus, le syst?me immunitaire est un syst?me dynamique dont les acteurs ?voluent entre diff?rentes localisations au sein de l?organisme selon des flux tr?s pr?cis. Enfin, certaines populations cellulaires du syst?me immunitaire se sp?cialisent particuli?rement en fonction de leur localisation, en particulier dans la peau. Ni les mod?lisations math?matiques, ni les syst?mes in vitro ne permettent de reproduire cela, ceci nous oblige donc ? utiliser des animaux afin de comprendre les interactions cellulaires r?gulant les r?ponses immunitaires et inflammatoires dans la peau. Des exp?riences in vivo sont donc n?cessaires.

Réduction

Le nombre de souris ? utiliser a ?t? calcul? ? l?aide d'un logiciel statistique, pour ob?ir aux minima n?cessaires ? des analyses statistiques valides, condition n?cessaire pour une interpr?tation biologique des r?sultats. Le nombre de souris par condition est de 20 afin que les r?sultats obtenus puissent pr?senter une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Dans le cadre de ce mod?le de blessure cutan?e, les animaux sont anesth?si?s par un agent anesth?siant inhalable et un analg?sique est administr? aux animaux lors de la chirurgie. Les animaux sont plac?s sur un tapis chauffant pendant la chirurgie et le r?veil afin d'?viter l'hypothermie. Des pansements adapt?s sont utilis?s (compresse st?rile, pansement semi-occlusif et bandage de contention). Les animaux sont surveill?s tous les jours pour l??tat g?n?ral, afin d?assurer leur bien-?tre et pour surveiller les ?ventuels signes de douleur, de souffrance ou de stress. Des soins post-op?ratoires sp?cifiques seront mis en place si n?cessaire, tels que l'injection de solution r?hydratante en cas de d?shydratation ou traitement par antispetiques en cas d'infection de la plaie. Les animaux seront pes?s et ?valu?s deux fois par semaine gr?ce ? une grille de score pour ?viter toute souffrance inutile des animaux.

Choix des espèces

La souris est le mod?le de choix car la physiologie de la souris est proche de celle de l?Homme. D?autre part les m?canismes immunitaires sont bien caract?ris?s chez la souris, ce qui en fait un mod?le particuli?rement adapt? pour ?tudier les cellules immunitaires et les r?ponses immunitaires anti-tumorales. Les souris seront utilis?es ? l'?ge adulte (de 8 ? 12 semaines) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les r?sultats ne soient pas affect?s ? cause de modifications dues ? un ?ge trop avanc? des animaux.

Déjà utilisées dans un autre protocole, 6 vaches laitières taries sont reprises pour tester un vaccin nasal contre la besnoitiose, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La tête bloquée au cornadis, chacune subit quatre prises de sang de trente millilitres, quatre écouvillonnages nasaux, trois instillations du vaccin et jusqu'à vingt-huit prises de température rectale. L'effectif tient à la disponibilité de ces six vaches, le porteur indiquant qu'il n'est pas modulable puisqu'elles proviennent d'un protocole antérieur. Toutes seront mises à mort à l'issue, au motif qu'elles auront été soumises à des produits expérimentaux.

Objectifs

La besnoitiose, caus?e par le parasite unicellulaire Besnoitia besnoiti (B. besnoiti), repr?sente une menace significative pour l??levage bovin. Maladie r?-?mergente en Europe, la besnoitiose progresse du sud vers le nord en France. Les parasites pr?sents dans la peau peuvent ?tre transmis par l?interm?diaire d?insectes ou d?aiguilles avec une progression jusqu?? 20% de nouveaux animaux infect?s par an dans les troupeaux touch?s. La phase f?brile est caract?ris?e par un larmoiement, un jetage nasal, une congestion des muqueuses, de la fi?vre ; puis la phase des ?d?mes touche toutes les r?gions du corps rendant les d?placements difficiles ; puis vient la phase de d?pilation et scl?rodermie accompagn? d?amaigrissement. La mort, spontan?e ou provoqu?e, peut atteindre jusqu?? 10 % des animaux infect?s. Cette maladie est ?galement une cause d?infertilit? des m?les pouvant impacter des taureaux de grande valeur g?n?tique. Aucun traitement curatif n?est disponible en Europe et les moyens de lutte sont limit?s au d?pistage et ? l??limination des animaux malades, ce qui est difficile pour les animaux asymptomatiques, ou au contr?le des insectes. Le d?veloppement d?un vaccin efficace offrirait aux ?leveurs une meilleure strat?gie de contr?le de cette maladie. Le but de ce projet est d??valuer l?immunog?nicit? et l?efficacit? d?un vaccin sous-unitaire ? administration nasale contre la besnoitiose. Ce vaccin est constitu? de prot?ines de B. besnoiti associ?es ? un muco-excipient ? base d?amidon. Les vaches seront immunis?es par voie intranasale pour d?clencher une r?ponse immunitaire muqueuse et syst?mique. Ces r?ponses seront ?valu?es par le suivi de l?apparition d?anticorps muqueux et s?riques sp?cifiques de B. besnoiti et par la production de mol?cules inflammatoires par les cellules sanguines. Le vaccin sera test? sur 6 vaches r?utilis?es et h?berg?es conform?ment aux directives europ?ennes, avec un enrichissement appropri? aux bovins. Toute m?dication interf?rant avec la r?ponse immunitaire est ? ?viter.

Bénéfices attendus

Les b?n?fices attendus sont la mise en ?vidence du d?veloppement d?une immunit? contre Besnoitia besnoiti, ? l?aide d?un vaccin nasal. Ces r?sultats sont essentiels pour envisager le d?ploiement de la vaccination de bovins dans les zones end?miques en France. Cet outil de lutte est attendu par les acteurs du secteurs (?leveurs impact?s, groupement de d?fense sanitaire qui soutient les ?leveurs dans la gestion de la besnoitiose).

Procédures

Les animaux seront soumis ? des pr?l?vements sanguins sous contention de la t?te au cornadis (environ 5 minutes par animal, 4 fois au total, ? deux semaines d?intervalle) ; des pr?l?vements nasaux par ?couvillonnage sous contention de la t?te au cornadis (environ 1 minute par animal, 4 fois au total, ? deux semaines d?intervalle) ; d?instillation du vaccin par voie intranasale sous contention de la t?te au cornadis (environ 1 minute par animal, 3 fois au total, ? deux semaines d?intervalle) ; des prises rectales de la temp?rature (environ 5 minutes par animal, entre 16 et 28 fois avec un maximum de 2 fois par jour pendant 3 jours apr?s vaccination).

Impact sur les animaux

Les prises de sang peuvent ?tre source de stress et de douleur mod?r?e. Au total, 4 prises de sang de 30 mL chacune, ? 2 semaines d?intervalle seront r?alis?es sur chaque animal. L??couvillon dans la narine peut provoquer une sensation de d?mangeaison limit?e ? la dur?e du geste. Au total, 4 ?couvillonages ? 2 semaines d?intervalle seront r?alis?es sur chaque animal. La prise rectale de la temp?rature peut occasionner une g?ne passag?re. Le pr?l?vement de sang au niveau de la veine jugulaire n?cessite une contention de la t?te ? l?aide d?un cornadis et d?un licol. Le pr?l?vement nasal se fera ? la suite pour profiter de l?immobilisation de la t?te de l?animal.

Devenir

A l'issue de la proc?dure 1, les 6 animaux seront mis ? mort ?tant donn? qu?ils auront ?t? soumis ? des produits exp?rimentaux.

Remplacement

Il n?existe ? ce jour aucune alternative non animale permettant d??tudier les r?ponses immunitaires. L??tude des r?ponses immunitaires n?cessite d?immuniser et de faire des pr?l?vements sur des animaux vivants. Le bovin est l?h?te de B. besnoiti. C?est donc la seule esp?ce pertinente pour ?tudier les r?ponses immunitaires d?un vaccin ? destination des bovins.

Réduction

Il s?agit d?une ?tude exploratoire sur des animaux r?utilis?s issus d?un autre protocole afin de ne pas en utiliser d?autres (r?duction). Le nombre d?animaux n?est donc pas modulable. Le fait que chaque animal soit son propre t?moin n?gatif permet d?avoir un lot unique et d?augmenter la robustesse des r?sultats. Pour les dosages de cytokines produites par les cellules sanguines stimul?es ex vivo, le test statistique non param?trique (2 ?chantillons appari?s) pourra ?tre utilis? pour d?terminer si la diff?rence entre le point avant vaccination (J0) et chaque point apr?s vaccination (J14, J28, J47) est significative. Une simulation r?alis?e avec l?outil de calcul de puissance de ce test indique que 6 individus sont n?cessaires pour atteindre 95 %, sans tenir compte de la grande variabilit? individuelle d?j? observ?e avec les cellules bovines et pour une augmentation attendue d?au moins 50 % de cytokines produites.

Raffinement

Les animaux ayant d?j? ?t? utilis?s, ils resteront dans leur environnement habituel. Ils ont d?j? ?t? acclimat?s et habitu?s aux pr?l?vements sanguins. Les prises de sang et les immunisations intranasales ne n?cessiteront qu?une contention minimale (au cornadis). Dans leur pr?cedent ?levage, les animaux ont d?j? ?t? habitu?s ? l?alimentation au cornadis. Un renforcement positif (granul?s pour vaches par exemple) sera appliqu? apr?s chaque immunisation et pr?l?vements. La vaccination ne devrait pas entrainer d?effet ind?sirable grave et toute m?dication pouvant interf?rer avec les r?ponses immunitaires (tels que les anti-inflammatoires) est proscrite. Enrichissement du milieu par : des brosses de grattage, des blocs de sels min?raux et de la paille r?guli?rement chang?e pour le couchage. Enrichissement social : les animaux seront h?berg?s en groupes stables et auront au minimum deux visites quotidiennes des animaliers.

Choix des espèces

Le bovin est l?esp?ce cible du vaccin test? dans cette exp?rimentation. Les vaches laiti?res sont au stade adulte et taries qui correspond au stade majoritairement infect? par B. besnoiti. En effet, le risque est li? aux piq?res d?insectes et il augmente avec l??ge des animaux.

Les souris dont l'état général se dégrade sévèrement, dont la douleur n'est plus contrôlée ou dont le score clinique dépasse les seuils fixés sont tuées. 45 000 souris sont concernées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré : 36 000 tuées et 9 000 réutilisées, dont celles dont le taux d'humanisation reste sous 25 %, orientées vers un projet de formation interne aux gestes techniques. Elles reçoivent, sur souris vigile, un agent qui détruit les cellules souches de leur moelle osseuse et provoque une "forte douleur abdominale", avant une greffe de cellules souches humaines, les nouveau-nés étant anesthésiés par hypothermie sur glace pendant dix minutes au maximum. Sur l'effectif, le porteur écrit : "Aucune approche statistique n'a été réalisée", l'estimation reposant sur le nombre d'études des années précédentes et sur une croissance anticipée "en accord avec le plan commercial".

Objectifs

Ce projet a pour objectif de greffer des cellules souches sanguines humaines et leurs d?riv?es (cellules d?riv?es de cellules souches ou d?riv?es de populations sanguines y compris des cellules pluripotentes induites) chez des souris immunod?prim?es, et ainsi permettre la reconstitution et l?analyse d?un syst?me immunitaire humain (physiologique ou pathologique) et pouvant ?tre modifi? par traitement, en vue d?essais pr?clinique chez la souris.

Bénéfices attendus

En greffant des cellules souches humaines, ou leurs d?riv?es, ? des souris immunod?prim?es, nous pouvons reconstituer un syst?me immunitaire humain. Ce faisant, nous apportons un mod?le d??tude sp?cifique qui peut jouer un r?le essentiel dans la compr?hension et le traitement de pathologies d?importance, comme certaines infections virales (virus de l?immunod?ficience humaine (VIH) ou h?patites), de nombreux cancers ou des maladies inflammatoires (asthme).

Procédures

IDENTIFICATION SOUS ANESTHESIE GENERALE. EN FONCTION DES BESOINS EXPERIMENTAUX, UNE PUCE CLASSIQUE ET/OU UNE PUCE PERMETTANT LA MESURE DE LA TEMPERATURE CORPORELLE. EN CAS DE PERTE OU DE NON-FONCTIONNEMENT, NOUVELLE PUCE AVEC AU MAXIMUM DEUX PU?AGES PENDANT LEUR DUREE DE VIE. SI LA FREQUENCE DES MESURES EST LIMITEE, LA TEMPERATURE CORPORELLE POURRA ETRE MESUREE PAR VOIE RECTALE. Des pr?l?vements sanguins seront r?alis?s sur souris avec ou sans anesth?sies. Les volumes maximaux de pr?l?vements seront proportionnels au poids et ? l??ge de l?animal selon un sch?ma ?tabli et une limite fix?e sur une p?riode glissante de 14 jours. Une r?hydratation avec du s?rum physiologique sera r?alis?e si n?cessaire. La r?partition des pr?l?vements figurera dans le protocole de l??tude et sera contr?l? par un v?t?rinaire. Chaque pr?l?vement durera quelques secondes. Pour les analyses n?cessitant un volume plus important, un pr?l?vement terminal sous anesth?sie gazeuse sera r?alis?. L?anesth?sie des nouveau-n?s sera r?alis?e par hypothermie avec de la glace pendant maximum 10 minutes. Des pr?l?vements vaginaux pourront aussi ?tre pratiqu?s quotidiennement pendant au moins cinq jours, voire plusieurs semaines pour caract?riser le cycle ?stral. L?humanisation inclura l?administration d?un agent, d?truisant les cellules souches de la moelle osseuse, sur souris vigile, suivie d?une greffe de cellules souches sanguines sur souris vigiles ou nouveau-n?s sous anesth?sie sur glace. Ces interventions dureront de quelques secondes ? quelques minutes. Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, une ou deux fois selon la dur?e de l??tude. Ces injections, administr?es uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Les injections pourront ?tre r?p?t?es selon le protocole et dureront quelques secondes. Certaines proc?dures n?cessiteront des actes chirurgicaux pour l?implantation de dispositifs sous-cutan?s, r?alis?s sous anesth?sie gazeuse avec une analg?sie pr?op?ratoire et un suivi post-op?ratoire rigoureux. L?implantation durera moins de cinq minutes et pourra ?tre r?p?t?e selon les besoins de l??tude. ? l?issue des ?tudes, les animaux non int?gr?s aux essais pr?cliniques seront euthanasi?s selon les m?thodes r?glementaires. Toutes les interventions seront r?alis?es sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.

Impact sur les animaux

-[MODIFICATION] Identification par puce ?lectronique classique ou thermopuce : stress, g?ne, douleur dans les heures suivants l?injection. -[MODIFICATION] Prise de temp?rature rectale : stress transitoire, inconfort ou l?g?re douleur ? l?insertion du thermom?tre, risque minimal de blessure rectale. -Injection de l?agent my?loablatif : induit une forte douleur abdominale disparaissant en quelques heures. -Injection(s) de solution saline isotonique contenant des plasmides (pour favoriser le d?veloppement de populations immunitaires humaines d?int?r?t) : peut engendrer des troubles cardio-respiratoires et une alt?ration marqu?e de l??tat g?n?ral, pendant les minutes suivants l?injection. Peut engendrer un h?matome. -Pr?l?vements vaginaux : peut engendrer une irritation locale, une inflammation ou un stress temporaire. -Chirurgie : douleur, h?morragie, un d?faut du syst?me d?anesth?sie / analg?sie (ex : la souris se r?veille en cours de proc?dure), un ?tat clinique d?t?rior? au r?veil (ex : hypothermie), mauvaise cicatrisation. -Administration de traitements : effets potentiellement toxiques des compos?s ? vis?es th?rapeutiques, h?matome, douleur, l?sion au site d?administration (notamment si administrations r?p?t?es) - Pr?l?vements sanguins : an?mie, h?matome, douleur, l?sion au site de pr?l?vement (notamment si pr?l?vement r?p?t?s). -Rasage et cr?me d?pilatoire : microl?sions, irritations cutan?es, g?ne (sensation de br?lure de la cr?me), inflammation transitoire. -Anesth?sie : risque d?hypothermie et de s?cheresse oculaire (ajout de gel ophtalmique en pr?vention). -Pr?l?vement d?urine et de f?ces : stress, g?ne voire potentiellement douleur si pr?sence de tumeurs au niveau abdominal. La manipulation chez le nouveau-n? pourrait engendrer le rejet de la m?re. Afin d??viter cela, des ?l?ments sont d?crits dans la proc?dure exp?rimentale. Des nuisances peuvent ?galement ?tre induites par le stress d? aux contentions. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivit?, une prostration ou des difficult?s ? se d?placer.

Devenir

Le processus d?humanisation pourra ?tre accompagn? d?une phase de modulation ou de renforcement in vivo du syst?me immunitaire humain en fonction des objectifs exp?rimentaux. Cette ?tape vise ? pr?parer les animaux aux ?tudes pr?cliniques envisag?es en optimisant la r?ponse immunitaire du mod?le humanis?. Les animaux n??tant pas jug?s comme aptes ? entrer en ?tude pr?clinique en projet de formation ou en projet de recherche interne seront euthanasi?s. C?est-?-dire les animaux avec un ?tat de sant? jug? moyen et/ou avis v?t?rinaire d?favorable. Dans le cadre d?une utilisation continue, pour r?aliser les ?tudes pr?cliniques, les animaux pourront ?tre int?gr?s aux autres projets autoris?s par le Minist?re dans l??tablissement utilisateur. Des souris issues de cette proc?dure pourront ?tre r?utilis?es dans le projet ? Formation interne aux proc?dures et gestes techniques appliqu?s aux souris ?, sous r?serve d?un avis v?t?rinaire favorable. Les animaux concern?s seront ceux ayant un taux d?humanisation < 25%. Un nouveau-n? mal humanis? pourra ?tre nouvellement humanis? en ?tant plus ?g?. La d?cision est prise par le v?t?rinaire.

Remplacement

Les tests in vitro seront envisag?s si ceux-ci sont appropri?s. Dans le cadre d?une utilisation continue, les souris humanis?es seront impliqu?es dans des ?tudes de recherches pr?cliniques impliquants le syst?me immunitaire. Il n'est actuellement pas possible de recr?er in vitro un environnement complexe comme le syst?me immunitaire tout en objectivant les effets potentiellement toxiques d?une mol?cule en d?veloppement. La souris constitue un mod?le scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le d?veloppement et la mise au point de th?rapies innovantes pour les patients.

Réduction

Un total de 45 000 souris seront utilis?es, couvrant [MODIFICATION] la dur?e du projet et permettant de r?aliser 720 ?tudes pr?cliniques de 50 souris, en se basant sur un taux de succ?s de l?humanisation de 80%. Aucune approche statistique n'a ?t? r?alis?e, l?estimation du nombre d?animaux est r?alis?e sur base du nombre d??tudes effectu?es les ann?es ant?rieures et anticipant une croissance chaque ann?e, en accord avec le plan commercial. Le nombre d?animaux utilis?s dans chaque ?tude sera r?duit au maximum.

Raffinement

Les souris seront h?berg?es pr?f?rentiellement par groupes sociaux stables compos?s de 5 individus ? partir du sevrage. Des compl?ments alimentaires pourront ?tre administr?s suivant l??tat de sant? des animaux (dietgel). La cage contiendra ? minima une couche de liti?re permettant aux souris de creuser, de se cacher et de r?aliser un nid, ?l?ment essentiel ? leur bien-?tre. Cette couche de liti?re pourra ?tre suppl?ment?e par un ?chantillon de liti?re provenant de cages m?les dans le but de synchroniser le cycle ?stral de la souris. En outre, des enrichissements de qualit? seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. ? leur entr?e dans l?animalerie, les souris b?n?ficieront d?une p?riode d?acclimatation de minimum 4 jours. Lors d?un changement de zone au sein de l?animalerie, les souris b?n?ficieront d?une p?riode d?acclimatation d?une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l?angoisse, une ?chelle de scores cliniques (pelage, mobilit?, ?tat g?n?ral, activit?, comportement etc) sera appliqu?e d?s le premier geste invasif ou d?s qu?un signe d?alt?ration est observ? lors de la surveillance quotidienne. Des traitements antalgiques pr?ventifs et curatifs seront mis en ?uvre d?s que n?cessaire, sous avis v?t?rinaire notamment bupr?norphine 0,1 mg/kg (voie IP ou SC), administr?e avant intervention chirurgicale ou toute proc?dure potentiellement douloureuse. Un rappel sera envisag? toutes les 4?6h selon l??valuation. Le v?t?rinaire aura pleine autorit? pour euthanasier un animal pour raison ?thique ou mettre en ?uvre un traitement anti-douleur s?il/elle le juge n?cessaire. Les fr?quences sont limit?es et une r?hydratation est pr?vue pour tout pr?l?vement unique ? partir de 8 mL/kg. Les points limites d?clenchant l?euthanasie incluent : atteinte s?v?re de l??tat g?n?ral, douleur non contr?l?e, ou tout score clinique d?passant les seuils d?finis.

Choix des espèces

Le s?quen?age complet du g?nome de la souris a d?montr? la proximit? phylog?n?tique des souris et des humains : 90 % des g?nes humains ont un ?quivalent chez la souris, permettant d??laborer des approches g?n?tiques et fonctionnelles valides. Lorsque les g?nes orthologues produisent des effets diff?rents entre souris et humain, le remplacement dans le g?nome du g?ne de la souris par son ?quivalent humain ou de mani?re fonctionnelle par greffe de cellules humaines dans une lign?e immunod?ficiente permet la cr?ation de lign?es humanis?es. Depuis de nombreuses ann?es, l'entreprise d?veloppe une expertise dans l?humanisation du syst?me immunitaire de multiples souches de souris, notamment les NCG, NXG, NOG et BRG. Fort de cette exp?rience, il est pertinent de poursuivre le processus d?humanisation sur cette m?me esp?ce. La proc?dure exp?rimentale requiert l'utilisation de souriceaux nouveau-n?s La proc?dure exp?rimentale requiert l'utilisation de souriceaux nouveau-n?s jusqu'? [MODIFICATION] jusqu'? l'?ge de 3,5 - 4,5 semaines, car leur immunit? immature favorise la prise de greffe et limite le rejet, garantissant ainsi une reconstitution optimale du syst?me immunitaire humain. ? cet ?ge, le thymus et la moelle osseuse offrent un environnement propice ? la maturation des cellules immunitaires humaines, permettant d'obtenir un mod?le plus fonctionnel et reproductible.

Les souris de ce projet portent une mutation créée en laboratoire d'après l'anomalie génétique d'un nourrisson de sept jours atteint d'un déficit immunitaire rare. 86 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune subissant quatre prises de sang à six, huit, dix et douze semaines, compensées par une injection de sérum physiologique sous la peau. Toutes sont tuées en fin de protocole pour prélever leurs organes, et le porteur précise qu'une modification importante des paramètres immunitaires pourrait avancer cette mise à mort. L'effectif d'abord annoncé était de 32 souris, augmenté de deux lots de vingt après qu'un "effet batch non attendu" a empêché de conclure, le total déclaré du projet s'établissant à 86.

Objectifs

Notre recherche porte sur une protéine présente dans les cellules, qui joue un rôle important dans la régulation du calcium. Ce calcium est essentiel à de nombreuses fonctions du corps : il participe à la croissance, à la production d’énergie, au bon fonctionnement des cellules et même à leur disparition quand cela est nécessaire. Cette protéine semble donc impliquée dans plusieurs mécanismes clés, bien que son rôle exact ne soit pas encore totalement compris. Un cas particulier nous a récemment interpellés : un bébé de 7 jours souffrant d’un trouble rare du système immunitaire. Il présente une anomalie génétique inhabituelle, jamais décrite auparavant et portant sur la protéine mentionnée ci-dessus, qui pourrait être liée à son déficit en cellules immunitaires. Ce lien possible a poussé notre équipe à explorer cette piste plus en détail. Pour mieux comprendre les effets de cette anomalie, nous avons mis au point un modèle animal, en modifiant le patrimoine génétique de souris grâce à une technique de pointe. Le but est d’observer les conséquences de cette modification, en particulier sur le sang et le système immunitaire. L’étude prévoit d’analyser deux groupes de souris : celles qui portent la modification, et celles qui ne l’ont pas. Des prélèvements sanguins seront effectués pour comparer leur état de santé et leur fonctionnement immunitaire. Au total, 32 souris seront nécessaires pour obtenir des résultats fiables. MODIFICATION : Pour palier à un effet de lot lors de la génération des cohortes expérimentales, nous ajouterons 2 lots chacun composé de 5 mâles mutants et 5 mâles WT, 5 femelles mutantes et 5 femelles WT. (soit 2x20 animaux)

Bénéfices attendus

L'objectif de notre projet est l'étude du système immunitaire, nous souhaiterons comprendre les mécanismes biologiques qui découlent de la mutation du gène d'intérêt et son effet sur l'immunité des souris.

Procédures

Dans le cadre de cette procédure, quatre prélèvements de sang seront réalisés sur chaque animal à 6 semaines, 8 semaines, 10 semaines et 12 semaines d'âges. Pour compenser la perte de volémie, la quantité de sang prélevé sera équilibré par une injection sous-cutanée de sérum physiologique d’un volume équivalent. Ce geste dure environ une minute.

Impact sur les animaux

Comme la mutation chez l’homme induit une dysfonction de la fonction immunitaire, un faible risque de faiblesse immunitaire pourrait être observé sur notre modèle de souris mutantes. Le prélèvement sanguin sera effectué sur animal vigile pouvant induire un stress. MODIFICATION: Aucun signe de phénotype dommageable sur les animaux mutants générés n'a été constaté sur la partie déjà réalisée de ce projet.

Devenir

En fin de protocole, tous les animaux sont mis à mort afin de procéder a la collecte de différents organes afin de les analyser.

Remplacement

Une partie importante de l’étude de caractérisation du gène ne nécessite pas l’utilisation d’animaux vivants et peut être étudié in vitro sur des lignées cellulaires modifiées génétiquement. Cependant, le modèle animal reste indispensable et nécessaire pour identifier l’effet de la modification du gène à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre d'un syndrome multi-systémique ; le système in vitro ne pouvant apporter un même niveau d’information. De plus, le système immunitaire est complexe et impliques plusieurs organes. Ce projet vise à mettre en évidence l'impact de la modification d’une protéine sur des fonctions métaboliques complexes lors d’une maladie immunitaire. Celles-ci ne sont modélisables que dans un organisme complet à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologies de régulations (régulation et production des cellules immunitaires). Seul une approche sur un mammifère permet une première collecte de données concernant les mécanismes physiologiques complexes mis en jeu dans cette étude (fonctionnement du système immunitaire), fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine.

Réduction

L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Vu l'expérience que nous avons sur l'étude de mutation génétique notamment au sein de consortiums, des groupes de 8 animaux par sexe sont nécessaire pour obtenir des résultats robustes. Durant cette étude nous allons générer des données (analyses sanguines, caractérisation des populations cellulaires du système immunitaire) qui seront analysées à l'aide de tests statistiques appropriés. MODIFICATION : Suite à une difficulté à la génération des animaux expérimentaux, nous avons réalisés les analyses en deux parties. Tous les animaux mâles et 4 femelles ont été étudiés dans une première partie et 12 animaux femelles dans un deuxième temps. Un effet batch non attendu a été observé ne permettant pas de conclure dans les conditions initialement prévues. Nous ajouterons ainsi deux lots de 5 mâles mutant et 5 mâles WT, 5 femelles mutantes et 5 femelles WT. Si le premier lot permet de conclure dans les conditions prévues nous ne générerons pas le second lot d’animaux.

Raffinement

Dans le cadre des procédures expérimentales, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress des animaux. Un suivi régulier de leur état général sera mis en place pour garantir leur bonne santé. Si la surveillance générale (apparence, comportement, posture, présence de vocalisation) indique un changement pouvant impacter la santé de l’animal, une surveillance rapprochée comportant un tableau de suivi sera mise en place. Par ailleurs, nous nous engageons à offrir les meilleures conditions d'hébergement possibles, avec un enrichissement adéquat. Ils disposeront sans limitation de nourriture, boisson et d'un milieu enrichi. Des soins locaux seront administrés à tout animal blessé. Si une douleur est présente, un antalgique pourra être administré selon les recommandations vétérinaires. Des points limites sont mis en place, si un des points limites est atteint, la mise à mort de l'animal pourra être envisagée afin d'éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Le modèle souris est très pertinent et est nécessaire pour étudier de la modification de notre gène d'intérêt à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre d'un syndrome multi-systémique. Le modèle de souris est très étudié pour les fonctions immunitaires. La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous possédons des techniques éprouvées pour obtenir une lignée génétiquement modifiée. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physio-pathologie humaine. En particulier, les systèmes immunitaires chez l’humain et chez la souris ont de nombreuses similitudes (réponse innée et adaptative, même protéines exprimées…). Les prélèvements commenceront sur les animaux à 6 semaines car c'est un âge compatible avec un prélèvement sanguin suffisant pour effectuer les analyses, mais aussi un âge où le système immunitaire est développé et permet une analyse fonctionnelle. Les prélèvements sont échelonnés sur quelques semaines pour permettre d'observer une modification du système immunitaire si la modification devait apparaitre plus tardivement. Les prélèvements s'arrêteront au plus tard à 12 semaines d'âge. Sur le temps des prélèvements, les résultats nous permettront de déterminer l'intérêt de ce gène. Si les résultats devaient montrer une modification importante des paramètres immunitaires, les animaux pourraient être sacrifiés avant pour prélèvement des organes.