Système immunitaire

312 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun subissant une mesure de glycémie hebdomadaire par coupe de l'extrémité de la queue, deux prélèvements de moelle osseuse sous anesthésie et des tests métaboliques de deux heures avec cinq prises de sang. Une partie reçoit du chlorure de lithium dans l'eau de boisson, à 600 mg/L pour les jeunes de cinq semaines et 1 200 mg/L pour les adultes de trois mois, avec des effets secondaires attendus sur le poids et le comportement. Pour 32 d'entre eux, les prélèvements sanguins répétés peuvent entraîner une perte de sang incontrôlée, une anémie ou une détresse respiratoire, risques que le porteur énonce lui-même. Tous sont tués à l'issue de chaque procédure pour le prélèvement des tissus, dont les îlots pancréatiques destinés à des expériences menées hors des rats.

Objectifs

Le diabète de type 2 est une maladie très fréquente qui représente aujourd’hui un important problème de santé dans le monde. Elle apparaît lorsque le pancréas, un organe qui aide à contrôler le taux de sucre dans le sang grâce à une hormone appelée insuline, ne fonctionne plus correctement. Cette maladie touche des centaines de millions de personnes et peut entraîner de graves conséquences pour la santé, notamment des problèmes au niveau du cœur, des reins ou de la vue. Aujourd’hui, il n’existe pas de traitement permettant de guérir définitivement le diabète de type 2. Il est donc essentiel de mieux comprendre comment cette maladie se développe afin de trouver de nouvelles solutions pour la traiter. Chez les personnes atteintes de diabète de type 2, le pancréas est soumis à une inflammation chronique, c’est-à-dire une réaction de défense du corps qui dure trop longtemps et finit par endommager l’organe. Cette inflammation semble être provoquée par une présence excessive de cellules immunitaires, les cellules chargées normalement de défendre l’organisme contre les infections. Cependant, nous ne savons pas encore précisément d’où viennent ces cellules immunitaires. Nous pensons qu’elles pourraient être produites en grande quantité par la moelle osseuse, le tissu situé à l’intérieur des os qui fabrique les cellules du sang et du système immunitaire. Notre laboratoire a déjà montré que, dans le diabète, la moelle osseuse produit davantage de cellules immunitaires favorisant l’inflammation. Nous faisons donc l’hypothèse que réduire cette inflammation dans la moelle osseuse pourrait aussi diminuer l’inflammation du pancréas et ralentir sa dégradation. Ce projet de recherche a pour objectif d’étudier l’inflammation dans le pancréas et dans la moelle osseuse à l’aide de modèles de la maladie. Il vise également à tester de nouvelles approches thérapeutiques pour voir si elles permettent de limiter cette inflammation et de préserver le bon fonctionnement du pancréas. Cette étude sera réalisée à la fois chez le mâle et la femelle car il est important de déterminer si le traitement pharmacologique peut améliorer l'état inflammatoire dans les deux sexes.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de construire une meilleure connaissance des mécanismes inflammatoires impliqués dans le diabète et d'identifier des cibles potentielles afin de proposer une stratégie thérapeutique plus complète, capable de limiter la progression du diabète chez les patients, améliorant, ainsi leur qualité de vie.

Procédures

Une partie des animaux de la procédure 1 et 2 seront traités au chloride de lithium (LiCl) dans l’eau de boisson à une dose de 600mg/L (rattons de 5 semaines) et 1200mg/L (rats adultes de 3 mois). Les animaux de la procédure 1 et 2 (312 rats) subiront un prélèvement de la durée de quelques secondes d'un très petit volume sanguin pour mes mesurer leur glycémie chaque semaine. Durant les tests métaboliques d'une durée de 2 heures, les rats subiront une injection et 5 prélèvements d'un petit volume sanguin pour le dosage de l'insuline plasmatique et la mesure de glycémie (prélèvement de la durée de moins d'une minute). Une fois, avant le début du traitement, et, une fois, à la fin du traitement, nous prélèverons une petite quantité de moelle osseuse chez les mêmes rats. Cette opération sera effectuée sous anesthésie générale et un anti-douleur sera injecté avant et après la procédure pour limiter au maximum la douleur. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour évaluer leur état. Certains animaux de la procédure 2 (32 rats) subiront plusieurs prélèvements d'un petit volume sanguin pour isoler leurs cellules immunitaires qui serviront à des analyses en dehors de l’animal. Ce prélèvement est réalisé sous anesthésie et dure quelques minutes. Dans cette procédure, nous prélevons du sang 2 fois au cours de toute la durée de vie de l’animal et chaque prélèvement sera espacé d’une semaine pour leur laisser le temps de se remettre totalement du geste.

Impact sur les animaux

Dans la procédure 1 et 2, les nuisances attendues sont les potentiels effets secondaires liés au traitement (perte de poids, comportement modifié…etc.). Nous prévoyons de contrôler chaque semaine le poids, la glycémie et le comportement des animaux. La mise à jeun des animaux constitue une nuisance, correspondant à une privation alimentaire temporaire, susceptible d’entraîner un inconfort transitoire. De plus, des légers effets indésirables seront liés à la piqure lors de l'injection aux cours des tests métaboliques, ainsi qu'à la coupe de l'extrémité de la queue lors des prélèvements de sang. Le prélèvement de moelle osseuse peut également générer des douleurs post-opératoires. Nous utiliserons un anti-douleur pour limiter ces effets. Dans la procédure 2, les potentielles nuisances sont liées aux effets secondaires possibles lors du prélèvement de sang. Cela peut entrainer une perte de sang incontrôlée, une anémie ou encore détresse respiratoire. Pour limiter le stress des animaux, ces derniers seront anesthésiés tout au long de la procédure. Nous prélèverons un petit volume sanguin et un point de compression sera réalisé jusqu’à l’arrêt du saignement. De plus, les animaux seront surveillés pendant et après la réalisation du geste pour s’assurer de leur bien-être.

Devenir

A l'issue de chaque procédure tous les animaux seront mis à mort pour permettre les prélèvements des tissus d’intérêt.

Remplacement

Le modèle animal est fondamental dans ce projet, puisque nous souhaitons étudier la réponse physiologique globale de l’organisme au traitement. Plusieurs niveaux de complexité sont nécessaires, impliquant des interactions entre différents types cellulaires et organes qui présentent une inflammation importante (moelle osseuse, circulation sanguine et pancréas), aspects qui ne peuvent pas être développés in vitro ou ex vivo.

Réduction

La stratégie expérimentale visera à étudier les mécanismes impliqués dans l'inflammation du pancréas. Nous constituerons des groupes expérimentaux comportant un nombre d'animaux réduit au maximum, mais permettant de prendre en compte la variabilité individuelle de la réponse à l’inhibiteur et de valider statistiquement les différences détectées entre les groupes. De plus, les animaux utilisés pour les prélèvements sanguins sont les mêmes animaux utilisés pour les prélèvements d’îlots pancréatiques au vu des expériences ex vivo, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux total utilisé. Pour les tests in vivo des différences significatives pourront être démontrées à partir de groupes de 10 animaux (en référence à nos études précédentes et en accord avec les résultats de tests statistiques).

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des cages enrichies (matériel de nidification, abris), dans des conditions contrôlées de température, d’humidité et de cycle lumineux. Un suivi hebdomadaire sera assuré afin d’évaluer leur état général (poids, glycémie, comportement, aspect du pelage, posture, mobilité). Des points limites prédéfinis permettront d’interrompre rapidement une procédure en cas de signe de souffrance excessive. De plus, une anesthésie et/ou une analgésie adaptée sera utilisée chaque fois que nécessaire. Le traitement pharmacologique pourrait engendre une perte de poids. Si celle-ci est supérieur à 15% l'animal concerné sera mis à mort. Les tissus seront prélevés après la mise à mort qui sera effectuée selon les procédures recommandées pour assurer leur confort et limiter la souffrance

Choix des espèces

Les rats que nous utilisons dans ce projet développent une maladie proche du diabète de type 2 observé chez l’Homme. Ils permettent d’étudier en même temps le fonctionnement du pancréas, du système immunitaire et du métabolisme, ce qui n’est pas possible avec des cellules cultivées seules. Les animaux utilisés seront de jeunes rats de 5 semaines, pas encore totalement diabétiques ainsi que des adultes de 3 mois ayant déjà bien développé le diabète. Cela nous permettra d’étudier la manière dont évolue la maladie au cours du temps et de déterminer les effets du traitement en effet préventif (avant que le diabète ne s’installe totalement) et curatif (effet du traitement sur la maladie déjà déclarée).

168 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils portent une altération génétique qui supprime la calpaïne-3, une protéine musculaire absente dans une forme de dystrophie des ceintures, et reçoivent des molécules par voie orale ou par injection dans l'abdomen jusqu'à cinq fois par semaine, avec des prélèvements sanguins et des tests fonctionnels qui peuvent léser leurs griffes. Les bénéfices médicaux annoncés, ralentir la maladie et préserver la force musculaire, sont renvoyés au conditionnel et au long terme, quand l'objectif immédiat reste d'identifier quels points du fonctionnement des mitochondries cibler. Sur le remplacement, le porteur explique que la calpaïne-3 n'apparaît qu'à un stade tardif de la maturation des cellules musculaires et qu'aucune culture cellulaire disponible ne reproduit correctement cette apparition tardive.

Objectifs

Les dystrophies musculaires des ceintures (LGMD) sont des maladies génétiques qui touchent surtout les muscles proches du tronc, comme ceux des hanches et des épaules. Elles entraînent une fragilisation progressive des muscles, ce qui peut provoquer une diminution de la force et des difficultés à marcher, se lever ou lever les bras. Selon les familles, la maladie peut se transmettre de différentes façons : parfois un seul parent porteur du gène suffit à transmettre la maladie (forme dite « dominante »), et parfois il faut que les deux parents transmettent chacun une copie du gène modifié (forme dite « récessive »). Dans notre laboratoire, nous étudions notamment la LGMD R1, une forme liée à des anomalies d’un gène appelé CAPN3. Ce gène permet normalement de produire une protéine présente dans le muscle (la calpaïne-3). Quand cette protéine manque ou fonctionne mal, la maladie apparaît, mais les mécanismes exacts qui expliquent comment cela abîme le muscle ne sont pas encore totalement compris. Plusieurs observations réalisées à partir d’échantillons de muscle de patients suggèrent cependant que les mitochondries pourraient être impliquées. Les mitochondries sont des structures présentes dans les cellules, souvent décrites comme des « centrales énergétiques », car elles aident à produire l’énergie nécessaire au bon fonctionnement du muscle. Pour mieux comprendre la maladie et tester des pistes de traitement, un modèle de rat dépourvu de calpaïne-3 (appelé rat C3) a été développé au laboratoire. De manière intéressante, ce modèle présente des anomalies des mitochondries comparables à celles observées chez les patients : leur structure et leur fonctionnement sont altérés. L’objectif final de ce projet est de déterminer si des stratégies visant à améliorer le fonctionnement des mitochondries peuvent apporter un bénéfice thérapeutique en cas de déficit en calpaïne-3. Le projet se déroulera en deux étapes : 1) D’abord, identifier précisément quels « points d’action » dans le fonctionnement des mitochondries seraient les plus utiles à cibler pour améliorer la situation ; 2) Ensuite, tester des molécules connues, déjà autorisées chez l’être humain, et qui agissent sur ces points, afin d’identifier celles qui montrent un effet bénéfique dans le modèle.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de mieux comprendre comment un mauvais fonctionnement des mitochondries peut contribuer à la faiblesse et à la dégradation des muscles dans certaines dystrophies musculaires. Les mitochondries sont de petites structures présentes dans les cellules, souvent comparées à des « centrales énergétiques », car elles produisent l’énergie dont le muscle a besoin pour fonctionner. Les bénéfices attendus sont de deux ordres. D’une part, sur le plan de la recherche, ce travail apportera de nouvelles connaissances sur la façon dont les mitochondries s’adaptent et se régulent dans un muscle malade. D’autre part, sur le plan médical, il aidera à repérer des cibles thérapeutiques pertinentes et à évaluer des traitements potentiels, y compris des molécules déjà autorisées chez l’être humain. À terme, les résultats pourront guider le développement de traitements visant à préserver la force et la fonction musculaires, à ralentir l’évolution de la maladie et, ainsi, à améliorer la qualité de vie des personnes atteintes de dystrophies musculaires

Procédures

Des injections sont réalisées par voie intra-veineuse une seule fois dans la durée de l’étude en moins de 5 minutes sur animaux vigiles. L’administration des molécules se fait soit par injection intra-péritonéale sur animaux vigile (durée d’injection : 1 minute) ou par voie orale (durée d’administration 2 à 5 minutes), maximum 5 fois par semaine

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont principalement liés aux manipulations, aux injections, aux administrations répétées de molécules, aux prélèvements sanguins et aux tests fonctionnels. Ils peuvent se traduire par un stress transitoire lié à la contention, une douleur de courte durée au site d’injection ou de prélèvement, ainsi qu’un risque limité d’irritation locale. L’administration répétée de molécules par voie orale ou par injection peut également être source d’inconfort. Les tests fonctionnels peuvent exceptionnellement entraîner des lésions locales mineures au niveau des griffes.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de réaliser des prélèvements d’organes et de muscles.

Remplacement

Les expériences prévues dans ce projet sont limitées aux questions qui nécessitent d’observer le muscle dans son environnement réel, avec ses tissus, sa vascularisation, ses interactions biologiques et sa fonction. Ces éléments sont essentiels pour comprendre la maladie et évaluer l’effet d’un traitement, et ils ne peuvent pas être reproduits de manière fiable avec les modèles alternatifs disponibles. Par ailleurs, la calpaïne 3 n’apparaît qu’à un stade tardif de la maturation des cellules musculaires. À ce jour, nous ne disposons pas d’un modèle in vitro qui reproduise correctement cette expression tardive. Il n’est donc pas possible, à ce stade, d’étudier de façon pertinente les conséquences d’un déficit en calpaïne 3 uniquement sur des cellules en culture.

Réduction

Le choix des gènes et des molécules étudiés dans ce projet repose sur une analyse approfondie de données scientifiques déjà publiées, ainsi que sur l’exploitation de bases de données existantes et d’analyses informatiques. Cette démarche permet de formuler des hypothèses solides avant de commencer les expérimentations et d’éviter de tester un trop grand nombre de pistes de manière exploratoire. Grâce à ce travail préparatoire, seules les pistes les plus pertinentes sont retenues pour être étudiées chez l’animal. Cette stratégie permet de limiter au maximum le nombre de gènes et de molécules à évaluer et contribue ainsi à réduire le nombre d’animaux nécessaires au projet. Le nombre d’animaux par groupe a été soigneusement calculé afin d’obtenir des résultats fiables tout en utilisant le minimum d’animaux possible. Pour évaluer l’efficacité des approches testées, un indicateur précis de l’atteinte musculaire est utilisé. Les données déjà disponibles montrent que ce paramètre est mesurable de manière reproductible dans le modèle étudié. Les calculs statistiques réalisés indiquent qu’un petit nombre d’animaux par groupe est suffisant pour détecter une amélioration significative de cet indicateur. Les groupes contrôles sont partagés entre plusieurs expériences lorsque cela est possible, afin de limiter encore le nombre total d’animaux utilisés

Raffinement

Les animaux sont suivis tout au long de l’étude : ils sont observés au minimum une fois par semaine et lors des pesées ainsi qu’à chaque administration. En cas d’administration répétée, de perte de poids, d’altération de l’état général ou de signe clinique, la surveillance est renforcée jusqu’à deux fois par jour. Le poids sert notamment à ajuster la quantité de produit administrée. Les animaux sont anesthésiés lorsque les procédures expérimentales sont potentiellement douloureuses ou stressantes. Pour les administrations sur animaux vigiles, une contention douce et adaptée est utilisée pour limiter le stress et les mouvements, ces administrations peuvent nécessiter une phase d’habituation. Les prélèvements sanguins sont réalisés en privilégiant une technique rapide et la moins contraignante possible (moins de 5 minutes). Plusieurs mesures sont mises en place pour améliorer leur confort. Par exemple, lors des anesthésies, un gel protecteur pour les yeux est appliqué afin d’éviter le dessèchement des tissus. En cas de difficulté à s’alimenter, la nourriture est placée au sol facilement accessible. Enfin, des « points limites cliniques » (critères d’arrêt) sont appliqués grâce à une grille d’évaluation : si un animal présente des signes indiquant qu’il pourrait souffrir ou se dégrader, des mesures appropriées sont prises sans attendre.

Choix des espèces

Pour ce projet nous utiliserons un modèle de rat appelé « rat C3 ». Ce modèle a été développé et bien décrit dans notre laboratoire. Il présente notamment des anomalies au niveau des mitochondries, de petites structures des cellules qui participent à la production d’énergie. Ce modèle est donc particulièrement adapté pour étudier le rôle des mitochondries dans la maladie et mieux comprendre leur implication dans la dystrophie musculaire des ceintures de type LGMDR1 Dans cette étude, les animaux seront inclus lorsqu’ils sont de jeunes adultes. À partir du sevrage, leurs muscles ont une taille et un fonctionnement suffisamment établis pour permettre des mesures fiables. Cela rend possible l’évaluation de l’impact du fonctionnement des mitochondries sur les muscles squelettiques, dans des conditions proches de la physiologie normale

Les souris employées ici portent un marquage fluorescent de leurs fibroblastes, obtenu par modification génétique, pour suivre ces cellules pendant que la tumeur se développe. 2 862 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un carcinogène chimique identique à ceux du tabac, une fois par semaine pendant dix semaines pour les tumeurs du poumon, ou dans l'eau de boisson pendant quatre à quatorze semaines pour celles de la vessie, et pour une partie d'entre elles une greffe de cellules tumorales introduite dans la vessie par un cathéter urétral sous une heure d'anesthésie, une tumeur trop volumineuse pouvant ensuite obstruer l'organe et provoquer une rétention d'urine douloureuse. Toutes sont tuées, celles dont le génotype ne sert pas au projet dès l'élevage, les autres pour l'analyse de leurs tumeurs après la mort.

Objectifs

Les recherches actuelles sur les cancers solides ne se focalisent plus uniquement sur les cellules cancéreuses mais ciblent aussi le microenvironnement tumoral. En effet, ce dernier composé de différents types cellulaires joue un rôle déterminant dans l’initiation et la progression tumorale. Le ciblage des cellules immunitaires (immunothérapie réactivant les lymphocytes T notamment) a conduit à des résultats spectaculaires de rémissions durables dans des tumeurs solides notamment dans le mélanome, le cancer du poumon et plus récemment le cancer de la vessie. Toutefois, cette stratégie thérapeutique fonctionne chez un nombre limité de patients (20 à 30%), incitant à étudier et comprendre les éléments contrôlant cette résistance. Des études récentes dans le cancer du poumon ont montré que certaines cellules (fibroblastes) associées aux tumeurs (CAF) forment une barrière autour des ilots tumoraux et empêchent les lymphocytes T de rentrer en contact directe avec les cellules tumorales empêchant leur destruction. Cette exclusion peut expliquer certains de ces échecs thérapeutiques. Deux types de tumeurs solides répondant partiellement à l’immunothérapie seront étudiées dans ce projet : - Le cancer du poumon :principale cause de décès par cancer dans le monde. Les traitements des stades précoces par chirurgie et radiothérapie conduisent à des rémissions durables mais les stades métastatiques ont une faible survie et restent un enjeu majeur de santé publique. - Le cancer de la vessie qui reste un enjeu majeur de santé publique en cas d’envahissement du muscle ou des ganglions lymphatiques voisins. Ces tumeurs peuvent potentiellement être guéries par l'ablation chirurgicale de la vessie et des ganglions lymphatiques. Cependant, chez plus de la moitié des patients qui subissent ce type d'intervention chirurgicale, des cellules cancéreuses ont déjà métastasé et le pronostic vital reste sombre. L’objectif de ce projet est d’identifier l’origine des fibroblastes capables de générer une barrière autour des ilots tumoraux et d’étudier leur fonctionnalité sur l’initiation et la progression tumorale. Cette recherche fondamentale sur l’origine et la fonction des CAF pourrait déboucher sur des thérapies innovantes ciblant les fibroblastes afin d’augmenter l’efficacité des immunothérapies

Bénéfices attendus

Les retombées à venir et les bénéfices attendus de ce projet sont importants car une meilleure caractérisation des cellules composant le microenvironnement tumoral a un impact majeur sur l’efficacité des nouvelles approches thérapeutiques antitumorales. Ainsi, l’identification de cibles pour manipuler les CAF et permettre aux lymphocytes T d’atteindre les cellules tumorales permettrait de guérir un nombre plus important de patients par immunothérapie, notamment dans un contexte de cancer du poumon ou de la vessie.

Procédures

Dans une première expérience, les animaux recevront une injection d’un produit non douloureux directement dans l’abdomen (intrapéritonéale) à raison d’une fois par jour pendant 5 jours. Deux jours après la dernière injection, les animaux recevront un traitement chimique en vue de favoriser le développement de tumeurs pulmonaires. Ce traitement (non douloureux) sera administré directement dans l’abdomen des animaux, à raison d’une fois par semaine pendant 10 semaines. Dans une seconde expérience, les animaux recevront un traitement chimique en eau de boisson pour induire le développement de tumeurs vésicale. Les animaux seront exposés à ce traitement pendant 4 à14 semaines. (MODIFICATION) Dans une 3ème expérience, les animaux recevront une greffe de cellules tumorales avec ou sans fibroblastes directement dans la vessie via l’urètre. Ce geste provoque uniquement une gêne à l’animal, ce même geste étant appliqué aux patients atteints de tumeurs de vessie pour apporter localement le traitement anticancéreux[VD1.1]. Les animaux seront anesthésiés au début de l’expérience par injection d’un produit non douloureux pour effectuer ce geste afin de les stabiliser pour le succès de la greffe. Les animaux seront anesthésiés pendant 1 heure le temps de garantir l’entrée des cellules dans la vessie et éviter leur sortie à cause d’une potentielle miction des souris.

Impact sur les animaux

Les produits administrés aux animaux ne sont pas irritants. Ils sont administrés dans l’eau de boisson ou par injection intrapéritonéale (douleur légère et de courte durée). Les dommages causés par le développement des tumeurs pulmonaires sont à long terme une perte de poids importante et dans les cas extrêmes non étudiés ici une difficulté respiratoire. Dans cette étude, une définition de points limites prédictifs et suffisamment précoces et un suivi régulier des animaux permet de ne pas atteindre ces stades avancés et de limiter la survenue de douleur. Suite au développement des tumeurs de vessie, les animaux pourront présenter une occlusion vésicale potentielle engendrée par une tumeur trop volumineuse (>7mm de diamètre) Cette occlusion peut provoquer une rétention d’urine et des douleurs associées. Une palpation régulière des animaux permet d’éviter ce stade terminal et de limiter la survenue de douleur. Aucune métastase n’a été observée dans ce modèle. (MODIFICATION) Une gêne de courte durée peut survenir suite à l’introduction d’un cathéter dans l’urètre afin d’injecter les cellules tumorales/fibroblastes dans la vessie.

Devenir

Mise à mort des animaux d’élevages de génotypes non pertinents Mise à mort des souris pour analyse des tumeurs post mortem

Remplacement

Le rationnel de ce projet a été établi sur des prélèvements de tumeurs humaines étudiés par immunohistochimie. Des essais de culture sous forme d’organoïdes en 3 dimensions sont en cours mais ne nous permettent pas de reproduire les observations réalisées ex vivo chez l’homme. (MODIFICATION) En effet, nous avons montré in vitro que les CAFs issus de tumeurs humaines de vessies favorisent l’invasion des cellules tumorales de stade précoce. Cependant, l’invasion vers le muscle de la vessie étant critique cliniquement et ne pouvant être mimée in vitro, il nous est indispensable d’utiliser des modèles murins pour le montrer. De plus, seuls des modèles de souris transgéniques possédant un marquage des populations de fibroblastes d’intérêt et porteurs de tumeurs pulmonaires et de vessie peuvent nous permettre d’étudier l’origine et le devenir de ces populations au cours de la progression tumorale. L’identification des fibroblastes impliqués dans l’initiation et la progression tumorale pourrait déboucher sur des thérapies innovantes ciblant les CAF afin d’augmenter l’efficacité des immunothérapies.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est basé sur les données de la littérature décrivant les 2 modèles chimioinduits et nécessite au minimum 10 souris/temps d’analyse afin d’obtenir suffisamment de matériel tumoral. Les souris mâles et femelles transgéniques seront inclus afin d’optimiser l’utilisation des animaux produits en élevage. Aucune différence liée au sexe n’est attendue ici. Les souris non pertinentes d’une même portée seront utilisées en contrôles. Aucun test statistique ne sera envisagé dans cette étude car il s’agit d’une étude qualitative de suivi des fibroblastes par un marqueur sur des coupes d’histologie de tumeurs pulmonaires et de tri de la population tracée. En revanche le faible nombre de tumeurs par souris nous impose d’utiliser un nombre suffisant d‘animaux afin d’avoir le matériel pour conclure. MODIFICATION L’utilisation de l’imagerie permet de réduire le nombre d’animaux utilisés et suivre la progression tumorale in vivo. Une variabilité interindividuelle est attendue, notamment en raison des différences potentielles de prise de greffe et d’implantation tumorale. Ceci nécessite 15 animaux par groupe afin de pouvoir observer des différences biologiquement pertinentes entre les groupes expérimentaux.

Raffinement

Les animaux transgéniques utilisés dans cette étude possèdent des fibroblastes marqués par une molécule fluorescente et présentent un état physiologique normal L’exposition au carcinogène chimique n’induit pas de douleur par lui-même, ni de perte de de l’appétit ou de poids. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux et l’absence de douleur due au développement des tumeurs. (MODIFICATION) Les souris opérées seront anesthésiées afin de réduire la gêne liée à l’introduction d’un cathéter dans l’urètre. Les animaux seront maintenus au chaud sur un tapis chauffant pendant la greffe et pendant la phase de réveil, phase pendant laquelle les animaux seront surveillés en continu. Un suivi régulier des animaux et une définition de points limites précoces permettent de limiter au maximum la souffrance engendrée par le développement des tumeurs. Les animaux seront mis à mort dès l’atteinte d’un point-limite

Choix des espèces

Le choix d’un modèle tumoral préclinique chez la souris est justifié du fait de l’existence de modèles de souris génétiquement modifiées permettant de visualiser une population de fibroblastes d’intérêt similaires à ceux trouvés chez l’Homme. L’induction de tumeurs (poumon ou vessie) par un carcinogène chimique dans de telles souris transgéniques permet de tracer in vivo le devenir de ces fibroblastes lors de la tumorigenèse et leur implication potentielle dans l’initiation et la progression tumorale. Les carcinogènes utilisés sont identiques à ceux présents dans le tabac et reproduisent des cancers de même type que ceux induits chez l’homme par l’exposition au tabac. De plus, les modèles murins permettent d’utiliser de nombreux outils disponibles (anticorps, cytokines) qui permettent d’étudier précisément la réponse immunitaire antitumorale dans cette espèce. Des souris adultes agées de 8 à 32 semaines seront utilisées en procédures. Cet âge adulte permet d’avoir un système immunitaire fonctionnel.

Exposition à un bruit fort pendant une à deux heures, tests auditifs sous anesthésie avec électrodes placées sous la peau, prélèvements de sang répétés jusqu'à six semaines : ces actes sont déclarés dans le premier des deux établissements, le résumé précisant qu'aucune intervention ne sera effectuée dans le second. 4 590 souris sont pourtant déclarées ici aussi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, ce second résumé reprenant mot pour mot le texte du premier, publié sous le même titre suivi de 2/2. Les 1 530 souris transférées dans ce second établissement y sont mises à mort pour analyser les mêmes tissus de l'oreille interne que les 3 060 autres. Le passage consacré au raffinement reprend lui aussi, mot pour mot, celui qui porte sur la réduction du nombre d'animaux non-humains, si bien que rien n'est dit des conditions faites aux souris.

Objectifs

Le projet se réalise dans deux établissements utilisateurs (EU1/2 et EU2/2). La perte auditive présente dès la naissance, touche 26 millions de personnes dans le monde, dont 60 % (environ 15 millions) sont dues à des facteurs génétiques. Cependant, plus de 440 millions de personnes souffrent d’une surdité acquise ou progressive après la naissance, qu’elle soit liée à l’âge, au bruit ou à d’autres facteurs. La perte auditive liée à l'âge (ou presbyacousie) a un impact significatif sur la qualité de vie : 1 adulte sur 3 âgé de plus de 65 ans souffre d'un certain degré de perte auditive. Bien que les mécanismes sous-jacents à ces déficiences auditives restent à élucider, il est de plus en plus reconnu que l'inflammation joue un rôle crucial dans le développement et la progression des troubles auditifs, qu’ils soient d’origine génétique, environnementale (exposition au bruit) ou lié à l’âge. En étudiant des modèles de souris présentant une surdité progressive ou liée au bruit, ciblant des gènes clés liés à l'immunité et ses voies de régulation, nos objectifs sont de : - caractériser les voies moléculaires, découvrir des marqueurs précoces, précis, et spécifiques pour la manifestation et l'évolution de la perte auditive - Étudier les liens entre l’inflammation, les marqueurs immunitaires et la perte auditive, en conditions normales et après exposition à des bruits. Ces recherches pourraient ouvrir la voie à des traitements ciblant l’inflammation dans l’oreille interne, réduisant ainsi les dommages auditifs et améliorant la fonction auditive.

Bénéfices attendus

Les données obtenues de ce projet nous permettront de mieux comprendre la relation entre la surdité progressive ou liée au bruit et la dérégulation des voies immunitaires. Nous identifierons également des biomarqueurs précoces, précis et spécifiques pour la manifestation et l'évolution de la perte auditive. Cela nous permettra de développer des thérapies ciblées pour atténuer les lésions auditives, applicables aux patients. À court terme, nous identifierons des marqueurs biologiques et des mécanismes physiopathologiques. À long terme, ces connaissances permettront de concevoir des traitements innovants pour préserver l'audition, avec des applications potentielles pour les humains et les animaux. Les résultats pourraient également contribuer à la prévention de la surdité induite par le bruit, un problème de santé publique majeur. Ce travail fondamental aura ainsi un impact significatif sur la recherche médicale et les applications cliniques futures.

Procédures

Dans l’EU1/2 : Exposition sonore : Les souris âgées de 3 semaines seront exposées pendant 1 ou 2 heures à un bruit d’un niveau sonore comparable à celui d’une discothèque ou une circulation urbaine dense. Tests auditifs : Des tests auditifs seront effectués dès l’âge de 3 semaines. Ces tests pourront être répétés à différents temps post-exposition sonore : 1 jour, 3 jours, 1 semaine, 2 semaines et 6 semaines. Les souris seront anesthésiées puis exposées à de brefs stimuli sonores d’intensité et de fréquence croissantes. Des mesures seront enregistrées à l’aide d’électrodes ou de sondes placées sous la peau ou à l’entrée du conduit auditif. L’ensemble de ces enregistrements ne durera pas plus de 30 minutes par session. Prélèvements de sang : Un petit échantillon de sang sera prélevé (quelques secondes par prélèvement) avant l’exposition sonore, puis à différents temps post-exposition sonore : 1 jour, 3 jours, 1 semaine, 2 semaines et 6 semaines. Aucune intervention ne sera effectuée dans l’EU2/2. Toutes les souris transférées dans l’EU2/2 seront mis à mort afin d’analyser des tissus.

Impact sur les animaux

Dans l’EU1/2 et l’EU2/2, certaines souris déficientes en protéine fonctionnelle de l’audition présentent des troubles de l’équilibre, qui apparaissent à partir de la 2ème semaine de vie post-natale et perdurent jusqu’à la mise à mort à l’âge de 60 jours. Les autres modèles murins, bien que sourds, ne présentent aucun autre symptôme et conservent un phénotype identique à celui des souris sauvages. Dans l’EU1/2, quelques manipulations du projet pourraient entraîner de légères nuisances : L’exposition sonore peut potentiellement induire un stress temporaire sur l’animal. Les études scientifiques sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité liée au bruit chez les rongeurs. Aucune dégradation durable de leur état de santé n’est anticipée, et aucun effet indésirable majeur (perte de poids, inactivité prolongée, comportement anormal) n’est attendu. Les tests auditifs nécessitent une contention de courte durée des souris, associée à une anesthésie générale légère pour les immobiliser. Bien que cette procédure puisse provoquer une angoisse passagère lors de la mise sous anesthésie, ses effets sont atténués par la courte durée du test (quelques minutes) et la réversibilité rapide de l'anesthésie. Aucun effet indésirable durable n'est attendu.

Devenir

À l'issue de cette procédure expérimentale, 3060 souris seront mises à mort dans l’EU1/2 pour récupérer des tissus de l’oreille interne afin de réaliser des analyses biologiques et histologiques. Les autres animaux (soit 1530 souris) seront transférées à un collaborateur dans l’EU2/2 où ils seront mis à mort pour une analyse complémentaire des mêmes tissus.

Remplacement

Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. Il n’existe pas à ce jour de méthode alternative in vitro ou in silico pour appréhender les mécanismes complexes impliqués dans le fonctionnement de l‘oreille interne que sont : 1) la perception du stimulus mécanique par les cellules sensorielles ; 2) la transduction de ce stimulus en un signal électrique ; 3) la transmission de ce signal électrique à certains neurones de la cochlée ; 4) le transfert via ces neurones et leurs relais de l’information jusqu’au cerveau. De fait, nous utiliserons des souris dans notre projet pour étudier les effets pathologiques de l’inflammation dans les surdités progressives ou liées au bruit, afin d’identifier des marqueurs biologiques, avec des applications potentielles pour les humains.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’individus par groupe expérimental, nous avons effectué une analyse de puissance statistique à partir des données issues de nos récentes publications. Ce qui nous a permis de déterminer qu’il nous faudrait un nombre de 5 individus par groupe. Nos données quantifiées seront analysées grâce à un logiciel d’analyse statistique. Nous choisirons les tests statistiques selon la taille et la distribution des échantillons. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et appliquerons les mesures sur le même animal le cas échéant.

Raffinement

Afin de limiter le nombre d’individus par groupe expérimental, nous avons effectué une analyse de puissance statistique à partir des données issues de nos récentes publications. Ce qui nous a permis de déterminer qu’il nous faudrait un nombre de 5 individus par groupe. Nos données quantifiées seront analysées grâce à un logiciel d’analyse statistique. Nous choisirons les tests statistiques selon la taille et la distribution des échantillons. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et appliquerons les mesures sur le même animal le cas échéant.

Choix des espèces

Les cellules et les molécules impliquées dans le fonctionnement de l’oreille interne sont comparables chez l’homme et la souris. Les pathologies qui nous intéressent ont déjà des modèles murins. Grâce à la transposabilité des résultats entre la souris et l’homme, ces modèles vont nous permettre d’explorer la relation entre la dérégulation des voies immunitaires et la surdité progressive ou liée à l'âge, et fournir ainsi de nouvelles stratégies thérapeutiques chez l’homme. Le projet impliquera principalement des souris adultes âgées de 3 semaines, correspondant au stade jeune adulte, afin d'étudier l'effet du bruit sur la réponse immunitaire dans l'oreille interne. Ce stade de développement a été choisi car l'oreille interne est complètement mature à ce stade, la réponse immunitaire est pleinement fonctionnelle, et cela permet d'étudier les effets du bruit sur un système auditif développé. La mise à mort se fera à 22 jours (soit 1 jour après exposition sonore) pour évaluer les effets immédiats, et entre 1 et 2 mois post-exposition pour évaluer les effets à long terme. Ces stades permettent d'étudier les réponses immunitaires aiguës à 22 jours, les changements chroniques entre 1 et 2 mois, et la progression potentielle de la perte auditive.

4 590 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 3 060 tuées dans le premier établissement pour prélever l'oreille interne, les 1 530 autres transférées chez un collaborateur où elles sont tuées pour les mêmes analyses. Dès l'âge de trois semaines, elles sont exposées une à deux heures à un bruit que le porteur compare à celui d'une discothèque, puis anesthésiées pour des tests auditifs avec électrodes sous la peau, répétés jusqu'à six semaines après l'exposition, et prélevées de sang à chaque échéance. Une partie d'entre elles, privées d'une protéine de l'audition, présentent des troubles de l'équilibre dès la deuxième semaine de vie, qui durent jusqu'à leur mise à mort à 60 jours. Le porteur écrit pourtant n'anticiper aucune "dégradation durable de leur état de santé".

Objectifs

Le projet se réalise dans deux établissements utilisateurs (EU1/2 et EU2/2). La perte auditive présente dès la naissance, touche 26 millions de personnes dans le monde, dont 60 % (environ 15 millions) sont dues à des facteurs génétiques. Cependant, plus de 440 millions de personnes souffrent d’une surdité acquise ou progressive après la naissance, qu’elle soit liée à l’âge, au bruit ou à d’autres facteurs. La perte auditive liée à l'âge (ou presbyacousie) a un impact significatif sur la qualité de vie : 1 adulte sur 3 âgé de plus de 65 ans souffre d'un certain degré de perte auditive. Bien que les mécanismes sous-jacents à ces déficiences auditives restent à élucider, il est de plus en plus reconnu que l'inflammation joue un rôle crucial dans le développement et la progression des troubles auditifs, qu’ils soient d’origine génétique, environnementale (exposition au bruit) ou lié à l’âge. En étudiant des modèles de souris présentant une surdité progressive ou liée au bruit, ciblant des gènes clés liés à l'immunité et ses voies de régulation, nos objectifs sont de : - caractériser les voies moléculaires, découvrir des marqueurs précoces, précis, et spécifiques pour la manifestation et l'évolution de la perte auditive - Étudier les liens entre l’inflammation, les marqueurs immunitaires et la perte auditive, en conditions normales et après exposition à des bruits. Ces recherches pourraient ouvrir la voie à des traitements ciblant l’inflammation dans l’oreille interne, réduisant ainsi les dommages auditifs et améliorant la fonction auditive.

Bénéfices attendus

Les données obtenues de ce projet nous permettront de mieux comprendre la relation entre la surdité progressive ou liée au bruit et la dérégulation des voies immunitaires. Nous identifierons également des biomarqueurs précoces, précis et spécifiques pour la manifestation et l'évolution de la perte auditive. Cela nous permettra de développer des thérapies ciblées pour atténuer les lésions auditives, applicables aux patients. À court terme, nous identifierons des marqueurs biologiques et des mécanismes physiopathologiques. À long terme, ces connaissances permettront de concevoir des traitements innovants pour préserver l'audition, avec des applications potentielles pour les humains et les animaux. Les résultats pourraient également contribuer à la prévention de la surdité induite par le bruit, un problème de santé publique majeur. Ce travail fondamental aura ainsi un impact significatif sur la recherche médicale et les applications cliniques futures.

Procédures

Dans l’EU1/2 : Exposition sonore : Les souris âgées de 3 semaines seront exposées pendant 1 ou 2 heures à un bruit d’un niveau sonore comparable à celui d’une discothèque ou une circulation urbaine dense. Tests auditifs : Des tests auditifs seront effectués dès l’âge de 3 semaines. Ces tests pourront être répétés à différents temps post-exposition sonore : 1 jour, 3 jours, 1 semaine, 2 semaines et 6 semaines. Les souris seront anesthésiées puis exposées à de brefs stimuli sonores d’intensité et de fréquence croissantes. Des mesures seront enregistrées à l’aide d’électrodes ou de sondes placées sous la peau ou à l’entrée du conduit auditif. L’ensemble de ces enregistrements ne durera pas plus de 30 minutes par session. Prélèvements de sang : Un petit échantillon de sang sera prélevé (quelques secondes par prélèvement) avant l’exposition sonore, puis à différents temps post-exposition sonore : 1 jour, 3 jours, 1 semaine, 2 semaines et 6 semaines. Aucune intervention ne sera effectuée dans l’EU2/2. Toutes les souris transférées dans l’EU2/2 seront mis à mort afin d’analyser des tissus.

Impact sur les animaux

Dans l’EU1/2 et l’EU2/2, certaines souris déficientes en protéine fonctionnelle de l’audition présentent des troubles de l’équilibre, qui apparaissent à partir de la 2ème semaine de vie post-natale et perdurent jusqu’à la mise à mort à l’âge de 60 jours. Les autres modèles murins, bien que sourds, ne présentent aucun autre symptôme et conservent un phénotype identique à celui des souris sauvages. Dans l’EU1/2, quelques manipulations du projet pourraient entraîner de légères nuisances : L’exposition sonore peut potentiellement induire un stress temporaire sur l’animal. Les études scientifiques sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité liée au bruit chez les rongeurs. Aucune dégradation durable de leur état de santé n’est anticipée, et aucun effet indésirable majeur (perte de poids, inactivité prolongée, comportement anormal) n’est attendu. Les tests auditifs nécessitent une contention de courte durée des souris, associée à une anesthésie générale légère pour les immobiliser. Bien que cette procédure puisse provoquer une angoisse passagère lors de la mise sous anesthésie, ses effets sont atténués par la courte durée du test (quelques minutes) et la réversibilité rapide de l'anesthésie. Aucun effet indésirable durable n'est attendu.

Devenir

À l'issue de cette procédure expérimentale, 3060 souris seront mises à mort dans l’EU1/2 pour récupérer des tissus de l’oreille interne afin de réaliser des analyses biologiques et histologiques. Les autres animaux (soit 1530 souris) seront transférées à un collaborateur dans l’EU2/2 où ils seront mis à mort pour une analyse complémentaire des mêmes tissus.

Remplacement

Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. Il n’existe pas à ce jour de méthode alternative in vitro ou in silico pour appréhender les mécanismes complexes impliqués dans le fonctionnement de l‘oreille interne que sont : 1) la perception du stimulus mécanique par les cellules sensorielles ; 2) la transduction de ce stimulus en un signal électrique ; 3) la transmission de ce signal électrique à certains neurones de la cochlée ; 4) le transfert via ces neurones et leurs relais de l’information jusqu’au cerveau. De fait, nous utiliserons des souris dans notre projet pour étudier les effets pathologiques de l’inflammation dans les surdités progressives ou liées au bruit, afin d’identifier des marqueurs biologiques, avec des applications potentielles pour les humains.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’individus par groupe expérimental, nous avons effectué une analyse de puissance statistique à partir des données issues de nos récentes publications. Ce qui nous a permis de déterminer qu’il nous faudrait un nombre de 5 individus par groupe. Nos données quantifiées seront analysées grâce à un logiciel d’analyse statistique. Nous choisirons les tests statistiques selon la taille et la distribution des échantillons. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et appliquerons les mesures sur le même animal le cas échéant.

Raffinement

Afin de limiter le nombre d’individus par groupe expérimental, nous avons effectué une analyse de puissance statistique à partir des données issues de nos récentes publications. Ce qui nous a permis de déterminer qu’il nous faudrait un nombre de 5 individus par groupe. Nos données quantifiées seront analysées grâce à un logiciel d’analyse statistique. Nous choisirons les tests statistiques selon la taille et la distribution des échantillons. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et appliquerons les mesures sur le même animal le cas échéant.

Choix des espèces

Les cellules et les molécules impliquées dans le fonctionnement de l’oreille interne sont comparables chez l’homme et la souris. Les pathologies qui nous intéressent ont déjà des modèles murins. Grâce à la transposabilité des résultats entre la souris et l’homme, ces modèles vont nous permettre d’explorer la relation entre la dérégulation des voies immunitaires et la surdité progressive ou liée à l'âge, et fournir ainsi de nouvelles stratégies thérapeutiques chez l’homme. Le projet impliquera principalement des souris adultes âgées de 3 semaines, correspondant au stade jeune adulte, afin d'étudier l'effet du bruit sur la réponse immunitaire dans l'oreille interne. Ce stade de développement a été choisi car l'oreille interne est complètement mature à ce stade, la réponse immunitaire est pleinement fonctionnelle, et cela permet d'étudier les effets du bruit sur un système auditif développé. La mise à mort se fera à 22 jours (soit 1 jour après exposition sonore) pour évaluer les effets immédiats, et entre 1 et 2 mois post-exposition pour évaluer les effets à long terme. Ces stades permettent d'étudier les réponses immunitaires aiguës à 22 jours, les changements chroniques entre 1 et 2 mois, et la progression potentielle de la perte auditive.