Système immunitaire

810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection anesthésiante dans l'abdomen précède l'instillation d'un liquide directement dans les poumons, geste répété une seconde fois pour une partie d'entre elles, avec un risque de blessure de la trachée. Certaines reçoivent ensuite une goutte de liquide par le nez six fois en deux semaines, et la croissance des tumeurs pulmonaires peut s'accompagner de difficultés respiratoires. La mise à mort sert à prélever les organes pour analyser le système immunitaire, et le porteur conclut qu'il n'existe "pas d'autre possibilité" que l'animal pour reproduire la réponse immunitaire.

Objectifs

L'élastine est une molécule donnant leur élasticité aux organes. Les poumons, de part leur besoin d'élasticité sont riche en élastine. Quand elle se dégrade des molécules appelées peptides d'élastine se forment et peuvent influencer les cellules du système immunitaire. Au cour de la croissance des tumeurs dans les poumons, beaucoup de peptides d'élastine sont produits. De plus ces peptides peuvent provenir d'un emphysème, c'est-à-dire de la destruction des poumons, qui est présent chez 50 à 60% des patients atteints de cancer des poumons. L'objectif de ce projet est de déterminer comment les peptides d'élastine influencent les cellules du système immunitaires pour les empêcher de combattre les cellules tumorales.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d'acquérir des connaissances supplémentaires sur la façon dont les peptides d'élastine influence le système immunitaire dans le cancer. A plus long terme, ce projet nous permettra de proposer de nouvelles thérapies ciblant les peptides d'élastines.

Procédures

Les souris subiront: Procédure 1 et 3: Une injection dans l'abdomen de produit anesthésiant et une injection d'un petit volume de liquide directement dans les poumons. Procédure 2: Deux injections dans l'abdomen de produit anesthésiant et deux injections d'un petit volume de liquide directement dans les poumons à quelques jours d'écart. Procédure 4: Une injection dans l'abdomen de produit anesthésiant et une injection d'un petit volume de liquide directement dans les poumons. Une semaine après les souris devront absorber une petite goutte de liquide par le nez 3 fois par semaine pendant 2 semaines soit 6 fois.

Impact sur les animaux

L'injection dans l'abdomen peut causer une douleur légère de courte durée. L'injection dans les poumons peut provoquer un inconfort. Dans de rares cas, il peut y avoir une blessure de la trachée qui conduira à l'euthanasie de la souris. La croissance des tumeurs dans les poumons pourrait s’accompagner de difficultés respiratoires. L'administration par le nez peut provoquer un inconfort.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de la procédure. En effet, l'analyse du système immunitaire nécessite la mise à mort pour le prélèvement et l'analyse des organes.

Remplacement

Les résultats précédemment publié par la communauté scientifique nous a confirmé qu'il n’existe pas d'autre possibilités que l'animal nous permettant de reproduire les mécanismes biologiques complexes à l’œuvre dans la réponse immunitaire. Notre projet nécessite donc l’utilisation d’un modèle animal.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons calculé le nombre d'animaux nécessaire au plus juste afin de limiter le nombre de souris.

Raffinement

Les techniques utilisées ont été optimisée dans le laboratoire afin de limiter l'utilisation des animaux. Les souris feront l’objet d’une surveillance rapprochée afin de détecter tout stress et souffrance et d'y pallier. De la naissance à la mort, les animaux seront hébergés dans des conditions optimales incluant un enrichissement.

Choix des espèces

Il n’existe aucun modèle n'utilisant pas les animaux capable de reproduire la complexité de la réponse immunitaire, le recours à l’animal est donc nécessaire. La souris est couramment considérée comme proche de l'humain pour l’étude du système immunitaire. L'utilisation de souris jeunes adulte est indispensable puisque la dégradation des poumons est un processus normal du vieillissement qui pourrait changer nos résultats mais le cancer du poumon que nous étudions est une maladie de l'adulte.

2 247 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les receveuses recevant à elles seules 9,5 grays d'irradiation corporelle totale en une journée, fractionnés en deux séances espacées de six heures. Les donneuses reçoivent une injection quotidienne de substance inflammatoire pendant un mois, une injection sublétale endommageant les cellules, ou 2 grays d'irradiation, avant d'être tuées pour prélever leurs cellules souches du sang. Chez les receveuses dont le greffon ne parvient pas à reconstituer le système sanguin détruit, le porteur décrit une détresse modérée cinq jours après la transplantation, et fixe des points limites qui vont de l'incapacité à se redresser à la peau ulcérée. L'espoir déclaré est de trouver comment lutter contre le vieillissement du sang, quand la destruction du système sanguin de plusieurs centaines de souris est, elle, le point de départ du protocole.

Objectifs

Les principaux objectifs de ce projet sont de comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent le vieillissement du sang (capacité réduite à se régénérer, à se différencier et à produire un répertoire complet de cellules sanguines et immunitaires matures). En impactant la fonction des cellules souches hématopoïétiques (CSH) (qui peuvent se transformer en tous les types de cellules sanguines), le vieillissement et les facteurs environnementaux tels que l'exposition à l'irradiation, la chimiothérapie ou l'inflammation chronique qui déclenchent un vieillissement prématuré, sont fortement associés à un risque accru de développer de nombreux troubles de santé liés à l'âge tels que les cancers et les maladies cardiaques, par le biais d'une baisse de l'immunité et d'une augmentation des infections et de l'inflammation.

Bénéfices attendus

Dans ce projet, nous testerons si l'activation de certains gènes sauteurs de notre génome, connus sous le nom d'éléments transposables, entraîne des changements fonctionnels dans les CSH et leur production de cellules myéloïdes avec l'âge et après un stress tel que la chimiothérapie, l'irradiation ou le stress inflammatoire, et si les éléments transposables sont impliqués dans les propriétés inflammatoires des CSH âgées, des progéniteurs myéloïdes et des cellules matures. Cela nous permettra d'identifier un mécanisme de vieillissement et pourrait donc offrir des moyens de lutter contre le vieillissement du système sanguin et les maladies du sang liées à l'âge.

Procédures

Les souris donneuses sont injectées par voie intrapéritonéale avec une substance qui induit une inflammation (6μg/souris/jour pendant un mois, et l'injection peut être réalisée en 3 secondes), injectées par voie intraveineuse avec une substance qui peut causer du stress et des dommages cellulaires (dose unique sublétale, la procédure d'immobilisation des souris et d'injection de la substance peut être réalisée en 25 minutes), irradiation corporelle totale (2Gy une fois chez les souris, la durée de l'irradiation est de 3 minutes), ou subissent un vieillissement naturel. Après chaque traitement, les souris sont euthanasiées et les CSH sont collectées, triées et examinées en vue d'une coculture puis d'une transplantation dans des souris receveuses. Les souris receveuses seront irradiées pendant 11 minutes dans un irradiateur à rayons X, où la dose de 9,5 Gy sera divisée en deux : 5 Gy le matin, et 6 heures plus tard, une autre dose de 4,5 Gy. Les souris receveuses subiront des injections intravasculaires (une par souris receveuse, l'injection de cellules dure environ 15 secondes) et des prélèvements sanguins (le prélèvement dure environ 15 secondes, 3 prélèvements sanguins par souris à 4, 8 et 12 semaines après la transplantation).

Impact sur les animaux

La piqûre de l'aiguille pour l'injection intraveineuse pendant les traitements des procédures, ou pendant les procédures de transplantation, provoque une légère douleur de courte durée. L'incapacité des greffons à restaurer le système sanguin (éliminé par l'irradiation) entraîne une détresse modérée chez l'animal 5 jours après la transplantation.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin d'isoler et d'étudier les cellules souches sanguines (qui peuvent se transformer en tous les types de cellules sanguines).

Remplacement

Ce protocole étudie l'interaction entre différentes cellules, telles que les cellules souches sanguines (qui peuvent se développer en tous types de cellules sanguines), et les cellules de leur micro-environnement, telles que les cellules myéloïdes. Aujourd'hui, il n'existe pas de système in vitro adapté à l'étude du processus de production des cellules sanguines qui soit comparable au corps des mammifères et qui établisse un micro-environnement dans lequel les CSH peuvent rester à l'état de sommeil. Seules certaines expériences peuvent être réalisées in vitro, comme les essais de formation de colonies, et ce sont celles qui seront utilisées. Il est donc indispensable de réaliser des expériences in vivo sur des souris.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, chaque groupe contiendra le nombre minimum nécessaire pour la quantité de matériel nécessaire à l'expérience et pour obtenir des résultats statistiquement pertinents. Nous effectuerons 3 répétitions pour vérifier si la variation est significative. Si les deux premières expériences donnent le même résultat, la troisième expérience sera annulée afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Pendant toute la durée des expériences, les souris seront surveillées par nous-mêmes et par les zootechniciens, et les critères de finalité humaine (arrêt/euthanasie des animaux) seront appliqués si l'un des critères suivants est observé: (1) Portage/mouvement : déficience grave (immobile lors d'un réveil prolongé (>15 minutes); ne bouge pas lorsqu'on le pousse ou fait de faibles tentatives de mouvement; s'effondre et est incapable de se redresser; agitation continue (>1 minute). (2) Posture: gravement altérée. (3) Pelage: gravement altéré / perte de poils (piloérection généralisée, c'est-à-dire pelage très rêche sur la majeure partie de la surface du corps). (4) Peau: Ulcérée. (5) Poids corporel : Perte >20 %.

Choix des espèces

La souris est le système idéal pour étudier le processus de production des cellules sanguines, car le système sanguin est très bien conservé entre les souris et les humains. En outre, le vieillissement du système sanguin est bien défini et l'approximation des âges pertinents entre l'homme et la souris est connue. Les animaux utilisés pour les expériences seront âgés de 2 à 4 mois, mâles et femelles. Chez ces jeunes souris, le pool de CSH est faible, mais la capacité à reconstituer le système sanguin est élevée.

Commandées à sept semaines chez un fournisseur agréé, ou nées de lignées génétiquement modifiées comparées à leurs contrôles de portée, 1 940 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever peau, cerveau, moelle épinière, rate et ganglions rachidiens. Le dos est dépilé puis exposé vingt minutes aux ultraviolets sous anesthésie, et la sensibilité mécanique de la zone brûlée est mesurée dix minutes par jour sur animal éveillé. Une partie subit l'ablation des glandes surrénales sous anesthésie profonde à l'âge de quatre semaines, d'autres reçoivent du LPS pour déclencher une inflammation aiguë, de la toxine diphtérique ou du tamoxifène jusqu'à trois fois par semaine. Le porteur affirme que ces interactions entre système nerveux et système immunitaire ne peuvent pas encore être modélisées in vitro ou in silico, tout en annonçant l'emploi de cocultures de neurones et de cellules immunitaires déjà maîtrisées au laboratoire.

Objectifs

Lors d’un coup de soleil, les cellules immunitaires orchestrent la réparation cutanée. La peau est aussi densément innervée par des neurones sensoriels qui communiquent avec les cellules immunitaires pour optimiser la cicatrisation, puis transmettent les informations vers le cerveau. Nous avons récemment observé qu’une zone particulière du cerveau appelée hypothalamus était sollicité suite aux coups de soleils et induisait la libération de neurohormones, les glucocorticoïdes, aux propriétés anti-inflammatoires. Notre objectif dans ce nouveau projet est de caractériser comment la peau et le cerveau dialoguent pour assurer un processus de cicatrisation optimal. Notre modèle de lésion cutanée aux ultraviolets est idéal pour étudier les échanges entre le système nerveux et le système immunitaire. En effet, il permet de suivre à la fois le processus de cicatrisation et la transmission nerveuse des messages de toucher et de douleur vers la moelle épinière jusqu’au cortex cérébral. Notre équipe a déjà démontré l’importance des neurones sensoriels au cours de la réparation de la peau, cependant, comment le cerveau perçoit les lésions cutanés et y réponds, reste encore mal compris. Ainsi, le projet a pour but de répondre aux objectifs suivants : (1) identifier les étapes clés de la réparation cutanée après lésion chez des souris de type sauvage, et sa perception par le système nerveux périphérique et central. (2) Déterminer les rôles respectifs des neurones sensoriels et de l’hypothalamus dans la réparation cutanée. (3) Déterminer les mécanismes moléculaires, médiés par le cerveau, qui orchestrent la réponse immunitaires de réparation cutanée. Comprendre ces mécanismes nous permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter les pathologies inflammatoires, prévenir les douleurs chroniques et favoriser la régénération tissulaire.

Bénéfices attendus

L’orchestration du processus de régénération tissulaire après lésion, par le système nerveux périphérique et central, reste encore très inexplorée. L’un des avantages majeurs de la neuro-immunologie est d’identifier des cibles pharmacologiques qui pourraient simultanément soigner les pathologies inflammatoires, et prévenir les douleurs qui y sont associées. Outre son aspect fondamental, la compréhension des mécanismes régulateurs sous-jacents, permettrait d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter l’inflammation et favoriser la réparation tissulaire tout en traitant les douleurs associées. Cette approche est particulièrement intéressante pour des personnes souffrant de défaut de cicatrisation telles que les personnes âgées ou bien atteintes de diabète. Nous proposons d’étendre nos résultats précédents à l’étude des interactions bidirectionnelles entre la peau et le cerveau. La douleur et le stress associé à une blessure (invalidité, chirurgie) constituent un problème majeur de santé public. Mieux comprendre comment ces deux processus modulent le système immunitaire au cours de la cicatrisation est primordial pour améliorer à terme le confort des patients, prévenir l’escalade de la douleur vers un stade chronique et approfondir notre compréhension de son mécanisme d’action. A terme, cette étude permettra de développer de nouveaux médicaments pour traiter la douleur inflammatoire tout en minimisant les potentiels effets secondaires.

Procédures

Toutes les souris subiront une anesthésie générale afin de subir une dépilation sur la peau du dos puis une exposition aux ultraviolets pendant 20 minutes de la zone dépilée, toujours sous anesthésie. Nous réaliserons ensuite des études de comportement pour tester l’évolution de la perception de la douleur (mesure de sensibilité mécanique ; 10 min/jour) suite à l’exposition aux ultraviolets sur animaux vigiles. Plusieurs des injections à réaliser (1 min) sont faites en intrapéritonéal, en sous cutané, ou en intradermique, sur animaux vigiles. Des prélèvements sanguins seront faits sur la veine sous-mandibulaire (2 min). Certaines procédures nécessiteront une chirurgie (ablation des glandes surrénales ; 10 min) sous anesthésie profonde (45 min), après laquelle la plaie sera suturée et les souris suivies quotidiennement et traités avec des analgésiques, crème cicatrisante et anti-inflammatoires.

Impact sur les animaux

Les animaux seront amenés à subir une irradiation aux ultraviolets (20 minutes) sur une petite zone de la peau du dos qui pourraient induire une perte de poids (sur 2 jours), des modifications de comportement en plus de l’inflammation cutanée. La procédure pourra aussi provoquer une sensibilité mécanique ainsi qu’un potentiel prurit (démangeaisons) au niveau de la peau irradiée. Les mesures de sensibilité mécanique (5 min.) peuvent engendrer du stress. Toutes ces procédures seront réalisées par un personnel qualifié et expérimenté et tout sera mis en œuvre pour minimiser la nuisance provoquée. Les injections, en intrapéritonéale ou sous cutanée, réalisées sur animaux vigiles peuvent générer un stress de courte durée (5 min.). Les modèles génétiques utilisés ne présentent pas de phénotypes dommageables. L’effet principal des déplétions génétiques que nous réalisons est une diminution de la sensibilité à la douleur chez ces animaux (perte de sensibilité à la chaleur, ou aux stimulations mécaniques). Le suivi de certaines souris impliquera une anesthésie légère à l’isoflurane (5 min.) jusqu’à 3 fois par semaine, ce qui induira du stress à l’animal. De même, certaines méthodes de traçage génétique nécessiteront une injection de tamoxifène jusqu’à 3 fois par semaine. La déplétion de certaines cellules immunitaires nécessitera une injection intrapéritonéale unique de toxine diphtérique. Pour notre approche pharmacologique, les traitements (injection ou application topicale) seront effectués journalièrement pendant 4 jours sous isoflurane et pourront engendrer du stress. La procédure (No3) chirurgicale visant à enlever les glandes adrénales (20 min/souris) nécessitera un traitement pré- et post-opératoire analgésique pour minimiser la douleur et le stress des animaux avant, pendant et après la chirurgie. Les souris traitées au LPS subissent une inflammation aigue pour une période de temps très courte (6 heures) au bout de laquelle les souris seront sacrifiées et analysées. La dose utilisée (100ng/10g) n’induit pas de choc septique. Cependant, il se peut que ces souris subissent une baisse transitoires (45 min.) de leur température corporelle. Nous utiliserons un tapis chauffant (37C) ainsi qu’un milieu enrichi pour prévenir cette hypothermie avant analyse.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures et les organes d'intérêts (peau, DRG, cerveau, moelle épinière, rate, ganglion lymphatique) seront prélevés post mortem pour analyse. Les animaux seront euthanasiés car le prélèvement des différents tissus est indispensable pour étudier le recrutement cellulaire de la réponse inflammatoire au niveau des tissus étudiés.

Remplacement

Le modèle animal (in vivo) est indispensable pour étudier les interactions entre système immunitaire et système nerveux sensoriel. En effet, ce sont des événements progressifs et multifactoriels qui dépendent des interactions tissulaires, cellulaires et moléculaires, localement sur le site inflammatoire mais également à distance dans les ganglions rachidiens de la racine dorsale (DRG) qui innervent la peau. Ces interactions ne peuvent pas encore être modélisées in vitro ou in silico, en particulier l’étude de l’innervation dans un tissu donné. Cependant, pour la recherche de mécanismes d’interaction neurone/cellule immunitaire ou des neuropeptides produits par ces neurones sensoriels, nous veillerons à utiliser dès que possible des techniques ex vivo déjà maîtrisées au laboratoire, telles que la coculture de neurones et de cellules immunitaires.

Réduction

Le plan de nos expériences est construit de manière à limiter le nombre de souris au maximum. Sur la base de nos résultats précédents, pour une différence biologiquement pertinente, nous avons estimé que 10 souris par expérience sont nécessaires : Des groupes de 5 souris seront générés en adéquation avec l’âge, le sexe et le fond génétique contrôle à chaque lignée murine (5 souris dites « test » et 5 souris « contrôles », soit 10 souris par expérience) pour chaque procédure. Chaque expérience sera répétées au moins une fois, soit 20 souris pour chaque condition testée pour répondre aux exigences statistique. Nous utiliserons à la fois des mâles et des femelles dans nos expériences, pour éviter de produire des animaux sans les utiliser. Tous les paramètres quantifiables seront vérifiés (poids, score d’inflammation, comportement) et tous les organes nécessaires à notre étude seront prélevés (peau, rate, et ganglion rachidien de la racine dorsale, moelle épinière et cerveau) afin d’éviter des expériences inutiles. Nous avons choisi de comparer les groupes de souris génétiquement modifiées avec leurs contrôles de portée respectifs et non avec des souris de type sauvage. Le contrôle des paramètres environnementaux et le statut sanitaire des animaux permettront de limiter la variabilité des résultats expérimentaux, et de réduire le nombre d’animaux nécessaire.

Raffinement

Nous avons optimisé le modèle UV dans notre Apafis précédent pour minimiser le stress et la souffrance liée à la lésion tissulaire. Seule une zone tres restreinte de la peau du dos des souris sera exposée aux ultraviolets. Les animaux utilisés dans ce projet sont élevés en groupes sociaux, la présence d’objets permet le raffinement de l’environnement dans des cages standards à toit ouvert (couvercle à filtre) avec de la sciure de bois utilisée comme litière et un accès ad libitum à un bidon d’eau et à un régime alimentaire standard. Nous utilisons alternativement des carrés de ouates pour que les animaux puissent faire un nid, des dômes en cellulose ou des tunnels en carton, qui sont changés chaque semaine. Les élevages sont effectués au sein d’un établissement agréé où 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages. L’état sanitaire et environnemental des animaux est contrôlé tous les jours. Nous avons recours à l’anesthésie/analgésie lors de l’exposition aux UV. Une planification fine des procédures expérimentales est effectuée (disponibilité des locaux d’expérimentation, du matériel, période d’acclimatation d’une semaine minimum des animaux aux pièces d’expérimentation et l’animalerie) pour diminuer le stress des animaux. Notamment lors du test comportemental par Von Frey les animaux seront acclimatés à l’enceinte 30 minutes avant les mesures pour minimiser le stress. Enfin l’établissement des points limites selon les grilles en annexe sera suivi au quotidien (vérification du poids, de la vivacité et de l’état du pelage des animaux) pour decider de continuer l’expérience ou non en fonction des signes vitaux des animaux. Une souris ayant perdu 20% de son poids sera systématiquement euthanasiée. Ces stratégies seront mises en place dans le but de réduire/supprimer la souffrance animale. Les modèles génétiques, ainsi que les déplétions chimiques ne présentent pas de phénotype dommageable. Les procédures incluant une chirurgie suivront un protocole strict pour réduire la souffrance de l’animal avant, pendant et après la chirurgie. Les souris seront maintenues profondément anesthésiées lors de l’opération et des soins pré-(Buprénorphine), per- (lidocaïne localement) et post-opératoires (Buprénorphine) adéquats sont administrés en plus de creme cicatrisante et nourriture humide pour éviter toute carences hydrique/alimentaires). Un tapis chauffant (37C) est utilisé pour éviter toute hypothermie pendant l'anesthésie.

Choix des espèces

Le niveau de similarité entre la souris et l’homme justifie son utilisation. L’état des connaissances actuelles, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation font de la souris le modèle idéal à l’étude des systèmes immunitaires et nerveux. En effet les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires entre la Souris et l’Homme. De plus, l’existence de modèle murins génétiquement modifiés fait de la souris un modèle animal de choix pour étudier ces phénomènes physiologiques. Des souris de 8 à 12 semaines seront utilisées car à ce stade elles ont atteint leur maturité en termes de défenses immunitaires et de développement du système nerveux. Ainsi, les animaux auront été commandés à 7 semaines auprès du fournisseur agréé de manière à ce qu'ils s'acclimatent à notre animalerie pendant au moins une semaine. Pour l’adrénalectomie, des souris de 4 semaines sont utilisées pour leur donner une période de rétablissement de 4 semaines avant induction de la lésion cutanée aux UV et étude de la réparation tissulaire.

Les 960 souris de ce projet seront toutes tuées, au nom de la gestion du risque lié à un agent pathogène de groupe III. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, infectées par le virus respiratoire syncytial ou par une souche de SRAS-CoV-2 adaptée à la souris, inoculée dans le nez sous anesthésie gazeuse. Chacune subit jusqu'à trois prélèvements de sang au sinus rétro-orbital sous anesthésie, avant chaque vaccination puis avant l'épreuve virale. Le porteur décrit des symptômes légers à modérés et une perte de poids qui n'excède pas 15 % chez les jeunes souris, et affirme que l'efficacité vaccinale ne peut être évaluée sans administrer l'agent pathogène à un animal vivant.

Objectifs

Les infections virales respiratoires représentent un défi de santé publique majeur à l’échelle mondiale. Parmi les virus responsables, on trouve notamment le virus respiratoire syncytial (VRS) et le SRAS-CoV-2. La prévention et le contrôle de ces infections virales constituent un enjeu crucial. L’étude des défenses immunitaires a longtemps été limitée aux poumons alors que les voies supérieures dont la muqueuse nasale sont les premiers tissus que rencontrent ces virus comme l'a très bien montré la pandémie de SRAS-CoV-2. Etudier les mécanismes d’infections et de défenses immunitaires dans la cavité nasale est donc indispensable pour mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques qui permettrons de lutter contre ces virus respiratoires et d'ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques. La plateforme vaccinale à adénovirus émerge comme une stratégie prometteuse pour le développement de vaccins contre les infections virales respiratoires. Cette approche exploite la capacité des adénovirus à délivrer des antigènes viraux ciblés dans les cellules hôtes. De plus, l'administration nasale de vaccins à adénovirus vise directement les voies respiratoires, stimulant ainsi les réponses immunitaires locales et conduisant potentiellement à la protection contre ces maladies tout en limitant la transmission des virus. Le présent projet a pour objectifs principaux (i) l’étude de la physiopathologie de l’infection à SRAS-CoV-2 et à VRS au niveau de la cavité nasale chez la souris et (ii) l’évaluation d’approches vaccinales adaptées à l’administration par voie nasale.

Bénéfices attendus

L’étude chez le rongeur des infections à SRAS-CoV-2 et à VRS, et des stratégies de prévention et/ou de contrôle est déterminante pour l’élaboration de stratégie de lutte contre les infections respiratoires. Ce projet s’inscrit dans une démarche de sciences appliquées au domaine médical en lien avec les déclarations d’intérêt, d’urgence ou de priorité nationale du gouvernement et des organismes publics de recherche. Ce projet va permettre d’évaluer les approches vaccinales à l’aide d’adénovirus et de caractériser le rôle des protéines du mucus (mucines) dans les infections virales respiratoires

Procédures

L’inoculation de la souche virale ou du vaccin est réalisée par voie nasale sous anesthésie gazeuse. Le vaccin est administré par injection intramusculaire à l’animal vigile par des manipulateurs expérimentés. Des analyses sérologiques seront réalisées au cours des essais vaccinaux. Tous les animaux seront prélevés au plus 3 fois lors de la phase d’immunisation : avant chaque vaccination (au maximum 2) et avant l’administration de la souche virale d’épreuve. Les prélèvements seront réalisés au sinus rétro-orbital sur animal anesthésié (isoflurane) avec ajout d’un collyre anesthésique.

Impact sur les animaux

L’infection de souris (> 5 mois) par le VRS ou la souche murinisée de SRAS-CoV-2 entraîne des symptômes légers ou modérés.L’infection par le VRS induit très peu de symptômes chez la souris (perte de poids très rare n’excédant jamais plus de 10%, pas de détresse respiratoire ni de changement de température corporelle, bonne apparence du pelage ni changement de comportement visible). L’infection de souris jeunes par la souche murinisée de SRAS-CoV-2 entraîne une perte de poids modeste, n’excédant pas 15% du poids initial. Le phénotype des lignées transgéniques Muc5b n'est pas dommageable avant l'âge de 6 mois car un problème de clairance mucociliaire peut se développer avec le temps aboutissant à un stress respiratoire. Cependant, les souris seront utilisées avant ce stade.

Devenir

La mise à mort des animaux est requise au regard de la gestion du risque d’exposition à l’agent pathogène de groupe III utilisé dans ce projet.

Remplacement

L’étude de la physiopathologie de l’infection et de l’efficacité vaccinale ne peut être menée sans avoir recours à l’administration de l’agent pathogène à l’animal vivant.

Réduction

Dans le but de suivre le principe des 3R et de réduire l’utilisation excessive d’animaux, le nombre de souris par groupe a été calculé sur la base de notre expérience acquise précédemment et des données bibliographiques (publications scientifiques). Dans notre expérience, des groupes de 6 animaux permettent d’atteindre une significativité statistique. La comparaison des traitements ou entre lignée de souris s’établit à l’aide de tests non paramétriques.

Raffinement

Pour minimiser le stress induit aux animaux, les souris seront anesthésiées sous isoflurane avant inoculation intra-nasale du virus ou du vaccin. L’endormissement complet sera contrôlé par pincement ferme de la queue. L’anesthésie à l’isoflurane est rapide et permet d’assurer un réveil rapide en minimisant l’hypothermie. Les animaux feront l'objet d'une surveillance accrue après l’administration des souches virales (mesure du poids quotidien et détection des points limites) afin de déceler rapidement une détresse de l'animal nécessitant une fin de protocole précoce. La bonne connaissance du modèle infectieux sur lequel repose ce projet permet de limiter les souffrances ressenties par les animaux au cours des procédures expérimentales. Notre expérience du modèle souris a été également mise à profit pour aborder la question du raffinement : enrichissement et habituation de l’animal à la manipulation. Les souris seront hébergées par 6 dans des portoirs ventilés, avec à leur disposition du matériel de nidification (coton), des tunnels et des maisonnettes en carton ainsi que des bûchettes de bois à ronger.

Choix des espèces

La souris est sensible à l’infection par les souches murinisées du SRAS-CoV-2. Elle présente l’avantage de pouvoir envisager l’emploi de souris génétiquement modifiée pour un gène d’intérêt nécessaire à l’exploration des mécanismes biologiques impliqués dans la susceptibilité ou la défense de l’hôte vis-à-vis de l’infection virale. La souris est le modèle rongeur pour les infections par le VRS, elle développe une infection productive et cette espéce permet d’utiliser des lignées transgéniques nécessaires à la réalisation du projet. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes entre 2 et 5 mois d’âge. Ces souris ont un système immunitaire mature et sont sensibles à l’infection par une souche adaptée à la souris tout en présentant des symptômes modérés.

Cinquante souriceaux âgés de deux à quatre jours vont être gavés ou piqués sous la peau pour que le personnel maîtrise le geste sur des nouveau-nés. 118 souris en tout vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour examiner leurs ganglions lymphatiques au microscope. Chaque animal reçoit trois gavages ou trois injections sous-cutanées sur trois jours consécutifs, avec une contention par la nuque, le gavage pouvant irriter à force de répétition. Le projet valide une nouvelle lignée de souris génétiquement modifiée, et le porteur justifie ses 68 autres animaux par le fait que le génotype reste inconnu à l'âge de l'administration, un quart environ formant les groupes utiles, pour une lecture qualitative de lames sans analyse statistique.

Objectifs

Les ganglions lymphatiques permettent l’initiation de la réponse immunitaire. Leur structure est formée par des cellules stromales qui forment un espace tridimensionnel dans lequel les cellules hématopoïétiques transitent et se regroupent en zones distinctes. Les cellules stromales mésenchymateuses du ganglion lymphatique organisent ainsi l’organe pour son bon fonctionnement. Des modèles de souris sont requises pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires pour la formation de ces cellules organisatrices. Dans ce projet, nous évaluerons une nouvelle souris génétiquement modifiée pour sa capacité de marquer les cellules mésenchymateuses et suivre leur différenciation.

Bénéfices attendus

Ces expériences permettront de valider le nouveau modèle de souris génétiquement modifiée et de faire avancer la recherche sur la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires. Les cellules mésenchymateuses jouent notamment un rôle clé dans la réponse immunitaire humorale impliquant des anticorps contre des maladies infectieuses, ou dans la formation des structures lymphoïdes retrouvées dans des cancers, ou des organes affectés dans des maladies autoimmunes. Ces résultats apporteront ainsi à court terme des données importantes sur la régulation et le développement du système immunitaire. Etant donné que des thérapies anti-cancer et anti-maladies autoimmunes visent le système immunitaire, ces résultats auront des retombées sur la thérapie anti-cancer et contre des maladies autoimmunes.

Procédures

Trois gavages ou 3 injections par voie sous-cutanée sont réalisés sur animal vigile sur une période de 3 jours consécutifs (duée de chaque injection ou gavage: 2-3 minutes). Le génotypage sera réalisé sur un surplus de tissu provenant de l'identification des animaux ou sur biopsie de queue réalisée post-mortem.

Impact sur les animaux

Le gavage peut être source d'irritation, du fait de la répétition du geste. Les injections répétées par voie sous-cutanée peuvent induire un certain inconfort. Ces voies d'administration nécessitent une contention au niveau de la nuque, source d’inconfort pour l’animal pendant quelques secondes.

Devenir

Euthanasie de tous les animaux à l'issue de la procédure et analyse post-mortem des ganglions lymphatiques par microscopie

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant la differenciation des cellules mésenchymateuses dans les ganglions lymphatiques ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduits de manière fiable par des expériences en culture cellulaire.

Réduction

Nous avons identifié des données dans la littérature scientifique, tels que la quantité de tamoxifène à administrer ou le moment choisi dans le développement de l’animal, permettant une meilleure réussite de l’expérience et ainsi de réduire le nombre de souris. Les moyens de l’administration (gavage oral ou injection par voie sous-cutanée) ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale. Une étude-pilote sera réalisée sur un maximum de 50 souriceaux âgés de 2-4 jours afin de maitriser les gestes techniques chez le nouveau-né, et ainsi minimiser la souffrance qui pourrait être induite lors de la manipulation. La validation de notre modèle sera ensuite réalisée avec un total de 68 animaux, en comparant l’efficacité d’excision suite à l’administration du tamoxifène par voie orale ou par injection sous-cutanée, versus des animaux contrôles qui recevront le véhicule. Ce total de 68 animaux est nécessaire dans la mesure où les produits seront administrés à 2-4 jours d’âge, où le génotype des animaux n’est pas connu. Théoriquement ¼ des animaux constitueront ainsi les cohortes expérimentales, soit environ 22-23 souris (15 animaux expérimentaux + 7-8 contrôles), effectif suffisant pour valider notre hypothèse. Cette validation est notamment basée sur une méthode d’analyse histologique qualitative, et n'implique donc pas d'analyse statistique, mais repose uniquement sur l'observation microscopique des lames.

Raffinement

Les injections sous-cutanées et les gavages sont effectués par un personnel formé et expérimenté. Les souriceaux sont rapidement retournés à la mère après injection ou gavage. Les souriceaux sont observés et surveillés dans les minutes qui suivent le gavage afin de s’assurer qu’il n’y a pas eu de fausse route. Un temps de récupération après les administrations est accordé (24h) aux animaux. Le bien-être de l’animal est évalué par un personnel expérimenté, prenant en compte l’attention accordée aux souriceaux par la mère, le lieu d’injection (sous-cutané au niveau de la nuque) et la croissance des animaux, le poids, l’apparence, le comportement, l'hydratation, la respiration et l’aspect des fèces. Lorsque qu’une anomalie est observée, l’animal bénéficie d’une prise en charge adaptée aux problèmes observés. A l’aggravation, la Structure du Bien-Être Animal est contactée et des mesures conseillées appliquées. Des points limites spécifiques ont été établis permettant de soustraire l’animal à la souffrance. Les souris seront hébergées par fratrie au sevrage tout en respectant le nombre de souris admis par cage. Si un animal devient agressif, il est aussitôt séparé du groupe. L’hébergement bénéficie d’un enrichissement des cages (matériel de nidification) et un tunnel sera utilisé lors de chaque manipulation et change.

Choix des espèces

La fonction du ganglion lymphatique et sa structuration sont identiques entre l’homme et la souris. Il existe chez la souris des moyens de suivre la différenciation des cellules par marquage génétique (lineage tracing) et d’invalider des gènes dans un type de cellules afin de pouvoir étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant la différenciation des cellules des ganglions lymphatiques à partir des cellules progénitrices. Des nouveaux-nés de 2 à 4 jours seront utilisés, en lien avec le développement du ganglion lymphatique qui commence au stade embryonnaire et se termine environ 5 à 7 jours après la naissance. Des souris adultes (8 semaines) où la différenciation des des cellules des ganglions lymphatiques est complétée, recevront également le tamoxifène et seront utilisées comme contrôles.

1 995 souris vont être infectées par le nez avec un virus de la grippe H1N1, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'infection leur fait perdre en moyenne 20 % de leur poids entre le septième et le dixième jour, selon le porteur. 135 subissent une seconde infection par une autre souche, 1 755 une injection intraveineuse d'anticorps, 435 trois gavages, 1 575 deux prises de sang, et 180 des injections dans le tibia ou la trachée. Le porteur conclut que "les avantages potentiels de ce projet à des fins médicales humaines justifient, d'un point de vue éthique, la réalisation d'expériences sur des animaux".

Objectifs

À travers l'histoire, l'humanité a été confrontée à plusieurs reprises à des épidémies de virus respiratoires qui se sont propagés rapidement dans le monde entier avant que nous ayons pu développer des vaccins efficaces. Par exemple, la grippe H1N1 a provoqué la mort de 50 millions de personnes lors de la pandémie de grippe espagnole en 1918, et le SARS-CoV-2, responsable du COVID-19, a déjà causé au moins 7 millions de décès. Ces virus déclenchent des réponses immunitaires importantes dans notre corps, notamment la production d'anticorps comme les IgM, IgG et IgA. Ces derniers, en particulier, sont essentiels pour protéger nos voies respiratoires en neutralisant les virus et en les empêchant de s'attacher aux cellules pulmonaires. Cependant, malgré l'efficacité des vaccins actuels, ils ne parviennent pas à générer des niveaux suffisants d'IgA dans les voies respiratoires. Comprendre comment les cellules produisant des IgA agissent pendant une infection respiratoire est donc crucial. Ce projet se concentre sur cette question, en explorant comment les cellules B qui fabriquent des IgA sont recrutées et quel impact cela a sur notre réponse immunitaire. En utilisant le virus de la grippe H1N1 comme modèle d'infection, et en travaillant avec des souris génétiquement modifiées, les chercheurs cherchent à mieux comprendre comment les cellules IgA influencent notre immunité. Cette recherche pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches de vaccination contre les maladies respiratoires.

Bénéfices attendus

Même si les IgA sont super efficaces pour protéger nos poumons contre les virus, les vaccins contre la grippe et le SARS-CoV-2 ne stimulent pas assez la production d'IgA dans nos voies respiratoires. C'est pourquoi il est crucial de comprendre comment les cellules qui fabriquent ces IgA agissent pendant une infection respiratoire. Dans ce projet, nous allons nous appuyer sur des découvertes récentes de mon équipe qui montrent que ces cellules sont dirigées vers un type spécifique de cellules immunitaires quand il y a une infection. On va développer des techniques sophistiquées pour comprendre comment les IgA influencent le comportement des cellules immunitaires, comme s'ils leur donnaient des instructions spéciales pour mieux combattre les infections. En comprenant mieux cela, on pourrait améliorer nos stratégies pour développer des vaccins plus efficaces.

Procédures

1) Infection intranasale primaire avec le virus de la grippe souche H1N1 : 1995 souris (1 fois - 1 heure). 2) Infection intranasale secondaire avec le virus de la grippe souche H3N2 : 135 souris (1 fois - 1 heure). 3) Injection par voie intraveineuse d'anticorps avant la mise a mort: 1755 souris (1 fois - 5 minutes). 4) Gavage oral d'un produit chimique pour induire la suppression de gènes dans de l'huile de maïs : 435 souris (3 doses - 20 seconds/dose). 5) Marquage des oreilles: 750 souris (10 seconds). 6) Prelevement sanguin: 1575 souris (2 fois - 20 seconds/fois). 7) Injection intratibiale d'un produit chimique: 90 souris (1 fois - 1 heure). 8) Injection intratracheale d'un produit chimique: 90 souris (1 fois - 10 minutes). 9) Injection intratracheale des anticorps: 105 souris (1 fois - 10 minutes).

Impact sur les animaux

1) L'infection intranasale par le virus de la grippe induit une perte d'appétit transitoire et une perte de poids moyenne de 20 % entre les 7e et 10e jours de l'infection. 2) Le gavage des animaux s'il est mal fait peut provoquer de la souffrance de l’animal. 3) La petite perforation de l'oreille pour le génotypage peut stresser l'animal. 4) Le prélèvement sanguin chez les animaux, s'il est mal réalisé, peut entraîner des saignements excessifs. 5) Complications de l'injection dans la veine caudale et le dispositif de contention pour l'injection qui peut stresser les souris. 6) L'instillation intratrachéale, si mal réalisée, peut entraîner des problèmes respiratoires chez la souris. 7) L'injection intratibiale peut entraîner une réduction de la motilité chez la souris et causer une certaine douleur pendant la journée de l'injection.

Devenir

Les animaux seront mis a mort a la fin de chaque experience. Nous prélèverons les organes (poumons, rate et ganglions lymphatiques) pour la cytométrie de flux, une technologie qui permet d'analyser rapidement des cellules lorsqu'elles passent devant plusieurs lasers, et la microscopie de cellules productrices d'anticorps.

Remplacement

La recherche sur les animaux est effectuée lorsqu'aucune autre approche ne permet d'obtenir les avantages scientifiques escomptés. Dans cette étude, nous analyserons le positionnement spatial de cellules B mémoires spécifiques dans la muqueuse pulmonaire apres l'exposition au virus de la grippe. Malheureusement, cet objectif ne peut être atteint autrement qu'en utilisant un modèle in vivo. En raison de la nature et de la complexité des interactions cellulaires au cours des réponses immunitaires, les expériences basées sur un organisme modèle sont inévitables pour développer nos connaissances sur les réponses des cellules B pulmonaires et ne peuvent pas être imitées par des modèles in vitro ou in silico. Nous utiliserons des souches de souris génétiquement modifiées, en raison des similitudes entre la physiologie de la souris et celle de l'homme et de la large gamme de réactifs immunologiques disponibles chez cette espèce. Les résultats escomptés permettront non seulement d'accroître les connaissances médicales, mais aussi de fournir des indications médicales pour le développement de vaccins contre le virus de la grippe. Par conséquent, les avantages potentiels de ce projet à des fins médicales humaines justifient, d'un point de vue éthique, la réalisation d'expériences sur des animaux.

Réduction

Dans la mesure du possible, nous réduirons le nombre d'animaux au minimum nécessaire. Nous utiliserons des tests statistiques lors de la planification des expériences afin de nous assurer que le nombre minimum d'animaux est utilisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Pour calculer la taille de l'échantillon requis, nous utilisons des logiciels, en tenant compte des considérations suivantes: a) puissance du test: 0,8; b) différence de rapport (taille de l'effet) à détecter / SD = 1; c) α = 0,05. d) test t bilatéral. Pour analyser les résultats, nous utiliserons des T-tests non appariés et One-way anova. Nous allons utiliser les mêmes souris pour les expériences d'imagerie et de cytométrie de flux pour réduire le nombre de souris nécessaires au projet.

Raffinement

L'utilisation d'animaux génétiquement modifiés et préalablement caractérisés est une bonne approche pour affiner les études sur les animaux, car elle évite l'utilisation de médicaments pour bloquer un processus biologique qui pourrait avoir des conséquences inattendues. Les souris seront hébergées dans des cages appropriées. La nourriture et l’eau seront à volonté. Des dômes et du papier absorbant seront misà disposition dans chaque cage pour enrichir le milieu. Nous pourrons fournir également des aliments semi-solides aux animaux au cours de traitment si necessaire. Nous surveillons les souris après chaque intervention pour nous assurer qu'elles retrouvent leur comportement normal après chaque intervention. Après une infection intranasale : surveillance jusqu'à ce qu'ils se réveillent de l'anesthésie (1 heure) et une fois par jour jusqu'à la reprise totale du poids (environ 14 jours). Après injection intra-tibiale : surveillance jusqu'à ce qu'ils se réveillent de l'anesthésie (1 heure) et une fois par jour jusqu'à la reprise totale du mobilité. Après instillation intratrachéale : 30 minutes. Après gavage oral : 30 minutes. Après injection intraveineuse : 10 minutes. Après un perçage d'oreille : 1 minute. Nous avons mis en place de points limites pour chaque precedure.

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle d’étude des maladies infectieuses pulmonaires car l’obtention d’animaux génétiquement modifiés est bien contrôlée et les modèles expérimentaux bien calibrés. Or ces modèles sont les seuls permettant de tester la contribution génétique de modifications de certains gènes de susceptibilité au développement de ces pathologies. Afin de limiter les variations dues à des différences d’âge, des souris adultes de 8 à 14 semaines seront utilisées.

Une ou deux injections dans l'abdomen, puis une goutte du même produit déposée dans le nez dix jours plus tard : 84 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes. L'inflammation pulmonaire ainsi déclenchée peut s'accompagner de difficultés respiratoires. Le projet cherche à comprendre comment certaines cellules immunitaires pénètrent dans les poumons, les applications thérapeutiques étant renvoyées au long terme. Sur la réduction, le porteur écrit avoir calculé le nombre d'animaux "au plus juste", sans donner ni méthode ni effectif par groupe.

Objectifs

Les pathologies inflammatoires pulmonaires ont pour caractéristique commune une inflammation pulmonaire qui perturbe les échanges gazeux lors de la respiration.Les cellules du système immunitaire participent à la maladie et pourraient constituer une cible thérapeutiques intéressante. Ce projet a pour but d'étudier la façon dont certaines de ces cellules immunitaires (les cellules lymphoïdes innées) pénètrent dans les poumons.

Bénéfices attendus

A court terme sur un plan fondamental, ce projet permettra de faire avancer les connaissances scientifiques sur la façon les cellules du système immunitaire infiltrent les poumons. Sur un plan pathologique, ce projet pourra déterminer comment l'infiltration des cellules lymphoïdes innées participe aux maladies inflammatoires respiratoires. A plus long terme, cela permettra de proposer des applications thérapeutiques ciblant les cellules immunitaires dans ces pathologies.

Procédures

Les souris subiront, selon la procédure, soit une soit deux injections dans l'abdomen des produits les sensibilisant. 10 jours après les souris devront absorber par le nez une goutte des mêmes produits.

Impact sur les animaux

L'injection dans l'abdomen peut causer une douleur légère de courte durée. Le développement de l'inflammation pulmonaire pourrait s’accompagner de difficultés respiratoires.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de la procédure. En effet, l'analyse du système immunitaire nécessite la mise à mort pour le prélèvement et l'analyse des organes.

Remplacement

Les résultats précédemment publié par la communauté scientifique nous a confirmé qu'il n’existe pas d'autre possibilités que l'animal nous permettant de reproduire les mécanismes biologiques complexes à l’œuvre dans la réponse immunitaire. Notre projet nécessite donc l’utilisation d’un modèle animal.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons calculé le nombre d'animaux nécessaire au plus juste afin de limiter le nombre de souris.

Raffinement

La méthodologie utilisée a été optimisée dans le laboratoire afin de limiter l'utilisation des animaux. Les souris feront l’objet d’une surveillance rapprochée afin de détecter tout stress et souffrance et d'y pallier. De la naissance à la mort, les animaux seront hébergés dans des conditions optimales incluant un enrichissement.

Choix des espèces

Il n’existe aucun modèle n'utilisant pas les animaux capable de reproduire la complexité de la réponse immunitaire, le recours à l’animal est donc nécessaire. La souris est couramment considérée comme le modèle le plus proche de l'humain pour l’étude du système immunitaire. L'utilisation de souris jeunes est indispensable puisque l’altération des poumons est un processus normal du vieillissement qui pourrait changer nos résultats.