Système immunitaire

Des souris receveuses sont irradiées à une patte arrière, puis reçoivent la moelle osseuse de souris génétiquement modifiées pour le gène TET2, dont la mutation est activée deux mois plus tard par cinq jours de gavage d'un médicament. 1320 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les receveuses subissent deux doses d'irradiation à 17 heures d'intervalle, une injection de cellules sous anesthésie et des prises de sang régulières pendant deux mois de suivi, le porteur signalant douleurs temporaires, perte de poids et baisse d'activité possibles. Aucune mise à mort n'est décrite dans ce projet. Toutes les souris doivent être exportées en Allemagne, où des collaborateurs provoqueront chez elles un accident vasculaire cérébral, dans le cadre d'un projet européen.

Objectifs

Ce projet vise à explorer le lien possible entre l'accident vasculaire cérébral (AVC) et l'hématopoïèse dite clonale, une condition liée à l'âge où les cellules souches hématopoïétiques (à l’origine de toutes les cellules du sang) subissent des mutations et prolifèrent de manière déséquilibrée. Les personnes atteintes d'hématopoïèse clonale présentent un risque accru de développer des tumeurs, des AVC ou des crises cardiaques. Il reste cependant incertain que ces cellules sanguines mutées pénètrent dans le cerveau et y causent des dégâts après un accident vasculaire cérébral. Chaque année, environ 12 millions de nouveaux cas d'AVC sont recensés dans le monde, avec, au total, environ 103 millions de survivants qui doivent vivre avec les séquelles de cette affection. Dans une étude récente, 41 % des patients ayant subi un premier AVC présentaient des mutations dans leurs cellules souches hématopoïétiques, augmentant leur risque de subir un deuxième AVC ou d'autres événements vasculaires dans les trois ans suivants. Pour examiner cette hypothèse, nous allons utiliser des souris génétiquement modifiées pour le gène appelé TET2 codant pour une enzyme importante pour la stabilité de l’hématopoïèse. Nous transplanterons la moelle osseuse de ces souris dans des souris receveuses localement irradiées sur le membre postérieur au préalable afin d’étudier la progression de l’hématopoïèse clonale à partir du site d’implantation du greffon comme pour modéliser le départ d’une hématopoïèse clonale chez l’Homme. Ces souris seront ensuite envoyées à nos collaborateurs en Allemagne pour modéliser l'AVC dont les conséquences seront graduées par gravité en fonction de la proportion de cellules clonales TET2. Les études sur les souris nous permettront de mieux comprendre les mécanismes des lésions cérébrales post-AVC, notamment l'impact des traitements sur la motricité fine, la démarche, l'équilibre, et la restauration des fonctions motrices, ainsi que sur la possibilité de traiter l'inflammation cardiaque. L'objectif global de ce projet est donc de déterminer si l'hématopoïèse clonale contribue à la gravité des AVC et de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents, ce qui pourrait ouvrir la voie à de nouveaux traitements pour améliorer la qualité de vie des patients.

Bénéfices attendus

Ce projet présente plusieurs bénéfices potentiels significatifs pour la compréhension et le traitement des accidents vasculaires cérébraux (AVC) et des conditions liées à l'hématopoïèse clonale. 1. Amélioration de la compréhension des AVC: En explorant les liens entre l'hématopoïèse clonale et les AVC, nous pourrons mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans l’aggravation des conséquences post-AVC et comment ceci est influencé par la présence de mutations sur un gène connu comme responsable de dérégulations de l’hématopoïèse (TET2). 2. Développement de nouveaux traitements: La recherche sur les souris génétiquement modifiées pour ce gène TET2 permettra d'évaluer l'impact des mutations sur les lésions cérébrales après un AVC. Ces études peuvent révéler si la taille du clone muté aggrave les conséquences de l'AVC, ce qui ouvrirait la voie à de nouveaux traitements ciblés, notamment des thérapies anti-inflammatoires adaptées aux patients présentant une proportion importante de cellules mutées pour le gène TET2.. 3. Amélioration de la prise en charge des patients: Pour les patients atteints d'hématopoïèse clonale, comprendre le rôle des cellules mutées dans les tissus cérébraux après un AVC peut améliorer les stratégies de traitement. Par exemple, en mesurant la taille des clones mutés, les médecins pourraient mieux orienter les traitements pour réduire l'inflammation et améliorer la récupération des fonctions motrices et cognitives après un AVC. 4. Contributions à la recherche sur le cancer: Étant donné que la mutation de TET2 est également courante dans les cancers de la moelle osseuse, ce projet pourrait avoir des implications pour la recherche oncologique. Les découvertes faites ici pourraient aider à développer des traitements qui ciblent non seulement les AVC mais aussi les cancers liés à ces mutations génétiques.

Procédures

Dans ce projet, nous réaliserons plusieurs interventions sur des souris pour comprendre les effets de certaines cellules sur les accidents vasculaires cérébraux (AVC). Les souris seront d'abord endormies (15min) avec une injection pour les préparer à une procédure. Elles recevront ensuite deux courtes doses d’irradiation (5min) , espacées de 17 heures, pour préparer leur moelle osseuse à recevoir la greffe de nouvelles cellules. Après chaque dose de rayons, les souris seront réveillées. Deux heures après la deuxième irradiation, les souris seront brièvement endormies pour que nous puissions injecter (30 secondes par injection) les nouvelles cellules mutées pour le gène TET2. Cette méthode permet de s'assurer que ces cellules atteignent bien leur destination et commencent à se développer correctement dans la moelle osseuse des souris. Deux mois après cette intervention, nous donnerons un médicament par gavage (1 minute) aux souris pendant cinq jours pour activer la mutation de ces nouvelles cellules TET2. Nous surveillerons ensuite les souris pendant deux mois supplémentaires pour vérifier que ces cellules se développent comme prévu. Pendant cette période, nous prélèverons régulièrement de petites quantités de sang pour suivre l'évolution des cellules et vérifier l'état de santé général des souris.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées pour comprendre les effets de certaines cellules mutées sur les AVC pourraient éprouver divers désagréments et effets secondaires. Les procédures que les souris subiront, comme l'irradiation et la greffe de moelle osseuse, peuvent provoquer des douleurs temporaires et un stress. L'irradiation peut entraîner une gêne temporaire dans la zone traitée. De plus, le traitement avec un médicament peut aussi causer des douleurs passagères, et le fait de donner ce médicament aux souris peut les stresser. Après l'irradiation et la greffe, il est courant que les souris perdent un peu de poids en réaction à ces procédures. Cette perte de poids est généralement temporaire, mais nous devons surveiller les souris de près pour nous assurer qu'elles restent en bonne santé. Les souris pourraient également être moins actives et bouger moins que d'habitude pendant un certain temps après ces interventions. Elles pourraient réduire leurs activités quotidiennes, explorer moins leur environnement et interagir moins avec les autres souris. Il existe aussi des risques de complications, comme des infections ou des réactions du système immunitaire, bien que ces problèmes soient rares si les procédures sont bien contrôlées. En résumé, les souris pourraient ressentir des douleurs, du stress, une perte de poids et une diminution de leur activité pendant un certain temps en raison des interventions nécessaires pour cette étude. Nous veillerons à surveiller attentivement leur bien-être tout au long du processus.

Devenir

Tous les animaux sont prévus pour être exportés en Allemagne à nos collaborateurs pour les expériences d’AVC dans le cadre du projet européen.

Remplacement

Ce projet a pour but de comprendre le lien entre l'accident vasculaire cérébral (AVC) et un phénomène complexe appelé hématopoïèse clonale. Il explore comment certaines cellules sanguines, qui ont subi des mutations, interagissent avec le cerveau lors d'un AVC. A ce jour, les méthodes sans animaux ne peuvent pas reproduire ces interactions complexes. Les cultures cellulaires et les organoïdes (mini-organes cultivés en laboratoire) ne parviennent pas à imiter toutes les interactions entre les différentes parties du corps. Elles ne peuvent donc pas nous donner une vue complète des effets de l'hématopoïèse clonale sur les AVC. Les simulations informatiques et les modèles mathématiques peuvent aider à comprendre certains aspects de cette recherche. Toutefois, ces outils dépendent de données préexistantes et ne peuvent pas prédire de manière fiable les interactions biologiques complexes qui se produisent dans un organisme vivant. Par conséquent, ils ne sont pas suffisants pour répondre à nos questions de recherche. Pour vraiment comprendre comment l'hématopoïèse clonale influence la progression et les conséquences des AVC, nous devons observer ces processus dans un organisme entier. Les souris TET2 présentent des mutations génétiques spécifiques et sont essentielles pour cette étude. Elles nous permettent de modéliser les mutations et de voir leurs effets sur l'ensemble du corps, y compris le cerveau. Ces modèles animaux nous offrent une vue intégrée des interactions entre les cellules sanguines mutées et les tissus cérébraux touchés par un AVC. Cette compréhension est cruciale pour développer des stratégies thérapeutiques efficaces. En résumé, bien que nous ayons envisagé des alternatives non animales, elles ne peuvent pas fournir les informations nécessaires pour atteindre les objectifs de ce projet.

Réduction

Pour ce projet, nous avons pris plusieurs mesures pour réduire le nombre d'animaux nécessaires, tout en garantissant des résultats fiables et pertinents. D'abord, nous avons effectué des expériences préliminaires pour déterminer combien de souris sont nécessaires pour obtenir des résultats significatifs. Ces expériences nous ont aidés à établir des sous-groupes d'au moins 8 à 10 souris, ce qui est crucial pour assurer la validité des résultats. Pour chaque condition expérimentale, nous avons besoin d'un minimum de 60 souris. Cela inclut 30 souris greffées avec des cellules souches mutantes TET2 et 30 avec des cellules souches non mutantes, réparties en trois sous-groupes en fonction de la réponse biologique observée. Pour réduire encore le nombre d'animaux, nous avons optimisé nos protocoles expérimentaux. Cela signifie que nous avons standardisé les procédures pour maximiser les données obtenues sur chaque souris. Nous suivons chaque animal à plusieurs moments clés au cours de l'étude. Cette approche longitudinale permet d'obtenir plus d'informations de chaque souris, réduisant ainsi le nombre total d'animaux nécessaires. Nous avons aussi pris en compte la variabilité biologique inhérente à ce type d'étude, ce qui signifie que nous avons ajusté nos chiffres pour compenser les éventuelles variations biologiques. Ces mesures permettront de garantir des résultats fiables tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés dans cette recherche.

Raffinement

Pour minimiser les nuisances sur le bien-être des animaux dans les procédures expérimentales de ce projet, nous mettrons en place plusieurs mesure, basées sur les meilleures pratiques en matière de soin et d’éthique animale. Les animaux seront surveillés de manière régulière, surtout après les interventions critiques telles que l'irradiation et la transplantation de moelle osseuse. Des observations fréquentes seront réalisées pour détecter rapidement tout signe de douleur, de stress ou de comportement anormal ou des aspects tels que la perte de poids, l’inactivité, les signes de douleur et d’autres indicateurs de bien-être. Immédiatement après les interventions, les animaux bénéficieront de soins post-opératoires complets. Cela inclut la mise en place de conditions environnementales optimales (température, humidité, nourriture et eau) pour favoriser une récupération rapide et confortable. Toutes les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie générale pour minimiser la douleur et le stress. Les paramètres vitaux des animaux seront surveillés tout au long de l’anesthésie pour s’assurer qu’ils restent dans des plages sécuritaires. Les cages des souris seront enrichies pour fournir un environnement stimulant et réduire le stress. Cela inclut l’ajout de matériaux de nidification et de cachettes (tube carton) pour favoriser une activité physique et mentale. Un environnement enrichi contribue au bien-être général des animaux et à leur récupération post-intervention. Des points limites ont été définis pour limiter ou arrêter la douleur et une analgésie sera mise en place si nécessaire

Choix des espèces

Pour ce projet, nous avons choisi d'utiliser des souris adultes consanguines. Ces souris sont les mieux caractérisées et les plus couramment utilisées dans les études sur le système hématopoïétique car leur consanguinité permet d’éviter les rejets lorsqu’on les greffe entre-elles et de limiter les variabilités expérimentales. Elles ont la particularité de pouvoir exprimer deux protéines distinctes , ce qui permet de reconnaître le greffon de l’hôte greffé. Les souris TET2 expriment le CD45.1 et sont greffées dans des souris CD45.2, ce qui permet de les suivre dans l’organisme. Nous utilisons également des lignées spéciales de souris TET2 qui portent des mutations génétiques spécifiques muettes que l’on rend fonctionnelles après la transplantation, grâce à un traitement avec un médicament appelé tamoxifène. Cela nous permettra d’étudier comment ces mutations affectent les cellules sanguines de l’hôte et leur interaction avec le cerveau. Les souris que nous utiliserons pour les greffes et les expériences seront toutes des adultes, âgées de 8 à 12 semaines. Ce choix d'âge est crucial car les processus biologiques que nous étudions, tels que l'hématopoïèse (la formation des cellules sanguines), sont plus stables et prévisibles chez les souris adultes. De plus, étant donné que nos expériences peuvent durer 2 à 3 mois, il est important que les souris ne soient pas trop âgées, afin d'assurer que les résultats soient cohérents et fiables.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse des tissus, chacune passant deux séances d'imagerie par semaine pendant six semaines, soit jusqu'à douze anesthésies, avec pose d'un cathéter dans la veine de la queue. Deux injections de collagène à trois semaines d'intervalle déclenchent chez elles une polyarthrite, puis viennent deux injections de traitement par semaine pendant trois semaines et une contention quotidienne de cinq à dix minutes. Le porteur indique que le gonflement des articulations peut gêner le déplacement et la préhension jusqu'à faire perdre du poids, et que l'irritation au point d'injection peut conduire l'animal à se gratter jusqu'à la plaie. Il attend de ces expériences l'identification d'une cible thérapeutique et le repositionnement d'un anticancéreux déjà commercialisé, bénéfices renvoyés à des étapes ultérieures quand les gonflements et les plaies, eux, sont prévus au protocole.

Objectifs

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie inflammatoire chronique, caractérisée par une atteinte articulaire, souvent bilatérale et symétrique, évoluant par poussées vers la déformation et la destruction des articulations atteintes. Il s’agit du plus fréquent rhumatisme inflammatoire chronique, touchant entre 0,5 et 1% de la population mondiale, et touchant 4 fois plus les femmes que les hommes. Les premiers symptômes se traduisent par des douleurs articulaires, des rougeurs et des gonflements des articulations, en particulier des mains et des pieds. A l’heure actuelle, il n’existe pas de traitement de la PR, seulement des moyens de soulager la douleur ou réduire l’intensité des symptômes. Il est donc nécessaire de développer des médicaments à la fois efficaces contre la progression de la maladie mais aussi ses symptômes, ainsi que de développer des moyens diagnostics précoces. Différentes études suggèrent que la modulation d’EZH2, une histone méthyltransférase, pourrait être une cible thérapeutique intéressante pour le traitement de la PR. En effet, des études in vitro et in vivo ont démontré que l’inhibition d’EZH2 permet de réduire l’inflammation dans de nombreux contextes physiopathologiques. Plus particulièrement, le laboratoire a démontré que dans des modèles murins d’arthrose, une autre pathologie articulaire inflammatoire, l’inhibition d’EZH2 par un médicament, l’EPZ-6438, permet de réduire la progression de la maladie (destruction de l’articulation), et la douleur associée. Dans la mesure où, comme dans l’arthrose, l’expression d’EZH2 est augmentée dans l’articulation des patients arthritiques, il a été proposé que l’inhibition d’EZH2 pourrait réduire la progression de la PR. Dans ce contexte, le but de cette étude est d’évaluer l’effet de l’inhibition d’EZH2 dans un modèle expérimental de PR afin de mieux comprendre les mécanismes de la maladie et d’envisager de nouvelles pistes de traitements. L'étude du rôle d'EZH2 sera effectuée in vivo grâce à l'imagerie à particules magnétiques (MPI). L'objectif est de tester un nouvel agent de contraste qui a montré une sensibilité de détection en MPI supérieure à celle en imagerie par résonnance magnétique (IRM).

Bénéfices attendus

Plusieurs laboratoires dont le nôtre ont démontré que l’inhibition d’EZH2 par l’EPZ-6438 ralentit la progression de l’arthrose en réduisant la dégradation du cartilage et l’inflammation articulaire, et améliore les fonctions motrices des souris ainsi que la douleur, ce qui suggère qu’EZH2 serait une cible thérapeutique intéressante dans le traitement de cette pathologie articulaire. Pour cette étude, nous nous attendons à des effets comparables voire plus prononcés dans la mesure où l’arthrite est une maladie articulaire à forte composante inflammatoire. Les bénéfices attendus sont donc l’identification d’une nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de la PR, capable d’induire une réduction des signes cliniques (réduction du gonflement et de l’inflammation sur les pattes des animaux). L’EPZ-6438 étant un traitement déjà utilisé en médecine humaine pour le traitement de certains cancers, une stratégie de repositionnement du médicament dans cette nouvelle indication pourrait être envisagée. Par ailleurs, la mise au point du protocole d’imagerie de l’inflammation par imagerie à particules magnétiques (MPI) devrait permettre d'imager de manière ultrasensible, spécifique et précoce l'inflammation articulaire. Cette nouvelle méthode de diagnostic pourrait être extrêmement utile pour le suivi des troubles articulaires inflammatoires.

Procédures

Les animaux recevront deux injections à 21 jours d’intervalle pour induire l'arthrite ainsi que deux injections par semaine pendant 3 semaines pour le traitement. Une contention régulière afin d’observer les animaux et les signes cliniques de la maladie seront nécessaires quotidiennement (5-10 min par jour et par animal). Des examens d'imagerie auront lieu deux fois par semaine pendant 6 semaines (moins d'une heure par jour, sous anesthésie). Pour l’imagerie, la pose d’un cathéter dans la veine de la queue est nécessaire (intervention sous anesthésie, 15min environ).

Impact sur les animaux

L’induction de l’arthrite se traduit généralement par le gonflement des articulations des pattes ainsi que par l’apparition de rougeurs. Ces gonflements, s’ils atteignent un stade élevé, peuvent induire des difficultés à se déplacer et à la préhension et donc des difficultés à se nourrir et à une réduction de la mobilité. Une perte de poids significative peut donc être attendue. L'injection de collagène à la base de la queue peut générer une irritation conduisant la souris à se gratter au point d'injection et à former des plaies. Aucun effet secondaire ou mortalité n’ont été mis en évidence sur les souris après administration répétées du médicament, l'EPZ-6438, par gavage ou par injection dans la littérature. Les examens d’imagerie se dérouleront sous anesthésie générale des animaux mais la pose du cathéter veineux dans la queue pour l'administration de l'agent de contraste peut provoquer un hématome.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure afin de procéder à des analyses des tissus.

Remplacement

Au sein de notre projet scientifique, nous étudierons l’impact d’un traitement contre la polyarthrite rhumatoïde, une maladie inflammatoire chronique qui touchent plusieurs articulations. La physiopathologie est complexe avec l’implication de nombreuses cellules immunitaires (lymphocytes, macrophages, etc) et articulaires (chondrocytes, synoviocytes), ne permettant pas de récapituler l’ensemble des processus in vitro. Ainsi, l’impact du traitement par un inhibiteur d'EZH2, l’EPZ-6438 sur l’évolution de la maladie (notamment gonflement des pattes et rougeurs) ne peut pas être évalué sur un modèle ex vivo ou in vitro. Des tests in vitro ont été réalisés sur l'agent de contraste utilisé en imagerie à particules magnétiques et ont permis de montrer que les propriétés magnétiques des microparticules conféraient un signal spécifique en imagerie à particules magnétiques (MPI). Toutefois, les expériences in vivo ne peuvent pas être totalement remplacées par des études in vitro et il est nécessaire d'estimer l'affinité de l'agent de contraste pour les molécules d'adhésion présentes au niveau des vaisseaux sanguins exprimées en conditions inflammatoires. D'après des études pilotes, on sait que l'agent de contraste cible efficacement l'inflammation dans d'autres pathologies et l'on souhaite savoir si ce ciblage sera détectable en imagerie MPI pour révéler l'inflammation articulaire dans la polyarthrite rhumatoide. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Dans des études précédentes, il a été montré que 10 animaux par groupe étaient suffisants pour obtenir une différence significative du signal en imagerie par résonance magnétique. Cependant, les données cliniques de l’arthrite indiquent que le sexe a une influence significative sur le développement de la pathologie et notamment la mise en place de la réponse du système immunitaire, nous souhaitons donc étudier l'effet du sexe. Nous prévoyons donc des groupes composés de males et de femelles. Deux modèles d'arthrite seront étudiés : un modèle de poussée et un modèle précoce de la maladie. L'incidence de l'arthrite dans le modèle de poussée est compris entre 80 et 100% tandis que l'incidence de l'arthrite dans le modèle précoce est compris entre 30 et 60%. Ainsi, un total de 60 animaux pour le modèle de poussée est nécessaire, mais 120 animaux seront nécessaires pour le modèle précoce de la maladie. Un total de 180 animaux sont donc nécessaire pour cette étude.

Raffinement

Les animaux seront contrôlés quotidiennement pour évaluer et réduire au maximum tout risque de douleur. Des points limites ont été definis pour chaque procédure. Les gestes susceptibles d’entraîner une douleur ou un stress seront réalisés sous anesthésie et l'administration d'un analgésique est prévu pour limiter la douleur. Les conditions de vie seront améliorées au maximum (5 souris maximum par cage, ajout de matériel de nidication et igloo en carton).

Choix des espèces

Deux souches de souris seront utilisées dans ce projet. L'injection de collagène de type II chez la souris DBA/1J entraine le développement d’arthrites sévères par réaction auto-immune, ce qui représente un bon modèle des phases de poussée de la maladie. La deuxième souche de souris mime les phases précoces de la maladie chez l’homme, avec l’apparition d’une arthrite moins sévère. Les souris utilisées sont âgées de 7 semaines, elles sont alors adultes et ont fini leur croissance.

Rasées et greffées sous la peau du flanc avec des cellules de mélanome, 392 souris reçoivent au quatrième puis au dixième jour des anticorps qui lèvent le frein immunitaire, avant de subir au douzième jour l'ablation chirurgicale de la greffe et de la peau au-dessus. Une dépigmentation apparaît vers le trente-cinquième jour, et le suivi se poursuit par une anesthésie gazeuse hebdomadaire pendant seize semaines pour peser, mesurer et photographier, avec quatre prises de sang. 400 souris au total sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées entre un et neuf mois pour les prélèvements. Le porteur décrit un arbre décisionnel dont les points limites comprennent la prostration, la taille maximale de la greffe, la nécrose et le saignement.

Objectifs

Les cytokines sont des petites protéines ayant un rôle essentiel dans la régulation du système immunitaire, lors des infections ou lors de maladies auto-immunes. L'équipe est reconnue pour avoir étudié le rôle d'une cytokine produite par les cellules de l'épiderme dans différentes maladies inflammatoires de la peau. Le vitiligo est une maladie auto-immune, caractérisée par l’apparition de taches blanches sur la peau. La prévalence de cette maladie est estimée à 1 % de la population mondiale et il n'existe actuellement aucun traitement pour la guérir. En effet, le vitiligo est une maladie complexe faisant intervenir de nombreux facteurs combinés : prédisposition génétique, stress, frottements. Avec une diminution de cette cytokine dans la peau chez le patient humain, il nous parait important d’étudier la fonction des voies de signalisation de cette cytokine dans la pathogenèse du vitiligo. En utilisant des modèles, nous pourrons développer de nouvelles thérapies. Le projet utilisera les souris initialement développées dans notre laboratoire où sont inactivées les gènes de la cytokine et d’un acteur de sa voie de signalisation dans un modèle d’induction du vitiligo décrit récemment dans les publications. Ce modèle est médié par une réaction auto-immune qui induit une dépigmentation de la peau. On greffe sous la peau des cellules d'une lignée cellulaire de mélanocytes générée à partir d’un mélanome de souris, qui vont induire une réponse immune par la production de lymphocytes T tueurs. Ceux-ci étant réprimés par des lymphocytes T régulateurs (Treg) qui seront bloqués par deux injections d’anticorps neutralisants, ces cellules T tueuses pourront provoquer une réaction auto-immune dirigée contre les cellules de la peau pigmentaires entrainant la décoloration : le vitiligo. Au bout de 12 jours, on retire les cellules greffées et la peau au-dessus de cette greffe. Au bout de 1 mois, on arrive à voir les modifications des populations de lymphocytes T. Au bout de 35 jours, on peut voir la dépigmentation se mettre en place. Entre un mois et 9 mois, nous euthanasierons les souris et effectuerons les prélèvements pour analyser le développement de cette maladie et son impact sur le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les phénomènes biologiques mis en place lors du développement du vitiligo, d’expliciter le rôle de la cytokine étudiée et de sa voie de signalisation et de proposer de nouvelles thérapies à cette maladie auto-immune très invalidante.

Procédures

392 souris seront anesthésiées, puis rasées et injectées en sous-cutanée sur un des flancs, avec des cellules de mélanome (durée : 5min). Au jour 4 et 10 post-greffe, ces souris vont être pesées puis injectées sans anesthésie en intrapéritonéale par des anticorps neutralisants (durée : 1min). 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi), les souris vont être anesthésiées par voie gazeuse légère pour pouvoir les peser, mesurer et photographier le développement de la greffe (durée 5x3min). Au jour 12, elles vont subir une opération sous anesthésie générale pour réséquer la greffe (durée = 10min). Puis, 1 fois par semaine, les souris vont être anesthésiées par voie gazeuse légère pour pouvoir les peser, mesurer et photographier le développement du vitiligo autour de la cicatrice et sur la queue (durée : 16 semaines x 3min). Entre 1 et 4 mois, en plus du suivi visuel, nous prélèverons 3 fois 100µl de sang pour analyser les cellules circulantes du système immunitaire ( 3x1min). Puis, à la fin de l'expérience (de 4 à 9 mois), nous pourrons encore prélever une 4ème fois 100µl de sang pour nos analyses.

Impact sur les animaux

La piqure d’injection des cellules en intradermique dans le flanc gauche sous anesthésie légère gazeuse peut entrainer une rougeur. 392 animaux développeront une masse cellulaire localisée sur le flanc, uniquement au niveau du point d’injection des cellules. La résection par chirurgie, d’une durée de 5 à 8 minutes, entraine au réveil un état de stress lié à un léger manque de mobilité de la patte arrière à cause de la pose de 2 points de suture et des 4 à 5 agrafes le long des berges de la plaie. Durant les premières minutes après le réveil, une douleur est ressentie par les animaux qui présentent des signes (dos vouté, raideur de la patte postérieure gauche, marche avec les pattes postérieures écartées). Après 10min, les souris retrouvent leur mobilité et un comportement normal (grooming, activité exploratoire, interaction sociale). Les sites d’injections d'analgésique en sous-cutanée sous anesthésie gazeuse légère peuvent présenter une rougeur. Les prises de sang effectuées à la joue nécessitent une contention stressante pour l’animal pendant 30s. La pression sur la joue pour arrêter le saignement ajoute du stress.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés pour effectuer les prélèvements qui seront analysés.

Remplacement

Les cibles (cytokines, récepteurs et cellules) étudiées dans ce projet ont été identifiées grâce à des travaux menés in vitro et in silico par notre équipe et par d'autres laboratoires. L'étude de la réponse immunitaires met en jeu plusieurs organes et réseaux complexes impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre le type d’interaction et les différentes voies de signalisation impliquées dans ces réponses immunitaires ainsi que le processus de pathogenèse du vitiligo.

Réduction

Ce protocole sera appliqué à un maximum de 400 souris. Elles seront utilisées afin de caractériser le rôle de la cytokine étudiée ainsi que des acteurs de sa voie de signalisation dans la pathogenèse du vitiligo. Nous réaliserons une expérience pilote avec un nombre limité d’animaux sauvages pour mettre en place et valider le protocole expérimental publié récemment et déterminer le meilleur moment pour faire nos analyses. Les groupes comporteront 40 souris pour avoir un effectif minimal de 24 (60% à 80% des souris traitées développent un vitiligo d’après la publication) pour obtenir, au meilleur moment choisi lors de l’étude pilote, des résultats statistiquement interprétables pour les paramètres étudiés (fréquences des Treg et des autres populations de lymphocytes T). Nous allons tout d'abord étudier 2 lignées de souris dans laquelle le gène d'intérêt est absent dans tout l'organisme, puis, si des résultats intéressants sont produits, d'étudier ensuite les lignées de souris dans laquelle les gènes étudiés sont absents dans un type cellulaire donné (les cellules dendritiques).

Raffinement

Les souris seront maintenues en groupe pour préserver les interactions sociales. La prise de photos et le suivi nécessitent une anesthésie gazeuse légère de courte durée. Les souris seront remises dans leur cage avec une courte exposition à la lampe chauffante. En plus de la surveillance journalière, le suivi de la croissance de la greffe (pesée, photos, mesure de la taille) sera réalisé 3 fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi). La chirurgie se fera sous anesthésie totale et sous antalgique, par des personnes ayant suivies la formation correspondante. La chirurgie, les médicaments utilisés et leurs doses seront validés par notre vétérinaire. Les observations faites lors des suivis permettront de situer l'état des animaux dans l'arbre décisionnel et d'appliquer ces points limites. L’arbre décisionnel mis en place pour ce projet tient compte de l’apparence physique ("Grimace Scaling"), du comportement (observation de la continuité des activités comportementales normales des animaux), de l’absence de signes d’infection aux lieux de piqures ou de traitements, du développement de la greffe qui ne doivent pas être invalidantes pour nos animaux. Ces critères sont assortis de points limites ou points d’arrêt, définis pour éviter des douleurs entrainant un changement dans les comportements des animaux et des blessures qui impactent nos résultats : prostration, taille maximale de la greffe, signe d’infection au point d’injection, nécrose, saignement.

Choix des espèces

La réponse immunitaire dans le contexte du vitiligo met en jeu différents organes comme la peau, les ganglions lymphatiques, le thymus, rendant nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse. Le modèle animal choisi pour étudier le mélanome est la souris car son système immunitaire est proche de celui de l'Homme avec une immunité innée et une immunité adaptative. De plus, la peau des souris présente des similitudes avec la peau humaine, rendant ce modèle pertinent pour l'étude du vitiligo. D'après la publication de référence, nous utiliserons des souris adultes âgées de 7 à 9 semaines car l'induction du vitiligo est maximal à cette période et les injections ne sont pas génées par le stade anagène du développement du système pileux.

Des souris génétiquement modifiées pour ne plus exprimer certaines molécules du réseau lymphatique, mais aussi des nouveau-nés, des femelles gestantes et des embryons : 520 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les nouveau-nés de cinq à onze jours subissent deux gavages et une biopsie de la queue, les adultes jusqu'à cinq prélèvements sanguins, deux injections et un prélèvement de lymphe sous anesthésie. Le porteur indique que l'immunisation peut provoquer une ulcération au site d'injection et une perte de mobilité des membres inférieurs, et que les transports entre sites partenaires ajoutent du stress. Toutes sont mises à mort en fin de projet pour analyse post-mortem, le porteur affirmant que la culture cellulaire ne reproduit pas ces mécanismes de façon juste.

Objectifs

Les cellules immunitaires, comme les lymphocytes B ou T, circulent à travers des ganglions lymphatiques afin d’y rencontrer des pathogènes provoquant une réponse immune. Les pathogènes sont amenés par le réseau lymphatique dans les ganglions. Un lien entre la fonction du réseau lymphatique et la taille et la structure du ganglion lymphatique a été suspecté mais jamais démontré. Ce projet vise à mieux comprendre cette relation en utilisant des modèles de souris présentant des défaillances dans le réseau lymphatique tissulaire et en analysant les conséquences sur le ganglion lymphatique et la réponse immunitaire. D’ores et déjà, nous savons que l’engagement du récepteur RANK exprimé par les cellules endothéliales lymphatiques par son ligand RANKL est nécessaire pour le développement du ganglion lymphatique. Le projet est un projet multi-sites.

Bénéfices attendus

Ces résultats apporteront à court terme des données importantes sur la régulation et le développement du système immunitaire. Etant donné qu’une thérapie visant une des molécules étudiée est actuellement utilisé en thérapie contre l’ostéoporose, ces résultats auront des retombées à moyen terme sur une nouvelle application dans des maladies impliquant le système immunitaire comme l’autoimmunité, l’infection ou le cancer.

Procédures

Des souris nouveau-nés seront soumises à 2 gavages (durée moins d’une minute). Le gavage permet une meilleure prise du traitement et est moins douloureux qu’une injection. Les souris adultes seront soumises selon les groupes à 5 prélèvements de sang d’une durée inférieure à 1 minute, à deux injections d’une durée inférieure à 1 minute sur animal anesthésié et à un prélèvement de lymphe (durée 2 minutes) sur animal anesthésié au site où la lymphe est la plus accessible. Les délais entre les prises de sang sont au minimum de 7 jours. Les nouveau-nés (entre jour 5 et jour 11 après naissance) seront soumis à une biopsie de queue (inf à 1mm) pour déterminer une mutation génétique (durée inférieure à 1 minute). Des souris gestantes recevront une injection (durée moins d’une minute).

Impact sur les animaux

Le gavage, l’injection des produits (par exemple l’anesthésie) et le prélèvement sanguin sous maxillaire nécessite une contention qui est source d’inconfort et de stress pour l’animal pendant quelques secondes. L’immunisation des souris pourrait conduire bien que très rarement à une ulcération au site d’injection et à une perte de mobilité des membres inférieurs. Le transport entre les sites partenaires et les procédures effectuées pourront générer un stress. Les procédures peuvent également induire une perte de poids, ainsi qu’un changement de comportement avec risque d’essoufflement pour certains lots. Des ulcérations et des raideurs de la patte peuvent advenir.

Devenir

Mise à mort de toutes les animaux à la fin du projet pour analyse post-mortem

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le système lymphatique et la réponse immunitaires dans les ganglions lymphatiques ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduits de manière reproductible et juste par des expériences en culture cellulaire.

Réduction

Les sites d’injections ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale, car elles ciblent de façon quasi exclusive les ganglions lymphatiques précisément identifiés. Le nombre d'animaux par groupe a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe dans une animalerie agrée avec un statut sanitaire contrôlé. Elles sont hébergées dans des cages enrichies par fratrie tout en respectant le nombre de souris admises. Si un animal devient agressif, il est aussitôt séparé du groupe. Les souris sont observées quotidiennement par un personnel expérimenté avec une mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille d’observation de critères définis. Des actions prévenant une possible douleur, stress ou inconfort sont entrepris (tapis chauffant, gavages avec des canules adaptées, anesthésie, antidouleur, apport de nourriture humidifiée). En cas ou le point limite est atteint l’animal est mis à mort. Le transport des souris entre les sites s’effectue par un professionnel agrée. A l’arrivée les souris sont pris en charge par un personnel expérimenté pendant la quarantaine d’une semaine avant le transfert en zone de maintenance. Les animaux seront acclimatés à la nouvelle structure au minimum 2 semaines avant le début de la procédure.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi pour réaliser les expériences de ce projet. La structure du ganglion lymphatique, la circulation sanguine et le drainage de la lymphe sont identiques entre l’homme et la souris. La souris Mus musculus étant de mieux en mieux connue du point de vue génétique, est un très bon modèle d’étude pour nos travaux. De plus, des modèles de souris génétiquement modifiées invalidées pour l'expression des molécules d’intérêt existent et leur utilisation permet d'aborder directement le rôle des protéines d'intérêts dans la formation du réseau lymphatique. La mesure de la réponse immunitaire utilise des moyens techniques qui n’existent que chez la souris. Toutes modifications génétiques ont été introduites chez la souris. Les souris seront étudiées à un âge où le système immunitaire est mature (à partir de 4 semaines). Des embryons et des nouveau-nés ont également été choisis, puisque le développement du réseau et des ganglions lymphatiques commence pendant l’embryogenèse.

Toutes tuées à la fin du projet pour des analyses post-mortem, 520 souris, dont des nouveau-nés et des femelles gestantes, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux sont gavés deux fois et subissent entre leur 5e et leur 11e jour une biopsie de la queue pour le génotypage, et les adultes, selon les groupes, jusqu'à cinq prises de sang, deux injections et un prélèvement de lymphe sous anesthésie. Le projet porte sur des souris génétiquement modifiées dont le réseau lymphatique est défaillant, pour comprendre son lien avec la taille et la structure des ganglions. Le porteur signale que l'immunisation peut provoquer, rarement, des ulcérations et une perte de mobilité des pattes arrière, et que le transport entre les sites partenaires peut générer un stress. Il affirme qu'il "n'est pas possible de remplacer les animaux", les mécanismes étudiés ne pouvant être reproduits en culture cellulaire "de manière reproductible et juste".

Objectifs

Les cellules immunitaires, comme les lymphocytes B ou T, circulent à travers des ganglions lymphatiques afin d’y rencontrer des pathogènes provoquant une réponse immune. Les pathogènes sont amenés par le réseau lymphatique dans les ganglions. Un lien entre la fonction du réseau lymphatique et la taille et la structure du ganglion lymphatique a été suspecté mais jamais démontré. Ce projet vise à mieux comprendre cette relation en utilisant des modèles de souris présentant des défaillances dans le réseau lymphatique tissulaire et en analysant les conséquences sur le ganglion lymphatique et la réponse immunitaire. D’ores et déjà, nous savons que l’engagement du récepteur RANK exprimé par les cellules endothéliales lymphatiques par son ligand RANKL est nécessaire pour le développement du ganglion lymphatique. Le projet est un projet multi-sites.

Bénéfices attendus

Ces résultats apporteront à court terme des données importantes sur la régulation et le développement du système immunitaire. Etant donné qu’une thérapie visant une des molécules étudiée est actuellement utilisé en thérapie contre l’ostéoporose, ces résultats auront des retombées à moyen terme sur une nouvelle application dans des maladies impliquant le système immunitaire comme l’autoimmunité, l’infection ou le cancer.

Procédures

Des souris nouveau-nés seront soumises à 2 gavages (durée moins d’une minute). Le gavage permet une meilleure prise du traitement et est moins douloureux qu’une injection. Les souris adultes seront soumises selon les groupes à 5 prélèvements de sang d’une durée inférieure à 1 minute, à deux injections d’une durée inférieure à 1 minute sur animal anesthésié et à un prélèvement de lymphe (durée 2 minutes) sur animal anesthésié au site où la lymphe est la plus accessible. Les délais entre les prises de sang sont au minimum de 7 jours. Les nouveau-nés (entre jour 5 et jour 11 après naissance) seront soumis à une biopsie de queue (inf à 1mm) pour déterminer une mutation génétique (durée inférieure à 1 minute). Des souris gestantes recevront une injection (durée moins d’une minute).

Impact sur les animaux

Le gavage, l’injection des produits (par exemple l’anesthésie) et le prélèvement sanguin sous maxillaire nécessite une contention qui est source d’inconfort et de stress pour l’animal pendant quelques secondes. L’immunisation des souris pourrait conduire bien que très rarement à une ulcération au site d’injection et à une perte de mobilité des membres inférieurs. Le transport entre les sites partenaires et les procédures effectuées pourront générer un stress. Les procédures peuvent également induire une perte de poids, ainsi qu’un changement de comportement avec risque d’essoufflement pour certains lots. Des ulcérations et des raideurs de la patte peuvent advenir.

Devenir

Mise à mort de toutes les animaux à la fin du projet pour analyse post-mortem

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le système lymphatique et la réponse immunitaires dans les ganglions lymphatiques ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduits de manière reproductible et juste par des expériences en culture cellulaire.

Réduction

Les sites d’injections ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale, car elles ciblent de façon quasi exclusive les ganglions lymphatiques précisément identifiés. Le nombre d'animaux par groupe a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe dans une animalerie agrée avec un statut sanitaire contrôlé. Elles sont hébergées dans des cages enrichies par fratrie tout en respectant le nombre de souris admises. Si un animal devient agressif, il est aussitôt séparé du groupe. Les souris sont observées quotidiennement par un personnel expérimenté avec une mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille d’observation de critères définis. Des actions prévenant une possible douleur, stress ou inconfort sont entrepris (tapis chauffant, gavages avec des canules adaptées, anesthésie, antidouleur, apport de nourriture humidifiée). En cas ou le point limite est atteint l’animal est mis à mort. Le transport des souris entre les sites s’effectue par un professionnel agrée. A l’arrivée les souris sont pris en charge par un personnel expérimenté pendant la quarantaine d’une semaine avant le transfert en zone de maintenance. Les animaux seront acclimatés à la nouvelle structure au minimum 2 semaines avant le début de la procédure.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi pour réaliser les expériences de ce projet. La structure du ganglion lymphatique, la circulation sanguine et le drainage de la lymphe sont identiques entre l’homme et la souris. La souris Mus musculus étant de mieux en mieux connue du point de vue génétique, est un très bon modèle d’étude pour nos travaux. De plus, des modèles de souris génétiquement modifiées invalidées pour l'expression des molécules d’intérêt existent et leur utilisation permet d'aborder directement le rôle des protéines d'intérêts dans la formation du réseau lymphatique. La mesure de la réponse immunitaire utilise des moyens techniques qui n’existent que chez la souris. Toutes modifications génétiques ont été introduites chez la souris. Les souris seront étudiées à un âge où le système immunitaire est mature (à partir de 4 semaines). Des embryons et des nouveau-nés ont également été choisis, puisque le développement du réseau et des ganglions lymphatiques commence pendant l’embryogenèse.