Troubles nerveux

Une entreprise teste des candidats médicaments contre la maladie de Parkinson sur des rats dont elle détruit, par une injection de toxine dans le cerveau, les neurones qui produisent la dopamine. 2 625 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués en fin de protocole pour prélever leur cerveau. Après cette chirurgie, une partie d'entre eux peut être réopérée pour l'implantation sous la peau d'une pompe de diffusion continue, et tous peuvent recevoir chaque jour, pendant six semaines au plus, le candidat ou le traitement de référence, avec des prises de sang répétées à la queue sans anesthésie. Environ 20 % des rats opérés ne présentent pas une destruction suffisante des neurones, et des tests de comportement réalisés deux semaines après l'injection doivent permettre de les écarter. Le porteur annonce trois tests de comportement sous contention, jusqu'à trois fois par protocole, sans préciser lesquels.

Objectifs

La maladie de Parkinson (MP) est, par sa prévalence de 1,5 pour mille, la plus fréquente des pathologies neurodégénératives, après la maladie d’Alzheimer. Elle touche environ 160 000 personnes en France. La MP se caractérise par un syndrome moteur défini par une lenteur d’initiation des mouvements associée à un tremblement de repos, une rigidité musculaire et une instabilité posturale. La principale caractéristique neuropathologique de la maladie de Parkinson est la mort progressive et massive des neurones en charge de la coordination des mouvements et qui produisent la dopamine. Les évènements qui sous-tendent cette mort restent mal connus. Ceci rend le diagnostic de la maladie de Parkinson difficile, d’autant que l’apparition des symptômes ne se produit qu’après une perte neuronale importante. À l’heure actuelle, le traitement de la maladie est donc essentiellement symptomatique et vise à compenser le déficit en dopamine (un messager chimique permettant la communication entre les neurones dans le cerveau) par l’administration d'une molécule semblable. Néanmoins, à long terme son efficacité s’atténue et des effets secondaires très invalidants (troubles moteurs, digestifs,cardiovasculaires, comportementaux, somnolence,…). Compte tenu de ces complications, des stratégies médicamenteuses alternatives sont en cours de développement et visent soit à retarder la prise de cette molécule soit à l’associer avec d’autres composés. L’objectif du présent projet est de tester l’efficacité antiparkinsonienne de nouveaux médicaments sur trois modèles précliniques de la maladie de Parkinson chez le rat. Ces modèles reposent sur une injection de toxines dans le système nerveux central en ciblant spécifiquement les neurones produisant la dopamine afin de mimer la mort des neurones entraînant la pathologie. Au cours du protocole, des tests comportementaux sont utilisés pour évaluer l’efficacité antiparkinsonienne des traitements testés. L’efficacité du nouveau médicament sera comparée aux médicaments actuels représentant le traitement de référence.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester l’effet antiparkinsonien des composés candidats pouvant avoir des bénéfices sanitaires significatifs en vue d’essais cliniques.

Procédures

Les animaux subissent une première chirurgie afin d’injecter la neurotoxine dans le système nerveux central (durée environ 30 minutes). Une deuxième chirurgie pourra être réalisée afin d’implanter sous la peau un dispositif permettant de diffuser un traitement en continu (durée environ 15 minutes). Des prélèvements répétés de sang pourront être réalisés sur animal vigile, à la veine de la queue (durée : 5min) ainsi qu’un prélèvement terminal sur animal anesthésié. Des administrations quotidiennes de candidat médicament ou de traitement de référence pourront être effectuées pendant toute la durée du protocole (6 semaines au maximum). Les animaux seront soumis à 3 tests de comportement en fin de protocole effectués sous contention par l’expérimentateur (durée totale : 20min) jusqu’à trois fois au cours du protocole. A la fin du protocole, les animaux seront mis à mort afin de prélever le cerveau.

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables potentiel est lié à l'administration du nouveau médicament et des molécules de référence. Un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut-être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul. -Les animaux seront soumis à une administration dans le cerveau d'une toxine nécessitant une chirurgie réalisée sous anesthésie gazeuse. Cette étape peut engendrer des douleurs durant les 24-48h suivant la chirurgie minorées par des antalgiques. La peau du crâne sera ensuite suturée ce qui peut provoquer des démangeaisons lors de la cicatrisation,un risque de retrait du point par l'animal et un risque rare d'infection. Une perte de poids des animaux peut être observée ainsi qu’une altération de la mobilité avec des rotations contraires au site d’injection pendant quelques jours après la chirurgie. -Une chirurgie d’implantation de pompe diffusant des subtances liquides sera réalisée nécessitant une anesthésie gazeuse, avec une ouverture de la peau pouvant être source de douleur et/ou une gêne au réveil -Les animaux réaliseront des tests de comportements nécessitant des contentions et des isolements courts dans des espaces restreints pouvant générer du stress. -Des prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigile soumis à une contention, impliquant parfois des piqures dans les vaisseaux à l’aide d’une aiguille pouvant être à l’origine 1) d’une douleur légère de courte durée, 2) de stress et 3) d’un écoulement sanguin persistant.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car il est necessaire de récupérer le cerveau de l'animal pour faire des analyses sur ce dernier.

Remplacement

L’objectif du projet est d’obtenir une preuve de concept d’efficacité de nouveaux composé in vivo. Afin d’évaluer l’effet antiparkinsonien du composé sur le comportement de l’animal, le recours à un modèle animal est nécessaire. En effet, le modèle in vitro ne permet pas d’induire et d’étudier les répercussions comportementales associées aux déficits parkinsoniens ni d’évaluer la présence du composé dans les organes.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu par groupe pour ce projet est basé sur des données préalables obtenues au sein de l’entreprise sur ce modèle préclinique de la maladie de Parkinson induite par l’injection de toxines dans le cerveau en ciblant spécifiquement les neurones produisant la dopamine (n=15 dont n=12 inclus dans l’analyse finale). Ce nombre se justifie pour les raisons suivantes : après la chirurgie induisant la lésion, environ 20% des animaux ne présentent pas de lésion sévère (

Raffinement

Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Des enrichissements multiples sont proposés aux animaux (batônnets en bois, carrés de cellulose, rouleaux en carton), en alternance, pour limiter l’habituation et l’ennui. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie. Les animaux seront également habitués à la manipulation et à la contention pour diminuer le stress lié à ces procédures. Après chaque prélèvement de sang, une réhydratation sera réalisée afin de compenser la perte du volume sanguin. Les chirurgies intracérébrales seront réalisées sous anesthésie et analgésie et les animaux bénéficieront d’une surveillance accrue (minimum 2 fois par jour) en phase post-opératoire durant 48h. De la nourriture et/ou des gels enrichis seront déposés dans la cage afin de limiter la perte de poids des animaux après la chirurgie. Par ailleurs, les animaux seront habitués aux environnements nouveaux dans lesquels seront réalisés les tests comportementaux afin de réduire le stress relatif à cela.

Choix des espèces

Les rongeurs, classiquement utilisés en laboratoire, présentent plusieurs similitude sur l'anatomie cérébrale et de l'activité des neurones produisant la dopamine que celles que l'on retrouve chez l'Homme. Les modèles de lésion induite par l'injection dans le cerveau de toxines se sont rapidement imposés comme des modèles précliniques de référence pour le test de nouveaux médicaments car ils reproduisent la mort des neurones produisant la dopamine. Des rats adultes d'environs 7 semaines (pesant entre 250 et 320g) le jour de la chirurgie de lésion dopaminergique seront utilisés dans ce projet car la grande majorité des résultats de la littérature concernant ce modèle a été obtenue sur des rats appartenant à cette gamme de poids. De même, les coordonnées exactes utilisées pour procéder à la lésion dans le cerveau proviennent de données issues d'un livre qui a également été réalisé sur la base d’observations faites sur des rats entre 250-300g. En fonction des objectifs de l’étude et des composés à tester, des rats mâles ou femelles pourront être utilisés puisque cette pathologie touche aussi bien les hommes que les femmes.

Le canal biliaire ligaturé au cours d'une laparotomie de quinze minutes, 760 rats reçoivent ensuite jusqu'à cinquante-six administrations de composés, par gavage, sous la peau, en intraveineuse ou dans le nez, ou quatre séances de dialyse péritonéale suivies de drainages, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués pour l'examen du foie, des reins et du cerveau. Le porteur qualifie le modèle de modéré parce qu'il "ne va pas jusqu'au seuil critique" de l'encéphalopathie hépatique, tout en énumérant des vocalises spontanées, une incapacité à se retourner, une absence de réflexe pupillaire et une pâleur prononcée qui "conduiront à la mort des animaux". Il annonce aussi un volume de liquide de dialyse "beaucoup plus important que celui recommandé", et renonce aux tests comportementaux poussés au profit d'une simple observation de la léthargie et de l'ataxie.

Objectifs

L'encéphalopathie hépatique (EH) est un problème cérébral qui survient à cause d'une maladie du foie, qu'elle soit aiguë ou chronique. Elle peut se manifester par des changements de comportement ou des troubles de l’esprit, allant de symptômes légers à un coma. Cette maladie est sérieuse et peut entraîner des complications graves, nécessitant des soins médicaux importants. Bien que l’on ne comprenne pas encore complètement les causes de l'EH, on sait qu’elle est liée à des substances inflammatoires et toxiques dans le corps, comme l’ammoniaque. L’ammoniaque provient en grande partie du métabolisme des protéines par les bactéries dans l’intestin. Normalement, le foie transforme l’ammoniaque en une autre substance, l’urée, qui est ensuite éliminée par les urines. Mais lorsque le foie ne fonctionne pas bien, il ne peut plus effectuer cette transformation correctement. En plus de la transplantation du foie, il existe des traitements comme le lactulose ou la rifaximine, mais ils peuvent avoir des effets secondaires, et certains patients ne répondent pas bien aux traitements. Ce projet vise à reproduire cette maladie dans différents modèles expérimentaux, afin de tester de nouveaux traitements pour l’encéphalopathie hépatique, quel que soit le mode d’administration (par voie orale, intraveineuse, par injection dans l’abdomen, ou même par dialyse péritonéale).

Bénéfices attendus

La prévalence de l’encéphalopathie hépatique (EH ou HE) clinique concerne 30 à 45 % des patients cirrhotiques avec une incidence de 20 % par an. La prévalence de l’EH minime est plus difficilement estimable mais elle pourrait toucher plus de 2/3 des malades. La prévalence de la cirrhose est d’environ 2000 à 3500 cas par million d’habitants, soit en France 700000 cas avec 10 à 15 000 décès par an. Le passage d’une cirrhose compensée vers une cirrhose décompensée est associé à une diminution de la survie à court terme (3-5 ans). La survenue d’une EH constitue un facteur majeur de mauvais pronostic. En effet, le développement d’un premier épisode d’EH au cours de la cirrhose est un facteur de risque indépendant de mortalité avec un taux de survie cumulée à 1 an et 3 ans de respectivement 42 % et 23 %. Ce projet vise donc à bloquer et reverser le processus qui conduit à la mise en place de l’encéphalopathie hépatique et de lui permettre d’avoir accès à une transplantation hépatique (seul recours actuel à la décompensation hépatique).

Procédures

La chirurgie passe par une laparotomie et ligature des voies biliaires sous anesthésie générale avec couverture analgésique pré et post opératoire (durée 15 minutes). Un prélèvement de sang (durée 1 minute) de randomisation sous anesthésie à l'isoflurane (durée 3 minutes).cas de la dialyse : 4 administrations des composés à raison d’une fois par jour pendant 4 jours consécutifs (durée 1 minute) sous anesthésie (3 minutes) et 4 Drainages du dialysat à raison d’une fois par jour pendant 4 jours consécutifs (15 minutes) sous anesthésie générale. Autres types de traitement : au maximum 56 administrations par gavage, en sous-cutanée, en intraveineuse, en intranasale (durée une minute) ou en administration intraveineuse lente (durée 30 minutes). 6 prélèvements de sang intermédiaires (durée 1 minute) sous anesthésie (durée 3 minutes) . Un prélèvement de sang final (durée 1 minute) sous anesthésie (durée 3 minutes).

Impact sur les animaux

Les modèles d’étude ne présentent pas de douleur ou d’inconfort pendant la phase d’induction de la fibrose ou de la cirrhose. Sur cette phase, le seul inconfort serait l’intervention chirurgical associée à la ligature des voies biliaires, celui-ci est géré par l’utilisation préventif d’un analgésique et en curatif pendant les deux jours qui suivent la période post-opératoire. L’encéphalopathie est une pathologie très lourde pouvant conduire au décès du patient. La décompensation « spontanée » peut inéluctablement conduire à la mort. Nous reproduirons ces évènements qui surviennent chez les patients cirrhotiques qui décompensent spontanément. Des signes comme des vocalises spontanées, des difficultés respiratoires, une incapacité à se retourner, une absence de réflexe pupillaire, du larmoiement et une pâleur prononcée conduiront à la mort des animaux et à un réajustement du modèle. Il est cependant à noter que l'administration du liquide de dialyse devra être réalisée par des personnes maitrisant parfaitement le geste (dans les règles de l'art). IL est aussi à noter que dans ce cadre le volume d’administration est beaucoup plus important que celui recommandé. Ce volume a déjà été testé dans une précédente autorisation et n’a entrainé ni douleur ni inconfort.

Devenir

L'évaluation histologique des organes majeurs (foie, reins et cerveau) et une investigation approfondie des biomarqueurs plasmatiques circulants imposent la mise à mort des animaux

Remplacement

Les modèles développés et décrits dans ce projet tentent de reproduire une cascade d’événements conduisant à la défaillance successive de plusieurs organes comme cela se produit chez le patient cirrhotique en phase de décompensation. Il n’existe pas de modèle in vitro permettant de reproduire la globalité ni la chronologie de la progression de la rupture multi organe. Les premières étapes du programme de recherche seront réalisées dans des tests in vitro pour évaluer les activités intéressantes sur des paramètres connus jouant un rôle dans l’évolution de la pathologie étudiée (par exemple l’inflammation, le stress oxydatif, ou la prolifération ou mort cellulaire etc.).

Réduction

Le nombre d’animaux estimé pour chaque procédure tient en compte de l’hétérogénéité associée aux modèles d’induction de la défaillance hépatiques. Cette estimation s’appuie sur nos expériences antérieures durant de nombreuses années du modèle BDL chez le rat et de l’hétérogénéité de variance de nos paramètres d’efficacité (biomarqueurs plasmatiques circulants qui sont assez labiles). A l’aide de ces données, un calcul de puissance et la déduction par le calcul théorique des effectifs est possible. Un test statistique est réalisé pour permettre de définir cet effectif théorique permettant d’atteindre la significativité recherchée. Cette approche statistique permet d’affiner les plans d’expérience pour lesquelles une étude pilote préalable par exemple a permis d’approcher un résultat très proche de la significativité.

Raffinement

L’encéphalopathie hépatique à son stade terminale est une pathologie sévère, qui chez l’humain entraîne de nombreux décès dans un délai de 1 à 3 ans. Notre modèle expérimental ne va pas jusqu’au seuil critique de la pathologie et est donc modéré. Un certain nombre de signes cliniques sans gravité associés à la mise en place de la pathologie seront observés. Sans mettre en place de tests comportementaux poussés, des changements notables seront observés chez les animaux : léthargie, apathie (perte progressive de l’exploration , de la curiosité à l’ouverture de la cage), une diminution de la prise alimentaire (sans risque pour l’état général de l’animal), des altération de la coordination (ataxie). D’autres signes nous conduiront à une plus grande vigilance dans l’observation tels que des crises de tremblements légers ou des spasmes musculaires, des réactions excessives aux stimuli extérieurs, de l’agitation. Ces signes individuellement ne seront pas des critères de mise à mort des animaux, mais nous permettront de juger de l’évolution de la pathologie. Certains signes cliniques comme l’absence de réaction ou des crises de convulsions seront par contre des points limites à nos études. La liste de ces points limites pourra être réajustée au fur et à mesure de nos observations, afin d’éviter toute souffrance non nécessaire à l’établissement des résultats. Les procédures se feront avec un hébergement adapté au bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, tunnel et éléments de nidification). Au cours des procédures, nous appliquerons pendant les périodes qui suivent les prélèvements sanguins, un apport d’aliment gélifié enrichi qui favorise la récupération des animaux suite à l’anesthésie. Une partie des observations étant de nature comportementale, les études requiert l’utilisation d’animaux et ne peuvent être remplacées par des expérience in vitro.

Choix des espèces

Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour de développer une encéphalopathie associée à une atteinte hépatique et donc de valider l’efficacité d’un traitement dans cette pathologie. Le génome des rongeurs et celui de l'homme ont 90% d’homologie, cela en fait un modèle de choix dans les études pharmacologiques. Le choix de l'espèce Rat a été fait en se basant sur la littérature scientifique et sur nos connaissances des caractéristiques des molécules à tester. Les études seront réalisées sur des jeunes adultes Les traitements induits aux animaux affectent essentiellement la fonction hépatique et produisent des modifications métaboliques. Il est nécessaire de les appliquer sur un organisme développé, qui puisse mettre en place des mécanismes de réparation et de défense. L’animal au stade de jeune adulte qui a un système immunitaire compétent (microbiote bien établi) et des mécanismes de réponse à des stress inflammatoires correspond au stade de vie requis pour développer notre modèle expérimental. Les études seront réalisées sur des animaux de 6 semaines (250-275 gr) à l'arrivage afin de permettre une phase d'habituation et d’avoir des animaux d'environs 400g au moment de la chirurgie. Pour les études dont la chirurgie sera faite en externe, nous utiliserons des animaux de 8 semaines (375-400 gr) au moment de la chirurgie.

Soumises pendant deux à cinq mois à un régime riche en cholestérol, puis à huit ou vingt injections pratiquées sur animal conscient, 760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique qu'elles développent en fin de régime un œdème du visage et des membres, et qu'elles perdent du poids. Leur queue est amputée d'un demi-millimètre pour le génotypage, sur animal vigile jusqu'au dixième jour de vie. L'objet immédiat est de tester des mimétiques d'une protéine régulant le cholestérol, la meilleure prise en charge des patients atteints d'athérosclérose étant renvoyée au long terme et à des résultats "concluants".

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires affectent beaucoup d’organes comme le cœur, le cerveau ou le foie. Une part importante de ces affections est due à l’accumulation de cholestérol dans la paroi des artères ou dans les organes. Ainsi, certaines maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer ou la maladie de Niemann-Pick sont liées directement ou indirectement à l’accumulation de cholestérol dans les cellules du cerveau. Cette accumulation de cholestérol dans la paroi vasculaire peut également être responsable des accidents vasculaires cérébraux (AVC) et infarctus du myocarde (IF). Comme pour l’IF et les AVC, le cholestérol peut également former des agrégats dans les parois des vaisseaux sanguins qui irriguent le cerveau, formant des lésions d’athérosclérose qui empêchent une bonne oxygénation des neurones et aboutissent à une altération du fonctionnement cognitif : la démence vasculaire. L’objectif de ce projet est l’identification de mimétiques chimiques d’une protéine spécifique qui permettra de réguler l’homéostasie du cholestérol dans les cellules. Nous étudierons comment ces mimétiques de la protéine en question permettent d’éviter l’apparition des complications neurodégénératives de l’accumulation du cholestérol dans les vaisseaux sanguins cérébraux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une connaissance fine de la survenue des atteintes cardiovasculaires liées aux dépôts de cholestérol dans la paroi des vaisseaux et des dépôts de cholestérol au niveau des cellules du système nerveuses central et de déterminer si l’injection d'un mimétique d'une protéine spécifique est en mesure de prévenir ou diminuer la gravité de ces atteintes cardiaques et cognitives. A long terme, si les résultats obtenus sont concluants, cette études permettra une meilleure prise en charge des patients atteints d'athérosclérose.

Procédures

Les animaux seront soumis à un régime riche en cholestérol pendant 2 ou 5 mois. Certains animaux (au maximum 760) seront soumis à 8 injections , soit 2 injections par semaine espacées de 2 à 3 jours (protocole de 2 mois de régime) ou 20 injections, soit 2 injections par semaine espacées de 2 à 3 jours (protocole de 5 mois de régime). Les animaux seront vigiles et le temps de la contention à la fin de l'injection sera d'environ 1 minute par animal. Les animaux subiront une biopsie de queue pour génotypage sous anesthésie (environ 1 min).

Impact sur les animaux

Les nuisances pour les souris lors des expérimentations sous régime pro-athérogène avec ou sans Intrapéritonéal, sont le développement d'oedème facial et des membres en toute fin de la période de régime pro athérogène. Un stress engendré par les injections lors des différents traitements et l'anesthésie finale en IP. Le traitement (en début de régime et après traitement avec les anticorps) peut potentiellement entraîner une perte de poids. Le génotype de ces souris est vérifié par PCR sur un prélèvement d’environ 0.5 mm de l’extrémité de la queue lors du processus d’identification par tatouage, ce qui est une source de stress, de nuisance et de douleur transitoire légère. Ce prélèvement est fait sur animal vigile jusqu'au 10ème jour après la naissance et sur animaux anesthésié du 10ème au 21ème jour après la naissance.

Devenir

Les animaux soumis à un régime riche en cholestérol et traités par les mimétiques seront mis à mort pour prélever les organes à des fins de caractérisation histologiques et biochimiques et ainsi répondre aux objectifs de l'étude.

Remplacement

L'accumulation de cholestérol de l'alimentation dans la paroi des artères aboutit à une maladie appelée athérosclérose qui peut entraîner des infarctus, des accidents vasculaires cérébraux et également une démence vasculaire et des maladies neurodégénératives. Il n'est pas encore possible de nos jours de modéliser in vitro ou in silico les processus liés à l'accumulation de cholestérol dans la paroi des vaisseaux, ni au niveau des cellules du système nerveux central. Etant donné qu'une partie des apports en cholestérol est alimentaire et que nous mettons en place un régime spécifique qui mime ces apports, nous ne pouvons pas utiliser un modèle cellulaire pour cette étude, mais un modèle animal qui reproduit toutes les conditions physiopathologiques des effets d'un tel régime. L'efficacité et la toxicité de ces molécules ont été testées sur un modèle de cellules avant l'utilisation sur la souris.

Réduction

Si nous arrivons à mettre rapidement en évidence un effet positif d'un des mimétique sur l'accumulation de cholestérol dans la paroi des vaisseaux ou dans les cellules du système nerveux central, nous n’utiliserons pas le nombre total d’animaux demandé (760 animaux sur 5 ans pour la procédure ). Si la significativité du paramètre étudié est atteinte avant l’utilisation du nombre d’animaux prévu pour le groupe considéré, nous arrêterons les expérimentations avant l’utilisation du nombre maximale d’animaux. La taille des groupes a été déterminée mathématiquement et est au minimum de 15 animaux en tenant compte de la mortalité due à la longueur de l'expérimentation pour obtenir des résultats statistiquement interprétables.

Raffinement

Nous mettrons en place différents points limites dans notre expérimentation pour atténuer autant que possible la gêne de nos animaux liée au régime riche en cholestérol que nous leur donnerons : ces points limites sont définis en tenant compte de l’aspect et du comportement des animaux au cours du régime. Le suivi de l’état des animaux sera quotidien et les animaux seront soumis à une inspection visuelle. Dès qu'un animal atteint un des points limites, il sera euthanasié et ces organes prélevés pour étude. Si la significativité du paramètre étudié est atteinte avant l’utilisation du nombre d’animaux prévu pour le groupe considéré, nous arrêterons les expérimentations avant l’utilisation du nombre maximale d’animaux. Le stress engendré par les différentes pratiques expérimentales sera limité au maximum. Les animaux seront entre 3 et 5 par cagée, leur environnement sera enrichi par des carrés de coton pour l’édification du nid (changement toutes les semaines). Des tunnels de change sont également ajoutés dans les cages pour diminuer le stress engendré par la préhension lors du change des cages et des buchettes de bois sont ajoutées pour que les animaux puissent user leurs dents.

Choix des espèces

La souris peut être génétiquement modifiée et permet ainsi d'étudier l'implication de gènes spécifiques dans la survenue des pathologies humaines. Nous utilisons un modèle de souris génétiquement modifiée qui permet une accumulation intracellulaire de cholestérol accélérée lorsqu'elles sont soumises à un régime riche en cholestérol, ce qui est difficile avec une autre espèce de rongeur. Pour ce projet, nous utilisons des souris de 3 mois qui ont atteint l'âge adulte. Après la période de régime riche en cholestérol, leur âge correspondra à l'âge d'apparition de la patholgie chez l'homme. De plus, chez la souris, la physiopathologie de la démence vasculaire est proche de celle que nous retrouvons chez l'homme.

Identifier des signatures électroencéphalographiques utilisables pour tester de futurs candidats médicaments : c'est l'objet du projet, et 128 souris porteuses de deux mutations humaines de la maladie d'Alzheimer y subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune passe par une neurochirurgie d'une heure, des enregistrements de douze à quarante-huit heures une fois par semaine, jusqu'à vingt prélèvements sanguins et trois mois d'hébergement individuel. Elles sont toutes tuées à l'issue, les dispositifs implantés n'étant pas amovibles. Le porteur écrit que le modèle ne présente pas d'effets indésirables et que les souris ne développent aucun symptôme dommageable jusqu'à douze mois, tout en décrivant une douleur modérée dans les heures suivant l'intervention et un stress lié à l'isolement.

Objectifs

L’objectif aujourd’hui est d’identifier des signatures électroencéphalographiques précliniques permettant d’évaluer à terme l’efficacité de futurs candidats médicaments. Cela signifie d’appréhender cette problématique par une approche consistant à utiliser les données existantes de la recherche clinique pour construire de nouvelles solutions de recherche préclinique et se baser sur des signes de la maladie dans le cerveau et des tests médicaux utilisables à la fois chez l’animal et chez l’homme. L'électroencéphalographie représente un outil de choix en raison de son caractère transposable entre différentes espèces. En effet, les activités cérébrales de base sont largement conservées dans l’évolution des mammifères montrant le fort potentiel de transposition de cette méthode du rongeur à l’Homme, et donc l’application chez le rongeur d’observations faites chez le patient et inversement. Les patients atteints d’une pathologie neurodégénérative telle que la maladie d’Alzheimer, souffrent, en plus des symptômes caractéristiques, de troubles du sommeil et du cycle veille - sommeil. Ces dernières années, les altérations du comportement veille-sommeil ont été proposées comme étant non seulement un symptôme comportemental de la pathologie de la maladie d’Alzheimer, mais également un facteur de progression de la maladie, indiquant une relation réciproque entre le sommeil et les biomarqueurs précoces de la maladie d’Alzheimer. Des études sur des modèles animaux ont montré que des perturbations du sommeil peuvent déjà être présentes au stade précoce (présence de symptômes avant-coureurs) de la pathologie. Dans ce projet, nous étudierons les phases de veille-sommeil et les oscillations cérébrales dans un modèle murin modélisant la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

L’optimisation de nouveaux médicaments nécessite d’identifier des signes de la maladie dans le cerveau et des tests transposables entre les études cliniques et précliniques. Ils doivent permettre d’évaluer de façon fiable et robuste l’efficacité des molécules testées. Les activités électriques cérébrales sont largement conservées à travers les mammifères permettant ainsi une transposition fiable entre l’humain et le rongeur. Dans ce projet, nous utiliserons des souris modélisant la maladie d’Alzheimer et chercherons à mettre en évidence des marqueurs de la maladie qui pourront par la suite être applicables à l’Homme et permettre de tester de nouvelles molécules thérapeutiques. L’identification d’un potentiel nouveau traitement de la maladie d’Alzheimer permettrait d’améliorer les conditions de vie de nombreux patients.

Procédures

L’ensemble des animaux de ce projet vont subir une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. Les animaux seront tous soumis à des enregistrements longs (12 à 48 heures) qui seront réalisés sur l’animal éveillé une fois par semaine. Des prélèvements sanguins sur animal éveillé pourront également être réalisés (20 maximum au total, durée inférieure à 1 minute), tous les animaux du projet sont susceptibles d'être soumis à ces prélèvements. Ces prélèvements seront espacés d’au moins une semaine. Les animaux sont hébergés de façon individuelle à partir de la chirurgie pendant 3 mois maximum.

Impact sur les animaux

Le modèle ne présente pas d’effets indésirables, selon nos informations. Jusqu’à 12 mois, les souris ne développent aucun symptôme dommageable de la pathologie Suite à la chirurgie, une diminution de l’activité locomotrice et une déshydratation passagère pourront être observées. Une douleur modérée pourra apparaître dans les heures suivant l’intervention chirurgicale. Les animaux sont hébergés de façon individuelle ce qui peut engendrer un certain niveau de stress. Les prélèvements de sang réalisé au cours de l’étude peuvent également représenter une source de nuisance pour les animaux (stress, douleur à la piqûre et possible plaie).

Devenir

Ce projet implique l’implantation de dispositifs d’enregistrement de signaux électriques du cerveau qui ne sont pas amovibles, les animaux doivent donc être mis à mort à la fin du projet.

Remplacement

Cette étude nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle étudie des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être représentés par des modèles plus simples (ex. modèle cellulaire ou informatique).

Réduction

Les études sur le long terme présentent un avantage significatif en permettant à chaque animal de servir de contrôle pour lui-même, réduisant considérablement le nombre d'animaux nécessaires par groupe. Cette approche méthodologique nous a permis de déterminer le nombre d'animaux de manière à minimiser celui-ci, tout en veillant à préserver la validité scientifique et la fiabilité des résultats des expériences menées. Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires à nos études, les protocoles combineront un ensemble de procédures permettant de faire un suivi et d’obtenir plusieurs informations chez la même souris.

Raffinement

Le raffinement a été appréhendé à travers les conditions d'expérimentation et d'hébergement qui sont optimisées afin de s'assurer du bien-être des animaux tout au long des procédures expérimentales. Les souris qui entrent dans ce projet ont au minimum une semaine d’acclimatation à la zone d’hébergement. Le projet prévoit des procédures engendrant des douleurs post-opératoires modérées. Toutefois, les animaux recevront un protocole de soins post-opératoires comprenant une évaluation clinique quotidienne, des antidouleurs et des anti-inflammatoires. Des critères d’arrêt anticipé de l’expérimentation en cas de survenue d’une complication ont été identifiés. De plus, nous appliquerons des actes expérimentaux les moins invasifs possibles aux souris testées comme le choix d’une anesthésie gazeuse (par rapport à une injection). L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et les points limites adaptés. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. La prise en compte de ces points permettra de juger du bien-être et d'éviter l'inconfort des animaux au cours de l'expérimentation de manière à garantir la qualité des résultats.

Choix des espèces

Dans ce projet nous utiliserons des souris. Ces animaux présentent des similarités anatomiques et fonctionnelles avec le cerveau humain et notamment au niveau des activités électriques du cerveau. De plus, la plupart des modèles de la maladie d’Alzheimer ont été développés sur cette espèce. Ce modèle exprime deux mutations humaines impliquées dans les formes familiales génétiques de la maladie. Cette lignée permet l’utilisation d’individus contrôles issus de la même portée. Ce modèle a donc un intérêt particulier pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point de traitements thérapeutiques. Par conséquent, l’utilisation de souris dans notre étude permettra une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine. La sélection de la souris est aussi basée sur des études précédemment réalisées. Les animaux sont âgés de 3,5 mois ou 9 mois puisque nous souhaitons évaluer les modifications des activités électriques chez des animaux adultes à différents stades de la pathologie. A ce stade, les circuits électriques du cerveau sont matures. Les animaux seront gardés jusqu’à l’âge de 14 mois maximum car le sujet d’étude concerne la maladie d’Alzheimer qui se développe avec le vieillissement.

3 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une administration unique du composé, puis jusqu'à six prélèvements sanguins en une semaine, sous anesthésie gazeuse. L'objectif est de mesurer comment un candidat médicament se répartit dans l'organisme, pour choisir la molécule et la dose qui passeront ensuite en clinique. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative" pour ce type d'étude et que les modélisations in silico ne sont "pas encore abouties".

Objectifs

Le projet a pour but d’évaluer la biodisponibilité de composés afin de sélectionner le meilleur candidat médicament, de définir les doses à administrer chez l’homme et la pharmaceutique optimale. Il fait suite à une première sélection de candidats médicament qui ont montrés leur efficacité sur des modèles vitro ou vivo

Bénéfices attendus

Ce projet permet d’étudier la biodisponibilité des candidats médicaments dans l’organisme vivant. Les données ainsi recueillies dans un contexte pré-clinique permettent de sélectionner les molécules candidates les plus prometteuses (selon leur profil pharmacocinétique et leur biodisponibilité) et d’identifier la forme pharmaceitique optimale avant de poursuivre vers les études cliniques. Les molécules étudiées sont à visée thérapeutique humaine ou vétérinaire (maladie d’Alzheimer, maladies cardiaques, diabète, ...).

Procédures

Les administrations sront réalisées sur animaux vigiles ou anesthésiés selon la voie utilisée. Les administrations sont réalisées en bolus (administration en une seule fois et inférieure à 30 secondes). Les animaux sont également soumis à des prélèvements sanguins répétés après application d’un analgésique si besoin et sous anesthésie. 6 prélèvements maximum sont réalisés par animal sur une semaine (la durée totale de l’intervention pour chaque prélèvement est d’environ 5 min : anesthésie + prélèvement) et sur un période allant de15 min à généralement 24h mais pouvant s’étendre jusqu’à 1 mois maximum

Impact sur les animaux

Les effets indésirables généralement observés sont principalement dus aux gestes expérimentaux, c’est à dire à l’administration du composé ou aux prélèvements sanguins. Pour les administrations on peut observer de l’inconfort ou une douleur locale au point d’injection. Pour les prélèvements répétés on peut observer un stress lié à la manipulation répétée des animaux, un inconfort, une douleur locale ou un hématome au point de prélèvement. Dans tous les cas l'inconfort ou le stress, si observé, sera de très courte durée, inférieur à 1 min. Les nuisances en lien avec les effets possibles des molécules testées sont rares. Néanmoins on pourrait observer les effets indésirables suivants : Signes de douleur sur la face, constrictions abdominales, posture modifiée, présence de sang dans les urines, modification de la consistance des selles, perte de poids, hypothermie, modification de la respiration. Si ces signes devaient néanmoins survenir ils seront de courte durée, inférieur à 1h.

Devenir

Les animaux utilisés étant des jeunes adultes entre 6 et 12 semaines, l’application d’une seconde procédure expérimentale ne peut pas être envisagée. A la suite du dernier prélèvement, l’animal est donc mis à mort.

Remplacement

L’étude de la biodisponibilité d’un candidat médicament est une étape importante et nécessaire dans le développement d’un médicament et il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour ce type d’étude. Des méthodologies de modélisation in silico sont en cours de recherche mais ne sont pas encore abouties et fiables pour apporter le même niveau d’information.

Réduction

Afin de calculer un minimum de statistiques descriptives (moyenne, écart-type et coefficient de variation) sur les données obtenues, un minimum de 3 animaux par conditions (molécule, voie d’administration, dose, formulation, temps de prélèvement) est nécessaire. L’expérimentation est définie pour prélever sur un même animal le volume minimum de sang nécessaire aux analyses tout en respectant les volumes de sang définis dans les textes règlementaires . Le nombre de prélèvement par animal est ainsi optimisé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux

Raffinement

Tout au long des expériences une observation de l’état clinique des souris est assurée. Les mesures de raffinement suivantes sont prises. Les animaux sont maintenus en groupe stable durant toute la période d’acclimatation et si possible pendant la procédure expérimentale. Afin de réduire le stress et la souffrance animale les administrations sont réalisées sous anesthésie gazeuse lorsque le geste technique ou le type d’administration le nécessite et les prélèvements sont réalisés sous analgésie et anesthésie gazeuse. Les souris à euthanasier sont placés dans une salle isolée du reste des animaux. Pour ce projet les études sont réalisées sur animaux sains. Aucune toxicité particulière n'est attendue sur les molécules testées. Des points limites adaptés sont définis et un arbre décisionnel basé sur ces points limites est établi. Des critères de diminution ou d’arrêt des souffrances sont mis en place.

Choix des espèces

Le modèle (rongeur) dans les études pré-cliniques précoces est le même modèle qui sera ensuite utilisé et requis dans le cadre d’études réglementaires de toxicocinétique. Le choix de la souris dépendra des données déjà disponibles dans la littérature et du modèle qui a été utilisé dans les précédentes études pré-cliniques et/ou qui sera requis selon les études réglementaires visées. Les animaux utilisés sont des jeunes adultes d’environ 6-12 semaines basé sur les recommandations des textes règlementaires et leur robustesse par rapport à des animaux plus âgés ou juvéniles. De plus l'utilisation d'animaux spécifiques de cette tranche d'âge permet la comparaison d'études différentes mais avec des molécules chimiquement proches en limitant le biais expérimental lié à l’âge.

Pour tester une irradiation par rayons X fins comme alternative à la chirurgie de l'épilepsie, 94 souris sont rendues épileptiques par injection d'une molécule dans le cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de quinze minutes, des IRM et une irradiation pouvant durer une heure, une seconde chirurgie de trente minutes pour implanter des électrodes, puis des enregistrements de trois heures toutes les deux semaines pendant huit mois. Le cycle reproducteur des femelles est évalué seize jours de suite, ce que le porteur reconnaît comme une source de stress répété. Toutes sont tuées pour prélever les cerveaux, une perte de poids supérieure à 20 % déclenchant l'apport d'un gel hypercalorique.

Objectifs

Une grande partie des patients épileptiques souffrent d’un type de la maladie qui est résistante aux médicaments. Cette forme d’épilepsie est caractérisée par des crises et est souvent associée à plusieurs troubles de la mémoire et de l’apprentissage. La chirurgie permet d'enlever la partie du cerveau malade qui génère les crises, mais c’est une opération qui présente certains risques et peut générer des effets secondaires. Nous étudions différentes formes de rayons X afin de développer une thérapie alternative sans avoir besoin d’ouvrir la boîte crânienne. Nous proposons d’utiliser un appareil qui permet d’appliquer des rayons X semblables à ceux actuellement utilisés en clinique humaine, mais aussi avec des faisceaux plus fins et moins nocifs, afin d'évaluer l’effet des différentes formes de rayons X. Ces expériences sont cruciales pour transférer la technologie des rayons X en faisceaux plus fins dans la pratique clinique. En démontrant sa faisabilité et son efficacité en tant que traitement non invasif de l'épilepsie pharmacorésistante, nous avons pour ambition de fournir une preuve de concept préclinique pour une application thérapeutique à l’horizon de 2030.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui, les patients souffrant de certains types d’épilepsie répondent mal aux traitements pharmacologiques classiquement prescrits. Le meilleur traitement reste la chirurgie de retrait de la zone du cerveau malade après ouverture de la boîte crânienne. Malgré un taux d'efficacité de 60%, cette technique présente de nombreux risques, tels que des infections et des troubles de la mémoire et de l’apprentissage. De plus en plus de patients sont réticents à cette méthode. Il est donc nécessaire de trouver des traitements alternatifs efficaces et non invasifs. Notre étude par irradiation avec des rayons X plus fins que ceux utilisés actuellement permettrait de développer une nouvelle méthode de traitement, plus efficace que la chirurgie, non invasive, avec moins d’effets secondaires et une durée d’hospitalisation moindre.

Procédures

Les souris subiront dans un premier temps une chirurgie d’environ 15 min visant à les rendre épileptiques, par injection d’une molécule dans une région précise du cerveau. Des IRM seront effectuées pendant une durée n’excédant pas 60 minutes. L’irradiation dure moins de 60 minutes. Afin de mesurer les effets de l’irradiation sur les crises, des électrodes intra-cérébrales seront positionnées (chirurgie d’environ 30 min). Les souris seront ensuite soumises à un enregistrement de leurs crises pendant 3 heures toutes les deux semaines pendant 8 mois après irradiation afin de vérifier l’efficacité et la stabilité du traitement. De plus, des tests évaluant le comportement des animaux seront effectués 4 et 8 mois après l’irradiation. Le cycle menstruel des souris femelles sera également évalué de manière répétée pendant 16 jours consécutifs.

Impact sur les animaux

Cette étude se déroule sur plusieurs mois et peut comporter certains effets indésirables pour les animaux. La première étant l’épilepsie. Les animaux font essentiellement des crises partielles qui ne présentent pas de signes de douleurs apparentes lors de leur déclenchement, et qui sont indolores chez l’homme. Certaines souris peuvent présenter des crises convulsives occasionnellement, qui peuvent entraîner un stress et des douleurs musculaires. Après les chirurgies, les souris peuvent ressentir des douleurs et potentiellement des problèmes pour se nourrir et s’hydrater pendant les premières 24 heures. Les souris épileptiques sont plus réactives et doivent être hébergées séparément pour éviter tout conflit entre individus et/ou une altération possible de l’électrode. Il est possible que les souris subissent un léger stress lors des déplacements vers les salles expérimentales. Après irradiation, il est possible que les souris présentent des effets indésirables comme une perte de poids et une perte de poil au niveau de la zone irradiée. Le cycle menstruel des souris femelles sera également évalué de manière répétée pendant 16 jours consécutifs, ce qui peut induire un stress répété.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever les cerveaux et d’observer au niveau structural et cellulaire les effets de la radiothérapie.

Remplacement

Actuellement, aucun modèle alternatif ne permet de remplacer l'utilisation d'animaux pour étudier ce type d’épilepsie. Il n’existe aucun modèle in vitro ou sur ordinateur qui permette de mettre en évidence ce type d’épilepsie dans le cerveau, ni de le traiter par irradiation. Le modèle de souris choisi pour cette étude est reconnu dans la littérature pour reproduire la pathologie chez l’homme : crises spontanées, perte des neurones, inflammation du tissu nerveux, modification de l'architecture neuronale du cerveau, résistance aux traitements antiépileptiques, autres symptômes de la maladie.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire est calculé en fonction de notre connaissance de ces procédures et des analyses statistiques des résultats qui seront utilisées. Grâce à une approche statistique, le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet.

Raffinement

Toutes les procédures (chirurgie pour l’épilepsie, IRM, chirurgie d’implantation de l’électrode, irradiation) sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie pour minimiser la douleur et le stress de l’animal. Pendant les premières 48h post-chirurgies et irradiation, des croquettes seront placées directement dans la cage, et un suivi journalier du poids et de l’état général de l’animal sera effectué. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long du projet, pendant et entre les procédures, et une échelle de douleur nous permettra d’intervenir rapidement par l’administration d’analgésique ou la mise à mort de l’animal. Du gel hypercalorique et appétent sera donné en cas de perte de poids constatée (plus de 20%). De plus, la manipulation des animaux sera faite de manière douce pour éviter un stress supplémentaire. Des sessions d’habituation (aux expérimentateurs, salles de comportement) seront également effectuées.

Choix des espèces

Le modèle d’épilepsie chez la souris que nous utilisons est actuellement un modèle de référence, parmi les plus proches des conditions observées chez l’homme. Des animaux adultes âgés de 8 semaines seront utilisés dans ce projet. Le modèle a été développé chez des animaux de cet âge afin de travailler sur un cerveau mature qui restera stable tout au long des procédures.

Pour désigner le vecteur viral le plus efficace avant des études réglementaires, deux macaques à longue queue sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous deux tués à l'issue pour prélever leurs organes. Ils reçoivent deux perfusions de rituximab de deux heures et une injection d'imlifidase, maintenus sur une chaise de contention pendant plus de deux heures à chaque fois, avant l'injection des vecteurs AAV. L'immunosuppression ainsi provoquée les rend plus vulnérables aux infections, et le porteur relève que ces mêmes produits peuvent déclencher chez l'humain des réactions anaphylactiques aiguës. Le nombre de deux animaux n'est adossé à aucun calcul, le porteur écrivant qu'aucune approche statistique n'a été réalisée.

Objectifs

Les vecteurs ou virus adéno-associés (AAV) sont des outils particulièrement efficaces et prometteurs pour le transfert de gènes, en partie parce que les AAV sont des virus non pathogènes capable de conduire à l'expression de gènes à long terme sans intégration de l'ADN du vecteur dans le génome de l'hôte. Cependant, la population est régulièrement exposée aux AAV. Elle peut ainsi développer une immunité dirigée contre ces AAV via la production d’anticorps neutralisants capable de détruire les produits construits avec des AAV et les empêchant d’être efficaces. L'objectif de cette étude est de sélectionner l’AAV le plus efficace après avoir inhibé temporairement la réponse immunitaire grace à des immunosupprésseurs. Pour cela le projet prévoit d'évaluer la capacité à traverser la barrière hémato-encéphalique et à transduire dans le système nerveux central (SNC) de plusieurs capsides d’AAV. En cas de succès, le vecteur selectionné pourra être utilisé pour un certain nombre de maladies génétiques liées au SNC.

Bénéfices attendus

En cas de succès, le vecteur pourra être utilisé comme « moyen de transport » pour apporter du matériel génétique dans les cellules cibles et ainsi traiter des maladies génétiques qui affectent le système nerveux central.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux vigiles recevront à deux reprises un anticorps monoclonal (rituximab) et à une reprise l'imlifidase par voie intraveineuse. Les injections d'anticoprs dureront 2 heures et la contention sur chaise durera environ 2 heures et 10 minutes et l'injection d'imlifidase durera 30 minutes et la contention sur chaise durera environ 40 minutes. Les animaux bénéficieront d’une période de repos de trois semaines entre les 2 administrations d'anticorps et 3 jours entre la dernière administration de l'anticorps et l'administration de l'imlifidase. Puis une semaine après l’administration de l’anticorps monoclonal les animaux recevront les AAV d’interêt. L’injection durera 15 minutes et la contention sur chaise durera environ 25 minutes. Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les administrations par voie intraveineuse pourront provoquer un stress, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou oedème léger par exemple) au niveau de la zone de d'injection. Durant les administrations, les animaux seront placés sur des chaises à contention ce qui a pour conséquence de réduire leurs mouvements. Les animaux auront accès à de l’eau et des friandises durant cette manipulation. Les études de toxicité du rituximab et de l'imlifidase aux doses precrites chez le singe cynomolgus n’ont révélé aucun autre effet que la diminution pharmacologique prévue du nombre des lymphocytes B. En revanche, chez l’humain l’administration de rituximab et de l'imilifidase peut engendrer dans les cas les plus graves des réactions inflammatoires ou anaphylactiques aigues. Après l’induction de l’immunosuppression, les animaux seront plus susceptibles de développer une infection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet dans le but de récolter les organes et d’évaluer la disctribution des AAV.

Remplacement

Les études de biodistribution in vivo chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles thérapies. En effet, celles-ci permettent de déterminer la localisation des AAV dans les tissus après administration et ainsi déterminer le lieu de distribution d'un futur transgène thérapeutique. Cette étude aura lieu chez le primate car cette espèce apporte les meilleures données transposables à l’homme concernant la traversée de la barrière hématoencéphalique mais également concernant la transduction avec les vecteurs AAV. Ceci ne pourrait être obtenu in vitro et justifie le recours à des animaux.

Réduction

Le nombre estimé d'animaux utilisés dans ce projet a été défini à 2 primates répartis en 1 lot. Il a été réduit au minimum afin de tout de même obtenir des résultats fiables interprétables. Ces données préliminaires permettront de définir le nombre d’animaux nécessaires pour les études réglementaires. Aucune approche statistique n'a été réalisée.

Raffinement

Un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie comprenant des enrichissements structuraux permettant aux primates d'évoluer dans un environnement tridimensionnel ; - De la litière pour leur permettre de fourrager ; - Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; - Des friandises et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; - De la musique d'ambiance est diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation specifique au projet de 28 jours sera mise en place avant le début de l’étude incluant un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (prise de température rectale, chaise à contention). Durant les administrations, les animaux seront assis sur des chaises à contention. Pour limiter leur stress et l’ennui, un personnel formé veillera à interagir avec les animaux, leur distribuer des friandises ou encore leur projeter un documentaire/dessin animé sur une tablette électronique par exemple. Des points limites seront mis en place afin de detecter précocément tout signe de stress ou de douleur. Les administrations seront réalisées sur animal vigile car l'anesthésie engendre un stress et un risque plus important pour l'animal que la procédure elle-même ou peut constituer un biais pouvant interférer avec les résultats scientifiques de l'étude en modifiant les paramètres physiologiques des animaux. Cependant, une sédation pourra être envisagée en cas de besoin.

Choix des espèces

Les primates non humains (PNH) constituent un modèle animal privilégié pour l'optimisation des protocoles d'administration de gènes dans les système nerveux central (SNC) par les AAV avant les essais cliniques chez l’homme. En effet, il est admis que les primates non humains (PNH) présentent de nombreuses similitudes que l'on ne retrouve pas dans d'autres modèles animaux, par exemple une grande homologie de séquence d'ADN (93 % avec les macaques rhésus), des schémas d'expression génique similaires entre les cerveaux de macaques et les cerveaux humains contrairement aux cerveaux de souris. Aussi les primates et les humains ont en commun un néocortex considérablement élargi et une spécialisation des zones corticales par rapport aux souris. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses post mortem. Sachant que des prélèvements d’organes seront réalisés post-mortem dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.