Troubles nerveux

Tester des candidats médicaments antiépileptiques pour le compte d'industriels du médicament : 1 200 rats issus de deux lignées sélectionnées pour être épileptiques vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un tiers subit une neurochirurgie d'environ une heure sous anesthésie générale, puis vit seul en cage, l'isolement social suivant l'implantation des électrodes d'enregistrement. Les injections peuvent être quotidiennes pendant quatre mois au maximum, et le porteur signale des effets indésirables non attendus possibles, perte de tonus musculaire, somnolence ou excitation selon les molécules. 1 000 rats seront tués pour prélever cerveau et tissus, 200 pourront être réutilisés pour de la formation ou un autre plan d'étude, l'effectif total reflétant selon le porteur "l'activité envisagée de la société" sur cinq ans.

Objectifs

L’épilepsie représente l’une des atteintes neurologiques les plus prédominantes, avec environ 0.8 à 1 % de la population mondiale souffrant d’un syndrome épileptique. Il existe différents types d’épilepsies pouvant être catégorisées suivant l’origine de la maladie mais également suivant l’origine cérébrale des décharges épileptiques. Dans ce projet, nous nous sommes intéressés à une forme généralisée d’épilepsie ; l’épilepsie-absence. Cette forme d’épilepsie se caractérise par l’apparition de décharges épileptiques généralisées non convulsives associées à une brève interruption de conscience et un arrêt de toute activité. Au niveau électroencéphalographique, des activités épileptiques sont observées. Ces crises sont appelées décharges pointes-ondes. Le développement clinique de nouvelles drogues antiépileptiques requiert tout d’abord le test sur des épilepsies pharmaco-résistantes en polythérapie puis en monothérapie. Ces nouvelles molécules doivent ensuite montrer une efficacité sur des épilepsies généralisées de type absence en polythérapie puis en monothérapie. L’épilepsie-absence a pu être modélisée chez le rat par croisement successif. Il existe 2 lignées obtenues de cette façon. Des études pharmacologiques sur ces modèles ont montré une sensibilité aux mêmes antiépileptiques que les patients, mais aussi une même sensibilité aux molécules induisant une aggravation chez les patients. Ces modèles, au cours des années, sont devenus des références pour évaluer les effets curatifs et éventuellement aggravants de nouvelles molécules en développement. Les traitements actuels contre l’épilepsie ne sont pas satisfaisants, il est donc nécessaire de valider de nouveaux candidats médicament. Ce projet vise à aider les industriels du médicament à identifier, sélectionner et valider de nouveaux médicaments afin de palier au manque d’alternatives thérapeutiques disponibles. Ce projet permettra une meilleure sélection et validation de nouveaux médicaments contre l’épilepsie absence et d’optimiser les chances de succès lors des phases cliniques.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels contre l’épilepsie ne sont pas satisfaisants, il est donc nécessaire de valider de nouveaux candidats médicament. Ce projet vise à aider les industriels du médicament à identifier, sélectionner et valider de nouveaux médicaments afin de palier au manque d’alternatives thérapeutiques disponibles.

Procédures

1/3 des animaux de ce projet va subir une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. Les animaux pourront être soumis à des enregistrements une à deux fois par semaine. Lors de ces enregistrements des traitements pharmacologiques en courte durée seront administrés (injections aigues durant quelques minutes), Une période de repos de 2 jours minimum sera respectée entre 2 sessions (en fonction du delais possible d'admission des candidats médicaments). Lors des tests pharmacologiques en administration de longue durée (chronique), les injections pourront être réalisées une fois par jour, sur une durée maximum de 4 mois. Des prélèvements sanguins (d'une durée de quelques minutes) pourront être faits au cours de la procédure expérimentale en fonction du plan expérimental établi.

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir une neurochirurgie d’environ une heure comprenant la période d’anesthésie. Suite à la chirurgie, une diminution de l'activité locomotrice et une déshydratation passagère pourront être observées. Une douleur modérée pourra apparaitre dans les heures suivant l'intervention chirurgicale. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tous tests de composés sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir, notamment une perte de tonus musculaire, une somnolence ou à l'inverse une excitation due au fait des mécanismes d'action des molécules testées. Les animaux sont hébergés en cage individuelle après l'implantation des dispositifs d'enregistrement ce qui engendre un isolement social. Les prélèvements sanguins pourront produire une douleur modérée (piqure d’aiguille). Les animaux présentent un phénotype d’épilepsie d’absence : les animaux présentent des absences momentanées de courtes durées.

Devenir

Dans la procédure 1 : les animaux pourront être réutilisés au besoin pour de la formation, si leur bien-être le permet et s’ils n’ont pas reçu toutes les administrations prévues dans les procédures. Dans la procédure 2 : les animaux seront mis à mort dans le but de faire des prélèvements et des analyses du cerveau et des tissus. Si les animaux ne sont pas mis à mort, ils pourront être réutilisés (pour de la formation ou pour un autre plan d'étude) si : - le nombre d'injection maximum n'a pas été atteint - le bien être de l'animal le permet.

Remplacement

Cette étude nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle implique des mécanismes pathologiques complexes qui ne peuvent pas être représentés par des modèles plus simples (ex. modèle cellulaire ou fait par ordinateur). Pour toute demande de mise sur le marché, et quel que soit le pays de vente ciblé, il est indispensable pour les industries pharmaceutiques de prouver l’innocuité et l’efficacité d’une molécule. Avant de réaliser des essais cliniques, des tests in vitro et in vivo sont nécessaires. Les mécanismes d’apparition, puis de mise en place des troubles neurologiques, sont encore peu connus et nécessitent des explorations supplémentaires. Cette étude nécessite donc l'utilisation de modèles animaux car elle cible des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être récapitulés par des modèles plus simples (ex. culture de neurones).

Réduction

Nous pouvons estimer notre utilisation à 4 lots par an sur 5 ans (soit 400 animaux). Un maximum de 20 rats par lot est prévu, selon le protocole expérimental établi. Ce nombre permet d’obtenir une bonne fiabilité des résultats et une puissance statistique suffisante pour conclure sur l’efficacité du composé testé. Pour la procédure 2, nous planifions l’utilisation de 2 lots par lot d’animaux passant en procédure 1 (2x4x20x5 rats) sur 5 ans pour les dosages pharmacocinétiques. Un lot représente un dosage sur un plan d’étude croisée : utilisation de 4 animaux par condition (en moyenne 5 conditions par plan d'étude). Les animaux pouvant être testés sur 2 plans d’étude croisé, ce nombre de lots reflète l’activité envisagée de la société dans les 5 prochaines années, soit 800 animaux. Ce nombre d’animaux est un nombre maximal, l’utilisation dépendra de la demande. Ce nombre d’animaux a été déterminé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en gardant un nombre suffisant pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées.

Raffinement

Le projet implique la mise en place d’un système d’enregistrement de l'activité des neurones chez le rongeur avec une chirurgie. Cependant, l’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Une analgésie est réalisée avant et après la chirurgie de manière à réduire la douleur pouvant survenir lors de l’acte chirurgical. A leur arrivée, les animaux passent 1 semaine en acclimatation dans l’animalerie avant toute expérience. Les animaux sont rassemblés 1 fois par semaine dans une « cours de récréation » pour assurer le maintien du contact social. Les animaux d’une même étude (maximum 12 animaux par session) sont rassemblés dans une enceinte fermée sur les cotés avec litière et divers enrichissements, leur permettant une liberté de mouvement plus grande et une interaction entre congénères. Cette session dure 30 minutes. Des points limite ont été définis et une prise en charge de la douleur avec utilisation d’analgésique sera effectué en cas de besoin.

Choix des espèces

Les modèles animaux sont indispensables pour avancer dans la compréhension des épilepsies. Les lignées des rats épileptiques ont été développées en sélectionnant des lignées de rats naturellement épileptiques, qui présentent le même type d’anomalies comportementales et neuronales que l’humain. Les activités neurologiques, visibles à l’enregistrement de neurones ont des tracés similaires à ceux observés chez les patients souffrant d’épilepsie-absence : début et fin abruptes, oscillations rapides et régulières. Les modifications comportementales sont similaires à celles d’un humain pendant une crise absence : brève rupture de contact se traduisant par une activité motrice figée et une fixité du regard. Les tests pharmacologiques montrent les sensibilités aux mêmes drogues. Des animaux adultes sont utilisés (âge minimum de 2 mois). Pour que les implantations des électrodes et leur fixation sur la boite crânienne se fassent sans douleur, il faut que la structure osseuse soit mature, c’est-à-dire que l’animal ait fini sa croissance osseuse. De plus, les crises d’épilepsie apparaissent et sont stables à adulte dans les 2 souches.

Placées dès le sevrage, à trois semaines, sous régime hyperlipidique ou standard pendant douze semaines, 1 300 souris mâles et femelles enchaînent ensuite quatre tests comportementaux espacés d'au moins 48 heures. Une partie subit une chirurgie stéréotaxique d'une heure, une partie des femelles une ovariectomie, et 52 d'entre elles un jeûne de cinq heures suivi de sept prélèvements sanguins en deux heures. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, le conditionnement de peur pouvant provoquer un stress aigu durant 24 heures et la chirurgie une perte de poids limitée à 13 %. Toutes finissent par une mesure de masse grasse de deux minutes, un dernier prélèvement de sang, puis la mise à mort pour récupérer les cerveaux.

Objectifs

Si l’obésité est un réel problème de santé publique, générant une diminution de l’espérance de vie en raison des maladies qu’elle entraîne (hypertension, cancers, diabètes …), elle est également associée des déficits de mémoire. Ceci est d’autant plus problématique pendant l’enfance et l’adolescence qui représentent des périodes de maturation de certaines structures du cerveau indispensables pour la mémoire, comme l’hippocampe. Notre équipe a récemment mis en évidence chez la souris que la consommation d'une nourriture hyperlipidique (HL) pendant l'adolescence, en plus d'entrainer l’obésité, perturbe la mémoire et ceci implique un important système neuromodulateur, le système endocannabinoïde (SEC), au sein d’une structure particulière du cerveau (l'hippocampe). Nos études, tout comme la quasi-totalité des études de la littérature, ont utilisé des souris mâles comme modèle de l'obésité. Cependant chez l'humain, l'obésité affecte hommes et femmes de façon équivalente. Ainsi, pour élargir l'étendue de ces découvertes chez l'Homme, l’équipe s’est récemment intéressée aux deux sexes en incluant l'utilisation de souris femelles. Il a pu être démontrer que la nourriture HL consommée à l’adolescence a bien des effets délétères sur la mémoire des souris femelles, semblable à ceux observés ultérieurement chez les mâles. Bien que le SEC soit également impliqué chez la femelle, les types cellulaires et/ou les structures cérébrales mis en jeu semblent différentes de celles des mâles. L'objectif du présent projet est d'identifier les mécanismes neurobiologiques impliqués dans les déficits de mémoire induit par la consommation d'un régime obésogène hyperlipidique à l’adolescence chez les deux sexes, afin de mieux considérer l'effet genre. Pour cela, des souris mâles et femelles seront exposées pendant 12 semaines à un régime hyperlipidique (HL) ou standard (Cont) avant de réaliser des tests comportementaux simples permettant d’évaluer la mémoire. L’ensemble des procédures proposées est en conformité avec les directives européennes 2010/63/UE et françaises, dans le respect des nouveaux standards de soin et de bien-être des animaux (règle des 3Rs).

Bénéfices attendus

Ces expériences devraient permettre une meilleure compréhension des effets d'une nourriture HL sur le cerveau et la mémoire en identifiant certains mécanismes afin d'envisager potentiellement à plus long terme des stratégies thérapeutiques.

Procédures

Tous les animaux subiront, à au moins 48h d’intervalle, quatre tests comportementaux. Chaque étape de ces tests dure entre 6 et 10 minutes. Une partie des animaux (52) subira une fois un jeune de 5h préalablement aux mesures métaboliques (7 prélèvements sanguins sur une durée de 2 h). Une partie des animaux subira une intervention chirurgicale. La chirurgie stéréotaxique, réalisée sous anestésie gazeuse et en présence d'antalgique et d'anti-inflammatoire, dure 1h avec une phase de réveil de 20 minutes. Une partie de femelles subira également une ovariectomie, réalisée sous anesthésie gazeuse et en présence d'antalgique et d'anti-inflammatoire. Cette intervention dure 15 minutes avec une phase de réveil de 5 minutes. Tous les animaux subiront en fin d’expérimentation, une seule analyse en imagerie d’une durée de 2 min afin d’évaluer la répartition de leur masse grasse/masse maigre et un seul prélèvement sanguin.

Impact sur les animaux

L’alimentation obésogène donnée pendant 12 à 15 semaines entraîne un surpoids qui reste non délétère chez des animaux jeunes, comme ceux utilisés dans notre étude. Les tests de comportement, ainsi que les injections intra-péritonéales peuvent induire un stress qui sera limité par une habituation à la manipulation et à l'injection avant expérimentation. Les prélèvements de sang à la queue durant le test de tolérance au glucose (GTT) pourront engendrer une légère douleur aux animaux. La chirurgie stéréotaxique pourra entraîner dans les 48h suivant l’opération une douleur et un stress se traduisant par une perte de poids qui doit se limiter à 13% du poids initial. La phase d'acquisition du conditionnement de peur pourrait induire une gêne passagère des animaux et entraîner un stress aigu qui pourrait se poursuivre pendant 24h, mais nos précédents tests n’ont pas montré d’effet sur l’état général ou le poids des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en vue de récupérer leurs cerveaux pour des analyses biochimiques ou des contrôles histologiques.

Remplacement

L’étude intégrée des effets de la nutrition sur des aspects comportementaux et du fonctionnement cérébral est permise grâce à l’utilisation du modèle de rongeur soumis à de la nourriture obésogène et il n’est pas possible de le remplacer par des approches cellulaires sur des modèles in vitro ou in silico. Les tests comportementaux utilisés font appels à des comportements spontanées chez les rongeurs. Les chirurgies sont courtes mais nécessaires pour réaliser des manipulations chémogénétiques dans le cerveau et restent peu invasives dans la vie de l'animal. Les recherches seront réalisées en accord avec les recommandations institutionnelles pour le bon traitement des animaux de laboratoire.

Réduction

Tous les efforts seront faits pour réduire les souffrances inutiles et réduire le nombre d'animaux en effectuant plusieurs tests comportementaux chez les mêmes individus plutôt que des groupes différents. De plus, le nombre d’animaux sera réduit au mieux grâce à l’utilisation de tests statistiques minimisant le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats concluants et permettre des comparaisons statistiques fiables. Cela représente un total de 1300 (702 femelles et 598 mâles) sur 5 ans. Ces expériences devraient permettre une meilleure compréhension des effets d'une nourriture HL sur le cerveau et la mémoire en identifiant certains mécanismes afin d'envisager potentiellement à plus long terme des stratégies thérapeutiques.

Raffinement

Un soin particulier sera porté au bien-être de l'animal tout au long de sa vie. Les souris recevront de l’eau et de la nourriture à volonté et seront surveillées régulièrement. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec administration d’antalgiques en pré- et post-opératoire pour limiter la douleur. Toutes les précautions d'asepsie et de confort seront prises pour limiter l'inconfort des animaux (application d'un gel ophtalmique, opération sur tapis chauffant, ré-hydratation post-chirurgie). Les jours suivant la chirurgie, les animaux sont surveillés attentivement une fois par jour pour s’assurer de leur bon rétablissement. Avec la mise en place de points limites, si un animal présente une anomalie, il sera immédiatement isolé, surveillé et soigné par la prise d’un anti-inflammatoire pendant 3 jours jusqu’à amélioration. Durant les mois suivant la chirurgie, les animaux seront surveillés tous les jours de la semaine et pesés 1 fois par semaine par un personnel qualifié. S’il n’y a aucun signe de mal-être chez l’animal, il passera en phase comportementale qui sera optimisée pour durer le moins de temps possible. L’expérimentateur prendra le plus grand soin en manipulant l’animal et les tests comportementaux seront le moins stressant (lieu calme, acclimaté et inoffensif) et les souris seront remises avec leurs congénères entre chaque phase de test. Les injections pharmacologiques seront réalisées de façon aigüe de sorte à limiter les interventions sur l’animal.

Choix des espèces

Le modèle de rongeur soumis à des régimes obésogènes permet l’étude intégrée de la nutrition sur des aspects comportementaux et de fonctionnement cérébral qu’il n’est pas possible de remplacer par des approches cellulaires. En particulier, les tests comportementaux permettant d’évaluer chez l’animal vigile les dimensions cognitives et émotionnelles sont une nécessité expérimentale pour évaluer la réalité physiologique de nos résultats. Les souris seront exposées aux régimes obésogène ou contrôle dès le sevrage (3 semaines d’âge) et pendant 12 semaines afin de couvrir la période de l'adolescence. Les approches immunohistochimiques et biochimiques permettent d’appréhender les mécanismes physiologiques régissant l’effet de différents apports nutritionnels sur les fonctions cérébrales.

Six macaques crabiers vont être utilisés, tous tués à la fin du projet pour une étude post-mortem du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'implantation pouvant durer six heures, des injections répétées de neurotoxine sur quatre mois qui les rendent parkinsoniens, un isolement de 72 heures après chaque injection, une tâche de vigilance de deux heures trois jours par semaine et des tests de latence d'endormissement de trois heures répétés au moins dix fois par condition. Un contrôle partiel de la ration d'eau pourra être mis en place pour maintenir leur motivation. La luminothérapie ayant déjà été publiée chez la souris et le rat, avec des essais cliniques en cours, le porteur affirme qu'une étude chez le primate non humain reste "nécessaire" avant toute mise sur le marché.

Objectifs

Les troubles du sommeil sont très fréquents dans la population et leur fréquence augmente considérablement chez les patients atteints de la maladie de Parkinson. Ce projet vise à évaluer l’effet de la lumière proche de l’infrarouge appliquée de façon non invasive sur les troubles du sommeil et leur répercutions sur la qualité de l’éveil dans la maladie de Parkinson. Les expérimentations seront réalisées chez l’animal sain puis rendu parkinsonien. La lumière sera appliquée de deux façon différente : en aigue (effet thérapeutique) et en semi-chronique (effet préventif). Dans ces 2 cas, le protocole sera identique, seul le mode d’administration de la lumière sera différent.

Bénéfices attendus

Environ 70 pourcents des patients atteints de la maladie de Parkinson souffrent aussi de troubles du sommeil. Dans la population 1 français sur 3 souffrent d’un mauvais sommeil. Un trouble du sommeil retentit sur la qualité de l’éveil, la physiologie et l’activité des structures cérébrales, ainsi un meilleur sommeil contribuerait à considérablement améliorer la qualité de vie et la santé des sujets sains ou atteints de maladies neurologiques. Ce projet propose d’évaluer l’effet de la luminothérapie, appliquée de façon non invasive, sur les troubles du sommeil. Le contrôle des troubles du sommeil permettrait une meilleure prise en charge des patients atteints de la maladie de Parkinson et contribuerait à améliorer leur qualité de vie. Enfin, il apparait que les troubles du sommeil sont des facteurs aggravants dans les maladies neurodégénératives, ce projet permettrait aussi d’envisager la dimension neuroprotectrice du sommeil.

Procédures

Tout au long du projet, les animaux réaliseront une tâche comportementale de vigilance qui prendra au maximum 2h par jour, à heure fixe et 3j sur7. Elle se déroulera à l’état conscient dans la cage à laquelle ils sont habitués et sur une chaise pour primates, sur laquelle ils sont entrainés à aller. La chirurgie d’implantation sera peu invasive, et durera au maximum 6h. De l’équipement, pour des enregistrements de sommeil, sera placé sur le crâne et sous la peau. Des enregistrements de sommeil, sans fil, se feront dans la cage d’hébergement de l’animal sans manipulation. Un maximum de 10 nuits et de 10 jours de 12h pourra être enregistré dans chaque condition : animal sain, animal sain avec illumination la nuit, animal parkinsonien, animal parkinsonien avec illumination la nuit. Des tests de latence d’endormissement seront réalisés dans une cage de sieste, à laquelle ils sont habitués. Le test dure 3h et sera effectué au moins 10 fois dans chaque condition. Les animaux seront rendus parkinsoniens par des injections de neurotoxine. Après chaque injection les animaux seront isolés pendant 72h jusqu’à l’élimination de la toxine. Les injections permettent l’obtention d’un syndrome parkinsonien modéré et stable. Cette phase dure 4 mois. Les prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien seront réalisés sous une légère anesthésie et espacés de un mois pour le premier et deux mois pour le deuxième.

Impact sur les animaux

Si nécessaire, afin d’obtenir une motivation maximale de l’animal pour réaliser des tests de memoire et d'attention, un contrôle partiel de la ration d'eau pourra être mis en place selon un protocole adapté à chaque animal et développé à partir de « Avis et recommandations sur le contrôle d'eau pour les protocoles scientifiques chez les primates non-humains », Comité national de réflexion éthique sur l’expérimentation animale, 2021. Cela permettra un maximum de motivation sans impact sur l'état de santé de l'animal. La chirurgie d’implantation peut engendrer une douleur post-opératoire suite à l’implantation du matériel d’enregistrement télémétrique. L’état de santé des animaux sera suivi avec attention et des traitements adaptés seront donnés en cas de douleur. Cet effet indésirable peut durer jusqu’à 1 semaine après l’implantation. Le test de la latence d’endormissement ne devrait pas induire d’effet indésirable chez les animaux car il se fera dans une cage de comportement à laquelle l’animal aura été habitué. Les expériences sur les rongeurs montrent que la luminothérapie ne crée pas de nuisances. Une évaluation de l’impact de la luminothérapie chez l’animal sain sera réalisée en début de projet et les paramètres de son application seront réglés à ce moment. Des injections de toxine engendreront un syndrome parkinsonien modéré présent jusqu’à la fin de l’étude . Lors de la période d’intoxication, les injections de toxine nécessiteront un isolement de 72h toutes les deux semaines pour ne pas contaminer ses congénères ainsi que le personnel. Ce syndrome sera surveillé et des traitements adaptés seront donnés en cas de détection de mal être de l’animal.

Devenir

A la fin du projet il est nécessaire de mettre à mort les animaux afin d’effectuer une étude post-mortem du cerveau pour constater l’effet de l’illumination sur le cerveau. Le nombre utilisé espéré d'animaux est de 3, les 3 autres seront commandés uniquement en cas de problème.

Remplacement

Le singe Macaque fascicularis, utilisé dans cette étude, est un animal qui présente une des structures cérébrales qui contrôlent le sommeil (le cortex, l’hypothalamus et le tronc cérébral) similaire à celles connues chez l'humain, ce qui sous-entend que les mêmes mécanismes se mettent en place au cours du sommeil chez ces 2 espèces. D’ailleurs, il présente un comportement de veille/sommeil similaire à celui des humains, avec un éveil diurne et une nuit organisée en au moins 7 cycles de sommeil. C’est aussi un modèle de choix dans cette étude car une intoxication avec une toxine permet de développer des troubles du mouvement et du sommeil similaires à ceux présents dans la maladie de Parkinson. Des résultats de la luminothérapie ont été publiés chez la souris et le rat, des essais cliniques très ciblés sont en cours, mais l’étude exhaustive des effets de la luminothérapie chez le primate non humain rendu parkinsonien sont nécessaires avant la mise sur le marché d’un tel dispositif pour les patients. A ce stade des avancées sur la luminothérapie, cette étude ne peut se faire qu’au niveau préclinique, donc chez le primate non humain, il nous est donc impossible de remplacer cet animal par un modèle rongeur, un modèle cellulaire ou de simulation informatique. Le recours à ces animaux est donc nécessaire dans cette étude qui constitue une étape vers la validation d’un dispositif thérapeutique utilisable par l’humain.

Réduction

C’est une étude dans le temps et préclinique dans laquelle l’animal est son propre contrôle, peu d’animaux seront donc nécessaires. La répétition des mesures dans les différents états (sain avec ou sans luminothérapie, parkinsonien avec ou sans luminothérapie) permettra d’évaluer l’impact de la luminothérapie avec un test statistique. Le nombre utilisé espéré d'animaux est de 3, les 3 autres sont prévus et seront commandés uniquement en cas de problème.

Raffinement

Durant la chirurgie, des analgésiques, des anesthésiques et des antibiotiques seront administrés aux animaux afin de supprimer les douleurs et de diminuer les risques d’infections. En post-opératoire il sera aussi administré des analgésiques et des antibiotiques afin de réduire au maximum les douleurs et les risques d’infections. Lors de la phase d’intoxication à la toxine les animaux serons isolé pendant 72h toutes les deux semaines. Afin de diminuer le stress des animaux, un programme d’habituation aux conditions expérimentales est mis en place dans l’animalerie. Ces habituations consistent en des entrainements et se feront selon un protocole progressif, dans lequel chaque étape est apprise progressivement et est récompensée. Un tableau de progression est utilisé pour suivre les progrès des animaux. Les techniciens de l’animalerie et les membres de la cellule bien-être animal s’assureront par des visites régulières qu’aucune souffrance ou mal être n’est ressenti par l’animal au cours de l’expérimentation. Le personnel impliqué sur le projet est formé au bien-être animal. Des points limites suffisamment précoces et adaptés à la procédure expérimentale ainsi qu'un arbre décisionnel pour intervenir le plus rapidement possible pour limiter la souffrance animal sont mis en places.

Choix des espèces

Le primate non-humain fait partie des mammifères les plus proches de l’espèce humaine. Son anatomie cérébrale est très proche de celle du cerveau humain. Les Macaques fascicularis, qui ne constituent pas une espèce de primates menacée d’extinction, possèdent des circuits neuronaux proches de ceux de l’humain et permettent ainsi la compréhension des circuits neuronaux impliqués dans les mécanismes du comportement de veille/sommeil, ce qui n’est pas le cas des rongeurs qui ont un rythme inversé avec des cycles plus courts. Il est possible de reproduire chez cet animal un syndrome parkinsonien similaire à celui observé chez les patients s'accompagnant de plus d'un trouble de sommeil comme chez le patient parkinsonien. Des adultes seront utilisés dans cette étude car les traitements à développer à la suite visent des patients adultes.

1 250 souris vont être utilisées, dont cinquante pour entraîner le geste chirurgical et quinze par donneur humain, avec des mises à mort échelonnées sur trois dates. Une partie est immunodéficiente, donc exposée aux infections et aux tumeurs, ce que le porteur nomme un phénotype dommageable. Chacune subit deux chirurgies de la moelle épinière à quarante-huit heures d'intervalle, l'une pour détruire la myéline, l'autre pour y greffer des cellules immunitaires humaines, puis des tests de traversée d'une barre crantée et de force des pattes avant. Toutes sont tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour fabriquer le modèle animal de sclérose en plaques qui manque aujourd'hui.

Objectifs

La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire et démyélinisante du système nerveux central. Dans cette pathologie les macrophages et lymphocytes du sang pénètrent le cerveau et la moelle épinière et viennent détruire une composante essentielle du système nerveux : la myéline. On distingue différent type de lésions décrites chez les patients atteints de sclérose en plaques. Un type de lésion en particulier est associé à une maladie plus agressive. Mais, à l’heure actuelle, aucun modèle animal ne permet l’étude de ce genre de lésion. L’objectif de ce projet sera de développer un nouveau modèle animal de lésions chroniques actives afin d’étudier la formation et l’évolution de ces lésions que l’on observe chez les patients atteints de forme agressive de la maladie.

Bénéfices attendus

En France, plus de 130 000 personnes vivent avec la sclérose en plaques (SEP), une maladie qui touche 2,8 millions de personnes dans le monde. Elle est souvent diagnostiquée entre 25 et 35 ans, mais peut aussi apparaître plus tôt ou plus tard. Chaque année, 5 000 nouveaux cas sont recensés en France. La SEP concerne principalement les femmes (trois malades sur quatre), mais leur progression vers le handicap est plus lente que chez les hommes, qui présentent un risque plus élevé de complications neurologiques. Il existe deux formes principales de la maladie : La forme rémittente (RR) : elle évolue par poussées, avec des symptômes qui apparaissent puis disparaissent. C'est la forme la plus fréquente et elle débute souvent entre 25 et 35 ans. Avec le temps, elle peut évoluer vers une forme plus sévère. La forme progressive (PP) : plus rare, elle se développe généralement après 40 ans et entraîne un handicap progressif, sans poussées distinctes. Les traitements actuels sont efficaces pour la forme rémittente, mais restent très limités pour la forme progressive, qui est la plus sévère. Certains types de lésions sont associés à cette forme aggressive de de la maladie, mais il manque aujourd’hui un modèle animal permettant de étudier en détail la formation et le développement de ce type de lésion. Notre recherche vise à mieux comprendre ces lésions et, à terme, à tester de nouveaux traitements pour améliorer la prise en charge des patients.

Procédures

Une partie des animaux auront une seule procédure chirurgicale pour optimiser le geste chirurgical menant à une lésion de démyélinisation de la moelle épinière. Les animaux participeront à deux tests comportementaux afin d’évaluer leurs capacités motrices. Dans le premier test, l'animal est placé sur une barre crantée et on mesure la durée de la traversée de la barre et le nombre d'erreurs, l'animal étant libre de ces mouvements durant le test. Dans le deuxième test l'animal est placé sur une grille sur laquelle l'animal s'accroche ce qui nous permet de mesurer la force de ses pattes avant. Ces deux tests comportementaux durent respectivement 90 secondes et 60 secondes. Les animaux réaliseront 2 procédures chirurgicales sous anesthésie générale et analgésie adaptée, à 48 heures d’intervalle, l’une pour la mise en place de la lésion de démyélinisation et la deuxième pour l’injection de cellules immunitaires humaines sur le site lésionnel. Chaque chirurgie durera 15 minutes. Une dernière procédure sous anesthésie générale et analgésie adaptée sera réalisée pour évaluer les voies sensorielles de l’animal entre une zone stimulée et le cerveau (1 fois, 30 minutes maximum par animal). Toutes les souris seront euthanasiées en fin de procédure expérimentale par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Une partie des animaux utilisés dans le projet sont immunodéficients (phénotype dommageable) et seront donc susceptibles de contracter des infections et des tumeurs. Les tests comportementaux pourront générer un stress aux animaux dû au changement d’environnement et aux manipulations. Les procédures chirurgicales (lésion de démyélinisation, greffe de cellules humaines) génèreront une douleur et un inconfort post-opératoire, et pourront être associées à des complications inattendues telles qu’un saignement ou une infection. L’anesthésie générale nécessaire pour leur réalisation impliquera une hypothermie, une sécheresse oculaire et un risque de dépression cardio-respiratoire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de réaliser des prélèvements post-mortem nécessaires pour répondre à notre question scientifique.

Remplacement

Le seul moyen à notre disposition pour décortiquer le processus de remyélinisation endogène et de démyélinisation chronique est d’utiliser un modèle animal bien établi du processus de démyélinisation/ remyélinisation développé il y a 20 ans que nous avons réadapté pour le rendre plus proche des conditions pathologiques des patients. En ce qui concerne la souche de souris immunodéficiente utilisées, la greffe de cellules humaines nous contraint à utiliser les souris les plus adaptée pour éviter le rejet de greffe. Pour étudier le processus de développement d’une lésion chronique l’utilisation d’un modèle animal est nécessaire. En effet des alternatives pour étudier la remyélinisation existe (comme l’utilisation de culture ex vivo de cervelet) mais celles-ci ne peuvent pas être utilisé dans notre cas car nous étudions l’évolution d’une lésion à long terme (3mois). De plus l’étude de tissus humain ne nous permet l’étude qu’à un temps donné des lésion chronique et non l’évolution. Il nous est donc impossible de substituer ces travaux par d’autres méthodes n’utilisant pas ces animaux

Réduction

Pour l'optimisation du geste chirurgical, des souris seront utilisées. Nous avons défini qu’un maximum de 50 souris pourrons être utilisées sur les 5 années du projet afin de perfectionner la technique d’injection dans le cordon dorsal de la moelle épinière. De plus, nous allons étudier la mise en place d’une lésion chronique en greffant les lymphocytes de deux types de patients atteints de sclérose en plaque, nous aurons 2 groupes de patients avec 20 patients par groupe et 40 donneurs sains, soit 80 sujets au total. Pour chaque patient, nous injecterons 15 souris puis nous échelonnerons les euthanasies sur 3 temps différents nous permettant ainsi d’avoir au final 5 souris par temps d’euthanasie et par patient. Par expérience nous savons que cet effectif sera suffisant pour des tests statistiques fiables. Pour les analyses statistiques nous aurons donc pour chaque temps 400 souris au total, 100 pour le premier groupe de patient avec une forme modérée de la maladie , 100 pour le deuxième groupe de patient avec une forme aggressive de la maladie et enfin 200 pour le groupe de donneurs sains. Nous aurons donc besoin au total de 1250 souris au total.

Raffinement

Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés et dans des conditions de température et d’hygrométrie définies par les normes européennes (directive européenne 2010/63/UE) soit 22Cplus ou moins 2C pour la température et entre 45 et 65 pourcent d’hygrométrie avec un cycle jour,nuit progressif de 12h. De plus, ils seront hébergés dans un environnement enrichi (animaux hébergés en groupe avec carré de coton et bâton à ronger) et observés quotidiennement. Ils bénéficieront d’une semaine d’acclimatation à leur arrivée. Les animaux seront suivis régulièrement par les utilisateurs ainsi que par notre vétérinaire désignée si nécessaire. Les animaux sont hébergés dans des cages à ventilation individuelles, des précautions lors de la manipulation sont prises comme manipulation sous hotte, changement de gant et nettoyage de l’endroit de manipulation entre chaque cage. Ils seront ensuite habitués à l’expérimentateur pendant 1 semaine avant le début des procédures pour réduire leur stress. Les animaux auront une période d’acclimatation aux pièces à raison de 30min à 1h avant chaque début des expériences comportementales, acclimatation également aux tests comportementaux à raison de 3 essais/tests/jours avant d’établir la performance basale de l’animal, pour diminuer le stress de l’animal. Entre chaque essais l’animal aura un temps de repos au minimum égal à son temps passé à faire le test. De plus les animaux seront manipulés de façon à diminuer le stress Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec une prise en charge analgésiques adaptée. Une surveillance renforcée sera mise en place en période post-chirurgie pendant 2 jours et puis 2 fois par semaine après la première semaine afin de s’assurer de la bonne récupération des animaux et afin d’adapter la prise en charge analgésique en fonction de l’observation de signes de douleurs une grille de score (mise au point avec la structure du bien être animal est utilisée pour définir la prise en charge de l’animal. En cas de signe de mauvaise santé (stress, blessure, comportements anormaux) un avis vétérinaire sera demandé, Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance des animaux.

Choix des espèces

Notre projet nécessitant un acte chirugical d’injection dans la moelle épinière, nous prévoyons d’optimiser le geste chirurgical des personnes (étudiants ou ingénieurs) associés à ce projet sur des souris immunocompétentes avant de réaliser ce geste ainsi que les injections de cellules humaines aux souris immunodéficiences. Notre projet nécessitant des greffes de cellules immunitaires humaines, nous utiliserons des souris immunodéprimées. En effet, ces souris présentent un système immunitaire déficient, elles sont donc de bonnes candidates pour la greffe de cellules humaines car il n’y aura pas de rejet de greffe. Les souris sont utilisées car le modèle de démyélinisation a été bien décrite chez la souris et nous avons une grande expérience de ce modèle dans notre équipe. Les animaux utilisés sont âgés d’au moins 8 semaines afin d’avoir une maturité suffisante du système nerveux central (jeunes adultes).

Anesthésiés pour une IRM cérébrale d'une heure, puis réanesthésiés trois à sept jours plus tard pour une ouverture de la boîte crânienne et l'implantation de sondes pendant cinq à sept heures, 20 cochons de moins de 15 kg ne se réveillent pas. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré, alors que la seconde se termine sans réveil. Il s'agit de tester des sondes capables de mesurer le froid ou la lumière délivrés dans le cerveau, pour des dispositifs destinés à l'épilepsie, à la maladie de Parkinson et à l'ablation de tumeurs. Leur cerveau est prélevé pour mesurer les lésions produites, et le porteur indique que 14 animaux suffiraient si les résultats attendus arrivent.

Objectifs

L’utilisation de sondes enregistrant l’activité cérébrale est indispensable dans l’étude de diverses pathologies neurodégénératives, comme la maladie de Parkinson par exemple, mais également dans l’identification des foyers épileptiques pour déterminer la zone à retirer par chirurgie. Actuellement ces sondes sont uniquement munies de capteurs permettant l’enregistrement de l’activité électrique des neurones ou permettant la stimulation pour identifier les zones fonctionnelles impliquées. Concernant les études portant sur l’épilepsie, une nouvelle thérapeutique portant sur l’utilisation de l’effet du froid au niveau du foyer épileptique pour stopper les crises semble émerger. Des équipes ont réussi à arrêter des crises chez les rongeurs en utilisant des électrodes refroidissantes sans pour autant produire de lésions locales. Ces caractéristiques font du refroidissement par sonde une bonne alternative à l’électrostimulation. L’utilisation de froid à des températures cryogéniques (-40°C) est une technique qui consiste à détruire les tumeurs par cryoablation. Ce type de sondes ne dispose pas de capteurs permettant la mesure in vivo de cette température, ce qui permettrait de mieux comprendre comment le froid se propage dans le tissu et ainsi améliorer la délimitation de la zone ciblée Dans la maladie de Parkinson, un essai clinique en cours évalue l’effet de la lumière proche infra-rouge dans le traitement de la maladie, ainsi que la sécurité de l’implant produisant la lumière et l’absence d’effets secondaires dus à cette lumière. Dans ce cas, il s’agit d’une sonde disposant uniquement d’un système émettant de la lumière sans système de mesure de la lumière diffusée dans le cerveau. L’objectif scientifique de notre étude est de proposer de nouvelles sondes multimodales qui devraient permettre d’acquérir plus de données simultanées pour mieux comprendre le fonctionnement de la structure cérébrale visée, la thérapeutique appliquée et également mieux maitriser les doses utilisées (la dose de lumière proche infra-rouge, la dose de froid appliquée en profondeur, mieux définir le foyer épileptique).

Bénéfices attendus

Ce projet vise à développer de nouveaux capteurs et senseurs qui pourraient être intégrés dans des dispositifs implantables chez l'humain pour le traitement de diverses pathologies cérébrales, telles que la maladie de Parkinson, l’épilepsie, le mapping chirurgical et l’ablation de tumeur. Les sondes de refroidissement auront une double utilité : arrêter les crises en refroidissant le foyer épileptique dans le cadre de l’épilepsie ou réaliser l’ablation d’une tumeur à des températures extrêmement basses, bien en dessous de 0 °C, tout en intégrant des fonctionnalités de monitoring permettant de délivrer précisément la dose de froid nécessaire. De plus, les nouveaux implants optiques et biochimiques permettront d'analyser les tissus autour des sondes et d’ajuster les doses de lumière à délivrer en conséquence.

Procédures

Les animaux seront soumis à une imagerie par IRM sous anesthésie générale (injection intramusuclaire pour la sédation et intraveineuse pour le produit de contratse) d'une durée d'environ 1 heure. Entre 3 et 7 jours après, une seconde anesthésie (injection intramusuclaire pour la sédation voir intraveineuse pour l'anesthésie), accompagnée d'analgésie par injection sous cutanée, sera réalisée pour procéder à une chirurgie d'implantation de sondes dans le cerveau après ouverture de la boite cranienne, d'une durée de 5 à 7 heures, sans réveil de l'animal.

Impact sur les animaux

La procédure envisagée a été imaginée pour réduire le plus possible les effets indésirables sur les animaux. Cette procédure en 2 étapes (imagerie puis chirurgie d’implantation sans réveil) se déroulera sur 2 semaines afin de permettre d’avoir une étape de 4 jours d’acclimatation des animaux à leur nouvel environnement lors de leur arrivée suivie d’un délai de 3 à 7 jours avant leur utilisation dans le 2nde protocole. Le protocole 2 étant une chirurgie sans réveil elle sera forcément accompagnée d’effets indésirables telles que la douleur qui est prise en charge par l’utilisation d’analgésiques appropriés. Dans un objectif de réduction de stress pour l’animal, ce protocole 2 sera réalisé pour chaque animal sur plusieurs jours consécutifs afin de ne pas laisser d’animaux seuls plus de 24h.

Devenir

A la fin des expérimentations et à la suite d’une procédure sans réveil, nous devrons euthanasier les animaux afin de prélever leur cerveau pour analyser le degré de lésion produit par les dispositif en vue d’un passage à un dispositif implantable chez l’Homme.

Remplacement

Il n’existe à ce jour malheureusement aucun modèle alternatif in vitro ou in silicone permettant de réaliser de tels tests fonctionnels. Par voie de conséquence, le projet doit être mené sur un modèle animal. Nous utilisons un modèle de mammifères de grande taille afin de nous permettre de tester nos dispositifs adaptés à la taille humaine sans devoir les réduire. Ceci diminuera ainsi une source d’incertitude reconnue dans l’évaluation des dispositifs médicaux lors de l’évaluation de certains dispositifs médicaux humains sur des modèles rongeurs de petite taille et permettra ainsi un transfert rapide à l’homme. Ce choix vient de fait également réduire le nombre d’animaux à utiliser pour mener à bien les tests des dispositifs.

Réduction

Ce projet cherche à évaluer de nouvelles sondes multimodales innovantes, utilisées pour diverses applications médicales. En procédant de cette manière, nous réduisons le nombre total d'animaux nécessaires en évitant de réaliser des tests séparés pour chaque technologie. Pour déterminer combien d'animaux sont nécessaires, nous avons utilisé une méthode statistique rigoureuse, en prenant en compte plusieurs points de mesure dans le cerveau. L'une des stratégies consiste à utiliser l'hémisphère opposé du cerveau comme référence, ce qui nous permet de limiter le nombre d'animaux requis. Selon nos calculs, le nombre maximal d'animaux prévu est de 20 individus, en tenant compte de la complexité des chirurgies. Cependant, nous n'en réaliserons que 14 si nous obtenons les résultats scientifiques attendus.

Raffinement

Les protocoles se dérouleront sous anesthésie et analgésie, et les animaux ne seront pas réveillés après la chirurgie, ce qui minimisera leur inconfort. Une attention particulière sera portée aux animaux pendant la période entre l'IRM et la chirurgie sans réveil. Avant l'IRM, les animaux seront d'abord sédatés, puis placés sous anesthésie, qui sera maintenue pendant toute la durée de l'examen. Pour la chirurgie, une prémédication sera administrée afin de préparer les animaux, et des médicaments seront utilisés pour réduire la salivation et faciliter l'intubation. La veille de la chirurgie, l'animal recevra un anxiolytique modéré pour réduire son stress. Pendant l'opération, une analgésie sera administrée pour contrôler la douleur avant l'incision, avec des doses supplémentaires administrées dès les premiers symptôme de douleurs. L'anesthésie générale sera maintenue tout au long du protocole, complétée par une anesthésie locale.

Choix des espèces

Nous souhaitons utiliser des dispositifs qui soient de la même taille que ceux qui pourraient être utilisés chez l’homme ce qui exclut le recours à un modèle rongeur. Le transfert technologique chez l’homme impose des tests préalables dans un modèle de grands mammifères, au plus près possible des conditions de mise en œuvre clinique. Le porc est un modèle pertinent de par les similitudes anatomiques et constitutives avec le cerveau humain. La physiologie de son système nerveux et ses caractéristiques spatiales sont suffisantes pour faire la preuve de concept des solutions techniques que nous proposons. Pour leur stade de développement, ce projet nécessite de travailler avec des animaux d’un poids inférieur à 15 kg (environ 8 semaines à la réception), afin de permettre l’imagerie des sujets dans l’IRM.

Pour tester si une protéine protège les vaisseaux du cerveau pendant un sepsis, 280 rats reçoivent une injection de lipopolysaccharide qui déclenche une inflammation généralisée, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reste anesthésié environ deux heures trente, dont une heure trente d'imagerie, avec deux prélèvements sanguins à la veine de la queue et une injection de radiotraceur dans la veine du pénis. L'inflammation provoquée peut entraîner une perte de poids, une baisse de mobilité et une diminution des interactions sociales. Tous les rats sont tués pour prélever organes et cerveau, et le porteur justifie le choix du rat plutôt que de la souris par sa plus grande taille, qui donne des images de meilleure qualité.

Objectifs

Le sepsis est une réaction inflammatoire exagérée qui force le corps à s’attaquer à ses propres tissus et organes. Il peut se produire en réponse à n’importe quelle infection, que ce soit par la présence d’une bactérie, d’un virus ou d’un parasite dans le corps. La forme la plus grave est le choc septique qui est une cause fréquente de décès. Cette inflammation entraîne des problèmes dans tout le corps, jusqu’à la baisse de la pression sanguine qui peut causer des défaillances d'organes. Si cette défaillance atteint le cerveau et les vaisseaux sanguins qui l’alimentent il peut y avoir des conséquences graves pour les patients, en accélérant l'apparition de problèmes de mémoire à long terme. Si l’inflammation reste excessive et continue dans le temps, elle va endommager la barrière qui sépare le sang et le cerveau entraînant un gonflement du cerveau et l'activation de certaines cellules immunitaires qui vont accentuer l'inflammation au niveau du cerveau. De plus, il peut y avoir des problèmes avec la circulation sanguine et provoquer des saignements dans le cerveau. Pour traiter le choc septique, on utilise des antibiotiques et on traite l'infection initiale. On s'assure aussi que la pression sanguine reste normale pour que les organes fonctionnent de manière normale. Actuellement, il n'y a pas de traitement spécifique pour traiter les problèmes qui touchent les vaisseaux altérés par cette maladie, ni l'inflammation du cerveau. Notre équipe de recherche étudie une protéine qui pourrait aider à conserver la fonction des vaisseaux pendant l'inflammation et empêcher les problèmes qu’elle provoque. Pour cela, nous utilisons un modèle chez le rat chez qui nous allons injecter une substance appelée Lipopolysaccharide (LPS). Le LPS est une molécule qu’on retrouve autour de certaines bactéries et son injection va provoquer l'inflammation au niveau du cerveau. Nous allons faire des imageries du cerveau de ces animaux pour voir si la protéine d’intérêt peut empêcher les problèmes liés à l'inflammation dans le cerveau, en étudiant l’intégrité de la barrière qui sépare le sang du cerveau.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à examiner comment la protéine agit sur la réponse de la barrière entre le sang et le cerveau en cas d'inflammation dans tout le corps. Avant de pouvoir envisager de tester cette protéine chez l'homme, il est important de vérifier son efficacité dans le traitement de l'infection grave chez le rat. Les résultats attendus aideront à mieux comprendre comment traiter ce genre d'inflammation chez les humains et à réduire le risque de développer des troubles de la mémoire graves. Il est possible qu'une première phase d'essais chez l'homme puisse être envisagée dans les cinq prochaines années.

Procédures

Dans cette étude, nous avons besoin d'endormir les animaux pour les examens d'imagerie. Les animaux seront imagés pendant environ 1h30. La phase de sommeil va durer aux alentours des 2h30 heures, du démarrage de l’anesthésie jusqu’à la fin du protocole complet. Pour induire l’anesthésie générale, nous injecterons au niveau abdominal un produit dont on ajustera la concentration en fonction du poids de l’animal. Après 5 minutes et confirmation de l'anesthésie générale, un prélèvement de sang sera effectué au niveau de la veine de la queue, ce geste expérimental prend 2 à 3 minutes. Nous allons mesurer dans ce prélèvement les différentes protéines impactées par la protéine d’intérêt pour voir si elle a bien effet. Ce prélèvement sera réalisé 2 fois au cours de ce projet, une première après vérification de la qualité d’anesthésie et une deuxième en fin de protocole d’imagerie toujours sous anesthésie générale. L’injection de lipopolysaccharide est réalisée par une injection au niveau abdominal en moins d’une minute, de même pour la protéine d’intérêt. L’injection du produit radiotraceur est réalisée au niveau de la veine du pénis après anesthésie générale et dure moins d’une minute.

Impact sur les animaux

Nous utiliserons des injections dans la cavité abdominale pour administrer la protéine d’intérêt, le lipopolysaccharide (LPS) pour provoquer l’inflammation générale ainsi que pour le produit anesthésique. Lors de ces injections l’animal est tenu dans les mains de l’opérateur ce qui peut entraîner du stress et une légère douleur lors de l’injection. L'injection du produit d'anesthésie peut être répétée avec une concentration plus faible pendant l'examen d'imagerie dans le cas où l'animal commence à présenter des signes de réveil. Le LPS est la substance qui va provoquer une réaction inflammatoire généralisée semblable à celle observée dans le sepsis. L’inflammation provoquée peut entraîner à court terme une perte de poids, une réduction de la mobilité et une diminution des interactions sociales chez les animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés pour effectuer des prélèvements d'organes et de sang. Ces prélèvements seront utilisés pour une analyse tissulaire au niveau microscopique afin d'évaluer le rôle protecteur de la protéine. Plus particulièrement pour les prélèvements de cerveau, nous allons les comparer aux données obtenues par imagerie.

Remplacement

L'inflammation du cerveau est un phénomène complexe résultant de l'interaction de différents types cellulaires et la barrière qui sépare le sang du cerveau. Cette interaction est encore partiellement connue. L'approche avec des modèles théoriques ou de remplacement ne permet pas de rendre compte de façon fiable de ces différentes interactions. Le modèle animal utilisé sera celui le plus validé à l'heure actuelle pour l'étude de l'inflammation du cerveau.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet a été déterminé à l’aide d’outils mathématiques spécialisés pour permettre une analyse cohérente et juste des données obtenues. Les données d'imagerie seront analysées au fur et à mesure, si les résultats sont satisfaisants avec moins d'animaux que prévu, les protocoles d'imagerie seront arrêtés afin de réduire le nombre d'animaux utilisés sur la totalité du projet.

Raffinement

Une période minimale d'acclimation de 7 jours à la réception des animaux du fournisseur sera respectée. Le nombre d'individus par cage sera adapté à leur taille mais aucun animal ne sera laissé seul en cage de plus les animaux auront à disposition du coton pour fabriquer leur nid et des objets récréatifs. La profondeur de l’anesthésie est vérifiée par l’absence de mouvement par pression sur la patte. Une évaluation en temps réel de l'anesthésie sera réalisée pendant les protocoles d’imagerie. Si la fonction respiratoire se dégrade et se maintient dégradée, le protocole d'imagerie sera interrompu pour permettre une surveillance accrue de l'animal dans une cage de réveil dédiée placée sous une lampe chauffante. Pour garantir un maintien de la température corporelle pendant le protocole d'imagerie, l’animal est réchauffé pendant tout le protocole d’imagerie. Les animaux seront observés quotidiennement par le personnel de l’animalerie et les points limites seront étudiés par les responsables de projet 2 fois par semaine pour s’assurer du bien-être des animaux et qu’ils soient traités avec le plus grand respect et le moins de douleurs possible. Si la mise en place d’un traitement anti-douleur ne permet de pas d’améliorer le bien-être animal, le protocole d’euthanasie sera réalisé.

Choix des espèces

Nous utiliserons des rats pour cette étude car c'est l'espèce utilisée dans les études sur ce modèle pathologique. Le rat est une espèce couramment utilisée pour les travaux d'expertise par imagerie chez le petit animal et les outils utilisés sont dédiés à cette espèce. De plus, c’est une espèce de plus grande taille par rapport à la souris ce qui permet d’avoir une qualité d’image supérieure avec plus de détails et précision pour les expérimentations d’imagerie préclinique. Nous utiliserons des animaux âgés de 10 à 12 semaines pesant entre 400 et 600g. Le stade de développement des animaux correspond à de jeunes adultes afin de mimer au mieux les conditions pathologiques retrouvées chez l'Homme.

À 18 jours de vie, puis chaque jour pendant une semaine à partir de 23 jours, des souris sont exposées à un son qui déclenche aussitôt une crise convulsive, et certaines subissent dix expositions déclenchant des crises, jusqu'à trois par jour. 370 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent aussi une injection dans le cerveau sous anesthésie à 1 ou 3 jours de vie, puis à 56 jours une chirurgie de deux à trois heures qui perce quatre orifices dans leur crâne, et une partie passe des séances quotidiennes d'imagerie d'une à deux heures, tête fixée, sur 31 jours. Le porteur prévoit qu'une crise peut entraîner une "douleur musculaire modérée et de courte durée", et affirme qu'il n'y a "pas de souffrance pendant la crise du fait de la perte de connaissance". Il écrit que les souris, toutes tuées à la fin de chaque procédure, ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées, et annonce que "Certains animaux utilisés pour un type d'expériences seront réutilisés pour un autre type d'expériences".

Objectifs

Le but du projet est d’approfondir la connaissance des mécanismes par lesquels une stimulation sensorielle peut déclencher une crise épileptique. Ce phénomène est bien connu dans les épilepsies humaines, avec notamment le principe de photosensibilité (déclenchement d’une crise après stimulation lumineuse intermittente), qui reste mal compris, notamment en ce qui concerne le site cérébral, où se réalise ce processus et où est générée la décharge épileptique. Les dynamiques d’activation lors d’une crise déclenchée par un son sont également mal élucidées. Ce projet permettra d’étudier comment une perception sensorielle conduit à la génération d’une activité neuronale pathologique. Une meilleure connaissance de ces mécanismes aidera à identifier des structures anatomiques à cibler dans le cadre de protocoles de neurostimulation, actuellement en plein essor dans la prise en charge des patients souffrant d’épilepsie. Enfin, ces résultats pourraient aider à comprendre au sens plus large d’autres mécanismes d’intégration sensorielle neurologique pathologiques, observés par exemple dans la migraine, les acouphènes, ou encore l’hyperacousie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus dans le domaine médical et clinique sont une meilleure connaissance des épilepsies dites « réflexes » (déclenchées par une stimulation sensorielle), incluant des phénomènes tels que celui de photosensibilité, bien connu dans les épilepsies humaines (déclenchement d’une crise après stimulation lumineuse intermittente). L’ensemble de ces épilepsies avec composante réflexe représente environ 5% des épilepsies (soit environ 30 à 50.000 patients en France) bien que ce chiffre soit probablement sous-estimé par défaut d’évaluation systématique. Les déterminants physiopathologiques des épilepsies réflexes sont encore mal connus, en particulier en ce qui concerne le site anatomique d’où sont générées ces crises, et les dynamiques d’activation et de propagation neuronale. Une meilleure connaissance de ces mécanismes aidera à identifier, à long terme, des structures anatomiques à cibler dans le cadre de protocoles de neurostimulation (invasive ou non invasive), actuellement en plein essor dans la prise en charge des patients souffrant d’épilepsie. Ceci impliquera au préalable une phase de translation de ces résultats aux patients, par exemple via l’imagerie fonctionnelle ou d’autres études invasive ou non-invasive. Enfin, ces résultats pourraient aider à comprendre au sens plus large d’autres mécanismes d’intégration sensorielle neurologique pathologiques, observés par exemple dans la migraine, les acouphènes, ou encore l’hyperacousie.

Procédures

Les souris seront soumises à: - une exposition sonore à l’âge de 18 jours, pour une durée maximale de 60 secondes (un jour) - une exposition sonore à l’âge de 23 jours, quotidienne pendant 7 jours, pour une durée maximale de 60 secondes. Ces expositions sonores déclenchent une crise convulsive immédiatement après l’exposition. - une procédure chirurgicale sous anesthésie et analgésie à l’âge de 1, 3 et 56 jours. La durée de la chirurgie est de 2 à 3 heures. - pour certains 10 expositions sonores déclenchant des crises convulsives. Chaque animal subira un maximum de 3 crises par jour. -pour certains animaux des sessions d’1 à 2 heures d’imagerie en contention, quotidiennes sauf le weekend sur 31 jours, après une phase d’entraînement à la contention de 7-15 jours. Les nuisances attendues sur les souris sont essentiellement liées au stress généré par les expositions sonores et les crises épileptiques, ainsi qu’aux lésions réalisées lors des gestes chirurgicaux et aux douleurs que celles-ci peuvent entraîner.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les souris sont : -L’exposition sonore à une intensité contrôlée peut entraîner une douleur légère de courte durée (durée maximale de 60 secondes) -La survenue d’une crise convulsive après l’exposition sonore ou la stimulation lumineuse peut entraîner dans les suites une douleur musculaire modérée et de courte durée (pas de souffrance pendant la crise du fait de la perte de connaissance). Les souris ne subiront pas plus de 3 crises par jour. -L’injection de certains composés à l’âge de 1 ou 3 jours se fait sous anesthésie et analgésie mais peut entraîner des douleurs post-opératoires légères et de courte durée. -La réalisation de 4 orifices crâniens à l’âge de 56 jours se fait sous anesthésie et analgésie mais peut entraîner des douleurs post-opératoires légères pendant 1 à 2 jours selon les observations faites dans des protocoles similaires. -Pour certains animaux, la réalisation une autre chirurgie craniale se fait sous anesthésie et analgésie et peut entraîner des douleurs post-opératoires modérées pendant 1 à 2 jours. -Pour certains animaux, la réalisation de sessions d’imagerie en contention, tête fixée, sur une durée maximale de deux heures par jour pendant 31 jours, peut entraîner un inconfort modéré pendant la durée de la contention. -Le maintien en place d’un dispositif crânien pour envelopper les électrodes intracrâniennes peut entraîner une gêne légère pour les souris, sur une durée totale d’1 à 2 mois.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet ces animaux auront subi des procédures invasives ne permettant pas de réutiliser les animaux au-delà des expériences décrites ci-dessus et auxquelles ils ont été initialement destinés, ni de les adopter en dehors de ce contexte expérimental.

Remplacement

Les outils modernes d’imagerie optique que nous utiliserons permettent d’enregistrer plus de 1000 neurones en parallèle, permettant de traiter un grand ensemble de données avec un minimum d’animaux. Le nombre d’animaux utilisés est aussi minimisé par la possibilité de répéter le protocole de mesure sur plusieurs jours voire plusieurs semaines avec le même animal pour maximiser la taille de l’échantillon de neurones collecté sur chaque animal. Le nombre d’animaux utilisé est donc essentiellement déterminé par la nécessité de mesurer des différences statistiques significatives pour la comparaison des groupes de souris. Certains animaux utilisés pour un type d’expériences seront réutilisés pour un autre type d’expériences. L’utilisation de tests statistiques sur échantillons appariés (lorsque nous compareront la fréquence de survenue de crise audiogène entre un animal stimulé et non stimulé, par exemple) permet de réduire le nombre de sujet nécessaire, chaque animal étant son propre témoin.

Réduction

Les outils modernes d’imagerie optique que nous utiliserons permettent d’enregistrer plus de 1000 neurones en parallèle, permettant de traiter un grand ensemble de données avec un minimum d’animaux. Le nombre d’animaux utilisés est aussi minimisé par la possibilité de répéter le protocole de mesure sur plusieurs jours voire plusieurs semaines avec le même animal pour maximiser la taille de l’échantillon de neurones collecté sur chaque animal. Le nombre d’animaux utilisé est donc essentiellement déterminé par la nécessité de mesurer des différences statistiques significatives pour la comparaison des groupes de souris. Certains animaux utilisés pour un type d’expériences seront réutilisés pour un autre type d’expériences. L’utilisation de tests statistiques sur échantillons (lorsque nous compareront la fréquence de survenue de crise audiogène entre un animal stimulé et non stimulé, par exemple) permet de réduire le nombre de sujet nécessaire, chaque animal étant son propre témoin.

Raffinement

L’utilisation de protéines excitables par stimulation lumineuse à travers la boîte crânienne permet d’éviter une procédure de chirurgicale additionnelle. Pour toutes les procédures chirurgicales, plusieurs mesures supplémentaires seront prises. Pendant la chirurgie, une réhydratation sera mise en place. Le volume de réhydratation sera ajusté en fonction de la durée de la chirurgie. Après la chirurgie, les animaux en récupération sont placés en cage de réveil sur une plaque chauffante, puis replacés dans leur cage qu’il sera possible de continuer à chauffer par des chaufferettes, et reçoivent une analgésie supplémentaire. De l’eau gélifiée sera ajoutée dans les cages suite à la chirurgie pour faciliter l’hydratation des souris. L’environnement de la cage sera enrichi. Les animaux sont suivis quotidiennement, s’il y a des signes de douleur, des doses d’antalgiques sont ajoutées, s’il y a des signes d’infection un traitement antibiotique est mis en place. La phase de récupération est de 7 jours au minimum pendant lesquelles l’animal n’est pas manipulé sauf pour le suivi post-opératoire en première semaine. Des points limites spécifiques et précoces sont définis, entrainant l’arrêt de l’expérience ou la mise à mort si les traitements associés ne permettent pas de diminuer la douleur ou l’inconfort sous 24h. Ils sont basés sur des indicateurs de poids, la persistance pendant plus de deux jours d’une réduction de la mobilité avec dos voussé, d’une piloérection marquée, d’un manque de toilettage ou toilettage excessif ; ou encore la survenue de signes de détresse. Lors d’une crise épileptique prolongée au-delà de 2 minutes, l’animal sera placé sous un masque à oxygène. Pour diminuer le stress et l’angoisse pendant l’imagerie en contention, nous avons mis en place un protocole d’habituation progressive. La souris est placée en contention le premier jour pendant 30min puis le second et le troisième jour pendant 1h. Si à la fin de l’entrainement l’animal montre des signes de stress et d’angoisse, l’animal sera ré-entrainé le jour suivant au palier inférieur et le protocole décalé en fonction. Si ces signes perdurent l’expérience sera arrêtée pour l’animal.

Choix des espèces

Ce projet implique l’utilisation d’organismes vivants dotés d’un système nerveux central permettant l’intégration des perceptions sensorielles. Ces organismes vivants doivent par ailleurs pouvoir présenter des crises épileptiques. La souris est un modèle adapté qui répond à ces deux critères. Par ailleurs, l’utilisation de souris comme modèle animal est nécessaire pour permettre l’application des outils de manipulation ciblée des circuits neuronaux qui nous permettront d’avancer dans la compréhension des mécanismes de l’épilepsie. Ces outils sont mieux établis chez cet animal que dans d’autres espèces. Par ailleurs le modèle souris possède un système auditif similaire à l’homme et est suffisant pour l’exploration de mécanismes fondamentaux. Le stade de développement est un point crucial dans la susceptibilité des souris aux crises audiogènes. La susceptibilité maximale des souris étudiées à la procédure de « priming » (procédure qui confère la susceptibilité aux crises audiogènes après une exposition à un son bref et intense au cours de leur développement) entre 13 et 25 jours post-natal, et idéalement au 18ème jour. Il existe également une fenêtre temporelle de susceptibilité au « kindling » (expansion progressive du réseau épileptique par expositions sonores répétées) se situant entre le 21ème et le 30ème jour post-natal. Ainsi, nous réaliserons le « priming » au 18ème jour et le « kindling » au 23ème au 30ème jour. Une injection intracérébrale sera réalisé chez le souriceau à P1-P3, sous anesthésie générale, pour permettre une expression homogène et diffuse. La procédure chirurgicale principale sera réalisée à la 8ème semaine post-natale, et les expériences d’activation ou d’inhibition des différentes structures, couplées à la neurophysiologie, seront réalisées 5 semaines plus tard (environ 13ème semaine post-natale).