Troubles nerveux
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Potentiel thérapeutique de tissus nerveux 3D issus de la bioingénierie pour le traitement des lésions traumatiques cérébrales 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Macaques rhésus : 2
Immunodéprimés par un traitement administré pendant toute la durée de l'étude, 4 macaques, deux à longue queue et deux rhésus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacun subit deux chirurgies de deux heures, dont une pour reproduire un traumatisme crânien, des séances d'IRM sous anesthésie avec injection d'un produit de contraste, des prélèvements sanguins et des tests comportementaux de trente minutes à une heure, maintenu en chaise de contention, sans que le porteur précise lesquels. Le transport entre les deux établissements se fait sous anesthésie, dans une cage recouverte d'une housse pour le soustraire aux regards. Cette étude pilote doit selon lui "définir les caractéristiques du modèle de traumatisme crânien" avant une évaluation thérapeutique plus large, et les quatre macaques seront tués pour l'examen post mortem de leur cerveau.
Objectifs
Cette étude se déroulera sur deux établissements utilisateurs. Cette étude pilote s’inscrit dans un projet plus vaste d’évaluation thérapeutique de greffe de neurones corticaux dans le but d’une réparation de lésion cérébrale. Pour cette étude, deux singes adultes seront utilisés afin de modéliser le traumatisme crânien, d’évaluer les conséquences post traumatiques sur le comportement, d’évaluer l’étendue des lésions en imagerie et de valider la technique de greffe de neurones. Nous évaluerons également quelle est la récupération fonctionnelle, par des tests de comportement et par imagerie afin de caractériser complètement le modèle avant de passer à l’étude thérapeutique plus complète.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de définir les caractéristiques du modèle de traumatisme crânien en termes de comportement et d’imagerie cérébrale des lésions mais aussi de la récupération post traumatique en vue d’une étude thérapeutique utilisant la greffe de neurones.
Procédures
Administration orale du traitement pour l’immunosuppression (Etablissement Utilisateur 1, toute la durée de l’étude), à l’anesthésie pour l’IRM par injection intramusculaire, injection intraveineuse pour le produit de contraste (Etablissement utilisateur 2, 2 heures). Prélèvements sanguins (Etablissement Utilisateur1, 15 minutes), traumatisme crânien (Etablissement Utilisateur 1, 2 heures). Comportement (30 minutes à 1 heure, Etablissement Utilisateur 1).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont liés 1) aux conséquences du traitement pour l’immunosuppression (toute la durée de l’étude, inconfort), à l’anesthésie pour l’IRM et aux douleurs liées aux 2 chirurgies (2 heures pour chaque, modérée). Les nuisances sont liées aux prélèvements sanguins (sous anesthésie, légère, 15 minutes, stress), à la chirurgie pour mimer le traumatisme crânien (stress, modérée, 2 heures), au comportement (durée du test de 30 minutes à 1 heure, en chaise).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure pour une étude post-mortem du cerveau
Remplacement
Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du Primate non-humain (PNH) car il n’existe pas de modèles mathématiques valide et réaliste permettant d’étudier les lésions dues à un traumatisme crânien. Nous recherchons à travers l’utilisation des modèles animaux complexes et intégrés à coller à la réalité de la pathologie humaine, impossible à trouver dans des modèles cellulaires. De ce fait, le recours à l’animal et tout particulièrement le PNH (du fait de sa proximité avec l’homme) pour étudier les mécanismes impliqués dans ces processus lésionnels et réparateurs, est une étape préliminaire nécessaire à la mise en place de nouvelles thérapies.
Réduction
Nos modèles sont générés sur un plateau de haute technicité, nous permettant la manipulation des animaux dans les meilleures conditions (chirurgie, déplacement…) et une grande reproductibilité dans les différents modèles ce qui limite le nombre d'animaux. Les prélèvements cérébraux réalisés à chaque fin d’étude sont destinés de prime abord aux études post-mortem visant à identifier des marqueurs pour déterminer de nouveaux traitements, et servent également à renforcer notre banque de tissus (cérébrothèque) afin de proposer à la communauté scientifique des tissus de (Primates non-humains) PNH et ainsi réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
A leur arrivée, les singes sont acclimatés pendant 2 à 3 semaines dans l’animalerie en volière. Les chirurgies sont faites sous anesthésie générale et avec une couverture antalgique permettant de réduire le plus possible les douleurs ressenties, avec des points limites associés spécifiques de la chirurgie, des soins appropriés en cas d’atteinte de ces points limites, avec un scoring permettant de décider des actions conservatoires à apporter, et des dispositifs de raffinement (monitoring cardiaque et respiratoire, maintien de la température corporelle, asepsie). Le transport du singe pour réaliser l’IRM s’effectue sous anesthésie dans une cage dédiée, sur chariot et protégée des regards extérieurs par une housse. Il est maintenu au chaud sous une couverture et bordé d’une bouillotte, ses paramètres vitaux sont surveillés.
Choix des espèces
La proximité d’espèce avec l’homme fera toujours du primate non-humain un modèle de choix dans la phase finale de détermination de nouveau traitements thérapeutiques, ceci est encore plus vrai dans ce cas précis avec ce modèle de lésions cérébrale et en tant qu’étude pilote en vue d’une greffe de neurones issue de cellules souches humains. Deux espèces de macaques, proches l’une de l’autre, seront utilisés, car ils sont effectivement très proches sur le plan évolutif et génétique, ils appartiennent au même genre (Macaca), ce qui explique leurs nombreuses similitudes morphologiques, comportementales et biologiques. L’une ou l’autre des espèces sera utilisée en fonction de leur disponibilité.
Étude chez la souris de l’influence conjointe des variants du gène de l’apolipoprotéine E, du sexe et d’une alimentation riche en graisses sur des changements biologiques liés à la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Trois tests comportementaux répétés deux fois, un prélèvement sanguin précédé d'un jeûne de trois heures et huit pesées hebdomadaires : 144 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour prélever leur sang et leurs structures cérébrales. Une partie d'entre elles reçoit un régime riche en graisses, avec une prise de poids attendue sous les 30 %, pour observer comment l'alimentation et les variants du gène de l'apolipoprotéine E modifient les membranes des cellules du cerveau. Le porteur affirme que l'étude de l'impact des régimes alimentaires sur le cerveau ne peut s'effectuer que sur un "organisme entier" et écrit que cette étude in vivo est "indispensable et irremplaçable". Il annonce trois tests comportementaux qu'il décrit comme indolores, sans préciser lesquels, tout en signalant un stress de manipulation lors de deux d'entre eux.
Objectifs
Les cellules de notre cerveau sont entourées d’une membrane composée de graisses nécessaires pour leur permettre de fonctionner correctement. Mais avec l'âge, sous l’influence d’une mauvaise alimentation ou de certains gènes, la composition en graisses des membranes devient déséquilibrée, occasionnant des dommages pouvant déclencher (bien avant l'apparition des premiers symptômes) une cascade de problèmes et d’anomalies menant à la mort des neurones et à la maladie d’Alzheimer (MA). Notre projet veut élucider, chez les individus de sexe masculin ou féminin, comment l’alimentation riche en graisses et certains gènes (dont un qui est un facteur de risque majeur) perturbent le fonctionnement des cellules nerveuses et favorisent la production de produits hautement neurotoxiques capables d’initier les lésions cérébrales liées à la MA. Notre objectif est de comprendre comment un régime alimentaire trop gras peut perturber les membranes des cellules du cerveau et favoriser les troubles liés à la MA, dans le but ultime de proposer de nouvelles stratégies de prévention.
Bénéfices attendus
Ce projet doit créer des modèles fiables pour étudier l’influence de la génétique, de régimes gras et du sexe sur l’apparition de la maladie d’Alzheimer, dans le but de découvrir des marqueurs biologiques pour identifier les personnes à risque et leur proposer une prévention appropriée.
Procédures
1. Tests comportementaux indolores (3, réalisés 2 fois), d’une durée de 10 à 15 minutes par test 2. Prélèvement unique d’un très faible volume sanguin, d’une durée inférieure à 30 sec 3. Mesure du poids corporel (hebdomadaire sur 8 semaines), d’une durée maximale de 1 min par pesée
Impact sur les animaux
- Stress légers de manipulation et de situation induits lors de deux des trois tests comportementaux - Un jeûne de 3 h préalable au prélèvement sanguin - Stress léger de manipulation lors de la pesée hebdomadaire - Une prise de poids (attendue à moins de 30 %) des animaux sous régime gras
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort sous anesthésie à l’issue de l'étude afin de prélever le sang et les structures cérébrales requises pour l’analyse des marqueurs biologiques d’intérêt.
Remplacement
L'étude de l’impact de régimes alimentaires sur le cerveau ne peut s'effectuer que sur un organisme entier. Cette étude in vivo est indispensable et irremplaçable, mais elle s'appuie sur une étude préalable menée sur des cellules en culture et dont les résultats permettent de limiter au strict minimum le nombre d’expérimentations animales.
Réduction
Nous avons minimisé les effectifs de souris en nous appuyant sur l’expérience cumulée par l’équipe lors de diverses études conduites lors des 15 dernières années. Les simulations opérées pour réduire les effectifs au strict nécessaire recommandent un minimum de 9 souris par groupe expérimental, sachant qu’il est indispensable d’évaluer l’impact du sexe. À ceux-ci s’ajoutent 5 animaux par groupe pour les études des tissus cérébraux et 4 animaux par groupe pour l’étude des lipides cérébraux à la moitié du régime.
Raffinement
Toutes les étapes du protocole seront assurées par des expérimentateurs qualifiés et en parfaite maîtrise des gestes techniques et dans le respect scrupuleux des réglementations en vigueur. Les animaux seront hébergés dans des espaces conçus pour minimiser le stress. Ils seront surveillés quotidiennement pour vérifier leur état de santé et détecter d’éventuels signes de détresse (par exemple la posture, l’activité et le poids). Tous les prélèvements seront menés sous anesthésie et les tests sont courts et sans douleur.
Choix des espèces
Ce projet utilise des souris adultes mâles et femelles, couramment utilisées pour la sensibilité aux régimes gras qui en fait de bons modèles afin d’étudier comment la génétique et l’alimentation peuvent augmenter le risque de maladie d'Alzheimer.
Effets de différents traitements dans des modèles murins de mort subite et inattendue en épilepsie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Une stimulation sonore de soixante secondes au maximum, appliquée une fois à chaque souris pour déclencher une crise convulsive qui peut la tuer : 3 168 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, les survivantes étant tuées à la fin pour prélever leurs organes. Certaines reçoivent une substance une seule fois, d'autres deux fois, et 576 jusqu'à vingt-huit fois, à raison de deux administrations par jour pendant quatorze jours. L'objet déclaré est de tester des traitements contre la mort subite inattendue en épilepsie, faute de traitement spécifique existant, en cherchant une dose efficace puis une éventuelle synergie entre deux molécules. Ces souris appartiennent à des souches sensibles aux crises audiogènes et sont testées vers le vingt-et-unième jour après la naissance, âge auquel le porteur indique que les crises létales sont les plus fréquentes, et jusque-là hébergées avec leur mère et leur portée.
Objectifs
La mort subite inattendue en épilepsie (SUDEP) est une cause de décès importante, dont l’incidence est évaluée autour de 1 cas pour 1000 patients épileptiques. Plusieurs hypothèses ont été émises sur les causes de cette mortalité : une anomalie du rythme cardiaque, secondaire à une crise généralisée, un arrêt respiratoire, ou encore une dépression générale des activités électriques cérébrales. Ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité de traitements contre les crises épileptiques provoquant une SUDEP. Pour cela, nous allons utiliser un modèle animal de crises audiogènes où une crise tonique pouvant provoquer la mort est induite par un stimulus audio. Ce modèle est reconnu comme un modèle de SUDEP. Nous proposons ici de tester plusieurs types de traitements : traitement aigu d’une substance (afin de définir la dose efficace pour prévenir des crises et de la mortalité, ainsi que pour définir le temps d’activité de la molécule), traitement répété d’une substance (afin d’évaluer si une exposition prolongée à une substance permet une meilleure protection contre les crises létales), et enfin un traitement associant 2 molécules (afin de définir une possible synergie entre ces molécules).
Bénéfices attendus
Le projet permettra d’évaluer l’efficacité de différents traitements contre le SUDEP à l’aide d’un modèle murin validé par la littérature. Il n’existe pas de traitement spécifique au SUDEP, ces travaux permettront d’évaluer le potentiel des substances évaluées et de leur association contre cette mortalité.
Procédures
Les animaux seront administrés vigiles: une fois pour 1728 animaux, deux fois pour 864 animaux, et au maximum 28 fois (si 2 fois/jour pendant 14 jours) pour 576 animaux. Tous les animaux seront exposés une fois à une stimulation audio (max 60s) induisant des crises audiogènes.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont la survenue de crises létales et non létales à la suite de la stimulation audio et un stress du aux administrations de substance.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d’effectuer des prélèvements d’organes, pour compléter cette étude.
Remplacement
Les méthodes expérimentales in vitro ne reproduisent pas l’ensemble des propriétés des crises d'épilepsie survenant dans un cerveau entier. De plus, la modélisation in silico nécessite des données expérimentales encore insuffisantes pour produire des données applicables chez l’humain.
Réduction
Nous ferons une planification rigoureuse des expériences, en réalisant d’abord des études sur chaque molécule administrée seule pour mieux les caractériser avant d’évaluer l’intérêt d’une administration répété ou de l’association de 2 molécules. De plus, selon les résultats des substances testés lors de la première partie du projet, nous ne retesterons que celles aux résultats positifs pour la 2ème partie. L’utilisation d’un modèle murin déjà validé comme modèle de SUDEP nous permet de ne pas passer par une procédure de validation du modèle. Le calcul du nombre d'animaux est fait selon une approche statistique, sur la base de la variabilité du comportement des souris modèles de SUDEP qui est décrite dans la littérature, nous estimons qu’il nous faut au minimum 12 animaux par groupe pour pouvoir évaluer leur phénotype épileptique. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous n’utiliserons pour chaque procédure que la moitié des animaux administrés par un contrôle véhicule.
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec leur mère et leurs congénères de même portée jusqu’à l’expérimentation à P21 ou jusqu’à leur sevrage à P21. Ils seront ainsi hébergés dans des conditions environnementales répondant à leurs besoins, avec un enrichissement adapté (papier tork ou frisure de carton). Les animaux seront manipulés par du personnel expérimenté afin de réduire le stress global. La stimulation audio induisant les crises est limitée à une par animal et pendant 60s maximum.
Choix des espèces
L’espèce que nous avons choisie (souches de souris sensibles aux crises audiogènes) est le modèle animal décrit dans la littérature comme reproduisant au mieux le SUDEP. Les animaux seront principalement testés vers le jour postnatal 21, où les crises audiogènes létales sont les plus fréquentes selon la littérature et selon nos précédents travaux internes.
Developpement d’approches thérapeutiques pour le Syndrome de Sanfilippo Type B
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
La production des données précliniques exigées par la réglementation avant tout essai chez l'humain fait partie de la finalité déclarée de ce projet sur le syndrome de Sanfilippo de type B, aux côtés de l'évaluation d'une thérapie génique et d'un traitement anti-inflammatoire. 2 244 souris vont être utilisées, toutes tuées par perfusion intracardiaque après anesthésie profonde pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 1 320 reçoivent une injection dans la veine de la queue à l'état vigile, 660 subissent une chirurgie cérébrale de quarante minutes avec pose d'une canule guide, et 1 408 passent des tests d'anxiété, d'activité locomotrice et de reconnaissance d'objets. Le porteur affirme que seul un "organisme entier" permet de suivre la biodistribution du vecteur et les réponses immunitaires, et écrit que les données de cette lignée murine sont "indispensable avant tout essai chez l'humain".
Objectifs
Le syndrome de Sanfilippo de type B (ou MPS IIIB) est une maladie pédiatrique génétique rare, touchant environ 0,5 naissance sur 100 000 en Europe. Elle est causée par un déficit d'une enzyme lysosomale qui entraîne l’accumulation de certaines molécules appelées oligosaccharides d’héparane sulfate dans le cerveau et d’autres tissus. Cette accumulation provoque des problèmes cellulaires, notamment un dysfonctionnement lysosomal, un stress oxydatif, une neuroinflammation et l’activation des cellules immunitaires du système nerveux, qui contribuent aux lésions neuronales et à la progression de la maladie. Les patients présentent un déclin intellectuel progressif et des troubles du comportement, avec une espérance de vie moyenne de 17 à 19 ans. Malgré les avancées en thérapie génique et en traitement enzymatique, aucun traitement ne permet aujourd’hui d'arrêter ou de ralentir l’évolution de la maladie. L’objectif de notre projet est de développer une approche thérapeutique pour le syndrome de Sanfilippo de type B, sur un modèle murin approprié, selon deux stratégies complémentaires : - Une thérapie génique, visant à restaurer l’activité enzymatique déficiente chez les enfants asymptomatiques, afin d’évaluer son potentiel curatif à un stade précoce de la maladie. - Un traitement anti-inflammatoire, destiné aux enfants non éligibles à la thérapie génique, visant à réduire la neuroinflammation, ralentir la progression des symptômes et améliorer la qualité de vie. Pour cela nous utiliserons le modèle de souris génétiquement modifiée MPSIIIB développé par le laboratoire Jackson. Il s'agit du seul modèle murin MPSIIIB qui reproduit les principales caractéristiques de la maladie humaine, notamment l'accumulation de HSO, la neuroinflammation, le déclin comportemental et la mort prématurée.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de développer et d’évaluer deux stratégies thérapeutiques complémentaires pour le syndrome de Sanfilippo type B. L’utilisation du modèle murin MPSIIIB permettra d’obtenir des données précliniques essentielles pour déterminer le potentiel thérapeutique de ces approches et indispensable avant tout essai chez l’humain. En effet, les données générées constituent un prérequis réglementaire pour toute application clinique. Au plus long terme, elles contribueront au développement de thérapies innovantes pour une maladie pédiatrique grave et actuellement incurable et à une meilleure compréhension des maladies lysosomales et neuroinflammatoires.
Procédures
Les interventions concerneront: 1) une injection IV dans la veine caudale sur animaux vigiles (1320 souris, chaque injection prend quelques minutes); 2) une injection intracerebroventriculaire un type de chirurgies sous anesthésie générale (660 animaux, 40 minutes); 3) traitement par alimentation pendant 21 jours; 4) une évaluation comportementale de l'anxiété et de l'activité locomotrice (une seule session de 10 minutes par animal), des processus cognitifs ( toutes les souris (1408), sur 15 jours au total, tests d'objets (3 sessions chacune de 10 minutes d'exploration libre sur 2 jours par animal); 5) un prélèvement sanguin à la veine caudale ou mandibulaire (sous anesthésie) pour test sérologique (2240 animaux, quelques secondes).
Impact sur les animaux
Pour l’injection IV, l’injection intraveineuse à la queue est susceptible d'induire un stress au moment de la préhension des animaux pour les placer dans l’appareil de contention et/ou de la douleur chez l'animal sur une durée inférieure à cinq minutes. Pour l’injection ICV, malgré l'aseptie rigoureuse pratiquée lors de l'étape chirurgicale, il est possible que l'animal présente de légères complications (infections) au niveau de la zone incisée. Pendant les 48 premières heures post-chirurgie, l’injection intra-cérébrale et l’installation des canules guide peuvent parfois entrainer une angoisse ou une prostration, anxiété et perte de poids. L'installation de la canule guide chez l'animal peut également entraîner de légères douleurs post-opératoires les premières 48 heures. Durant l'expérimentation, les animaux seront prélevés une ou deux fois en cours d'étude (prélèvement de sang) à la veine mandibulaire ou caudale, ce qui peut provoquer du stress et/ou de la douleur chez l'animal. L'état général des animaux pourrait être de ce fait altéré.
Devenir
A l'issue des 3 procédures, les 2244 souris seront mises à mort par perfusion intracardique après anesthésie profonde, afin de réaliser le prélèvement d'échantillons d'organes, pour réaliser des analyses biochimiques, cellulaires ou moléculaires ou réaliser une biobanque.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude intervient après de nombreuses études in vitro utilisant des modèles cellulaires (fibroblastes de patients MPSIIIB et lignée de microglie murine) qui ont démontré l’effet bénéfique des procédures thérapeutiques proposées dans ce projet. La thérapie génique et les traitements anti-inflammatoires agissent sur plusieurs tissus et impliquent des interactions immunitaires complexes. Seul un organisme entier permet de suivre la biodistribution du vecteur ou du traitement, d’évaluer l’efficacité dans le cerveau notamment par des tests de comportement et cognitifs, de mesurer les effets collatéraux ou indésirables, et d’observer les réponses immunitaires et inflammatoires au niveau systémique. Par conséquent, les études in vitro ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine. Une telle pertinence est essentielle pour garantir la robustesse des résultats et leur transposabilité dans des applications cliniques.
Réduction
Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, tout en permettant une analyse statistique valide des résultats. Nos études antérieures ont montré que des groupes de 12 animaux par expérience comportementale étaient nécessaires pour les souris MPSIIIB et de 10 pour le groupe Wild-type. Pour les procédures 1 et 3, nous répéterons les expériences à 3 temps post-traitement différents afin de rendre nos résultats comparables à ceux de nos études antérieures. Pour la procédure 2, nous répéterons les expériences à 5 temps post-traitement différents. Le calcul de puissance réalisé avec G*Power, basé sur une différence attendue de 20% entre groupes, une variabilité estimée à 15 % et une puissance de 70 %, indique un effectif nécessaire de 10 animaux par groupe. Pour le groupe MPSIIIB, nous prévoyons 12 souris par groupe afin de tenir compte d’une éventuelle mortalité ou exclusion. Ce nombre garantit la détection de l’effet recherché tout en limitant l’utilisation d’animaux au strict minimum et avoir des résultats significatifs. Nous maximiserons également les données par animal : réalisation de multiples analyses (tests comportementaux, histologie, biologie moléculaire, analyses biochimiques...) sur les tissus prélevés afin de limiter l'utilisation d'animaux supplémentaires. Comme dans nos études précédentes, l’expérimentateur principal reste systématiquement en aveugle vis-à-vis du génotype et du traitement administré.
Raffinement
Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état clinique des souris utilisées sera assurée soit par l’expérimentateur soit par le personnel de la zootechnie. Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien Être Animal (SBEA) de notre établissement, sont les suivants : - défaut d'alimentation et/ou de boisson sur une période de 24 à 48 heures se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation ; - perte de poids >10 % du poids normal maintenue sur 72 heures ; -hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger ; - difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire ; - faiblesse ou paralysie des membres, se traduisant par des défauts de locomotion; - lésion non résorbée dans la zone d'implantation de la canule guide malgré les soins; - infection non contrôlée dans la zone d'implantation de la canule guide malgré les antibiotiques. Si un de ces points limites est atteint, les animaux seront mis à mort immédiatement. Pour la procédure 2 – chirurgie pour injection intracérébrale et installation de la canule guide- un tapis chauffant sera positionné sous l’animal pendant l’anesthésie ainsi que sous la cage pour le réveil des animaux afin de prévenir l’hypothermie et un gel oculoprotecteur sera appliqué systématiquement aux souris anesthésiées afin de prévenir le dessèchement oculaire. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et par administration d'analgésique ( administrée 1 heure avant la chirurgie et toutes les 24 heures en fonction de l’état des souris dans les 48 heures postopératoires). La pose d'une canule guide va permettre un meilleur confort de l'animal puisqu'elle implique une réduction du nombre de contentions et d'administrations répétées chez ce dernier. Les expérimentateurs qui effectueront la chirurgie de la pose de la canule guide sont exclusivement des personnels formés à la chirurgie et maîtrisent les bons gestes garantissant l'aseptie pendant la chirurgie ainsi que le bien-être animal en pré-, per- et post-opératoire. Enfin, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant les pathologies humaines. Notre projet de recherche est basé sur l’utilisation des animaux génétiquement modifiés, spécifiquement la souris MPSIIIB. Cette souche mutée pour l’enzyme lysosomale est le seul modèle à reproduire fidèlement les caractéristiques humaines : accumulation d’héparane sulfate, dysfonction lysosomale, neuroinflammation, troubles cognitifs et comportementaux et réduction de l’espérance de vie. De plus, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, une très bonne adaptation aux conditions expérimentales et surtout être un modèle de choix pour les études comportementales. Les animaux seront utilisés à 1 mois, ce qui correspond à l’âge avant l’apparition des symptômes de la maladie pour mimer l’état des patients asymptomatiques qui seront éligibles à ce type de traitement (thérapie génique). De plus, ça permet de laisser 1 semaine entre le sevrage et le début de l’expérimentation pour limiter le stress dû au sevrage. les animaux seront également utilisés à partir de 2 mois afin d'étudier les premiers signes et la progression de la neuro-inflammation. Et des animaux seront utilisés à partir de 21 jours afin d'étudier l’efficacité de la modulation de l’inflammation. Ce choix est en accord avec les précédentes études déjà menées au laboratoire.
Traitement du microbiote intestinal et des intestins pour prévenir la maladie de Parkinson
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
352 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes mises à mort pour prélever leur cerveau et leurs intestins. Chacune est maintenue trois minutes par jour dans un dispositif de contention pour recevoir de la lumière rouge puis infrarouge sur l'abdomen, quatre à huit semaines pour les souris exposées au pesticide, cinq jours par semaine pendant seize mois pour les souris transgéniques. Une pompe implantée sous la peau du dos délivre la roténone, les souris sont mises à jeun jusqu'à douze heures, isolées jusqu'à huit heures sans eau ni nourriture pour la collecte des selles, gavées si elles refusent de boire les solutions de test, et les transgéniques développent à partir de douze mois une réduction locomotrice pouvant aller jusqu'à la paralysie. Le porteur annonce trois tests moteurs et des tests olfactifs sans préciser lesquels.
Objectifs
La maladie de Parkinson (MP) est une maladie neurodégénérative touchant 270 000 personnes en France. Elle se caractérise par la mort progressive et irréversible de certains neurones. Cette perte entraîne l’apparition de troubles moteurs (tremblements, lenteur des mouvements, rigidité musculaire) et non-moteurs (constipation, perte d’odorat, troubles du sommeil), invalidant progressivement les personnes atteintes jusqu’à conduire à leur décès. A ce jour aucun traitement curatif n’existe. La photobiomodulation (PBM) est un traitement innovant qui repose sur l’exposition des tissus à une lumière rouge et/ou proche infra-rouge. Des études précliniques sur la MP ont montré que l’application de la PBM à l’intérieur du cerveau permet une protection des neurones et une préservation des fonctions motrices. Cependant, cette technique est invasive et limite son application en clinique pour tous les patients. Des études récentes, ont montré l’importance de l’axe intestin-cerveau dans la MP, car des dysfonctionnements intestinaux (inflammation, déséquilibres de la flore intestinale et constipation) apparaissent souvent plusieurs années avant les symptômes moteurs et pourraient contribuer au déclenchement et la propagation de la maladie. L’objectif de ce projet est de déterminer si la PBM administrée au niveau de l’abdomen, influence la flore intestinale de manière à prévenir et ralentir la MP. Pour répondre à cette question, nous utiliserons 2 modèles de souris de la MP : 1) Un modèle induit par l’exposition à un pesticide, la roténone, qui reproduit des caractéristiques majeures de la MP, telles que l’apparition de troubles moteurs et la dégénérescence de certains neurones tout en induisant des perturbations intestinales. Il permettra ainsi d’évaluer l’efficacité de la PBM abdominale administrée précocement pour prévenir ou limiter les altérations de la MP induites par des facteurs environnementaux. 2) Un modèle génétiquement modifié, exprimant une des mutations génétiques humaines présente dans une forme familiale de la MP. Ce modèle présente un avantage majeur pour l’étude des stades précoces (avant l’apparition des symptômes moteurs) de la maladie. Sa cinétique lente offre un cadre privilégié pour tester l’efficacité préventive de la PBM abdominale, visant à moduler la flore intestinale dans le but de retarder ou empêcher l’installation de la pathologie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre l’implication de la flore intestinale dans le développement de la maladie de Parkinson, d’identifier d’éventuels effets secondaires de la photobiomodulation et d’optimiser la fenêtre thérapeutique avant d’envisager des essais cliniques chez l’humain. Ces travaux permettront à la fois de renforcer nos connaissances sur la maladie de Parkinson tout en favorisant l’émergence d’un nouveau traitement pour les patients.
Procédures
Toutes les souris seront entraînées progressivement à entrer et rester pendant 3 minutes dans un système de contention en vue d’être traitées par photobiomodulation. L’abdomen des souris qui recevront le traitement, sera exposé pendant 3 minutes à une lumière rouge puis infrarouge de faible intensité tous les jours pendant 4 semaines minimum et 8 semaines maximum pour le modèle exposé à un pesticide et 5 jours par semaine pendant 16 mois pour le modèle génétique. Pour exposer les souris au pesticide, celles-ci seront opérées sous anesthésie générale avec administration d’antalgique afin de placer sous la peau de leur dos, une mini-pompe qui délivrera le produit en faible quantité sur 4 semaines. Les fonctions motrices des souris seront évaluées à l’aide de 3 tests moteurs avant et pendant l’exposition au pesticide et tous les mois à partir de l’âge d’apparition des troubles moteurs (11 mois) pour le modèle génétique. Des tests olfactifs pourront être effectués tous les 6 mois pour le modèle génétique. Afin de déterminer si les souris présentent des troubles gastrointestinaux, elles seront entraînées pendant 3 jours à boire volontairement différentes substances. Dans le cas où cette procédure échouerait, l’administration se fera par gavage. Avant chaque test gastrointestinal, les souris pourront être mises à jeun pendant 4h. Pour évaluer le temps de transit, elles boiront un mélange contenant un pigment rouge et seront ensuite isolées dans des cages jusqu’à l’apparition d’une selle rouge ou pour une durée maximum de 8h. Pour évaluer la perméabilité intestinale, les souris boiront un mélange contenant une substance fluorescente. Quelques heures plus tard, un prélèvement sanguin (maximum 5 minutes) sera effectué soit en vigile dans un système de contention soit sous anesthésie générale. Pour récolter les selles et évaluer la constipation, les souris seront placées dans des cages individuelles sans eau ni nourriture pendant 1h. Les tests gastrointestinaux seront réalisés deux fois avant la chirurgie puis toutes les semaines après la chirurgie pour le modèle utilisant le pesticide ; et tous les 3 mois pour le modèle génétique. Une IRM d’une durée d’une heure pourra être réalisée une fois sous anesthésie générale pour toutes les souris. Pour évaluer la vidange gastrique, les souris seront mises à jeun une fois pendant 12h puis placées dans des cages individuelles avant d’être replacées dans leur cage d’origine avec leurs congénères.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux sont les suivants : • Le placement des souris dans un système de contention pendant 3 minutes peut provoquer un stress aigu ce qui pourra affecter temporairement leur bien-être physiologique et comportemental. • L’anesthésie des animaux peut entraîner du stress et des effets physiologiques transitoires notamment lors de l’induction et du réveil. • Pour les animaux opérés, l’implantation d’une pompe en sous-cutanée peut engendrer du stress, un inconfort, une faible perte de poids, de la douleur temporaire et un risque d’infection et d’inflammation au site d’incision. • Les tests gastrointestinaux nécessiteront l’isolement des animaux (8h maximum), des restrictions alimentaires pouvant aller jusqu’à 12h, et une administration de substances par boisson volontaire qui pourront entraîner du stress, des modifications physiologiques et comportementales chez les souris. Dans le cas où les souris refuseraient de boire volontairement les substances proposées, elles seront gavées ce qui pourra provoquer du stress, de l’inconfort, et occasionner des douleurs et blessures. • Le prélèvement sanguin peut provoquer une douleur aiguë mais brève ainsi qu’un stress transitoire principalement lié à la contention et à la manipulation. • Les tests de comportement pourront induire un stress transitoire lié à la manipulation et à l’exposition à un environnement nouveau. • Concernant les souris transgéniques, les animaux développeront progressivement, à partir de l’âge de 12 mois, une réduction des fonctions locomotrices pouvant conduire à une paralysie.
Devenir
Afin de déterminer l’efficacité de la photobiomodulation au niveau cellulaire, notamment pour évaluer l’effet protecteur du traitement sur les neurones et les changements induits sur le microbiote intestinale, toutes les souris seront mises à mort en fin d’expérience afin de prélever en post mortem leur cerveau et leurs intestins.
Remplacement
Les expériences sur des cellules cultivées en laboratoire sont essentielles pour étudier la photobiomodulation (l'utilisation de la lumière à des fins thérapeutiques). Elles permettent de contrôler précisément différents paramètres, comme la couleur de la lumière, son intensité, la durée d'exposition ou encore le type de cellules étudiées. Cela permet d'observer directement les effets de la lumière sur les cellules, sans les nombreuses influences qui existent dans un organisme vivant. Des études précédentes réalisées sur des cellules intestinales et des bactéries du microbiote intestinal ont permis de déterminer les réglages de lumière les plus efficaces pour réduire l'inflammation et aider le microbiote à mieux résister au stress. Ces travaux ont également amélioré notre compréhension des interactions entre les cellules de l'intestin et les bactéries qui y vivent. Dans notre étude, qui s'intéresse aux liens entre l'intestin et le cerveau dans la maladie de Parkinson, l'utilisation de modèles animaux est nécessaire. En effet, ils permettent d'étudier les échanges complexes entre le cerveau et le microbiote intestinal, qui ne peuvent pas être reproduits avec de simples cultures cellulaires. Grâce aux connaissances obtenues lors des études en laboratoire, les modèles animaux permettront d'évaluer si les effets de la photobiomodulation sur l'intestin et le microbiote peuvent aussi avoir un impact sur le comportement, les capacités motrices, le fonctionnement du cerveau et la santé intestinale dans le contexte de la maladie de Parkinson. À l'heure actuelle, les modèles animaux restent les seuls outils permettant d'évaluer de manière globale l'efficacité d'un traitement sur les symptômes moteurs et non moteurs d'une maladie.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé à l’aide d’un logiciel de statistique afin qu’il soit réduit au minimum tout en permettant de pouvoir observer un effet significatif du traitement.
Raffinement
Afin de réduire le stress lié au maintien des animaux dans un système de contention pour le traitement par photobiomodulation, les animaux seront habitués progressivement sur une semaine à entrer et rester de plus en plus longtemps, jusqu’à 3 minutes maximum, dans le système de contention. Pour l’implantation de la pompe, les animaux recevront un antalgique avant l’anesthésie générale. Pour prévenir toute baisse de température, les souris seront placées sur un tapis chauffant pendant la chirurgie et ce jusqu’au réveil sous une surveillance continue. Les animaux seront surveillés étroitement pendant 3 jours suivant la chirurgie et l’état général des animaux sera évalué selon une grille de score. Le traitement antalgique pourra être prolongé si besoin. Pour les tests de comportement, les animaux seront préalablement habitués à la manipulation et à la pièce d’expérimentation afin de réduire au maximum tout stress occasionné. L’administration de substances guidée par micropipette sera précédée d’une période d’entraînement sur 3 jours afin que les souris apprennent à boire volontairement les solutions proposées pour les tests gastrointestinaux. Pendant les restrictions alimentaires et l’isolement des animaux, une surveillance attentive des animaux sera effectuée. Avant la mise à mort des souris, celles-ci recevront un antalgique puis seront soumises à une anesthésie générale. Les traitements antalgique et anesthésique se feront dans une pièce différente de la salle d’hébergement et d’euthanasie pour réduire et éviter la transmission d’un stress aux autres animaux. Un mois avant l’apparition des troubles moteurs, soit à partir de l’âge de 11 mois, l’état clinique des souris transgéniques sera évalué toutes les semaines à l’aide d’une grille de score afin de prévenir toutes souffrances.
Choix des espèces
La souris a une grande proximité génétique et biologique avec l’être humain, notamment au niveau des circuits nerveux impliqués dans la maladie de Parkinson. Environ 85 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, ce qui permet de reproduire certaines mutations responsables de la pathologie et d’observer leurs effets sur le cerveau. Les modèles de souris, qu’ils soient génétiques ou induits par des toxiques, reproduisent des caractéristiques essentielles de la maladie, notamment la dégénérescence de certains neurones et les troubles moteurs et non-moteurs. Par ailleurs, la souris est particulièrement adaptée à l’étude du microbiote intestinal, car sa flore intestinale peut être contrôlée, modifiée ou même remplacée, ce qui permet d’analyser précisément l’influence du microbiote sur l’inflammation et la communication entre l’intestin et le cerveau dans la maladie de Parkinson. Pour le modèle avec le pesticide, les souris utilisées seront adultes et auront entre 2 et 5 mois. La maladie de Parkinson touchant uniquement les adultes, l’utilisation d’animaux adultes est nécessaire pour reproduire les mécanismes de la maladie liés à l’âge et évaluer l’efficacité ainsi que la tolérance de la photobiomodulation dans un contexte biologique comparable à celui des patients. Les souris transgéniques seront utilisées entre l’âge de 1 et 17 mois car elles développent des troubles gastrointestinaux dès l’âge de 2 mois et le traitement par photobiomodulation doit commencer au moins un mois avant l’apparition des troubles gastrointestinaux pour pouvoir évaluer son effet préventif.
Étude de l’effet de l’insufflation intra-abdominale de dioxyde de carbone (CO₂) sur l’inflammation générale et cérébrale dans un modèle d’entérocolite (inflammation sévère de l’intestin) chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Nourris par une sonde introduite par la bouche jusqu'à l'estomac, matin et soir du 3e au 7e jour de vie, avec un lait contenant une substance qui provoque une inflammation intestinale, 432 souriceaux subissent aussi trois passages quotidiens de dix minutes dans une chambre où l'oxygène est abaissé de 21 à 5 %. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré à sévère, avec douleur abdominale, diarrhée, sang dans les selles, altération de l'état général et décès parmi les effets attendus. Certains reçoivent au 6e jour une insufflation de dioxyde de carbone dans l'abdomen, que le porteur décrit comme réalisée sous anesthésie générale afin qu'ils ne ressentent aucune douleur, tout en signalant une perforation d'organe suivie du décès et une perforation possible de l'œsophage lors du passage de la sonde. Des tests comportementaux sont annoncés au 30e et au 45e jour de vie, sans que le document précise lesquels. Tous sont tués, à 8 jours pour prélever intestins, cerveaux, sang, foie et rate, à 50 jours pour prélever les cerveaux.
Objectifs
L’entérocolite ulcéro-nécrosante (ECUN) est une maladie grave de l’intestin du nouveau-né prématuré, correspondant à une inflammation sévère pouvant abîmer voire détruire une partie de l’intestin. Elle est responsable d’un état inflammatoire général prolongé avec un risque élevé de complications et de décès (15–30 %). Elle peut également avoir des effets sur le développement cérébral. En effet, elle est associée à une augmentation de la survenue de troubles du neurodéveloppement (TND) sans que l’on ne comprenne encore pourquoi. Les troubles du neurodéveloppement regroupent plusieurs difficultés liées au développement du cerveau pendant l’enfance et peuvent inclure par exemple des difficultés pour apprendre, se concentrer, communiquer ou interagir avec les autres. L’hypothèse principale pour expliquer ces séquelles neurologiques est que l’inflammation due à l’entérocolite perturberait le développement du cerveau chez ces nouveau-nés très fragiles. Le traitement de l’ECUN repose initialement sur les antibiotiques et la mise au repos de l’intestin (mise à jeûn). Si l’intestin se perfore ou si l’état du nouveau-né s’aggrave malgré ce traitement, une opération devient nécessaire. La chirurgie se fait classiquement par laparotomie, c’est-à-dire par une large ouverture abdominale. Une technique plus récente et moins invasive peut être utilisée. Il s’agit de la coelioscopie néonatale. Il s’agit d’une technique chirurgicale peu invasive. Elle consiste à faire de petites incisions dans le ventre pour introduire une caméra et des instruments. Le ventre est légèrement gonflé avec un gaz (le dioxyde de carbone) afin de créer de l’espace et permettre de voir et d’explorer les organes. Seulement 8 % des chirurgiens pédiatres dans le monde utilisent la coelioscopie dans la prise en charge des ECUN. Les études ont montré une diminution significative de l’inflammation chez les nouveau-nés ayant bénéficié d’une coelioscopie. L’hypothèse est l’effet anti-inflammatoire du CO2 insufflé lors de la cœlioscopie et son interaction directe avec l'intestin. Notre projet de recherche a pour objectif d’étudier l’effet anti inflammatoire et notamment neuroprotecteur de l’insufflation intra-abdominale de CO2 sur un modèle d’entérocolite chez la souris. L’intégralité de ce travail aura une application directe sur le protocole de prise en charge chirurgicale des entérocolites des nouveau-nés prématurés, et sur leur pronostic.
Bénéfices attendus
Un enfant né prématuré sur trois aura des TND. La survenue de ces troubles est plus fréquente en cas d’ECUN associée. En effet, plus de 50% des nouveau-nés prématurés avec ECUN auront un trouble du neurodéveloppement. Les effets de l’entérocolite sur le cerveau des nouveau-nés n’ont pas encore été élucidés. Avec ce projet, nous cherchons à comprendre d’une part l’association entre TND et entérocolite en étudiant l’impact de l’inflammation sur le développement du cerveau des nouveau-nés. Nous cherchons à comprendre d’autre part la baisse de l’inflammation et la meilleure évolution des nouveau-nés ayant bénéficié d’une coelioscopie, qui ont été constaté chez les patients. Seulement 8 % des chirurgiens pédiatres dans le monde utilisent la coelioscopie dans la prise en charge des ECUN. Les résultats de nos expériences précliniques, s’ils s’avèrent positifs, constitueraient un pré requis indispensable à la généralisation de l’exploration coelioscopique chez les nouveau-nés atteints d’ECUN. L’intégralité de ce travail aura une application directe sur le protocole de prise en charge chirurgicale des ECUN, et sur leur pronostic à court et long terme.
Procédures
Les animaux seront soumis à quatre types d’intervention : - Une alimentation par une fine sonde orogastrique (fin tube introduit par la bouche, jusqu'à l'estomac) avec une solution lactée matin et soir du 3ème au 7ème jour de vie. La composition de la solution lactée diffère entre les groupes. Certains souriceaux recevront du lait à usage vétérinaire. D’autres souriceaux recevront du lait à usage vétérinaire contenant une substance qui provoque de l’inflammation intestinale (Dextran Sodium Sulfate). Cela permet de reproduire, chez la souris, une entérocolite similaire à celle observée chez les nouveau-nés prématurés. - Un maintien pendant 10 minutes trois fois par jour du 3ème au 7ème jour de vie dans une chambre avec une concentration en oxygène abaissée de 21 à 5%. - Au 6ème jour de vie, certains souriceaux auront une insufflation de CO2 dans l’abdomen, c’est à dire qu’ils recevront une faible quantité de gaz dans la cavité abdominale à l’aide d’un très fin tube. Cette procédure sera réalisée sous anesthésie générale afin que les animaux ne ressentent aucune douleur. Le gaz sera administré pendant 10 minutes avec une pression très faible et contrôlée. Chaque souris concernée recevra cette intervention une seule fois. - Une IRM cérébrale sera réalisée sur chaque souris autour du 40ème jour de vie. Celle-ci sera réalisée sous anesthésie générale pour obtenir une immobilité parfaite.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent tout d’abord subir un stress temporaire lors : des manipulations, de la séparation ponctuelle avec la mère chez les souriceaux, des tests comportementaux, et du transport des animaux vers les salles d’expérimentation. Ils peuvent ensuite être sujets aux symptômes d’entérocolite : douleur abdominale, diarrhée, sang dans les selles, altération de l’état général, décès. L’administration du lait par voie orogastrique (sonde introduite par la bouche jusqu’à l’estomac) présente également des risques : l’introduction de cette sonde peut entrainer un stress et un inconfort liés au passage de la sonde et à la contention. Dans de rares cas des complications peuvent survenir, comme une fausse route ou une perforation de l’œsophage. De plus, bien que cela reste exceptionnel, une perforation d’organe suivi du décès peut survenir lors de l’introduction du petit tube d’insufflation de CO2. Pour finir, ils présentent un risque de décès provoqué par les produits anesthésiants lors des procédures réalisées sous anesthésie générale.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure afin de réaliser les prélèvements tissulaires post-mortem : - A l’âge de 8 jours : prélèvement des intestins pour caractériser l’entérocolite, des cerveaux pour analyse de l’architecture cérébrale et des conséquences cérébrales de l’inflammation, du sang, du foie et de la rate pour caractériser l’inflammation. - A l'âge de 50 jours : prélèvement des cerveaux pour caractériser l’architecture cérébrale.
Remplacement
Les effets de cette maladie sur le cerveau et sur le système de défense du corps ne peuvent pas être étudiés correctement sans utiliser un animal entier. Il n’est pas possible de tester cette approche uniquement sur des cellules en laboratoire ou à l’aide d’un logiciel, car ces méthodes ne permettent pas de reproduire toute la complexité de la maladie. La souris est un animal souvent utilisé en recherche médicale pour les modèles d'entérocolite. Elle permet d’étudier cette maladie de manière fiable, car son organisme réagit d’une façon comparable et adaptée à ce type d’étude.
Réduction
Le modèle de maladie utilisé a été mis au point pour provoquer des lésions de l’intestin tout en limitant la gravité de l’état des jeunes souris, permettant de limiter la souffrance et de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude. Une surveillance au minimum quotidienne est mise en place afin d’apprécier l’état des souriceaux. Plusieurs examens sont réalisés sur les mêmes animaux au cours de l’étude, ce qui permet de recueillir un maximum d’informations tout en limitant le nombre total de souris nécessaires. Le nombre de souris est réduit au strict nécessaire à l’obtention de résultats fiables.
Raffinement
Toutes les interventions sont réalisées par du personnel formé et autorisé. Cela concerne notamment l’alimentation des jeunes souris à l’aide de la sonde, l’anesthésie, les insufflations dans l’abdomen. Les animaux sont hébergées dans des conditions adaptées à leur bien-être : alternance jour/nuit régulière, température stable, eau et nourriture à volonté. Les cages contiennent du papier doux pour leur permettre de construire un nid. Les mères et leurs petits ne sont pas dérangés avant le troisième jour de vie. Lors des manipulations, la séparation est la plus courte possible et les petits sont maintenus au chaud avant d’être replacés auprès de leur mère. Pendant la période où la maladie est provoquée, les animaux sont observés deux fois par jour (poids, comportement, état général). Des règles précises sont suivies pour décider si un animal doit être euthanasié plus tôt afin d’éviter toute souffrance inutile. L’administration du gaz dans l'abdomen est réalisée sous anesthésie générale afin que les animaux ne ressentent pas de douleur. Le matériel utilisé permet de délivrer une pression très faible, adaptée à la taille des jeunes souris. Les animaux sont surveillés en permanence pendant et après l’anesthésie. Les tests de comportement sont réalisés dans une salle calme. Les animaux sont d’abord habitués à l’environnement et sont manipulés avec douceur.
Choix des espèces
Parmi les modèles animaux d’ECUN, le rongeur est largement utilisé dans la littérature. Plusieurs études sur les conséquences de l’insufflation du CO2 chez la souris ont été publiées précédemment. L’insufflation de CO2 intra-abdominale chez la souris est facilement réalisable, reproductible et ne nécessite qu’un seul point de ponction. Notre modèle d’entérocolite est induit chez des souriceaux du 3ème au 7ème jour de vie car ils ont à cet âge, un développement cérébral comparable à celui d’un nouveau-né prématuré. Les tests comportementaux sont réalisés pendant la période de l’acquisition motrice puis plus tard au 30ème et 45ème jours de vie correspondant aux périodes d’adolescence et de jeune adulte, à la recherche de troubles du neurodéveloppement.
Mise au point d’une thérapie pharmacologique dans un modèle murin de la maladie de Wolfram
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
Les souris utilisées portent la mutation du syndrome de Wolfram et développent, dès 21 jours de vie, une surdité et un syndrome vestibulaire, auxquels s'ajoute un diabète. 1 440 souris sont engagées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever plusieurs structures cérébrales. Elles subissent des injections quotidiennes pendant deux mois et demi, six contrôles alimentaires de quinze heures, six piqûres caudales sur neuf mois, et le porteur signale une irritation possible aux sites d'injection sur l'abdomen. Des tests comportementaux servent à évaluer les capacités motrices du premier mois à l'âge adulte, sans que le document précise lesquels.
Objectifs
Le syndrome de Wolfram est une maladie génétique rare mais qui ne dispose aujourd'hui d'aucune thérapie. L'identification de la protéine responsable de la pathologie et la compréhension récente de son rôle dans la cellule et son implication dans les processus neurodégénératifs, fondamentaux dans des pathologies comme Alzheimer, Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique ou la maladie de Huntington, permet aujourd'hui d'envisager des approches thérapeutiques. Il est important de caractériser les effets thérapeutiques de composés neuroprotecteurs chez les souris pour définir les paramètres d'efficacité des candidats médicaments testés par la suite chez l'Homme. Le modèle d'étude est la souris qui possède la même mutation que l'Homme. Cette souris développe plusieurs déficits d'équilibre et d'audition. Les objectifs de ce projet sont de déterminer l'ampleur des déficits observables et d'évaluer les effets bénéfiques des composés médicaments testés.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre d'apporter une preuve d'efficacité des composés testés. Le bénéfice à terme est d'amener en clinique des composés à visée thérapeutique pour des pathologies rares/orphelines (Sclérose latérale amyotrophique, Hungtington...) pour lesquelles il n'existe actuellement aucun traitement.
Procédures
Les gestes techniques à réaliser lors de ce projet sont les suivants : Les animaux seront soumis à 1 contrôle alimentaire (durée 15h), des injections journalières pendant 2 mois et demi et des prélèvements de quelques gouttes de sang mensuellement pour suivre l'évolution dans le temps des altérations de la fonction pancréatique des modèles murin. Au total, en plus des injections journalières, les animaux seront soumis à 6 contrôles alimentaires, 6 injections et 6 piqures caudales sur une période de 9 mois.
Impact sur les animaux
Les effets attendus seront "légers" à "modérés". Le contrôle alimentaire sur un durée de 15h peut également engendrer un stress. Une irritation peut survenir aux sites d'injections sur l'abdomen de l'animal. L'incision pour les prélèvements de goutte de sang est superficielle mais peut engendrer un léger stress . Pour limiter le stress, les animaux sont habitués à la manipulation au préalable. Le modèle murin du syndrome de Wolfram-like développe progressivement des troubles neurosensoriels ( surdité et syndrome vestibulaire) à partir de 21 jours après la naissance.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort et les organes collectés pour procéder aux analyses de biologie moléculaire et d'immunohistochimie permettant la compréhension des mécanismes moléculaires mis en jeu.
Remplacement
L’utilisation de modèles murins du syndrome de Wolfram pour ce projet est indispensable car ce modèle mammifère est le seul recours « in vivo » autre que l’humain à présenter les symptômes pathologiques du syndrome de Wolfram, type déficit vestibulaire, dans une fenêtre de temps relativement courte permettant l'élaboration d'un traitement curatif plus rapidement. Aucune alternative à ce jour ne peut se substituer totalement à ce modèle. Même si les méthodes in vitro ou in silico jouent un rôle important dans de nombreux projets de recherche, elles ne permettent pas, seules, de comprendre et de reproduire les interactions multiples au sein d’un organisme vivant. Toutes les molécules testées ont été préalablement testées sur des modèles in vitro de culture cellulaire et sur des tests comportementaux sur la larve de poisson zèbre dont l'âge est inférieur à 5 jours.
Réduction
Les analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux par groupe. Ce nombre de 12 souris par groupe fait également références aux études antérieures réalisées au laboratoire. Une veille bibliographique sera également prise en compte durant la durée du projet. Plusieurs structures du cerveau seront prélevées dans cette étude afin de collecter un maximum d’échantillons.
Raffinement
Nous procéderons à l’enrichissement du milieu avec un accès à des maisons en carton pour éviter que les animaux ne se blessent et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Si les animaux présentent un augmentation de leur production d'urine (dû à l'installation d'un diabète) les fonds de cages seront changés plus régulièrement. Les animaux seront manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Après les tests comportementaux les animaux sont directement remis dans la cage d’origine à l’écart du test de comportement afin de retrouver leur environnement sécurisant. Une crème analgésique sera appliquée sur la queue avant les prélèvements de sang. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Dans le cas où le traitement pharmacologique serait à l’origine de douleur visible ou de détresse le traitement serait interrompu .
Choix des espèces
Ces expérimentations seront réalisées sur un modèle murin de type syndrome de Wolfram qui mime tous les symptômes que l'on retrouve chez l'Homme atteint par cette pathologie, à savoir un diabète, et une dégénérescence des cellules ciliées de l'oreille menant à des troubles vestibulaires. Les capacités motrices des animaux seront testées dès le 1er mois jusqu'à l'âge adulte.
Efficacité pharmacologique et suivi en imagerie de nanoparticules capables d’emmener des molécules thérapeutiques dans le cerveau chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Trépanées au-dessus du cortex pour y sceller une fenêtre de verre, puis maintenues sous anesthésie jusqu'à trois heures pendant l'imagerie, 336 souris vont être utilisées dans des procédures menées sans réveil ou impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées en fin de procédure par surdosage d'anesthésique. L'objectif est de suivre le passage, du sang vers le cerveau, de nanoparticules chargées d'une molécule thérapeutique, que le porteur décrit comme un "cheval de Troie" leurrant un transport naturel. Il revendique une "quasi-innocuité" de ses composés et annonce qu'un score de sévérité sévère constitue le point limite déclenchant la mise à mort immédiate.
Objectifs
Ces dix dernières années, notre société et ses partenaires académiques ont réussi à identifier et à développer des petites entités, dénommées vecteurs, pour faire pénétrer dans le cerveau des médicaments dont l’accès est proscrit par la présence d’une barrière biologique appelée Barrière Hémato-Encéphalique (BHE). Cette barrière est constituée par une paroi extrêmement étanche des vaisseaux sanguins du cerveau. Cette barrière laisse passer uniquement les composés du sang nécessaires au fonctionnement cérébral et le protège des agressions extérieures mais, ce faisant, en empêche l’accès à certains médicaments. Il existe un système de transport naturel de molécules au niveau des vaisseaux sanguins et nos vecteurs sont capables de s’y attacher pour être amenés vers le cerveau. Dans ce projet nous allons attacher à la surface de nanoparticules (100 nm de diamètre) nos vecteurs et les remplir d'une molécule thérapeutique. Ces nanoparticules leurrent se système de transport comme un cheval de Troie pour pénétrer dans le cerveau suite à leur délivrance dans le sang. L’objectif de ce projet et de quantifier l’efficacité de l’agent thérapeutique embarqué et de suivre en imagerie le passage des nanoparticules, du sang au cerveau avec différents types de contrôles. Cette thématique de recherche a donc un potentiel révolutionnaire pour le traitement des pathologies du cerveau comme Parkinson et Alzheimer. Le succès de ces travaux et nos dernières études ont démontré la quasi-innocuité de nos composés et tout le potentiel de notre technologie sur le développement de nouveaux traitements. C’est dans ce contexte que nous souhaitons relever de nouveaux défis et optimiser notre technologie pour améliorer ou prolonger l’effet de cette stratégie.
Bénéfices attendus
Grâce au profil pharmacologique et à l’optimisation de nos composés, nous pourrons envisager de meilleurs effets pharmacologiques /thérapeutiques notamment par la capacité de délivrer une large quantité d’agents encapsulés dans nos nanoparticules. Les correcteurs transitoires d’ADN (dont les ARN messagers et interférents) sont de plus en plus reconnus comme ayant un potentiel révolutionnaire thérapeutique, notamment par leur capacité à moduler transitoirement l’expression génique, ouvrant la porte au traitement de nombreuses pathologies. Ces entités thérapeutiques peuvent présenter de multiples effets définis par leur design (activation/répression, correction de la transcription de l’ADN en ARN messagers, etc.). Ainsi les limites des applications et des cibles de ces molécules thérapeutiques vont bien au-delà des approches classiques (petites molécules, anticorps, protéines, peptides, etc…). En théorie, ces thérapies pourraient être développés pour toute pathologie et même personnalisables pour chaque patient pour restaurer les fonctions déficientes. C’est particulièrement le cas pour toute pathologie présentant une composante génétique identifiée (maladie génétiques type myopathie de Duchenne, cancers, pathologies neurodégénératives, etc…). Bien qu’ils présentent une excellente sélectivité d’action, grâce à leur appariement précis sur une cible donnée, ils souffrent d’un handicap majeur pour permettre leur développement et leur essor dans l’arsenal thérapeutique : en tant que macromolécules chargées, leurs propriétés physicochimiques, leur stabilité et leur taille ne leur permettent pas de traverser les barrières biologiques à des doses acceptables. En outre, bien qu’ils présentent spontanément une affinité préférentielle pour les organes d’excrétion, avec notamment une accumulation au foie, ils ne se distribuent que très peu dans autres les tissus.
Procédures
Dans la procédure 1 un les animaux subiront une injection dans la queue en contention (durée < 1 min) puis seront stabuler jusqu’à 14 jours post injection avant mise à mort par un surdosage d’un mélange d’anesthésique/analgésique (15min entre l’injection et la mise à mort). Dans la procédure 2 qui se déroule entièrement sous anesthésie générale gazeuse induite en boite (2 min) puis maintenue au masque tout au long de la procédure (jusqu’à 3 heures incluant la session d’imagerie). Ensuite les animaux reçoivent des analgésiques systémiques et locaux (2 min) avant de subir la chirurgie d’implantation d’une chambre optique. Cette fenêtre osseuse est ménagée dans le crâne au-dessus du cortex avec un trépan (10 min) puis une lame de verre est déposée au-dessus puis scellée avec un ciment orthopédique (10min). L’animal est ensuite installé sous le microscope (10min). La procédure d’imagerie commence par une injection caudale d’un traceur vasculaire fluorescent (1 min). S’en suit l’acquisition en imagerie du réseau vasculaire cérébral (10 min). Les nanoparticules sont ensuite injectées de la même manière (1 min) et s’en suit l’acquisition en imagerie durant 2h30 avant la mise à mort de l’animal par surdosage d’un mélange d’analgésique/anesthésique. Dans la procédure 3, les animaux reçoivent la veille en contention soit une injection IV caudale de VEGF A soit d’une NP chargée avec un ARNm Cre (1 min). Le lendemain il subissent la même chirurgie d’implantation, session d’imagerie et protocole de mise à mort que ceux décrits ci-dessus (durée totale 3H).
Impact sur les animaux
Nos conjugués reconnaissent une cible fortement exprimée au niveau des vaisseaux sanguin du cerveau, et sont relativement bien tolérés. Cependant, toute nouvelle entité peut présenter des effets indésirables malgré des évaluations préalables. Pour limiter la douleur et la souffrance, un suivi quotidien est mis en place, avec évaluation comportementale et attribution d’un score de sévérité (non présent, modéré, sévère) pour les procédures éveillées. L’apparition d’un score sévère constitue le point limite et déclenche immédiatement la mise à mort des animaux. Ces mesures garantissent la protection des animaux tout en préservant la fiabilité des résultats expérimentaux. Les points limites liés à l’administration des composés sont : tout signe de toxicité. Pendant les 24h décisives ces points concernent les constantes vitales ainsi que le comportement des animaux. Pour les procédures chirurgicales et la session d’imagerie sous anesthésie générale, les points limites qui seront observés concernent : les constantes vitales au cours de l’anesthésie et les potentiels dommages que pourrait subir le cerveau pendant la chirurgie. Pour les sessions d’imagerie, une partie des études sont classées sans réveil (toutes les sauf « rupture de BHE et NP-ARNm Cre » où les animaux reçoivent une injection la veille : classe modérée). Tous les gestes suivants jusqu’à la mise à mort sont réalisés sous anesthésie générale. L’autre procédure (efficacité pharmacologique), de classe modérée, comprend une injection en contention, une période de stabulation puis une injection terminale avant récupération des tissus/sang pour post analyses. De fait, les seuls stress rencontrés seront des administrations en contention et l’induction des anesthésies (le projet inclura des anesthésiques et analgésiques). Quasiment aucun effet délétère n’est attendu à l’issue des administrations, en termes de toxicité (données antérieures et élimination rapide). Les volumes d’administration sont en accord avec la littérature. L’administration de ces NP peut potentiellement engendrer un léger impact transitoire sur les constantes sanguines (environ 1h post-administration sans conséquences pour le bien-être des animaux) selon nos données antérieures. Il est à noter que nous avons une grande connaissance de l’innocuité de nos composés (toxicité, risques immunogènes) ainsi qu’une maitrise de leur pureté (>97% selon nos standards) et des taux d’endotoxines comparables à une étude clinique humaine.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure
Remplacement
Toutes études de mesures pharmacologique ou d’imagerie en temps réel, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l’heure actuelle aucune alternative qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions mécanistiques et physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille, de petite taille, facile d'utilisation, facile à reproduire et disposant d'une large panoplie de variants génétiquement modifiés ; la souris est l'espèce idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. Le développement de nos vecteurs ne peut être réalisé que par une approche in vivo pour réellement mesurer le bénéfice des molécules développées. L'utilisation de rongeurs impose la prise en compte de la règle des 3R, la conformité vis à vis des et du cahier des charges. A noter que la présélection des vecteurs, des NP et des agents thérapeutiques embarqués passent par une phase de criblage in silico sur des bases de données informatiques ce qui permet d'éviter d'avoir recours aux animaux et ces derniers sont testés in vitro sur lignées cellulaires avant de passer aux phases in vivo (souches sauvages et génétiquement modifiées) et d’envisager dans d’autre projet un passage au primate non-humain en fin d’étude préclinique. Ce faisant nous respectons scrupuleusement tous les outils à disposition pour sélectionner nos composés avant d’envisager une étude chez l’animal.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été réduit au minimum requis pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs (N.S. one-way anova). Pour réduire d'avantage le nombre d'animaux nous nous basons sur notre historique de résultats, notamment au niveau de la reproductibilité inter-individuelle, et d’un plan d’expérience aboutissant à un n=4 pour la première procédure dans chaque groupe et un n=6 pour les procédures d’imagerie 2 et 3.
Raffinement
Pour la procédure d’efficacité pharmacologique, les administrations en contention (très rapides
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus utilisé (physiologie connue et proche de l’homme). Il facilite les manipulations, les injections et observations comportementales. Il est aussi plus adapté et intéressant pour la pharmacologie (diminution des quantités administrées). On l’utilise principalement pour la facilité de mise en place des expérimentations et l’obtention de groupes sans trop de contraintes de stabulation. La souris est également idéale lorsqu’il s’agit de mette en place l’élevage d’une lignée. De plus, de nombreux modèles génétiquement modifiés y ont été développés et sont disponibles, dont ceux inclus dans ce projet. Enfin l'utilisation de souris est indispensable car nos Vecteurs ont été développés pour cibler différentes formes de notre récepteur d’intérêt « forme sauvage mais aussi génétiquement modifiée sous sa forme humanisée). Enfin les animaux inclus seront des mâles et femelles à un stade de développement adulte.
Electrorétinographie, potentiel évoqué visuel et thérapie génique chez des souris modèles de myopathie de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Pour vérifier si l'électrorétinogramme peut servir de marqueur des atteintes cérébrales de la myopathie de Duchenne, 1 260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau et de la rétine, dans des procédures menées sans réveil ou impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent la pose d'électrodes sur la cornée, une incision du scalp et une ou deux perforations du crâne, une injection intraoculaire et une injection intracérébrale, sous anesthésie prolongée de deux heures chez les adultes et sous hypothermie sur glace chez les nouveau-nés. Le porteur indique que les injections dans l'œil peuvent provoquer une déshydratation, un ulcère de la cornée ou une cataracte, et qualifie de légère la douleur des interventions chirurgicales. Il précise que le projet sera interrompu si aucune anomalie corticale n'est mesurable, auquel cas l'effectif déclaré serait "largement surestimé".
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est causée par des mutations d’un gène qui produit des protéines nommées dystrophines, qui conduisent à une dégradation des muscles pouvant être associée à des troubles cognitifs et divers autres troubles sensoriels et cérébraux. Les patients atteints de DMD peuvent notamment développer des rétinopathies. Nos récents travaux montrent que chez différents modèles murins de DMD, l’expression de différentes dystrophines rétiniennes, et la fonction de la rétine, sont affectées de manière variable en fonction de la position de leur mutation. Les anomalies mesurées in vivo à l’aide d’électrorétinogrammes (ERGs) pourraient refléter la sévérité des troubles cérébraux, aider à classer les patients en fonction de la sévérité de leurs atteintes centrales, voire servir de marqueur non invasif de l’évolution de la pathologie et des effets de traitements thérapeutiques. Le projet a pour but de vérifier cette hypothèse en enregistrant en parallèle les ERGs et les potentiels évoqués dans le cortex visuel (Potentiel évoqué visuel, ou PEV), chez des souris porteuses de différentes mutations. Le PEV est un outil important pour évaluer la fonction visuelle et le traitement cortical des informations visuelles, offrant une nouvelle perspective d’étude de l'impact neurologique de la maladie. La mesure synchronisée des ERGs et des PEVs permettra de vérifier l’existence d’une corrélation entre la sévérité des altérations rétiniennes et celle des altérations cérébrales. Le cas échéant, nous testerons ensuite la sensibilité de ces mesures électrophysiologiques à des traitements de thérapie génique pour déterminer si les ERGs, et/ou les PEVs, peuvent effectivement servir de marqueur d’efficacité des traitements ciblant le cerveau. Ce projet est donc important pour le diagnostic, le développement et le suivi de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement des troubles affectant le système nerveux dans la DMD.
Bénéfices attendus
L’évaluation des capacités visuelles à l’aide d’électrorétinogrammes et l’enregistrement de potentiels évoqués corticaux sont très rarement effectuées chez les patients, voire pas du tout en ce qui concerne l’activité électrique corticale. Notre étude permettra d’évaluer si ces mesures devraient être appliquées chez les patients, soit dans un but pronostique (évaluer la sévérité de futures déficits cérébraux), diagnostique (classer les patients en fonction de la sévérité des atteintes centrales présumées), ou encore pour suivre l’évolution de la pathologie ou des effets d’un traitement avec des méthodes qui seront non invasives chez l’Homme. Les approches de thérapie génique prévues dans ce projet incluent différents mode d’injections qui permettront de déterminer la réversibilité des déficits centraux en fonction de l’âge auquel le traitement est administré. Elles permettront aussi d’identifier les dystrophines qu’il faut ré-exprimer en priorité pour atteindre un objectif thérapeutique, et la fenêtre thérapeutique optimale pour ces traitements. Les découvertes issues de ces études ont un intérêt critique pour l’orientation du traitement d’un nombre important de patients atteints de DMD, et les méthodes employées pourront également être applicables à d’autres pathologies du système nerveux.
Procédures
Une anesthésie avec hypothermie transitoire (5 min) chez les nouveau-nés, ou une anesthésie profonde prolongée chez les souris adultes (2h), éventuellement répétée après un intervalle de 2 mois. Sous anesthésie générale et avec analgésie : Pose d’électrodes de contact sur la cornée de l’œil, d’électrodes sous-cutanées, incision du scalp et 1 ou 2 perforations du crâne pour électrodes corticales de surface (sans réveil), injection intraoculaire (1 œil, 1 fois, sans réveil), 1 injection intracérébrale (une seule fois) sous anesthésie générale (durée environ 5 min).
Impact sur les animaux
Les injections intraoculaires sont susceptibles d’induire une déshydratation oculaire, un ulcère de la cornée ou une cataracte. Certaines interventions chirurgicales peuvent occasionner une douleur légère pendant et après la chirurgie. L’anesthésie sur glace provoque une hypothermie.
Devenir
À la suite des enregistrements, les souris tests seront euthanasiées pour prélèvements post-mortem du cerveau et de la rétine.
Remplacement
Nos molécules thérapeutiques font systématiquement l’objet d’une évaluation in vitro afin de ne sélectionner que les meilleurs candidats thérapeutiques, non toxiques sur cellules, et d’éviter ainsi le recours systématique à des méthodes d’évaluation in vivo. Ensuite, les études précliniques pour ces pathologies n’ont pas de modèle in silico ou in vitro et sont généralement menées sur des souris modèles déficientes en dystrophine chez lesquelles les déficits sont préalablement caractérisés, afin de servir de marqueur pour évaluer l’efficacité des traitements. Notre projet implique des injections suivies de périodes de récupération, et des enregistrements électrophysiologiques qui nécessitent l’utilisation d’animaux vivants, mais sous anesthésie et antalgie.
Réduction
Sur la base d’études précédentes, la caractérisation des anomalies rétiniennes et cérébrales nécessite 12-15 souris par groupe, minimum nécessaire pour une démonstration statistique convaincante des objectifs. Certains groupes comprennent des souris recevant un traitement et des groupes contrôles indispensables aux analyses statistiques. Nous utiliserons préférentiellement des tests statistiques adaptés aux petits échantillons, sauf dans le cas d’analyses plus complexes d’interactions entre facteurs ne pouvant être effectuées avec ces tests. Pour les traitements, la sélection préalable in vitro, des molécules à fort potentiel thérapeutique et non toxiques, permet de limiter le nombre d’études in vivo. Le projet comprend une caractérisation préalable des dysfonctions, qui débutera avec les souris modèles connues pour exprimer les déficits les plus sévères. Si cette étude ne révèle pas de dysfonction mesurable au niveau cortical, la suite du projet sera interrompue, auquel cas le nombre d’animaux déclaré dans ce projet sera largement surestimé.
Raffinement
Dans le cas où les animaux seraient importés et non issus de nos élevages, ils auront 5-7 jours d'acclimatation à leur nouvel environnement lors de leur arrivée. Tous les tests seront effectués avant l’âge de 6 mois, donc avant apparition de la faiblesse musculaire due à la myopathie. Les injections et anesthésies, la récupération post-opératoire et les études fonctionnelles ont été optimisées en concertation avec notre vétérinaire. Elles comprennent une anesthésie/analgésie générale et locale (au niveau de l’œil et de la peau du crâne), une prévention de la déshydratation oculaire, et l’utilisation d’un tapis chauffant pendant la chirurgie (sauf pour les injection néonatales sous anesthésie par hypothermie) et pendant le réveil. Toutes les manipulations sont effectuées par des personnels qualifiés parfaitement formés aux procédures mises en place dans ce projet ; le taux d’échec sera donc faible. Les thérapies géniques ont été choisies sur la base des études antérieures pour leur efficacité, l’absence de toxicité et la possibilité de transposer les résultats à des doses applicables à des patients. Leur administration nécessitera des interventions chirurgicales qui ont déjà été éprouvées, qui sont maitrisées et associées à des anesthésies générales avec analgésie, et un suivi régulier des animaux. Le bien-être des souris au cours du traitement sera évalué par observation quotidienne par l’expérimentateur et par l’équipe zootechnique le week-end. En cas de signe de détresse ou souffrance, l’animal sera soigné, ou bien retiré de l’expérimentation et euthanasié, selon un protocole mis en place avec notre vétérinaire référent. Les conditions d’hébergement sont enrichies jusqu’à la fin du projet et les souris expérimentales sont maintenues en groupe sociaux par fratrie.
Choix des espèces
D’autres modèles animaux de la DMD existent (rat, chien, porc), mais seule l’espèce souris permet actuellement de disposer de différents modèles mutants ou transgéniques porteurs de mutations variées et représentatives des sous-groupes de patients montrant des variations dans la sévérité des symptômes. Les troubles visuels ont uniquement été étudiés chez les souris modèles. Les recherches précliniques pour ces pathologies sont donc généralement menées sur ces souris modèles, chez lesquelles les problèmes identifiés servent de marqueur pour évaluer l’efficacité des traitements. Les électrorétinogrammes ne sont pas stables avant 8 semaines, et il est important de ne pas inclure des variations liées à l’âge qui pourraient compliquer nos conclusions sur les effets des traitements. Les enregistrements seront donc effectuées chez des souris adultes (12-14 semaines), ce qui sera comparable à nos études précédentes. Les injections intraoculaires et intracérébrales seront effectuées au moins 2 mois avant, temps nécessaire pour atteindre un plateau d’efficacité des molécules thérapeutiques. Pour être en accord avec de précédentes études, les souris seront injectées à l’âge 8 semaines, excepté pour le groupe qui recevra un traitement en post-natal (nouveau-nés). L’administration du traitement dans un groupe de nouveau-nés est susceptible d’être plus efficace d’après des résultats obtenus par des collaborateurs, et pourrait avoir des effets préventifs plutôt que curatifs.
Valider l’engagement d’une cible par un traceur ou un compétiteur pour une cible à potentiel thérapeutique ou diagnostique par imagerie TEP.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Réattribués à une nouvelle procédure après validation vétérinaire, dix macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque séance commence par une mise à jeun depuis la veille, se poursuit sous anesthésie continue avec trois cathéters posés, et comporte jusqu'à trente prélèvements sanguins, dans la limite de 15 % du volume circulant de l'animal. Le porteur reconnaît que des prélèvements trop répétés peuvent provoquer une anémie, et que l'hébergement individuel imposé le temps de la décroissance du radioisotope, jusqu'à 72 heures, constitue un stress. Il justifie le recours au macaque par la taille de ses veines, par la ressemblance de son cerveau avec celui de l'humain, et par le fait que ces études pharmacologiques ne sont "souvent pas autorisées chez l'homme".
Objectifs
Ce projet de recherche a pour objectif de vérifier si certaines molécules d’intérêt médical peuvent se fixer de manière fiable à une cible biologique précise, susceptible d’être utilisée en diagnostic ou en thérapie. Pour cela, nous utilisons une technique d’imagerie non invasive appelée tomographie par émission de positons (TEP), qui permet de suivre le comportement de ces molécules dans l’organisme vivant. La première question posée est de savoir si le radiotraceur utilisé se lie réellement à la cible visée, et si cette liaison est suffisamment spécifique et sélective. Autrement dit, il s’agit de vérifier que le signal observé correspond bien à la cible d’intérêt et non à d’autres structures biologiques. Cette étape est étudiée en administrant une molécule compétitrice connue, capable de prendre la place du radiotraceur. La deuxième question porte sur la reproductibilité des mesures, c’est-à-dire les différences de distribution du radiotraceur entre différents individus et également chez un même individu (test-retest). La troisième question concerne le devenir des molécules d’intérêt dans le sang et les tissus : sa répartition entre le sang total et le plasma, sa liaison aux protéines sanguines, sa stabilité dans le temps et sa distribution dans les organes. Enfin, la quatrième question vise à évaluer l’exposition globale de l’organisme au radiotraceur, un paramètre clé pour anticiper une utilisation future chez l’homme.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet apporteront des résultats significatifs dans la compréhension des mécanismes biologiques impliqués dans certaines maladies, en particulier en ce qui concerne l’interaction entre des molécules d’intérêt médical et leurs cibles dans l’organisme. Ces connaissances contribueront à accélérer le développement de nouveaux outils diagnostiques et thérapeutiques. En définissant des critères clairs de sélection des molécules dès les premières étapes de la recherche, les résultats permettront de mieux orienter les efforts scientifiques vers les solutions les plus efficaces, tout en limitant le recours ultérieur à des études plus complexes et plus lourdes. Le projet produira également des données fiables sur la distribution des molécules dans le cerveau et dans l’ensemble du corps, informations essentielles pour comprendre leur mode d’action et leur devenir dans l’organisme. Ces résultats renforceront la qualité des évaluations pharmacologiques et faciliteront la comparaison entre différentes molécules candidates. À plus long terme, les données générées constitueront une base scientifique solide et réutilisable, pouvant servir à l’identification de biomarqueurs diagnostiques ou à la préparation d’évaluations thérapeutiques ciblant des pathologies spécifiques. Grâce à la forte proximité biologique du primate non humain avec l’être humain, les résultats obtenus permettront une meilleure transposition vers la clinique, augmentant les chances que les avancées issues de ce projet se traduisent en bénéfices concrets pour la santé humaine. L’optimisation des stratégies de recherche contribue aussi à une utilisation plus raisonnée des ressources expérimentales, au bénéfice d’autres espèces et de l’environnement.
Procédures
Avant l’imagerie les animaux sont mis à jeun depuis la veille au soir pour un examen d’imagerie réalisé le matin. Après l’induction de l’anesthésie, trois cathéters sont posés, l’un sert à administrer l’anesthésie de manière continue pendant l’imagerie, l’autre à administrer les ligands, et le troisième pour effectuer des prélèvements sanguins. Le volume sanguin total prélevé et le nombre de prélèvements (maximum 30) correspondra à moins de 15% du volume circulant de l’animal. L’hébergement individuel est limité à la durée de décroissance du radioisotope (min 4h, max 72h.
Impact sur les animaux
Chaque séance d’imagerie sur le PNH est un acte qui peut générer plusieurs nuisances ou effets indésirables : - L’anesthésie peut induire une hypothermie et perte de poids transitoire de l’animal : les animaux sont thermorégulés avec un suivi de la température corporelle. Au réveil, les animaux sont nourris avec quelques fruits ou légumes en plus de leur ratio de croquettes. - L’anesthésie peut induire une déshydratation de l’animal. - Des prélèvements sanguins trop répétés peuvent induire une anémie chez le PNH: le taux d’hémoglobuline est mesuré régulièrement et une période de repos est accordée aux animaux entre les examens. - L’hébergement temporaire en zone TEP lors de la décroissance est un stress pour l’animal : cette période est réduite à la période de décroissance réglementaire. - L’introduction des cathéters peuvent induire des hématomes et douleurs associées.
Devenir
A l’issue de la procédure, après validation par le vétérinaire, les primates non humains peuvent être attribués à une nouvelle procédure.
Remplacement
Avant toute utilisation d’animaux, les radiotraceurs font l’objet d’une stratégie de développement progressive visant à privilégier les méthodes de remplacement. Des approches in silico (modélisation numérique) sont d’abord mises en œuvre afin de sélectionner les candidats les plus pertinents. Ces candidats sont ensuite évalués par des méthodes in vitro (tests de liaison, de spécificité, de stabilité et de métabolisme sur systèmes cellulaires ou biochimiques) et, lorsque cela est possible, par des approches ex vivo. Ces étapes permettent un remplacement partiel de l’expérimentation animale et conduisent à l’élimination précoce des radiotraceurs ne répondant pas aux critères requis. La validation in vivo chez le rongeur constitue une étape intermédiaire indispensable pour étudier la biodistribution, la pharmacocinétique et le signal d’imagerie dans un organisme vivant. Toutefois, pour certains ligands à visée clinique, les données obtenues chez le rongeur ne permettent pas d’obtenir des résultats suffisants, notamment en raison de différences physiologiques, anatomiques et métaboliques limitant la transposabilité à l’homme. Dans ces situations spécifiques, l’évaluation chez le primate non humain devient nécessaire afin de se rapprocher au plus près des conditions cliniques humaines. À ce stade du développement, il n’existe pas d’alternative complète permettant de reproduire de manière intégrée l’ensemble des paramètres requis (biodistribution, métabolisme, cinétique du radiotraceur, passage de barrières biologiques et signal d’imagerie). Ces phénomènes ne peuvent pas être modélisés de façon fiable par des méthodes in silico, in vitro ou ex vivo seules. Seuls les radiotraceurs pour lesquels l’ensemble des approches alternatives et des modèles de rongeurs s’est révélé insuffisant sont testés chez le primate non humain, ce qui permet de limiter strictement le nombre d’animaux utilisés. L’imagerie TEP, méthode non invasive, autorise par ailleurs des études longitudinales chez un même animal, contribuant au raffinement des procédures et à la réduction globale de l’utilisation d’animaux.
Réduction
L’imagerie TEP est une technique d’imagerie peu invasive, ce qui permet de répéter l’examen chez le même animal, réduisant ainsi le nombre d’animaux. Les examens d’imagerie étant très bien tolérés par les animaux, nous faisons le choix de réduire le nombre d’animaux dans cette demande d’autorisation de projet et d’augmenter les répétitions. Si certaines informations sont déjà connues dans la littérature, ces expériences ne seront pas répétées.
Raffinement
L’examen se déroule sous anesthésie générale. Une assistance respiratoire est appliquée en cas d’arrêt respiratoire. Pendant l’examen, les paramètres physiologiques, tels que le rythme cardiaque, la pression artérielle et la fréquence respiratoire sont utilisés comme indicateurs pour adapter la profondeur de l’anesthésie. Avant chaque protocole, le taux d’hémoglobine est mesuré pour chaque primate non humain au début, et pendant toute la durée de la procédure. Pendant les examens, les animaux sont hydratés. Des points limites ont été identifié conduisant à l’arrêt de l’imagerie, suivi par le réveil, et une phase de récupération puis reprise normale du protocole ou prolongement période de repos.
Choix des espèces
Le primate non humain permet par sa taille d’effectuer des prélèvements sanguins simultanément à l’acquisition des images TEP, contrairement au rongeur. Ce projet utilise des jeune adulte d’au moins 5 ans pour assurer que : - le volume sanguin permette les prélèvements nécessaires, - la taille des veines/artères permette facilement la pose de cathéters. Chez l’homme, le prélèvement sanguin artériel demande une logistique hospitalière importante, et est difficile voire impossible à mettre en œuvre chez certains patients. L’utilisation du primate non humain se justifie par la ressemblance anatomique et fonctionnelle du cerveau par rapport à celui de l’homme. La taille et la structure du cerveau permettent des analyses anatomiques et fonctionnelles strictement comparables à celles réalisées dans les mêmes conditions chez les patients. L’utilisation du primate non humain se justifie par le fait que les études pharmacologiques ne sont souvent pas autorisées chez l’homme, car les pharmaceutiques utilisés dans ces études ne disposent pas toujours d’une autorisation de mise sur marché (AMM). Jeune adulte d’au moins 5 ans pour assurer que: - le volume sanguin permette les prélèvements nécessaires pour la mesure temporelle de la concentration sanguine du radioligand, - la taille des veines/artères permette facilement la pose de cathéters.
Étude la biodistribution de 3 vecteurs de thérapie génique (AAV9) destinés à réduire la progression de la maladie de Huntington après administration intracérébroventriculaire.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Une injection dans le cerveau sous anesthésie, une heure d'intervention, puis vingt-neuf jours avant la mise à mort, neuf macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois vecteurs de thérapie génique contre la maladie de Huntington sont testés, à raison de trois animaux par vecteur, l'enjeu déclaré étant de déterminer lequel atteint le mieux sa cible dans le cerveau. Le porteur indique que l'administration intracérébrale peut provoquer un saignement dans le cerveau et des troubles de la locomotion, et les neuf animaux sont tués à l'issue pour prélever leurs organes. Il justifie l'emploi de jeunes adultes par la volonté d'écarter les anomalies liées au vieillissement, et écrit que les similitudes entre cerveaux de macaques et cerveaux humains rendent cet emploi "indispensable".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de caractériser le suivi dans le corps de candidats médicaments innovants développés pour le traitement de la maladie d’Huntington après administration dans le cerveau. Huntington est une maladie qui affecte les fonctions motrices et entraine une détérioration physique et mentale chez l'Homme. Il n'existe actuellement aucun traitement sur le marché permettant de la soigner, de retarder son apparition ou de ralentir sa progression. Les candidats médicaments testés visent à corriger la cause sous-jacente de la maladie et non traiter ses symptômes. Cette étude permettra de sélectionner le médicament qui atteignera le mieux sa cible après administration.
Bénéfices attendus
En cas de succès, l’administration unique de ce médicament, au plus proche de sa cible (directement dans le cerveau) permettra d’induire un ralentissement significatif de la progression de la maladie.
Procédures
Après plus de trois semaines d’acclimatation et d’habitation, les 9 animaux inclus dans le projet recevront une injection du candidat médicament dans le cerveau sous anesthésie et analgésie (après mise à jeun inférieure à 16h). L’intervention durera environ 1h. Des prélèvements de sang seront réalisés avant et après administration sur animal vigile (3 prélèvements sanguins par animal seront réalisés sur une période de 29 jours). Le temps de contention nécessaire à la réalisation de ces prélèvements est compris entre 3 et 5 minutes. Le suivi des paramètres physiologiques (poids, température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Une pesée par semaine par animal sera réalisée. La température corporelle sera mesurée 1x/jour 3 jours avant administration, 2x/jour le jour de l’administration et 1x/jour durant 3 jours après l’administration. Le projet prendra fin 29 jours après l’administration du candidat médicament et les 9 animaux impliqués seront mis à mort sous anesthésie afin de récolter leurs organes.
Impact sur les animaux
L’administration dans le cerveau pourra provoquer une douleur modérée avec des risques neurologiques (saignement dans le cerveau, trouble de la locomotion…) et/ou l'apparition de réactions locales au niveau de la plaie chirurgicale (du type hématome, gonflement, saignement léger, infection par exemple). Durant les administrations, les animaux seront anesthésiés, ce qui pourra engendrer un stress ou une sensation d’inconfort lié à la mise à jeun (inférieure à 16h), à la procédure d’induction (contention, administration, perte de conscience…) ou lié au réveil de l’animal (risque de vomissement, perte d’équilibre…). Les prélèvements de sang pourront provoquer un stress léger, une douleur légère et/ou l’apparition de réactions locales (du type hématome léger). Les pesées et les mesures de température rectale peuvent également engendrer un stress léger chez les animaux.
Devenir
Les 9 animaux utilisés dans le cadre de ce projet seront mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter leurs organes pour déterminer la biodistribution des candidats médicaments testés.
Remplacement
Les études permettant de déterminer le suivi des candidats médicaments dans le corps sont indispensables au développement de nouvelles thérapies. En effet, celles-ci permettent de déterminer sa localisation dans les différents tissus après administration. Cette étude dépend d’un grand nombre de facteurs qui interagissent en temps réel dans un organisme vivant et complexe (ex : échanges entre les tissus, barrières biologiques…). Seul un organisme complet, où tous les organes sont en interaction constante permet de répondre aux objectifs scientifiques du projet. Ceci ne pourrait être obtenu en culture cellulaire et justifie le recours à des animaux.
Réduction
9 primates répartis en 3 groupes seront utilisés dans ce projet. 3 médicaments seront testées, chacun sur 3 animaux. 3 animaux seront utilisés par groupes car, en plus de pouvoir détecter une tendance dans le groupe, ce nombre permet de déceler toute valeur extrême, ce qui est un paramètre critique pour l’interprétation des résultats scientifiques du projet. Cette étude n’étant pas règlementaire, elle ne nécessite pas de réaliser des tests statistiques sur de grandes cohortes d’animaux.
Raffinement
Un programme d'enrichissement complet sera mis en place au sein de l'animalerie comprenant des enrichissements structuraux permettant aux primates d'évoluer dans un environnement tridimensionnel, de la litière pour leur permettre de fourrager, des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent, des friandises et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs). De la musique d'ambiance/des documentaires/dessins animés seront diffusés pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation de plus de 3 semaines sera mise en place avant le début de l’étude incluant un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif. Elle permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (prise de température rectale, pesée, prises de sang). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l’étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. Un suivi spécifique neurologique sera également mis en place. Pour limiter le stress et l’ennui lié aux actes techniques, le personnel veillera à interagir avec les animaux en gardant une interaction quotidienne avec chaque animal. L'administration des médicaments dans le cerveau sera réalisée sous anesthésie et anti-douleurs. Des antibiotiques et des anti-inflammatoires seront également utilisés pour le confort des animaux. Les prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile afin d’éviter les modifications physiologiques de l’animal et le stress, engendrés par une anesthésie, ainsi qu’un risque plus important pour l’animal que la procédure elle-même. Des points limites seront mis en place afin de détecter précocement tout signe de stress ou de douleur. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire. L’arrêt du protocole sera envisagé si l’état de l’animal se dégrade (sous la responsabilité du vétérinaire).
Choix des espèces
Les primates constituent un modèle animal de référence pour déterminer le suivi de candidats médicaments dans le système nerveux avant les essais cliniques chez l’Homme. En effet, il est admis que les primates présentent de nombreuses similitudes avec l’Homme que l'on ne retrouve pas dans d'autres modèles animaux, par exemple une grande homologie d'ADN, de grandes similitudes entre les cerveaux de primates et les cerveaux humains contrairement aux cerveaux de rongeurs. Cette espèce apporte donc les meilleures données transposables à l’Homme. L’ensemble de ces similitudes avec l’Homme rend son emploi indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. De jeunes animaux seront utilisés dans ce projet. Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter le système nerveux, ce qui pourrait interférer avec les résultats scientifiques de l’étude et la qualité des échantillons prélevés. Leur organisme a atteint la maturité mais ne subit pas encore les variations liées au vieillissement. Il est donc préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge.
Étude du rôle et du potentiel thérapeutique de cellules immunitaires anti-inflammatoires dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer et des Tauopathies
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Immobilisées éveillées pour recevoir sept à douze injections sur trois à six mois, puis saignées cinq à sept fois, 1 245 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles portent une maladie neurodégénérative qui installe des déficits cognitifs et peut les rendre agressives avec l'âge, jusqu'aux bagarres et aux blessures. L'objectif déclaré est de tester une immunothérapie ciblant des cellules immunitaires périphériques dans la maladie d'Alzheimer et les tauopathies. Une partie des souris passe des tests comportementaux dont la nature n'est pas précisée, et une autre partie est tuée en fin de période reproductive sans qu'aucun prélèvement soit réalisé.
Objectifs
L'implication de l'immunité dans les troubles neurodégénératifs est un domaine qui émerge fortement et qui est désormais considéré comme une voie très prometteuse pour le développement d'immunothérapies innovantes modifiant la progression de ces pathologies, en particulier dans la maladie d'Alzheimer (MA) et les autres maladies d’accumulation de la protéine tau, les Tauopathies. Outre cette inflammation locale, des preuves de plus en plus nombreuses mettent aujourd'hui en évidence un rôle des acteurs périphériques du système immunitaire dans la pathophysiologie de la MA et des tauopathies. Des résultats préliminaires suggèrent fortement une réactivité de ces cellules en réponse à l’accumulation de protéines Tau pathogènes. Le projet a ainsi pour objectif de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant certains acteurs périphériques du système immunitaire, afin de contrôler leur activité et moduler les mécanismes d’inflammation cérébrale qui contribuent à l’émergence des processus neurodégénératifs.
Bénéfices attendus
La Maladie d’Alzheimer (MA) a un impact considérable sur le secteur de la santé et le secteur médico-social, en raison du coût important de la prise en charge et de la prévalence élevée de cette maladie, qui touche environ 7 millions de personnes en Europe. Avec le vieillissement de la population, le nombre de personnes concernées par cette forme de démence ainsi que d’autres maladies neurodégénératives va largement augmenter. La prise en charge de ces patients constitue aujourd’hui un coût de plus de 20 milliards d'euros par an pour la France. Aucune thérapie actuelle ne parvient à enrayer significativement cette pathologie, qui conduit à une destruction irréversible des neurones. Nous pensons qu’il y a un réel intérêt à développer cette nouvelle stratégie thérapeutique pour les maladies neurodégénératives. Cette approche se différencie des autres stratégies d’immunothérapie actuellement testées en clinique, qui visent à induire l’élimination active des dépôts protéiques pathogènes. Notre approche cherche à moduler l’inflammation cérébrale associée à la réactivité contre ces protéines pathogènes. Ces études devraient ouvrir la voie au développement de nouveaux essais cliniques thérapeutiques dans la MA et dans d’autres maladies neurodégénératives, dans le but de proposer une prise en charge plus efficace aux nombreux patients touchés par ces maladies.
Procédures
Les souris utilisées dans le projet développent une maladie neurodégénérative avec des déficits cognitifs au cours du temps. Cela pourrait entrainer des troubles du comportement et potentiellement une agressivité accrue avec l’âge source de bagarre et donc de blessures ou lésions potentielles (rare). Les traitements seront administrés par injection répétées à partir de l’âge jeune adulte ou adulte pour une période de 3 à 6 mois, à raison d’une injection toutes les 2 semaines (7 à 12 injections totales). Ces injections sont effectuées sur animal vigile (éveillé) immobilisé dans un système de contention adapté et ne durent que quelques secondes par animal (moins de 30 secondes). Des prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile tous les mois sur la durée du traitement (environ 30 secondes à 1 minute par prélèvement). Les animaux seront prélevés entre 5 et 7 fois sur la durée du traitement (période de 6 mois). Une partie des animaux sera soumise à des tests comportementaux pour évaluer l’effet thérapeutique des traitements proposés, en étudiant leur impact sur les fonctions cognitives. Ces tests comportementaux durent entre 5 et 20 minutes chacun ; certains ne sont effectués qu’une seule fois, d’autres sont répétés tous les jours pendant 5 jours. Les souris seront habituées au lieu d’évaluation au préalable et auront un repos de 24h minimum entre chaque test. Enfin, les animaux seront euthanasiés selon différentes méthodes réglementaires à l’issue de la période de thérapie prévue, afin de réaliser des prélèvements pour des analyses complémentaires.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées dans le projet développent une maladie neurodégénérative avec des déficits cognitifs au cours du temps. Cela pourrait entrainer des troubles du comportement et potentiellement une agressivité accrue avec l’âge source de bagarre et donc de blessures ou lésions potentielles (rare). Les traitements mis en œuvre impliquent des injections répétées au cours du temps ainsi que des prélèvements sanguins. Ces actes peuvent être source de stress et de douleur de courte durée avec un risque d’hématome ou de saignement. Les tests de comportement réalisés sur une partie des animaux pourront générer du stress et ou de l’angoisse en raison de la néophobie du modèle rongeur. Enfin, l’anesthésie précédant l’euthanasie des animaux pour les prélèvements implique une injection pouvant induire un stress en raison de la contention et une douleur de courte durée liée à la piqûre.
Devenir
A l’issue des procédures, les animaux seront tous euthanasiés par des méthodes réglementaires. Une première partie dans le cadre du maintien des lignées sera euthanasiée en fin de période reproductive sans réalisation de prélèvement. Une seconde partie sera euthanasiée afin de prélever les organes pour réaliser différentes analyses biologiques. Ces analyses permettront d’évaluer l’impact biologique des différents traitements, en utilisant les différents marqueurs de progression de la pathologie.
Remplacement
L’ensemble de ce projet vise à développer des stratégies thérapeutiques innovantes et jamais testées dans le cadre des maladies neurodégénératives. Il est donc indispensable d’avoir recours à un modèle expérimental in vivo chez la souris pour appréhender l’efficacité thérapeutique des traitements envisagés. Ces études ne peuvent être en aucun cas remplacées par des modèles in silico ou in vitro. Au préalable, des études in vitro ont permis de valider les propriétés régulatrices des cellules d’intérêt. Cependant, ce projet vise à mettre en évidence le rôle de certaines cellules dans un modèle de la Maladie d’Alzheimer et son impact sur la pathologie. L’évaluation de l’impact et du potentiel thérapeutique nécessite des évaluations comportementales sur animal vigile, qui ne peuvent donc pas être remplacées par des analyses in vitro. Cette stratégie s’inscrit dans un principe de remplacement, en limitant les tests in vivo autant que faire se peut.
Réduction
Le projet impliquera un total de 1245 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et inter-groupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Les souris utilisées pour une partie des analyses biologiques seront les mêmes animaux que ceux utilisés pour les tests comportementaux. Par ailleurs, une analyse statistique sera réalisée et nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
Les procédures de ce projet ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats, tout en respectant le bien-être animal, et en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau à volonté. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou d’enrichissement des lanières de peuplier compactées permettant de faire un nid très volumineux. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, soins, suivi). La lignée utilisée est déjà bien caractérisée et connue de l’équipe, et les actes mis en œuvre sont parfaitement maitrisés par le personnel et adaptés au modèle animal. Pour les stades les plus tardifs d’utilisation des animaux (plus de 500 jours), nous mettons en place un étiquetage spécifique associé à une alimentation directement dans la cage afin de faciliter l’accès et un enrichissement avec des lanières de peuplier compactées permettant de faire un nid très volumineux en complément pour éviter toute baisse de la température corporelle. Les administrations ou prélèvements seront effectués avec un matériel adapté et le plus petit possible. Les traitements seront administrés à l’aide d’un système permettant d’immobiliser l’animal sans douleur.
Choix des espèces
Justification de l’espèce : La souris est une espèce largement caractérisée et validée pour l’étude des réponses immunitaires. Il s’agit également d’une espèce chez laquelle ont été développés de nombreux modèles expérimentaux dont notamment des pathologies neurodégénératives. Justification des stades de développement : Dans le cadre de ce projet, les souris seront utilisées soit à partir de l’âge de 3 mois, correspondant au stade précoce de la pathologie, soit à l’âge de 9 mois ou 11-12 mois, stades où les troubles cognitifs sont observés selon le sexe, et jusqu’à 24 mois au plus tard pour évaluer le développement tardif de la pathologie.