Troubles nerveux

À 11 semaines commencent les tests, répétés toutes les cinq semaines pendant dix mois : réflexes visuels sur écrans, imagerie de l'œil, équilibre sur barre rotative, force de préhension sur grille, activité en cage individuelle, suspension par la queue. 48 souris porteuses d'une mutation reproduisant une maladie neurodégénérative infantile sont utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À partir de huit mois elles perdent la vue et la capacité de se déplacer, et le porteur arrête le protocole à dix mois, âge auquel il indique que les animaux deviennent trop atteints pour passer les tests. Toutes sont tuées pour prélever les tissus.

Objectifs

Ce projet porte sur l’étude d’une maladie rare et grave du cerveau qui touche de jeunes enfants. Les enfants atteints commencent à perdre leurs capacités motrices (comme marcher ou tenir des objets), leurs capacités visuelles, puis leurs capacités intellectuelles, dès l’âge de deux ans. Ils décèdent souvent avant l’âge de dix ans, car il n’existe pas encore de traitement pour traiter cette maladie. La maladie est causée par une modification d'un gène, qui fabrique une protéine entrant dans la composition du lysosome, un organite qui évacue les déchets des cellules. Quand ce système ne fonctionne plus, des déchets s’accumulent dans les cellules, ce qui les abîme, en particulier dans le cerveau. Pour mieux comprendre comment cette maladie évolue et pourquoi elle provoque ces dégâts, nous voulons étudier une souris porteuse d’une version similaire de la maladie. Cette souris, encore jamais décrite dans les publications scientifiques, présente les mêmes symptômes que les enfants malades : elle perd peu à peu ses capacités à bouger, ses capacités visuelles et ses capacités cognitives et nerveuses, puis meurt prématurément. Nous allons notamment observer son comportement et sa vision, afin de mieux comprendre le développement de la maladie. Les tests réalisés seront : une évaluation des réflexes visuels à l’aide d’écrans, un test ophtalmique avec une imagerie de l’œil, un test d’équilibre avec une barre rotative, un test de force et de préhension à l’aide d’une grille, une observation de l’activité dans une cage individuelle et un test neurologique par suspension par la queue. Ce travail fait suite à une première étude qui s’était intéressée à ce qui se passe dans les cellules et qui avait commencé à tester une première piste de traitement en laboratoire.

Bénéfices attendus

Cette étude va nous aider à mieux comprendre cette maladie rare (la céroïde lipofuscinose neuronale de type 7) chez la souris. Après avoir testé en laboratoire un traitement Invitro (sur des cellules porteuses de cette maladie), nous voulons maintenant observer comment les symptômes apparaissent et évoluent chez les animaux. Cela nous aidera à savoir à quel moment il serait le plus efficace de commencer un traitement.

Procédures

Les animaux seront soumis à une batterie de tests de comportement et de vision non invasif durant 10 mois. Une série de tests s’étalant sur deux semaines sera répété toutes les 5 semaines afin d’évaluer la progression de la maladie. La série de tests est adaptée, au cours du temps, à la progression attendue de la maladie. Un test de vision sera effectué une fois à l'âge de 20 semaines nécessitant une anesthésie par injection et l'application d'un collyre afin de dilater la pupille. Les tests comportementaux que subiront les animaux sont : un test d'évaluation de la vision (20 min, 2 fois), un test de force (15 min, 5 fois), un test de coordination (15 min, 4 fois), un test neurologique (1 min, 5 fois), un test d'activité (2h, 5 fois). Lorsque plusieurs tests sont prévus la même semaine, un temps de repos d’un minimum de 24 heures entre les tests sera prévu afin de permettre à l’animal de récupérer et d’obtenir des résultats fiables. MODIFICATION: Une biopsie d’oreille (ear punch) sera pratiquée à l’aide d’un puncher (outil adapté et spécifiquement conçu pour cette opération). Cette biopsie est nécessaire afin de vérifier le génotypage (caractérisation génétique) des animaux du projet.

Impact sur les animaux

L'accumulation des tests de comportement pourrait induire un stress léger. Un léger stress des animaux pourra résulter de l'anesthésie ainsi que des deux injections nécessaires à celle-ci. MODIFICATION: La biopsie d'oreille est réalisé sur animal vigile et peut produire une douleur. Le geste est rapide et ne produit pas de douleur persistante.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus pour des analyses histologiques.

Remplacement

Une première étude a été réalisée sur des cellules de souris de la lipofuscinose céroide neuronale de type 7 pour étudier cette maladie et tester une possibilité de traitement. Cependant, l'étude présente a pour objectif l'observation des modifications du comportement, l'apparition de symptômes, ne peuvent être réalisé que sur un organisme complet. Le modèle murin est idéal pour étudier l’impact d'une maladie neurodégénérative chez les mammifères en raison de leur similarité biologique avec l’humain et de leur développement rapide.

Réduction

L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 12 par groupe constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction du nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Dans le cadre des procédures expérimentales, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress des animaux. Un suivi régulier de leur état général sera mis en place pour garantir leur bonne santé. Si la surveillance générale (apparence, comportement, posture, présence de vocalisation) indique un changement pouvant impacter la santé de l’animal, une surveillance rapprochée comportant un tableau de suivi sera mise en place. Notre étude étant réalisé sur des animaux développant un phénotype dommageable à partir de 8 mois, un tableau de suivi sera mis en place à ce moment pour tous les animaux. Ce tableau établit un score sur base de paramètre tel que la perte de poids, l'apparence physique, le comportement à distance et le comportement à la manipulation. Selon les résultats des scores, les animaux pourront être retirés de l'étude voir être euthanasiés selon l'état d'avancement des symptômes observés. Par ailleurs, nous nous engageons à offrir les meilleures conditions d'hébergement possibles, avec un enrichissement adéquat. Les animaux disposeront sans limitation de nourriture, boisson et d'un milieu enrichi. Des soins locaux seront administrés à tout animal blessé. Si une douleur est présente, un antalgique pourra être administré selon les recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

L'utilisation de la souris comme modèle d'étude est particulièrement pertinente en raison de sa similitude génétique avec l'humain, de la possibilité de manipulations génétiques précises et de son utilisation largement validée dans la recherche sur les maladies neurodégénérative telle que celle de ce projet mais aussi Alzheimer par exemple. Le modèle murin de lipofuscinose céroïde neuronale avec lequel nous avons choisi de travailler récapitule assez bien les phénotypes observés dans la pathologie humaine. Les symptômes de la maladie (baisse de la vision, paralysie progressive) apparaissent tout le long de la vie de l'animal jusqu'à 11 mois d'âge, âge auquel les animaux sont trop atteints pour les tests expérimentaux. L'étude commencera à 11 semaines d'âge, âge auquel les animaux ont une taille suffisante pour passer les tests de comportement. Elle se prolongera jusqu'à 10 mois car l'apparition des symptômes de paralysie commencent vers 8 mois et se terminera à 10 mois soit avant que les symptômes ne soient trop importants pour le bien-être des animaux.

56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie du cerveau de deux à deux heures et demie sous anesthésie, des périodes d'isolement, des enregistrements de sommeil de vingt-quatre heures et des tests de mémoire spatiale. Le modèle vise à voir si l'activation d'un type de neurones de l'hippocampe améliore la mémoire dans une forme de maladie d'Alzheimer reproduite chez la souris. Les bénéfices, repérer plus tôt les dysfonctionnements cérébraux et ouvrir des pistes thérapeutiques, sont renvoyés au long terme.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer entraîne une détérioration progressive de la mémoire et d’autres fonctions du cerveau. Avant même l’apparition de lésions importantes, le fonctionnement des réseaux de neurones peut déjà être perturbé. Mieux comprendre ces changements précoces est important, car ils pourraient expliquer une partie des troubles de la mémoire observés au début de la maladie. Ce projet cherche à comprendre le rôle d’un type particulier de cellules du cerveau qui participent au bon contrôle de l’activité nerveuse. Ces cellules sont connues pour être importantes dans l’organisation de l’activité cérébrale et dans certaines fonctions cognitives, notamment la mémoire. Des travaux antérieurs suggèrent que leur fonctionnement est altéré dans la maladie d’Alzheimer, ce qui pourrait contribuer aux troubles observés. L’objectif du projet est donc de déterminer si l’activation ciblée de ces cellules peut améliorer le fonctionnement global du cerveau et les performances de mémoire dans un modèle murin de la maladie. En parallèle, le projet cherchera à identifier des modifications de l’activité cérébrale associées aux premiers stades de la maladie, afin de mieux comprendre comment apparaissent les dysfonctionnements. Plus largement, ce travail permettra d’améliorer les connaissances sur les mécanismes précoces de la maladie d’Alzheimer. À plus long terme, il pourrait contribuer à identifier de nouvelles pistes pour repérer plus tôt certaines anomalies du fonctionnement cérébral et, à terme, orienter le développement de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes précoces impliqués dans les troubles de la mémoire au cours de la maladie d’Alzheimer. Il pourrait aider à identifier certaines modifications de l’activité cérébrale associées aux premiers stades de la maladie. À plus long terme, ces travaux pourront contribuer à faire émerger de nouvelles pistes pour repérer plus tôt certains dysfonctionnements cérébraux et, à terme, orienter le développement de nouvelles approches thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale réalisée sous anesthésie générale à l’âge de 5 à 8 mois d’une durée d’environ 2h à 2h30. Ils seront isolés le temps du réveil de la chirurgie (maximum 12h), entre les phases d’acquisition et de rétention des tâches mnésiques (3h de délai, pendant lequel l’activité cérébrale est enregistrée) et la tâche d’association place-objet (5 min de délai). De la même manière, des enregistrements de sommeil de 24 ± 1h seront répétés 2 fois entre les sessions de comportement. Enfin les souris sont soumises à des tests comportementaux afin d’évaluer leur mémoire spatiale (3x10 mins sur 2 jours par animal pour le test de localisation d’objet et 20 minutes pour le test d’association place/objet).

Impact sur les animaux

L’anesthésie générale peut provoquer un stress transitoire lié à son caractère aversif. L’intervention chirurgicale peut entraîner une douleur modérée ainsi qu’une altération temporaire de l’état général dans les jours qui suivent. Des difficultés de cicatrisation ou, plus rarement, une infection au niveau de la plaie peuvent également survenir. Enfin, les périodes d’hébergement individuel nécessaires à certaines étapes de l’étude peuvent être une source de stress pour les animaux.

Devenir

Les souris seront mises à mort pour réaliser des prélèvements de tissus et effectuer des observations anatomiques et histologiques nécessaires à la validation scientifique de ce projet.

Remplacement

Ce projet vise à établir un lien causal entre le remodelage des neurones PV, l’amélioration des performances mnésiques et le rétablissement de dynamiques électriques cérébrales globales chez des souris modèles de la maladie d’Alzheimer (MA). Une telle démonstration causale, couplant manipulation neuronale spécifique, enregistrements et évaluation comportementale, n’est pas réalisable chez l’humain, en particulier aux stades précoces. Les modèles murins génétiques permettent au contraire de sélectionner des animaux à un âge défini (ici 5 à 8 mois), correspondant chez le modèle utilisé à un stade avec troubles de la mémoire spatiale en l’absence de dépôts amyloïdes détectables selon nos critères. Enfin, l’étude de dynamiques cérébrales globales associées à des comportements complexes requiert un cerveau intact et ne peut pas être menée in vitro ; elle doit donc être réalisée chez l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au minimum compatible avec les objectifs scientifiques du projet. Le protocole repose sur un suivi des mêmes animaux à différentes étapes de l’étude, ce qui permet de limiter le nombre total d’animaux nécessaires tout en augmentant la robustesse des comparaisons. Tous les animaux inclus contribuent à plusieurs volets du projet, avec l’enregistrement de l’activité cérébrale, l’évaluation de la mémoire et les analyses finales sur les tissus. Cette organisation permet d’éviter la constitution de cohortes supplémentaires. Le nombre d’animaux prévu tient également compte d’un risque limité d’exclusion, par exemple en cas de qualité insuffisante des enregistrements, de ciblage insuffisant de l’intervention ou de complication après la chirurgie. L’effectif retenu vise donc à obtenir un nombre suffisant de données exploitables sans avoir à recommencer une expérimentation complémentaire.

Raffinement

Plusieurs mesures sont mises en place pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux tout au long du projet. L’intervention est réalisée sous anesthésie générale, avec une prise en charge adaptée de la douleur avant, pendant et après la chirurgie. Les animaux bénéficient d’une surveillance rapprochée après l’intervention, avec une attention particulière portée à leur état général, à la cicatrisation et à la reprise de l’alimentation. Les conditions de maintien sont également adaptées pour limiter le stress : période d’acclimatation avant le début des expériences, familiarisation progressive à la manipulation, au transport et au dispositif d’enregistrement, hébergement en groupe en dehors des phases où un isolement temporaire est nécessaire, et présence de matériel permettant le nid et l’enrichissement du milieu de vie. Des points limites précoces ont été définis afin qu’un animal en difficulté puisse être pris en charge rapidement ou retiré de l’étude si nécessaire.

Choix des espèces

La souris a été choisie car elle constitue un modèle de référence pour l’étude des maladies neurodégénératives et du fonctionnement de la mémoire. Son cerveau présente une organisation générale compatible avec l’étude des circuits impliqués dans la mémoire, ce qui permet d’explorer des mécanismes difficilement accessibles chez l’humain. Les animaux seront étudiés à l’âge adulte, à un stade correspondant à l’apparition de troubles de la mémoire dans le modèle utilisé. Ce choix est important pour analyser les changements précoces du fonctionnement cérébral, avant l’installation de lésions plus avancées, et pour étudier des mécanismes susceptibles de jouer un rôle au début de la maladie.

2 366 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune soumise à quatre tests de mémoire, à des injections et parfois à l'ablation des glandes génitales. Nourries douze à quinze semaines d'un régime obésogène dès le sevrage, une partie subit une ou deux chirurgies sous anesthésie, puis une imagerie de la masse grasse en fin d'expérience. Le projet vise à comprendre le rôle des hormones sexuelles dans les troubles de mémoire liés à l'obésité, chez les mâles comme chez les femelles. Les stratégies thérapeutiques évoquées restent lointaines, quand la stérilisation et la mise à mort des 2 366 individus sont, elles, programmées.

Objectifs

L'obésité, en tant que défi de santé publique, réduit l'espérance de vie en raison des pathologies qu'elle favorise (hypertension, cancers, diabètes, etc.). Elle est également associée à des troubles de la mémoire, ce qui est particulièrement préoccupant durant l’enfance et l’adolescence, des périodes clés pour la maturation de structures cérébrales essentielles à la mémoire. Chez la souris, la consommation d'une nourriture riche en lipides pendant l'adolescence, en plus d'entrainer une prise de poids excessive, altère les capacités de mémoire en impliquant des mécanismes spécifiques dans certaines régions du cerveau. La majorité des travaux scientifiques ont été réalisés chez des mâles, alors que, chez l’humain, l’obésité touche de manière comparable les deux sexes. Afin de mieux transposer ces résultats, des études ont également été menées chez des femelles. Comme chez les mâles, la nourriture riche en lipides, à l’adolescence, a des effets négatifs sur la mémoire. Toutefois, les mécanismes impliqués semblent différer selon le sexe. L’objectif de ce projet est donc d’identifier le rôle des hormones sexuelles dans les altérations de la mémoire induites par un régime riche en lipides, chez les mâles comme chez les femelles.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet devrait produire des données expérimentales sur l'évaluation de la mémoire dans différentes conditions expérimentales (régime, age, sexe, traitement) chez la souris. Les résultats issus de ce projet devraient être accessibles à moyen terme, à l’issue de l’analyse complète des données et de leur diffusion via des publications scientifiques et des communications dans des congrès spécialisés. Et à plus long terme, ces expériences devraient permettre une meilleure compréhension des mécanismes à la base des effets délétères d'une nourriture hyperlipidique sur le cerveau et la mémoire en fonction du sexe et le rôle des hormones sexuelles, afin d'envisager potentiellement des stratégies thérapeutiques, puisque le surpoids concerne 47 % des français adultes et 17% des français souffrent d'obésité.

Procédures

Tous les animaux subiront, à au moins 48h d’intervalle, quatre tests comportementaux afin d'évaluer leur mémoire. Chaque étape de ces tests dure 10 minutes. Une partie des animaux subira lors de ces tests comportemantaux des injections périphériques ou locales. Une partie des animaux subira une fois un jeune de 5h préalablement aux mesures métaboliques (7 prélèvements sanguins sur une durée de 2 h). Une partie des animaux subira une ou deux interventions chirurgicales réalisées sous anesthésie gazeuse et en présence d'antalgique et d'anti-inflammatoire. Ces interventions durent entre 20 et 45 minutes avec une phase de réveil entre 5 et 20 minutes. Tous les animaux subiront en fin d’expérimentation, une seule analyse en imagerie d’une durée de 2 min afin d’évaluer la répartition de leur masse grasse/masse maigre et un seul prélèvement sanguin.

Impact sur les animaux

L’alimentation obésogène donnée pendant 12 à 15 semaines entraîne un surpoids qui reste non délétère chez des animaux jeunes comme ceux utilisés dans notre étude. Outre la sterilité induite par le retrait des glandes génitales, il n'y a que peu d’effets secondaires notables. Les tests de comportement, ainsi que les injections peuvent induire un stress qui sera limité par une habituation à la manipulation et à l'injection avant expérimentation et limitée par la maitrise des expérimentateurs. Les prélèvements durant le test de tolérance au glucose pourront engendrer une légère douleur aux animaux. Les chirurgies pourraient entraîner dans les 48h suivant l’opération une douleur et un stress se traduisant par une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en vue de récupérer leurs cerveaux pour des analyses post mortem.

Remplacement

L’étude intégrée des effets de la nutrition sur des aspects comportementaux et du fonctionnement cérébral est permise grâce à l’utilisation du modèle de rongeur soumis à de la nourriture obésogène et il n’est pas possible de le remplacer par des approches cellulaires sur des modèles in vitro ou in silico.

Réduction

Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux en effectuant plusieurs tests comportementaux chez les mêmes individus plutôt que des groupes différents. De plus, le nombre d’animaux sera réduit au mieux pour obtenir des résultats concluants lors de nos comparaisons statistiques. Pour réduire le nombre d’animaux transgéniques produits, les besoins expérimentaux seront planifiés et les stratégies de croisement optimisées par l'utilisation de reproducteurs génotypés. Cela représente un total de 2366 animaux (1183 males et 1183 femelles) sur 5 ans.

Raffinement

Des critères objectifs d’arrêt des souffrances des animaux sont définis afin d’encadrer de manière objective et graduée les décisions visant à prévenir toute souffrance excessive. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec administration d’antalgiques en pré-, péri et post-opératoire pour limiter la douleur. Toutes les précautions d'asepsie et de confort seront prises pour limiter l'inconfort des animaux. Les jours suivant la chirurgie, les animaux sont surveillés attentivement une fois par jour pour s’assurer de leur bon rétablissement. Avec la mise en place de points limites, si un animal présente une anomalie il sera immédiatement isolé, surveillé et soigné pendant 3 jours jusqu’à amélioration. Si il n'y a pas d'amélioration et après avis de la cellule bien être et de l'avis du vétérinaire désigné, les animaux seront mis à mort. Si il y amélioration et durant les mois suivant la chirurgie, les animaux seront pesés 1 fois par semaine et un suivi avec des critères objectifs est mis en place. S’il n’y a aucun signe de mal-être chez l’animal, il passera en phase comportementale, qui sera optimisée pour durer le moins de temps possible. Une période d’habituation des souris à l'expérimentateur sera mise en place avant les taches comportementales afin de réduire le stress lié aux manipulations et aux procédures, contribuant ainsi à améliorer leur bien-être et la fiabilité des données recueillies. Les souris seront remises avec leurs congénères entre chaque phase de test. Les injections pharmacologiques seront réalisées de sorte à limiter les interventions sur l’animal.

Choix des espèces

L'espèce animale utilisée dans ce projet est la souris. Ce choix s’explique par la possibilité de modifier de façon précise le fonctionnement de certains éléments du cerveau chez cet animal. Ce sont des animaux sur lesquels les traitements nutritionnels et l'induction de l'obésité sont faciles à conduire et notre équipe dispose d’une expérience de longue date pour conduire des approches nutritionnelles chez cette espèce. Le modèle de rongeurs soumis à des régimes obésogènes permet l’étude intégrée de la nutrition sur des aspects comportementaux et de fonctionnement cérébral qu’il n’est pas possible de remplacer par des approches cellulaires. Les chirurgies et les tests comportementaux, maîtrisés sur cette espèce dans notre laboratoire, sont facilement mis en œuvre et permettent d’évaluer chez l’animal vigile les dimensions cognitives et émotionnelles, qui sont une nécessité expérimentale pour évaluer la réalité physiologique de nos résultats. Les souris seront exposées au régime hyperlipidique ou contrôle dès le sevrage (3 semaines) et pendant 12 semaines. Cette exposition commence dès le sevrage (jusqu’à l'âge adulte) afin de couvrir la période de l'adolescence. Certains animaux subiront une chirugie, une partie à l’âge de 4 semaines (pré adolescence) et une autre partie à l’âge adulte (8 semaines). Les taches comportementales seront réalisées à l'age adulte entre 15 et 18 semaines.

Exposés au fongicide in utero puis jusqu'au sevrage par l'alimentation de leur mère, à des doses dites réglementaires, 132 ratons subissent aussi six prélèvements sanguins hebdomadaires sous anesthésie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le projet cherche à savoir si ce pesticide, autorisé aux doses en vigueur, altère les barrières protectrices du cerveau en développement. Le porteur présente les nuisances des prélèvements comme légères, un stress court et une hypothermie transitoire. Tous les ratons sont tués en fin de protocole pour prélever leurs tissus.

Objectifs

Des études récentes montrent que certains pesticides, largement utilisés actuellement en agriculture pourraient poser un problème de santé publique important. Parmi les différents composés sur le marché, certains pourraient avoir une activité sur la consommation d'oxygène par les cellules. Dans le contexte du développement cérébral précoce, les barrières protectrices du cerveau nécessitent beaucoup d’énergie pour fonctionner correctement. Ainsi, l’altération de la respiration de ces barrières, provoquée par une exposition précoce au pesticide étudié est un facteur de risque méconnu de développement de pathologies cérébrales. L'objectif de cette étude est l’étude des altérations du fonctionnement des barrières protectrices du cerveau et du cerveau lui-même, provoquées par une exposition lors de la période périnatale (depuis le développement in utero jusqu'au sevrage) à un pesticides aux doses réglementaires.

Bénéfices attendus

Ce projet produira des données nouvelles et originales qui permettront aux agences réglementaires d’affiner leur analyse de risque sur la santé environnementale des populations exposées au pesticide étudié.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins hebdomadaires réalisés sous anesthésie générale. Nombre de prélèvements sanguins et durée : 6; 3 minutes chacun.

Impact sur les animaux

Les anesthésies gazeuses réalisées lors de prélèvement sanguins peuvent induire une légère hypothermie transitoire. La manipulation des animaux peut induire un stress léger de courte durée.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin du protocole afin de collecter les tissus pour analyse.

Remplacement

Le projet envisage l'étude des barrières protectrices du cerveau en lien avec une exposition expérimentale à un pesticide. Les modèles in vitro de barrières sang-cerveau ne permettent pas d’étudier l'influence globale des différentes cellules cérébrales sur la perméabilité de ces interfaces, et ne permettent pas de mimer des intoxications périnatales. Ceci implique donc le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Nous avons calculé, sur la base des effet attendus, le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet.

Raffinement

Conformément aux exigences de raffinement, les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie, et seront hébergés dans un environnement enrichi (bûchettes de bois, tunnel en plastique et éléments de nidification). Le suivi individuel consiste en une inspection visuelle du comportement et de l’apparence au quotidien. Des points limites spécifiques ont été définis et provoqueront la mise à mort des animaux si ils sont atteints. L'exposition au pesticide est réalisé par voie orale de façon naturelle via l'alimentation et sans manipulation des animaux. Les prélevement de sang sont réalisés sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Le projet sera réalisé sur des rats Sprague Dawley qui est une espèce de référence pour l'étude du neurodéveloppement. Cette lignée a des portées nombreuses. Le projet prévoit d’utiliser des ratons jusqu'au sevrage afin d’étudier l’impact d'un pesticide sur l’intégrité des barrières protectrices du cerveau au cours du développement précoce.

Opérées de l'abdomen pendant la gestation, greffées de cellules humaines chez l'embryon puis injectées dans le cerveau à la naissance ou à l'âge adulte, 1 470 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Les chirurgies durent environ une heure, suivies d'injections d'analgésique toutes les huit heures pendant vingt-quatre heures. Le projet construit un modèle dit "humanisé" de la maladie d'Alzheimer pour en étudier les mécanismes précoces, avec une ouverture affichée vers des collaborations avec des start-ups. Les bénéfices thérapeutiques sont renvoyés au long terme, quand les atteintes chirurgicales sont immédiates.

Objectifs

Le projet à caractère scientifique a pour objectif de décrypter les mécanismes conduisant aux pathologies neurodégénératives, comme la maladie d’Alzheimer (MA), et impliquant certains récepteurs cellulaires. Le rôle important de ces récepteurs dans la mémoire et les processus cognitifs, progressivement altérés lors de l’évolution de la MA est démontré. L’avantage d’un modèle de greffe de cellules humaines ou selon l’appellation de « souris humanisée » est de fournir un contexte permettant de mieux appréhender les mécanismes de la dégénérescence neuronale évolutive, à des phases bien plus précoces que celles utilisées pour le diagnostic de la maladie, c’est-à-dire ceux de l’apparition des premiers symptômes chez les patients. Les nouvelles approches d’analyses sur cellule unique permettront de mieux caractériser et comparer les mécanismes moléculaires impliqués dans les formes familiale et sporadique de la MA, qui à ce jour sont suspectés différents mais encore non clairement identifiés dans les deux cas.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la pathogénèse des deux formes sporadique et familiale de la maladie d’Alzheimer (MA). A court terme, le projet devrait permettre de démontrer le potentiel des méthodes in-vivo utilisées pour décrypter ces mécanismes. Enfin, un transfert des compétences acquises et extension de l’étude sur cellules issues de patients devraient aussi permettre d’autres avancées. A plus long terme, le projet devrait pouvoir s’orienter vers l’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour la MA et offrir la possibilité de collaborer avec des start-ups déjà identifiées pour tester des molécules candidates pour traiter la MA.

Procédures

MODIFICATIONS texte en majuscules - 3 INJECTIONS SOUS-CUTANE (CHIRURGIES UNIQUEMENT), DUREE DE 15 SECONDES PAR INJECTION. - INJECTIONS SOUS-CUTANE SUR POUR TRAITEMENT POST-CHIRURGICAL : TOUTES LES 8 HEURES PENDANT 5 JOURS SOIT 15 REPETITIONS, DUREE DE 15 SECONDES PAR INJECTION. - UNE NJECTION INTRAPERITONEALE SUR L’ENSEMBLE DES ANIMAUX POUR ANESTHESIE LETALE EN FIN DE PROTOCOLE, 15 SECONDES / INJECTION. - CHIRURGIE ABDOMINALE CHEZ LA SOURIS GESTANTE). CHAQUE CHIRURGIE DURE ENVIRON 60 MIN, EN EXCLUANT LES TEMPS DE PREPARATION DE L’ANIMAL ET LES TEMPS POST-OPERATOIRES. -GREFFE DE CELLULES CHEZ L’EMBRYON DE SOURIS AU DERNIER TIERS DE GESTATION : DE 30 SECONDES CHACUNE. - INJECTION DANS LE CERVEAU CHEZ LA SOURIS NOUVEAU-NE: INJECTION 45 SECONDES PAR INJECTION DANS LE CERVEAU, UNE OU DEUX INJECTIONS. - INJECTION DANS LE CERVEAU CHEZ LA SOURIS ADULTE : INJECTION 30 MIN AU TOTAL /2 INJECTIONS PAR SOURIS.

Impact sur les animaux

MODIFICATIONS texte en majuscules Les effets indésirables chez les souris nouveau-nés comprennent le stress d’une courte séparation de leur mère (et réciproquement pour la mère par rapport à la portée), et une douleur modérée à l’injection difficile à évaluer à ce stade néonatal, mais bien anticipée par des antalgiques (injection s.c. de buprénorphine 30 min avant les chirurgies puis toutes les 8 heures pendant 24h (dose de 0.1 mg/kg). Pour les souris adultes subissant une chirurgie pour injection stéréotaxique sous anesthésie, les effets indésirables sont une douleur post-opératoire modérée contrôlée et gérée par des antalgiques (buprénorphine en s.c. 30 min avant la chirurgie et toutes les 8 heures pendant 24h à la dose de 0.1 mg/kg et metacam en forme injectable 5mg/kg en s.c. et en forma buvable dans l’eau de boisson pendant 5 jours). Pour les souris devant subir une laparotomie, les nuisances sont une douleur modérée post-opératoire du fait de la chirurgie abdominale contrôlée, anticipée et contrôlée par des antalgiques : injection s.c. de buprénorphine 30 min avant la chirurgie puis toutes les 8 heures pendant 24h (dose 0.1 mg/kg). L’ADMINISTRATION UNIQUE DE SUBSTANCE CHEZ LA SOURIS INDUIT UNE NUISANCE DE NIVEAU MODERE, DU FAIT DU STRESS DE CONTENTION, DE LA DOULEUR BREVE LIEE A LA PONCTION, DE L’INCONFORT ABDOMINAL TRANSITOIRE ET SURTOUT DE L’INDUCTION D’UN ETAT INFLAMMATOIRE GENERAL TRANSITOIRE. CELUI-CI PEUT SE TRADUIRE PAR UN ABATTEMENT, UNE DIMINUTION DE L’ACTIVITE, UNE PILOERECTION, UNE REDUCTION DE LA PRISE ALIMENTAIRE ET HYDRIQUE, UNE PERTE DE POIDS TRANSITOIRE ET UNE HYPOTHERMIE. LES ANIMAUX SERONT SUIVIS ETROITEMENT APRES INJECTION SELON UNE GRILLE DE SCORE CLINIQUE PREDEFINIE ET DES POINTS LIMITES SERONT APPLIQUES SANS DELAI EN CAS D’ALTERATION MARQUEE DE L’ETAT GENERAL.

Devenir

MODIFICATIONS LES SOURIS AYANT SUBI UNE OPERATION CHIRURGICALE ET TOTALEMENT CICATRISEES PEUVENT ETRE UTILISEES POUR PRELEVEMENTS DE CERVEAUX (APPRENTISSAGE DE COUPES TISSULAIRES). TOUS LES ANIMAUX INTEGRES DANS L’ETUDE SERONT MIS A MORT A LA FIN DE CHAQUE PROCEDURE DU FAIT DES ANALYSES PREVUES EXCLUSIVEMENT EX-VIVO. ILS NE PEUVENT ETRE NI REUTILISES, NI REPLACES, NI ADOPTES.

Remplacement

MODIFICATIONS texte en majuscules L’évaluation des processus associés à la maladie d’Alzheimer (MA) ne peut être réalisée autrement que sur animaux vivants, présentant des niveaux de développement cognitif et de capacités mnésiques suffisants et démontrés pour représenter un modèle d’étude pertinent. LA MA IMPLIQUE DES PROCESSUS DYNAMIQUES ET INTEGRES QUI NECESSITENT UN CERVEAU ENTIER VIVANT POUR ETRE RELIES CAUSALEMENT A DES ALTERATIONS COMPORTEMENTALES. LES MODELES IN VITRO/HUMAINS EX VIVO DECRIVENT UNIQUEMENT DES MECANISMES MAIS NE REPRODUISENT PAS TOUS LES SYMPTOMES, ET L’ETABLISSEMENT DE RELATIONS CAUSE‑EFFET ET L’EVALUATION PRECLINIQUE D’INTERVENTIONS SUR LA PROGRESSION ET LA COGNITION REPOSENT DONC ESSENTIELLEMENT SUR DES MODELES ANIMAUX. Les protocoles décrits ne peuvent s’effectuer que chez les rongeurs (rat ou souris) du fait des outils disponibles (taille des appareillages, atlas des régions cérébrales pour le repérage des structures en stéréotaxie), et de la manipulation plus aisée. Le modèle souris est un modèle de choix permettant de travailler sur des animaux manipulés génétiquement et est de ce fait celui retenu. Ce projet représente actuellement le seul modèle « humanisé » pour la MA permettant à terme une avancée thérapeutique ciblant les cellules humaines in-vivo et principaux acteurs en interaction constante dans l’évolution de la maladie.

Réduction

Puisqu’il s’agit d’un renouvellement de projet, les nombres d’animaux ont été optimisés par les études antérieures et sont réduits à leur minimum. Aucune étude pilote est nécessaire. Tous les protocoles d’injection sont largement maitrisés et chaque souris utilisée conduira à des résultats interprétables. Selon les résultats et leur interprétation, il est possible que la méthodologie soit à terme simplifiée sur un mode de chirurgie unique sans impact sur les objectifs scientifiques. Les analyses prévues sur cellule unique se feront selon un protocole déjà mis au point. Elles permettent d’obtenir une masse de données à partir de peu d’échantillons de tissus cérébraux. Les tissus non utilisés seront conservés à -80°C. Pour les greffes des souris dans l’utérus, les portées sont très larges, permettant de réduite à son strict minimum le nombre de souris gestantes. Le stade de greffe retenu a été optimisé lors de précédentes études, permettant une très bonne survie des nouveau-nés. Mâles et femelles seront utilisés en pourcentages les plus équivalents possibles et identifiés. Les animaux greffés seront mis à mort en fin d’expérience et non réutilisables. Le projet met en œuvre une collaboration avec un bio-informaticien possédant l’expertise des modes d’analyses transcriptomiques sur cellule unique et des tests statistiques associées. Pour les études relevant des analyses anatomiques/morphologiques, nous nous baserons sur nos études publiées selon des protocoles similaires.

Raffinement

MODIFICATIONS texte en majuscules Les chirurgies seront réalisées dans un laboratoire dédié exclusivement à la chirurgie L’élevage sera en cage individuelle par portée et des mesures seront prises pour éviter tout animal isolé au-delà d’une période de 24h. Les animaux seront placés sur dispositif chauffant pour maintenir une bonne température corporelle avant, pendant et après l’expérience et seront étroitement surveillés après chirurgie. Dans les procédures expérimentales, les souris feront l’objet d’une surveillance accrue ET RENFORCEE, de soins pré- et post-opératoires, des mesures de gestion de la douleur seront entreprises pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des souris. CES MESURES COMPRENNENT UN RENFORCEMENT DE L’ANALGESIE, EGALEMENT LE MAINTIEN DES SOURIS A UNE BONNE TEMPERATURE SUR DISPOSITIF CHAUFFANT AU REVEIL DES CHIRURGIES, UNE LITIERE DOUCE. POUR LES FEMELLES GESTANTES, ELLES SERONT MAINTENUES AVEC UNE AUTRE FEMELLE POUR EVITER TOUT ISOLEMENT ET STRESS ASSOCIE. Pour les souris immunodéficientes, des conditions maximales d’asepsie seront appliquées. De façon générale et pour l’ensemble des protocoles de chirurgies sous anesthésie, nous rechercherons à minimiser la douleur par antalgiques, ajout de diet gel, par un réchauffement continu des animaux, et par des solutions de réhydratation maintenues à la température corporelle. Nous renforcerons également l’enrichissement des cages. Nous surveillerons l’utilisation des cotons, et l’état de la nidification le cas échéant sous les dômes en carton. Durant les chirurgies, nous assurerons l’absence d’autres manipulations d’animaux dans la pièce de chirurgie et la préparation de tout le matériel sera réalisée en amont pour réduire les temps de manipulation. Deux expérimentateurs seront présents pour réduire les temps d’action. Tous les points limites seront contrôlés pour chaque procédure et anticipés par traitements analgésiques (injection s.c. de buprénorphine 30 min avant la chirurgie et toutes les 8 heures pendant 24h (0.1 mg/kg) pour un effet visible au plus tard dans un délai de 24 heures. En absence d’effets, l’animal est mis à mort.

Choix des espèces

L’évaluation du rôle du système nicotinique et d’un récepteur particulier chez l’homme dans les processus associés à la maladie d’Alzheimer ne peut être réalisée autrement que sur animaux vivants, présentant des niveaux de développement cognitif et de capacités mnésiques suffisants pour représenter un modèle d’étude pertinent. Les protocoles décrits ne peuvent s’effectuer que chez les rongeurs (rat ou souris) du fait des outils disponibles (taille des appareillages), et de la manipulation plus aisée. La souris représente un des meilleurs modèles, jusqu’à présent, sur lesquels on peut étudier les comportements liés à la psychiatrie, dont l’élevage et le maintien en bonnes conditions reste pratique à réaliser en laboratoire, et dont on sait également analyser et manipuler le génome (pour étudier notamment le rôle des sous-unités nicotiniques dans le cadre de ce projet). Les animaux seront utilisés à trois stades de développement distincts : embryonnaire, néonatal et adulte. Pour la gestation, des femelles de 8-10 semaines seront utilisées. Les souris greffées seront sevrées à 4 semaines après naissance, en séparant mâles et femelles. Tous les animaux sevrés et injectés avec des vecteurs, seront utilisés à partir de 8 semaines et testés en groupe d’âge et protocoles indépendants jusqu’à 9 mois (3, 4, 5, 7 et 9 mois). Une condition de greffe de cellules sans vecteur sera initiés dès 1 mois. Le projet vise à étudier le développement de cellules humaines dans un contexte in-vivo, se rapprochant de conditions physiologiques et pathophysiologiques et mimant au mieux ce qui se passe dans la pathogénèse de la maladie d’Alzheimer chez les patients avant l’apparition des signes cliniques et également avant celle des premiers évènements cellulaires. Mieux comprendre les interactions entre les cellules greffées et celles de l’hôte présentant des stades de maturation différents, représente également un enjeu important pour le futur et les approches de médecine régénérative à venir.

Opérées puis soumises à cent minutes de tests d'activité locomotrice, 88 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une puce mesure leur température pour suivre le passage d'anticorps vers le cerveau. Le projet s'intitule mise en place d'une méthode alternative pour réduire l'utilisation de souris, et annonce jusqu'à 80 % d'animaux en moins que les méthodes classiques. Il tue malgré tout 88 souris, dont les ovaires et le cerveau sont prélevés, et sert de base à un projet plus large.

Objectifs

Dans cette étude pilote, nous voulons savoir si les anticorps que nous développons peuvent atteindre leur cible dans le cerveau chez la souris. L’objectif est de mettre en place une méthode alternative qui permet de suivre en temps réel le passage de ces anticorps grâce à une puce mesurant la température sur plusieurs heures, sans devoir sacrifier des animaux à chaque mesure. Cette étude permettra de tester si la technique fonctionne, quel anticorps est le plus efficace, quelle dose utiliser et quelle voie d’administration est la meilleure.

Bénéfices attendus

Le bénéfice de cette étude pilote est de mettre en place une nouvelle méthode qui réduit le nombre d’animaux utilisés tout en permettant de mesurer plus efficacement si les anticorps atteignent le cerveau. Cette étude servira de base pour un projet plus large visant à montrer les effets bénéfiques de ces anticorps sur les troubles du spectre autistique et la maladie d’Alzheimer.

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale (une fois, 15 minutes par animal) et effectueront des tests de comportement (100 minutes par animal) pour mesurer leur activité locomotrice. Une administration (1 min) sera réalisée. Les animaux recevront une dose d’antalgiques et d’anesthésiques (1 min) avant leur mise à mort.

Impact sur les animaux

La contention, l’injection des anticorps et le test de comportement peuvent entraîner un léger stress pour l’animal. Les souris seront soumises à des procédures chirurgicales pouvant entraîner une diminution transitoire de leur bien-être et, très rarement, des infections.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés et les organes prélevés pour l’étude directement (ovaires) mais aussi pour des études ultérieures (cerveau).

Remplacement

Les anticorps sont d’abord développés et testés sur des cellules en laboratoire. Seuls les 5 plus prometteurs seront évalués dans cette étude pilote chez la souris. Il n’existe pas de méthode alternative pour mettre en place cette technique, car elle nécessite un organisme vivant entier, depuis l’injection des anticorps jusqu’à l’observation de leurs effets sur la température, afin de démontrer leur passage dans le cerveau.

Réduction

Cette étude pilote consiste justement à mettre en place une méthode alternative pour réduire le nombre d’animaux utilisés (jusqu’à 80 %) par rapport aux méthodes classiques. Nous avons optimisé le nombre d’animaux pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement valides.

Raffinement

L’environnement des souris est enrichi et renouvelé régulièrement pour optimiser le maintien de leur chaleur corporelle et de leur bien-être. Les injections et les tests de comportement seront réalisés dans une pièce calme et faiblement éclairée, et seront les plus brefs possibles afin de minimiser l’inconfort et l’anxiété des animaux. De plus, les animaux seront habitués à cette pièce et au contact des expérimentateurs, notamment afin de vérifier leur état de santé. Les souris soumises aux procédures chirurgicales seront traitées avec des antidouleurs jusqu’à leur rétablissement pour limiter leur douleur et, comme pour tout changement chez un animal, feront l’objet d’une surveillance renforcée. Des points limites adaptés à chaque procédure ont été mis en place et seront appliqués.

Choix des espèces

Les souris sont de petits animaux sociaux, et dont les comportements sont proches de ceux de l’homme. Notre but est d’étudier les effets bénéfiques des anticorps dans les modèles de souris des troubles autistiques et la maladie d’Alzheimer, qui impactent fortement la qualité de vie chez l’homme. À l’heure actuelle, les quantités d’anticorps produites dans notre laboratoire sont compatibles avec une utilisation chez la souris adulte âgée de 2 mois, ayant un cerveau mature.

Jusqu'à deux chirurgies cérébrales de quatre heures et des séances répétées d'IRM et de TEP sous anesthésie générale sur un an: 60 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Des protéines pathologiques humaines sont injectées dans leur cerveau pour y reproduire une maladie de Parkinson ou d'Alzheimer et suivre l'apparition de troubles moteurs et cognitifs. Le porteur juge le primate "indispensable" au motif que les rongeurs ne reproduisent pas les symptômes cognitifs. Tous les cerveaux sont prélevés après la mise à mort pour analyse.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer ou la paralysie supranucléaire progressive se caractérisent par l’accumulation progressive d’agrégats protéiques spécifiques dans le cerveau. Avec l’évolution de la maladie et le vieillissement cellulaire, ces agrégats deviennent toxiques, entraînant la mort des neurones et l’apparition de symptômes moteurs et cognitifs. Il est donc essentiel de comprendre le rôle de ces agrégats dans le développement des déficits, d’évaluer leur impact fonctionnel et d’explorer des stratégies thérapeutiques visant à favoriser leur élimination, telles que les immunothérapies. Les modèles animaux classiques, notamment les rongeurs, permettent de reproduire certaines lésions mais ne reflètent pas pleinement les symptômes, en particulier cognitifs. Cette limite pourrait s’expliquer par les différences anatomiques entre le cerveau humain et celui des rongeurs. Ainsi, l’utilisation d’un modèle animal phylogénétiquement proche de l’Homme apparaît indispensable pour étudier les conséquences fonctionnelles de l’accumulation de protéines pathologiques. Des travaux récents montrant le caractère « infectieux » de certaines protéines ont ouvert la voie au développement de modèles chez le primate non humain. Ces modèles animaux permettent de reproduire les mécanismes d’agrégation protéique et d’induire des troubles moteurs et cognitifs similaires à ceux observés chez les patients même à des stades précoces de la maladie. Ils offrent également la possibilité d’un suivi longitudinal (au cours du temps) des lésions et du comportement grâce à des techniques d’imagerie non invasives directement applicables à l’Homme telles que l’IRM, les examens ophtalmologiques et la tomographie par émission de positons (TEP). L’objectif du projet est double: développer des modèles de maladies neurodégénératives chez le primate non humain par différentes approches (surexpression de protéines pathologiques humaines ou de protéines de synthèse), et suivre in vivo l’évolution des agrégats protéiques en lien avec l’apparition et la progression des déficits moteurs et cognitifs.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de développer de nouveaux modèles animaux plus robustes et pertinents d’un point de vue biologique des principales maladies neurodégénératives, telles que la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer ou la Paralysie Supranucléaire Progressive. L’utilisation de méthodes non-invasives similaires à celles utilisées dans les hôpitaux va permettre une meilleure application à l’Homme. Sur le long terme, ces nouveaux modèles animaux permettront de valider des thérapies innovantes ou des biomarqueurs diagnostiques ciblant ces maladies neurodégénératives.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés pour inoculer des protéines mutées synthétisées in silico ou isolées et amplifiées à partir de cerveaux de patient. . Un maximum de deux chirurgies de 4h maximum espacées de 6 mois sont prévues. Les animaux seront ensuite réévalués à 6 mois et 12 mois post injection. Les animaux seront évalues de la façon suivante à 3 temps espacés de 6 mois : - Comportement moteur spontané sans restriction alimentaire ou hydrique (1h/j/4j à 4 temps différents maximum). - Comportement cognitif sur écran tactile avec renforcement positif et sans restriction alimentaire ou hydrique (1h/j/4j à 4 temps différents maximum). - Imagerie IRM sous anesthésie générale pendant 1 à 3 heures maximum par session avec un minimum de 1 session et un maximum de 3 sessions espacées d’au moins une semaine par temps et un maximum de 4 temps. - Imagerie TEP sous anesthésie générale durant 2 à 4 heures maximum par session avec un maximum de 3 sessions espacées d’une ou deux semaines (voir renouvelée une fois à 6 mois) en fonction de la nécessité de réaliser des prélèvements sanguins (tous les traceurs TEP ne demande pas des prélèvements de sang pour l’interprétation des résultats). Un maximum de 3 temps 12 mois. - Imagerie ophtalmique sous anesthésie générale durant 1 à 3 heures maximum par session avec un maximum de 3 sessions espacées d’au moins une semaine et un maximum de 3 temps sur 12 mois. - Un prélèvement sanguin et de LCR sous anesthésie (15min).. Ces prélèvements sont couplés à l’un des examens d’imagerie pour réduire le nombre total d’anesthésies.

Impact sur les animaux

L’administration de vecteurs viraux ou des protéines entraine une douleur locale, de courte durée et légère. La délivrance de ces composés dans le cerveau entraine une douleur locale due à l’ouverture de la peau et la rétraction du muscle. Les anesthésies, qu’elles soient de courte durée ou plus longues, génèrent un risque d’hypothermie (stress thermique) si la température n’est pas contrôlée. De plus, la mise à jeun la nuit qui précède l’anesthésie et la manipulation des primates avant anesthésie pourraient induire un stress jusqu’à leur réveil, nourrissage et remise en groupe social. Les anesthésies de longue durée nécessitent la pose d’un cathéter veineux pour maintenir une anesthésie en continue et une intubation ce qui entraine une douleur locale, légère, et de courte durée. Pour les chirurgies et les examens d’imagerie, la nécessité d’immobilisation peut entrainer une nuisance locale transitoire au niveau du canal auditif jusqu’au retrait du cadre. Le maintien de l’œil ouvert lors des examens ophtalmologiques peut entrainer une douleur locale transitoire. Les anesthésies répétées peuvent induire une perte de poids, raison pour laquelle un suivi du poids sera réalisé tous les mois pendant toute la durée de l’expérience.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés à la fin du projet afin de pouvoir prélever leurs cerveaux. Des analyses histopathologiques et biochimiques seront réalisées afin de caractériser l'expression des protéines aberrantes dans les différentes régions du cerveau, ainsi que l’inflammation, afin de valider les résultats obtenus in vivo.

Remplacement

Pour ce projet, le recours à l’animal est nécessaire, car aucun milieu de culture, organoïdes ou système synthétique, ne permet aujourd’hui de reproduire la complexité architecturale et fonctionnelle du système nerveux au point de prédire la cinétique d'accumulation des protéines anormales et leur impact fonctionnel. Par ailleurs, la réaction du système immunitaire suite à la surexpression d’une protéine doit aussi être évaluée dans un modèle animal proche de l’Homme pour augmenter sa valeur prédictive en termes de sureté et absence d’effets adverses.

Réduction

Une veille de la littérature est faite pour éviter de refaire des expériences déjà publiées. Le nombre d’animaux prévu dans ce projet a été réduit au minimum afin de pouvoir exploiter correctement les résultats. Un calcul statistique de puissance a été réalisé afin de dimensionner les groupes expérimentaux. De plus, le suivi longitudinal chez le même individu par des méthodes d’évaluation fonctionnelle non-invasives (imagerie et comportement) permet de réduire le nombre d’animaux en évitant l’euthanasie pour une confirmation histologique à différents temps, et sans compromettre la possibilité d’observer un effet pathologique significatif.

Raffinement

Afin de minimiser le stress et l’angoisse des animaux d’élevage importés pour des utilisations scientifiques, les primates seront acclimatés pendant au moins un mois en dehors de la quarantaine et avant la date de début du protocole. Le protocole d’anesthésie pour la réalisation des études comporte des analgésiques pour minimiser l’inconfort. La surveillance rapprochée suite aux anesthésies et plus particulièrement après les chirurgies à l’aide d’une grille d’évaluation péri-opératoire, l’évaluation du comportement moteur tous les 6 mois à l’aide d’une grille adaptée au modèle , le suivi régulier du poids, l’interaction avec la Structure chargée du Bien Être des Animaux (SBEA) et la mise en place de points limites clairs permettent de limiter les nuisances liées aux interventions. De plus, le nombre d’interventions ainsi que leur durée sont réduits au maximum. L’interaction positive au quotidien avec les personnels impliqués dans l’étude constitue aussi une forme d’enrichissement.

Choix des espèces

Le macaque adulte est retenu comme modèle d'étude sur les critères suivants : - il n'est pas possible de reproduire tous les signes pathologiques des maladies neurodégénératives dans les modèles cellulaires/organoïdes ou les modèles rongeurs, et par conséquent, il est difficile de prédire l'effet d'une thérapie chez l'Homme. - il permet d'intégrer des méthodes d'évaluation fonctionnelle, telles que l'imagerie, le comportement et les signes cliniques, qui peuvent être directement extrapolés à l'Homme dans une démarche translationnelle et utilisant des équipements d’imagerie et de tests comportementaux identiques ou similaires à ceux utilisés en clinique. - sa ressemblance anatomique et fonctionnelle du cerveau par rapport à l’Homme. La taille et la structure du cerveau permettent des analyses anatomiques et fonctionnelles strictement comparables à celles réalisées dans les mêmes conditions que chez les patients. Les animaux seront adultes (6 ans ou plus) pour mieux mimer le stade auquel les maladies neurodégénératives donnent lieu à des signes cliniques et pour éviter toute plasticité cérébrale présente chez les jeunes individus.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune subissant deux chirurgies de la moelle épinière à un mois d'intervalle, des injections modulant l'activité neuronale, puis des tests moteurs et une mesure de conduction nerveuse sous anesthésie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le modèle reproduit une sclérose en plaques pour observer si stimuler les neurones aide à réparer la myéline. Les prélèvements de cerveau et de moelle épinière imposent la mise à mort de tous les animaux. Les retombées annoncées pour les patients, limiter la progression du handicap, restent renvoyées au conditionnel et au long terme.

Objectifs

La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire, dégénérative du système nerveux central (cerveau et moelle épinière) et la première cause d’handicap neurologique non traumatique chez les jeunes adultes. Dans cette maladie, on observe des phases de démyélinisation (il s’agit d’une perte de la myéline, substance permettant de favoriser les influx nerveux et la protection des neurones) dans lesquelles l’organisation des neurones est altérée, conduisant à des déficits fonctionnels chez les patients. Un mécanisme de réparation existe, mais il est incomplet et très variable selon les patients. Les cellules immunitaires du cerveau et de la moelle épinière (microglie) sont activées précocement lors de la démyélinisation et participent à la réparation de la gaine de myéline. La microglie contacte par ailleurs les neurones et cette interaction peut influencer positivement la réparation post-démyélinisation. Nous avons mis en place une technique permettant de moduler l’activité neuronale lors de la phase de rémission dans un modèle murin de sclérose en plaques pour étudier l’impact de cette modulation sur les interactions entre les cellules immunitaires du cerveau et les neurones, afin de favoriser la réparation tissulaire et la récupération fonctionnelle. Le présent projet vise à mesurer par des tests comportementaux et des mesures de conduction nerveuse chez la souris si la modulation de l’activité neuronale facilite la récupération fonctionnelle dans nos modèles et si cela dépend de l’interaction neurone-microglie.

Bénéfices attendus

La sclérose en plaques touche plus de 100 000 personnes en France et se déclenche majoritairement chez le jeune adulte. La réparation de la myéline (remyélinisation) est essentielle dans cette pathologie, mais reste partielle, d’où une perte neuronale à long terme et des déficits irréversibles chez les patients. L’activité neuronale a été montrée comme favorisant la remyélinisation. Ce projet permettra de mieux comprendre l’impact biologique obtenu de l’activité neuronale sur les interactions neurones-cellules immunitaires et leur rôle dans un modèle murin de sclérose en plaques. A plus long terme, la mise en évidence d’effets bénéfiques de l'activité neuronale sur la réparation via une modulation directe du dialogue neurones-cellules immunitaires pourrait permettre d'envisager des stratégies thérapeutiques visant à limiter la progression du handicap chez les patients.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à deux procédures chirurgicales sous anesthésie générale avec une prise en charge analgésique adaptée, afin de réaliser une injection au niveau de la moelle épinière (chirurgies séparées d’un mois, durée 15 minutes chacune). Tous les animaux recevront à l’état vigile deux injections (moins d’une minute) séparées de 3h pour moduler ou non l’activité neuronale. Tous les animaux participeront à des tests comportementaux visant à mesurer leurs compétences motrices (sessions de 2h30 incluant des pauses entre les tests). Des mesures de la vitesse de conduction nerveuse seront effectuées sous anesthésie générale avec traitement analgésique en fin d’étude (maximum 45 minutes), avant euthanasie par une méthode réglementaire pour réaliser différents prélèvements tissulaires.

Impact sur les animaux

Les chirurgies engendreront un inconfort temporaire lors du réveil après anesthésie (environ 30 min d’inconfort au réveil) et un risque de douleurs post-opératoires. Il existe un risque rare de complications liées à la chirurgie : infections, hémorragie. L’anesthésie générale sera associée à des risques d’hypothermie, de sécheresse oculaire et de défaillance cardiorespiratoire. Les injections seront associées à un risque de légère et brève douleurs et d’inconfort de courte durée. Le traitement modulateur d’activité neuronale peut occasionner un trouble locomoteur et une gêne dans les 3 heures maximum suivant l’injection. Les tests comportementaux peuvent induire un stress léger.

Devenir

Des prélèvements tissulaires (cerveau et moelle épinière) sont réalisés post mortem, ce qui implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux pour répondre à nos objectifs scientifiques. L’euthanasie est réalisée par une méthode réglementaire.

Remplacement

Dans un objectif de remplacement, nous travaillons en première approche avec des modèles in vitro et ex vivo, qui nous ont permis d’établir le rôle positif de l’activité neuronale dans le dialogue neurone-microglie pour limiter l’aspect pro-inflammatoire de ces cellules après démyélinisation. Les modèles murins in vivo sont ultimement nécessaires pour l’étude fondamentale de la Sclérose en plaques, car ils permettent d'étudier la démyélinisation et la remyélinisation dans un contexte intégré, impliquant des interactions entre tissus nerveux, effecteurs de l’immunité circulante et apports métaboliques par le réseau sanguin, qui sont des composantes importantes de la sclérose en plaques. Le présent projet nous permettra d’avoir une lecture fine de l’impact de l’activité neuronale sur la réparation et la part de cet effet dûe au dialogue neurone-microglie dans nos modèles démyélinisants in vivo.

Réduction

Des approches statistiques permettront d’optimiser le nombre d’animaux utilisés après l’utilisation des premiers lots d’animaux afin de réduire au strict minimum le nombre d’animaux nécessaires : ce nombre sera calculé pour chaque groupe d’expériences à l’aide d’un calcul statistique après utilisation initiale de 5 à 6 animaux par condition. Au maximum nous utiliserons 100 animaux pour ce projet. Des tests statistiques seront utilisés pour l’analyse des résultats obtenus, adaptées à chaque expérience et réalisées en partenariat avec des biostatisticiens.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une semaine à leur arrivée avant leur entrée en procédure. L’eau et la nourriture sont fournies à volonté. Un environnement enrichi est fourni aux animaux, comprenant nidification (carré de coton, kraft) et bâton à ronger. Les animaux sont manipulés uniquement par un personnel qualifié et sensibilisé au bien-être animal. Ils seront observés quotidiennement, toute anomalie sera gérée en collaboration entre notre équipe, la structure chargée du bien-être animal et nos vétérinaires afin d’assurer une prise en charge adaptée pour chaque animal. Des points-limites sont définis, ainsi qu’un suivi par l’équipe de recherche pour éviter la souffrance de l’animal. Les animaux soumis aux procédures chirurgicales sont placés sous anesthésie générale (durée maximale de 30 minutes), avec une prise en charge analgésique adaptée. Nous nous assurerons du maintien de la température des animaux durant toute la durée de l’anesthésie. Un gel de protection oculaire sera appliqué sur leurs yeux. En post-chirurgie, les animaux auront un accès facilité à la nourriture et à l’eau pour faciliter leur récupération. Nous mettrons également en place une surveillance renforcée post-chirurgie. Avant les tests comportementaux, les animaux auront un temps d’acclimatation. La mesure de la conduction nerveuse sera réalisée sur un animal anesthésié. L’animal ne sera pas réveillé ensuite et euthanasié au cours de son anesthésie générale.

Choix des espèces

La souris est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et sa génétique sont bien connues et sont relativement proches de l'Homme. L’âge adulte est requis pour pouvoir faire les actes chirurgicaux et les mesures d’activité neuronale envisagées dans ce projet.