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Effet d’une espèce bactérienne intestinale sur la santé métabolique de l’hôte en fonction de régimes, supplémentés ou non, en fibres alimentaires.
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Gavées pour recevoir un microbiote puis la bactérie étudiée, nourries douze semaines avec un régime riche en graisses, placées trois ou quatre fois dans un pot en plastique pour la collecte des crottes, 148 souris dépourvues de flore intestinale vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Après six heures de jeûne vient le test de tolérance au glucose, avec un gavage et des prélèvements de sang répétés à la queue. Le porteur présente Prevotella comme un probiotique de nouvelle génération à fort potentiel de valorisation, tout en reconnaissant que son effet sur la santé humaine reste ambigu. Toutes sont tuées pour que l'intestin et le contenu du cæcum soient prélevés.
Objectifs
Il est maintenant bien admis que des milliards de micro-organismes vivent dans notre tractus digestif. Cette communauté bactérienne, fongique et virale forme le microbiote intestinal. Celui-ci joue un rôle très important pour notre santé et est modulé par l’alimentation. En effet, la consommation d’aliments riches en fibres (fruits, légumes, céréales complètes ou légumineuses) favorise le développement intestinal des bactéries bénéfiques pour la santé. Ces bactéries, qualifiées de probiotiques de nouvelle génération, représentent un réservoir encore trop peu connu d’espèces bactériennes à fort potentiel d’innovation et de valorisation pour l’amélioration de la santé ou le développement de nouveaux traitements. Prevotella est une bactérie intestinale qui persiste dans le tractus digestif d’individus consommant beaucoup de produits végétaux. De nos jours, l'impact de Prevotella sur la santé humaine reste ambigu. Certaines études mettent en évidence son impact bénéfique sur la régulation du sucre dans le sang, alors que d’autres travaux rapportent des effets délétères de cette bactérie. L’objectif du projet est de mieux comprendre comment Prevotella agit dans le corps humain et comment l’alimentation moderne pauvre en fibres influence sa présence et son rôle dans notre santé.
Bénéfices attendus
La bactérie intestinale Prevotella pourrait avoir un effet positif sur notre santé, en particulier sur la santé métabolique. Ainsi, elle pourrait améliorer la sensibilité à l’insuline et réguler la glycémie. Cependant, ses effets bénéfiques peuvent dépendre du type d’alimentation : Prevotella peut agir surtout lors d’une forte consommation de fibres, ce qui est souvent moins le cas dans le régime occidental (riche en produits transformés et pauvre en fibres). Au final, cette étude permettra d’évaluer le potentiel de Prevotella comme probiotique de nouvelle génération ciblant les dysfonctions métaboliques et d’en préciser les mécanismes d’action sur l’hôte. Elle soulignera également les bénéfices des fibres alimentaires, dont la consommation, insuffisante dans les régimes occidentaux, doit être encouragée et soutenue.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements de fèces 3 ou 4 fois sur une période de 14 semaines. Le prélèvement de fèces ne dépassera pas 10 minutes de séjour dans un pot en plastique transparent. Les souris seront soumises à un test oral de tolérance au glucose, après un jeûne de 6 heures en fin d’expérimentation. Ceci implique un gavage oral et des prélèvements de sang. La durée totale moyenne du gavage des souris est de 2 à 5 minutes par souris en incluant le temps de contention de l’animal, l’acte de gavage, ainsi que la vérification post-gavage. La collecte sanguine capillaire nécessite environ 2 à 5 minutes par animal, incluant la contention, le prélèvement et l’hémostase. Elles auront également des gavages pour l’implantation du consortium bactérien et pour administrer notre bacteéie d’intérêt. Il faut également ajouter 2 prélèvements de sang espacés de 6 semaines. Le prélèvement sanguin prend en moyenne 2 minutes, une fois l’animal correctement immobilisé. Une partie des souris seront nourries avec un régime riche en graisse ou avec un régime riche en graisse enrichi en fibres alimentaires et ceci sur 12 semaines.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à un stress sur de temps très courts, lors des gavages pour l’inoculation du microbiote et du glucose pour l’OGTT (test de tolérance oral au glucose), et pour les prélèvements sanguins à la veine submandibulaire et à la queue pour le suivi de la glycémie durant l’OGTT. Les souris seront soumises à un jeûne de 6h avant les tests de tolérance au glucose ce qui n’entraine qu’une diminution modérée de la glycémie mais aucune hypoglycémie. Les animaux subiront également un stress lors des prélèvements de fèces (10 minutes de séjour au plus dans un pot en plastique transparent), soit trois fois (procédure 1) ou quatre fois (procédure 2) sur la durée totale de l’expérimentation.
Devenir
L'ensemble des animaux sera euthanasié afin de prélever certains tissus comme intestin et contenu de caecum
Remplacement
Actuellement, il n'existe pas de méthode alternative validée à l’expérimentation animale capable de reproduire la façon dont les différents organes du corps communiquent sur le plan métabolique. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux pour étudier l'ensemble du système, car cela permet d'observer comment les gènes, les bactéries intestinales, l'alimentation et les organes interagissent les uns avec les autres. On peut ainsi mesurer des paramètres importants comme le taux de sucre et d'insuline dans le sang.
Réduction
Nous prévoyons d'utiliser 16 souris par groupe testé. D'après notre expérience, ce nombre est nécessaire pour obtenir des résultats fiables et pouvoir affirmer avec certitude qu'une différence observée est significative. En effet, le taux de sucre dans le sang varie naturellement d'une souris à l'autre, il faut donc suffisamment d'animaux pour compenser ces variations. Nous utiliserons à la fois des mâles et des femelles, ce qui permet de mettre en évidence les variations éventuelles en fonction du sexe.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des cages, par petits groupes du même sexe (2 à 4 par cage). Pour leur bien-être, elles disposeront de papier à déchiqueter, de morceaux de bois à ronger et de cachettes en plastique. La litière et la nourriture seront stérilisées pour garantir leur santé. Elles auront accès en permanence à de l'eau et à de la nourriture (standard ou enrichie en graisses et fibres selon les groupes testés). Différentes procédures seront mises en place pour limiter l'inconfort : • Les gavages seront effectués uniquement par du personnel expérimenté, de manière rapide et délicate. Les quantités données seront faibles et nous utiliserons des sondes souples ou à olive non blessantes. • Pour collecter les crottes, les souris seront placées dans un petit récipient transparent et ouvert pendant 10 minutes maximum, ce qui leur permet de continuer à voir leurs congénères. • Lors du test de tolérance au glucose (qui dure environ 2 heures), les cages seront posées sur un tapis chauffant pour éviter que les souris n'aient froid. L’état de santé des animaux sera évalué régulièrement par des agents expérimentés santé afin de détecter rapidement tout problème physique ou comportemental (pesée, contrôle de l'alimentation). Des points limites seront définis et appliqués.
Choix des espèces
Nous utilisons des souris car c'est l'animal de référence pour étudier les maladies liées au métabolisme (comme le diabète). Pour cette étude, nous avons besoin d'animaux sans bactéries intestinales (dits animaux axéniques), et la souris est l'un des rares animaux chez qui nous pouvons obtenir cette condition particulière. Nous commençerons les expériences sur des souris agées de 4 à 5 semaines, soit après sevrage, pour cibler des jeunes adultes au moment du changement alimentaire.
Evaluation de l’efficacité de différents traitements lors de l’interruption du flux sanguin intestinale.
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- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
Un clip posé pendant une heure sur l'artère qui alimente l'intestin, une chirurgie d'une heure trente, des injections de traitements au retour du sang, puis jusqu'à 72 heures d'observation avant une seconde opération de vingt minutes. 970 souris passent par ce protocole d'ischémie intestinale, 820 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 150 sous anesthésie sans réveil. Le porteur indique que l'ischémie peut provoquer une perte de poids importante, des douleurs, une déshydratation et le passage de bactéries intestinales dans le reste du corps. Toutes sont tuées sans phase de réveil pour prélever l'intestin grêle.
Objectifs
L’ischémie mésentérique aiguë (IMA) ou ischémie intestinale est une urgence médicale grave qui touche les vaisseaux sanguins de l’intestin. Elle survient lorsque le sang ne circule plus correctement vers l’intestin, ce qui peut entraîner sa destruction (infarctus intestinal) en quelques heures. Malgré les progrès de la médecine, cette maladie reste très dangereuse, avec un risque élevé de chirurgie lourde (ablation de l’intestin) et un taux de mortalité important, surtout en dehors des centres spécialisés. Même lorsque le flux sanguin est rétabli, des complications graves peuvent survenir à cause de l’inflammation et des caillots provoqués par ce qu’on appelle le phénomène d’ischémie/reperfusion (I/R). Actuellement, les traitements reposent sur les anticoagulants et les antibiotiques, mais leurs effets sont encore mal compris. Notre projet vise à mieux comprendre les mécanismes de cette inflammation pour développer des traitements plus ciblés. Grâce à un modèle expérimental sur la souris, nous testons de nouvelles pistes thérapeutiques pour protéger l’intestin et améliorer le pronostic des patients.
Bénéfices attendus
Quand une artère se bouche près de l’intestin, il est souvent difficile de rétablir correctement la circulation sanguine dans les petits vaisseaux en aval. Ce projet de recherche cherche à comprendre pourquoi, et à trouver des moyens d’améliorer cette "reperfusion", essentielle pour éviter des lésions graves. Une partie du problème vient de l’inflammation, des caillots (thrombose) et des troubles de la coagulation qui se déclenchent lorsque le sang revient après une interruption. Si on n’agit pas rapidement sur ces mécanismes, les tissus peuvent être irrémédiablement endommagés. Pour limiter ces effets, plusieurs traitements sont en cours d’étude : des anti-inflammatoires ciblés, des anticoagulants, des médicaments qui protègent la paroi de l’intestin, ou encore des antibiotiques pour freiner les infections graves (sepsis). Ces approches pourraient améliorer considérablement le pronostic dans des situations critiques comme l’ischémie mésentérique aiguë, certains chocs en réanimation, ou les greffes intestinales.
Procédures
Dans cette étude, les souris suivront une procédure médicale visant à reproduire une situation grave que l’on retrouve chez l’humain : une interruption temporaire de la circulation sanguine vers l’intestin. Pour cela, un petit clip est placé pendant 1 heure sur l’artère principale qui alimente l’intestin (la durée totale de la chirurgie sera de 1h30). Ensuite, le sang est laissé circuler à nouveau, et différents traitements seront testés par injection (temps d'injection limité à moins de 15 secondes). Certaines souris recevront aussi un traitement antibiotique (ajouté dans l'eau de boisson des animaux pendant 2 semaines) avant l’opération. Des prises de sang seront effectuées avant et après la chirurgie pour mieux comprendre les effets de l’ischémie et des traitements. Tout cela se fera sous anesthésie générale, pour que les animaux ne ressentent aucune douleur pendant les interventions. Après l’opération, les souris seront suivies de près chaque jour. Si un signe de douleur est observé, un antidouleur leur sera injecté. Si la douleur ne peut pas être soulagée, l’animal sera euthanasié dans le respect de son bien-être. Les animaux seront observés pendant 72h maximum avant d'être ré-opéré sous anhestésie générale pour une observation de l'état des vaisseaux alimentant l'intestin. Cette chirurgie terminale durera 20 minutes. En fin d'expérimentation, les animaux seront euthanasiés sans phase de réveil.
Impact sur les animaux
Quand le sang n’arrive plus correctement à l’intestin (on parle d’ischémie mésentérique), cela peut provoquer des lésions irréversibles. Sans intervention rapide, des bactéries provenant du microbiote intestinal peuvent passer dans le reste du corps, entraînant une infection grave (sepsis) et un risque de défaillance des organes vitaux. Après chaque épisode d’ischémie et de rétablissement du flux sanguin (appelé "reperfusion"), les réactions sont très variables. Chez certaines souris, une partie de l’intestin est déjà abîmée pendant l'ischémie, alors que chez d’autres, les lésions apparaissent après la reprise de la circulation. Lors d’expériences sur la souris, plusieurs signes peuvent apparaître après une heure d’ischémie et pendant la reperfusion : perte de poids importante, douleurs, baisse d’appétit, faiblesse générale, déshydratation ou irritation au niveau des sutures. Pour observer ce qui se passe dans l’intestin, des techniques comme l’imagerie laser sont utilisées de façon brève et ciblée afin de ne pas causer d’effets secondaires. Ces observations sont bien tolérées, comme l'ont montré nos études précédentes.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées en fin de procédure afin de prélever l’intestin grêle pour des analyses des tissus biologiques.
Remplacement
L’ischémie-reperfusion mésentérique est une maladie rare mais extrêmement grave. Elle survient lorsque la circulation sanguine vers l’intestin est interrompue, puis rétablie. Ce phénomène peut entraîner de lourdes complications, comme des infections généralisées (sepsis), et un taux de mortalité très élevé, pouvant atteindre 80 % chez l’humain. C’est une maladie complexe, encore mal connue, qui touche à la fois les artères, les veines, l’intestin et le système immunitaire. Elle varie beaucoup d’une personne à l’autre, ce qui rend son étude encore plus difficile. À cause de cette complexité, il n’est pas possible de la modéliser correctement en laboratoire à l’aide de cellules seules (modèles in vitro) ou d’ordinateurs (modèles numériques). C’est pourquoi les chercheurs utilisent un modèle animal, notamment la souris, pour mieux comprendre les mécanismes en jeu et tester de nouveaux traitements. C’est aujourd’hui la méthode la plus fiable pour faire avancer la recherche sur cette pathologie.
Réduction
Dans notre recherche, nous utilisons 10 souris par groupe. Ce nombre a été soigneusement calculé : il s'agit du minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables et scientifiquement valides. Cela nous permet de prendre en compte les différences naturelles entre les animaux, car les effets de l’ischémie intestinale ne sont pas toujours identiques d’un individu à l’autre. Pour comparer les effets des traitements, nous utiliserons des outils statistiques reconnus. Cela nous aidera à savoir si les différences observées entre les groupes sont vraiment dues au traitement ou simplement au hasard. Nous testerons d’abord deux doses pour chaque traitement, sur une courte durée (1 heure), afin de choisir la plus efficace. Seule cette dose sera ensuite utilisée pour les tests plus longs. Enfin, pour limiter le nombre d’animaux, les groupes témoins seront mutualisés dès que cela est possible, notamment lorsque plusieurs traitements ont le même placebo.
Raffinement
À leur arrivée, les animaux bénéficient d’une période de repos et d’adaptation de 7 à 10 jours avant toute intervention. Pendant ce temps, ils vivent dans un environnement confortable avec de la nourriture et de l’eau à volonté, ainsi que du matériel pour faire leur nid et jouer, afin de limiter le stress. Les animaux sont observés chaque jour par le personnel animalier, en plus de la surveillance régulière de l’expérimentateur. Si un signe inhabituel ou inquiétant est détecté, une intervention immédiate est prévue. En cas de douleur légère (même si elle ne dépasse pas le seuil critique), la surveillance est renforcée deux fois par jour. Pour améliorer leur confort, des croquettes humidifiées sont ajoutées dans la cage, et un antidouleur est administré une fois par jour par une petite injection, avec une aiguille fine, afin de soulager efficacement la douleur.
Choix des espèces
Notre laboratoire a une grande expérience dans le travail avec les souris, à chaque étape : soins avant les expériences, gestion du stress, anesthésie, chirurgie, suivi de l’état de santé, soulagement de la douleur et, si nécessaire, euthanasie dans le respect du bien-être animal. Pour observer les vaisseaux sanguins dans l’intestin à l’aide d’un microscope spécialisé (microscopie intravitale), nous utilisons de jeunes souris males ou femelles d’environ 7 semaines et pesant 20 g. Ce choix permet une observation claire, car au-delà de ce poids, la graisse empêche de bien voir les vaisseaux. Les résultats obtenus grâce à ce modèle permettent de mieux comprendre certains mécanismes biologiques, en particulier ceux liés à l’inflammation ou à de nouveaux traitements. Ces données sont utiles pour la recherche médicale humaine, car de nombreuses réactions sont similaires entre la souris et l’humain.
Etude de l’implication des voies de régulation immunitaire de l’hépatite auto-immune dans un modèle murin préclinique
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1 536 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections destinées à faire exprimer un auto-antigène dans le foie, une vaccination dans les deux pattes arrière qui gonfle le muscle pendant douze à vingt-quatre heures, cinq injections en deux semaines sur animal éveillé et deux prélèvements de sang sous anesthésie. Le modèle actuel ne produit qu'une hépatite minime qui se résorbe vite, loin de la maladie humaine, et l'équipe veut donc invalider dans les cellules du foie les gènes de molécules immunitaires inhibitrices pour obtenir une auto-immunité qui dure. Foie, rate et sang sont prélevés après la mise à mort, le porteur affirmant qu'aucun système de remplacement pertinent n'existe et que les biopsies humaines sont rares et de petite taille.
Objectifs
L’hépatite auto-immune est une pathologie dont les causes restent méconnues. L’ L’hépatite auto-immune est caractérisée par une attaque immunitaire du foie conduisant à des niveaux élevés des enzymes hépatiques et des anticorps notamment des auto-antigènes. Les patients répondent pour la plupart bien aux traitements immunosuppresseurs non spécifiques; Toutefois, ces traitements à long terme ne sont pas sans effets délétères. Les cellules immunitaires sont classiquement considérées comme responsables des lésions hépatiques, mais les mécanismes cellulaires, notamment les antigène-spécifiques impliqués restent largement incompris. Notre équipe a mis en place des modèles murins ressemblant à l’hépatite auto-immune qui permettent d’étudier le rôle des cellules immunitaires spécifiques d’un antigène exprimé dans le foie. De nombreux outils sont disponibles pour l’expression et l’étude de cet antigène, permettant ainsi de suivre les réponses immunitaires spécifiques associée à l’antigène après expression de celui-ci dans le foie. Avec ce système, notre équipe a pu montrer que l’expression de l’antigène dans le foie des souris est tolérée et n’induit pas de réponse spécifique contre celui-ci, de plus que l’accumulation de cellules immunitaires dans le foie des souris dépend d’une immunisation préalable contre l’antigène et l’expression de celui-ci au niveau du foie. Nous avons également montré que les cellules immunitaires spécifiques de l’antigène ressemblaient aux cellules immunitaires auto-réactives chez les patients et que le blocage transitoire des molécules immunitaires inhibitrices perturbe le contrôle de cette réponse . Cependant, l’hépatite induite est peu détectable/minime et se résorbe rapidement ce qui diffère de la maladie chez l’homme. Notre hypothèse est que l’évolution chronique d’une auto-immunité dans le foie dépend d’une dérégulation de ces voies immunitaires inhibitrices sur le long terme. Dans cette mesure, nous souhaitons invalider, spécifiquement dans les hépatocytes, les gènes codant pour ces molécules inhibitrices et évaluer leur impact à court et long terme, ce qui permettrait une compréhension des mécanismes impliquées dans la maladie chez l’humain.
Bénéfices attendus
Nos travaux permettront de mettre en évidence comment l’environnement hépatique joue un rôle dans les réponses inflammatoires locales contre un auto-antigène hépatique, en identifiant des voies de signalisations essentielles au contrôle de ces réponses sur le long terme. Les résultats de nos travaux devraient apporter de nouvelles pistes thérapeutiques plus spécifiques contre la pathologie.
Procédures
Les animaux subiront plusieurs actes en fonction du protocole appliqué. Acte 1 : Les animaux recevront, des injections (durée de l’acte : 1 minute, animal anesthésié et analgésié localement). Cette injection sera réalisée dans tous les groupes une fois et un seul groupe recevra 3 injections supplémentaires une semaine après (1 jour d’intervalle/injection). Acte 2 : Les animaux recevront 5 injections (durée : 30 secondes, animal vigile), à 2 ou 3 jours d’intervalle. Acte 3 : Prélèvement sanguin (durée : 2 minutes, animal anesthésié et analgésié localement) une première fois durant le protocole et une dernière fois en fin de protocole.Acte 4 : Les animaux recevront, 1 injection / patte soit deux injections par souris (1 minute, animal anesthésié).
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, les animaux recevront des gestes plus ou moins douloureux au cours des différentes procédures. Une procédure d’injection répétée cinq fois en deux semaines pourra entrainer un inconfort local et transitoire au moment de l’injection dû au passage de l’aiguille dans la peau qui s’estompera 5 min après la procédure. . La vaccination des souris sera réalisée au niveau des deux pattes arrière qui entrainera un étirement local du muscle. Cette gêne temporaire associée à un gonflement du muscle durera entre 12h et 24h. La gêne disparait généralement 24h post injection. Lors des prélèvements sanguins un inconfort durant ces gestes est estimé à 1min correspondant au temps nécessaire à la réalisation du prélèvement. L’animal pourra également ressentir pendant 30 secondes une gêne lors de la réalisation du geste de compression pour arrêter le saignement éventuel post prélèvement. Les prélèvements et injections sont réalisées sous anesthésie gazeuse pouvant entrainer une phase de stress pour l’animal pendant environ 30 secondes avant la phase d’endormissement . De plus la phase de réveil avec le reprise de conscience sera également un facteur de stress qui durera environ 1min pour l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de récupérer différents tissus (sang, foie et rate) indispensables pour mener diverses analyses d’histologie, de biologie cellulaire, de biologie moléculaire, de biochimie et d’immunologie.
Remplacement
Dans ce projet, nous interrogeons les voies de régulations de l’auto-immunité dans le foie. Cet aspect ne peut être étudié chez le patient humain car le diagnostic de l’hépatite auto-immune est très tardif et les échantillons (biopsies) sont rares et de petites tailles. Par ailleurs, l’étude des mécanismes immunologiques dictant le développement de la pathologie n’est pas réalisable à l’échelle cellulaire et, à nos connaissances, il n’existe pas de système pertinent de remplacement. Ainsi, dans notre projet l’étude in vivo chez l’animal est indispensable car cela permet d’avoir accès à des échantillons de l’organe cible de la pathologie, le foie. Cela permet d’une part de mesurer les dommages hépatiques et d’autre part d’étudier l’environnement immunologique dans l’organe.
Réduction
Nous estimons que pour ce projet 1536 animaux seront étudiés. Les groupes expérimentaux seront constitués du minimum d’animaux nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique robuste des effets observés. Pour cela, le calcul des effectifs a été réalisée par un calcul de puissance, basé sur des expériences préliminaires réalisées dans des conditions comparables. Durant le projet, une réduction du nombre d’animaux pourra être envisagée en fonction des résultats expérimentaux obtenus. Nous pourrons être amenés à manipuler moins d’animaux si l’effet de certains composés s’avère significatif au cours des premières expériences. A l’inverse, si l’effet d’un composé rejette l’hypothèse émise dès les premières expériences, le composé sera exclu des prochaines expérimentations afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Dans le but d’extraire le maximum de données de chaque animal, plusieurs tissues seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire).
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Afin de limiter le stress des animaux, un foisonnement à base de frisures de papier kraft sera mis dans les cages. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, si toutefois des souris paraissent agressives lors du protocole, une séparation pourrait être nécessaire avec le maintien d’un enrichissement de type tunnel rouge ou dôme. Les utilisateurs passeront régulièrement du temps avec les animaux avant les procédures et en dehors des jours d’expérimentation pour limiter leur stress et les habituer à être manipulés. Les animaux seront conditionnés afin de limiter le stress lors de la manipulation. Ainsi avant toute manipulation, un stimulus sonore (tapotement sur la cage) sera réalisé avant récupération pour les phases de manipulation. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale gazeuse et d’une analgésie locale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur un tapis chauffant. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un symptôme réversible sera signalé, l’animal recevra les soins nécessaires. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l'euthanasie de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.
Choix des espèces
L’étude chez l’animal étant indispensable dans notre projet, nous travaillerons avec la souris (Mus musculus) qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. A nos connaissances, il n’existe pas de modèle pertinent pour étudier le développement de l’auto-immunité dans le foie utilisant une autre espèce animale. De plus, le modèle murin utilisé au cours de ce projet, et développé au sein du laboratoire, a déjà démontré sa pertinence pour étudier une réponse spécifique d’un antigène hépatique. Nous travaillerons avec des souris adultes de 8 à 12 semaines, car la croissance hépatique est achevée et le système immunitaire mature. A des âges plus avancés le système immunitaire ainsi que la capacité de prolifération du tissu hépatique peuvent varier, ce qui pourrait engendrer une plus grande variabilité au cours des expérimentations.
Induction de la cholestase chez le modèle de rat de la myopathie myotubulaire, et son évolution dans le contexte des thérapies géniques visant à guérir la maladie
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
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- Système musculosquelettique
Trop faibles pour se relever ou pour ronger, les rats mâles porteurs d'une myopathie myotubulaire reçoivent leur nourriture posée à même le sol de la cage. 170 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués pour prélèvement de tissus. Un régime alimentaire modifie la composition de leur bile afin de provoquer une cholestase, cette accumulation de bile qui détruit le foie, et leur sang est prélevé une à quatre fois par la veine de la queue ou par voie intra-orbitale. L'objectif est de reproduire chez le rat les atteintes hépatiques qui ont tué quatre enfants inclus dans l'essai de thérapie génique ASPIRO, pour rendre les prochains essais moins dangereux.
Objectifs
La myopathie myotubulaire est une maladie génétique rare et très grave qui touche surtout les garçons. Elle provoque une forte faiblesse des muscles, y compris ceux qui servent à respirer, et entraîne souvent le décès avant l’âge d’un an. Elle est causée par une mutation du gène MTM1, indispensable au bon fonctionnement musculaire. Un essai clinique appelé ASPIRO teste une thérapie génique : un virus inoffensif est utilisé pour apporter une copie normale du gène dans les muscles. Quatre patients, qui présentaient déjà des signes de mauvais fonctionnement du foie, sont décédés d’une insuffisance cholestatique. Chez ces patients, la bile ne parvient plus à s’écouler vers l’intestin et s’accumule dans le foie, endommageant l’organe jusqu’à sa défaillance. Chez le rat, modèle de la maladie, la faiblesse musculaire et respiratoire est très proche de celle des patients. En revanche, les rats ne développent pas de cholestase, probablement grâce à la composition moins toxique de leur bile. Mais ils présentent déjà certains signes de mauvais fonctionnement du foie liés au manque de myotubularine. Notre projet consiste à modifier l’alimentation des rats pour changer la composition de leur bile et la rendre plus proche de celle des humains. Cela devrait provoquer une cholestase et donc mieux reproduire les atteintes observées chez les patients. Nous pourrons alors tester si, dans ces conditions, la thérapie génique aggrave les troubles du foie comme chez les enfants. Ce modèle permettrait d’anticiper les risques et de rendre les futurs essais cliniques plus sûrs.
Bénéfices attendus
Des troubles hépatiques avaient été détectés pour un percentage des patients sélectionnés pour participer à l’essai clinique visant à guérir la myopathie myotubulaire par thérapie génique. Ces conditions n’impliquaient pas une raison d’exclusion de l’essai clinique, et beaucoup des patients ont vu leur état amélioré après le traitement. Néanmoins, certains sont décédés à cause des complications hépatiques. Avec ce travail, nous cherchons à créer chez le modèle de myopathie myotubulaire une condition hépatique, appelé cholestase, qui nous permettra à approcher les caractéristiques du modèle à celles des patients. De cette façon, de nouvelles thérapies pourraient être testés dans des conditions similaires à la réalité des patients de myopathie myotubulaire avec complications hépatiques, ce qui nous aiderait à réduire les effets indésirables.
Procédures
Prélèvements de sang sur animaux vivants anesthésiés: environ 5 min par rat, entre 1 et 4 fois en fonction de la durée de l’étude. Injections intraveineuses du traitement : environ 1 min par rat, 1 fois. Injection d’anesthésiques : environ 1min, 1 fois.
Impact sur les animaux
Les nuisances que les animaux utilisés dans cette étude peuvent rencontrer sont liées à trois circonstances : - Le phénotype délétère lié au manque d’expression de la protéine myotubularine. Les mâles Mtm1-KO développeront une faiblesse musculaire généralisée, ce qui rendra difficile leurs déplacements et l’accès à la nourriture située dans la partie supérieure des cages. Cette condition amène les rats vers une condition sévère. - Les prélèvements du sang seront réalisés par la veine caudale ou par voie intra orbital (ce qui provoque une douleur légère), à une fréquence de 1 à 4 reprises, entre 3 semaines et l’euthanasie. - Les traitements seront appliqués par injection (ce qui provoque une douleur légère), et ils risquent d’exacerber les problèmes hépatiques (interruption du flux biliaire vers le système digestif) chez les rats qui seront nourris avec un régime visant à changer la composition de la bile provoquant ainsi des douleurs modérées.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de pouvoir prélever les tissus qui nous permettront de déterminer les effets des régimes alimentaires seuls ou en combinaison avec la thérapie génique.
Remplacement
Le modèle de rat utilisé dans ce projet reproduit la myopathie myotubulaire avec fidélité, et grâce aux régimes alimentaires particuliers, nous visons à reproduire aussi les troubles hépatiques qu’on retrouve chez certains patients. Ces troubles, impliquant plusieurs organes du corps, ne peuvent pas être étudiés avec des cellules et nécessitent l’utilisation d’un animal. L’évaluation de l’état du foie dans le contexte de cette maladie et l’impact que la thérapie génique peut avoir sur lui n’est pas réalisable avec les modèles en laboratoire, car nous avons besoin d’étudier le métabolisme de la bile et le structure et l‘organisation des tissus hépatiques.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque étape de ce projet a été défini à partir de références bibliographiques permettant de déduire le nombre minimal d’animaux pour observer les effets des régimes alimentaires sur le foie des animaux sains et des animaux malades. La première étape de ce projet nous permettra d’évaluer l’impact de deux régimes différents sur l’état de santé du foie par rapport à un régime contrôle. Si cet effet est avéré, nous allons les tester dans le contexte des thérapies géniques, afin d’observer si nous observons les mêmes effets que chez les patients. Si un des deux régimes testés ne nous permets pas de nous rapprocher du phénotype du foie des patients, il ne sera pas testé dans le contexte de la thérapie génique.
Raffinement
Afin de garantir qu’ils puissent se nourrir correctement, la nourriture (pro-cholestase ou pas) sera placée au sol de la cage pour garantir son accessibilité, pour que les animaux malades (qui ont des problèmes musculaires qui les empêchent de se relever ou de bien ronger) puissent le manger facilement. Afin de réduire la souffrance et le stress des animaux, des points limites et un l’arbre décisionnel ont été établis, décrivant les actions adaptées à réaliser en fonction de l’état des animaux. En cas d’appréciation de manque des interactions grégaires ou d’apathie, des conditions d'hébergement particulières seront appliquées garantissant ainsi leur survie et leur bien-être (inclusion de cylindres en carton). Les animaux seront traités avec de la crème soulageant et des pansements en cas de démangeaisons. Des soins particuliers seront administrés en cas de besoin des animaux : désinfection locale de la peau, des soins dentaires et des soins oculaires.
Choix des espèces
Le rat a été choisi comme animal modèle pour les raisons suivants: 1) Un modèle de rat de la myopathie myotubulaire a été caractérisé et il reproduit avec fidélité les signes cliniques caractéristiques de la maladie humaine. 2) Les rats Mtm1-KO montrent une atteinte au niveau du foie. 3) La gestation étant de 3 semaines, les animaux nécessaires peuvent être obtenus rapidement. Les animaux utilisés seront tous des mâles, pour se rapprocher de la clinique, car seulement les garçons sont touchés par la maladie. Les rats seront utilisés à partir de la 3ème semaine, au sevrage, ce qui correspond au moment où les premiers symptômes de la maladie apparaissent ; à 5 semaines en l’absence de traitement, et à 10 semaines après traitement de thérapie génique. Les rats seront utilisés à partir de la 3ème semaine, au sevrage, ce qui correspond au moment où les premiers symptômes de la maladie apparaissent ; à 5 semaines en l’absence de traitement, et à 10 semaines après traitement de thérapie génique.
Identification de nouvelles molécules à visée anti-fibrotique dans un modèle murin – MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles urogénitaux
1 642 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leurs reins et leur foie, dont 1 052 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent deux injections par semaine pendant six semaines d'un produit qui provoque la fibrose, puis des gavages quotidiens par cycles de sept jours ou des injections de traitement deux fois par semaine, avec pesées bihebdomadaires et prélèvement sanguin sous anesthésie avant la mise à mort. Trente d'entre elles sont hébergées vingt-quatre mois pour vieillir, et une lignée déficiente pour le gène col4a3 perd l'audition vers six à huit semaines avant de développer une fibrose rénale. Le porteur écrit que neuf souris par groupe suffisent et que le nombre total estimé s'élève à 986 animaux, alors que le projet en déclare 1 642.
Objectifs
La fibrose est définie comme une cicatrisation anormale des tissus constatée après agression de ces derniers. Cette affection est irréversible et s'aggrave au cours du temps. Ce phénomène peut affecter la plupart des organes dont les poumons, les reins, le foie ou encore le coeur et représente un problème majeur de santé publique. En effet, 45% des décès dans les pays industrialisés seraient liés à la présence d’une composante fibrotique. Cependant, les mécanismes à l'origine de ce processus restent actuellement largement méconnus. De ce fait, un des enjeux majeurs de ces dernières années consiste à mieux appréhender les causes et les mécanismes de cette maladie afin de développer de nouveaux marqueurs diagnostiques, pronostiques et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Les modèles cellulaires ne permettant pas de refléter de manière satisfaisante le processus de fibrose, le recours à l'animal reste une étape indispensable pour démontrer le potentiel anti-fibrotique d'un candidat médicament. Les objectifs de notre projet sont les suivants : - Identifier de nouvelles molécules présentant un potentiel anti-fibrotique dans des modèles murins de fibrose hépatique et rénale. Ces molécules ont été sélectionnées préalablement dans notre laboratoire à la suite de tests in vitro. Pour cela, nous utiliserons différents modèles murins couramment décrits dans la littérature scientifique permettant d'induire (ou développant spontanément) des lésions de fibrose hépatique ou rénale. De plus, la fréquence de la plupart des pathologies fibrotiques étant fortement augmentée après 50 ans, nous inclurons dans notre étude des souris âgées pour être plus représentatifs de la pathologie humaine. - Confirmer le rôle instrumental d’un gène, miR-21, dans la fibrose dans un modèle de souris déficientes pour ce gène. En effet, les résultats préliminaires obtenus in vitro nous ont permis de démontrer l'implication de ce gène dans la fibrose. Nous souhaitons donc confirmer nos résultats dans un modèle complexe.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer le potentiel anti-fibrotique de 5 molécules dont l’intérêt a été démontré in vitro au préalable en utilisant à la fois des souris jeunes et âgées. A terme, ce projet devrait permettre d’obtenir la preuve de concept de l’utilisation de ce type de molécules dans la prise en charge des patients atteints de fibrose, pour lesquels les options thérapeutiques restent à l’heure actuelle très limitées.
Procédures
Partie 1 : 30 souris hébergées pour étudier leur vieillissement subiront un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (2min30) avant leur mise à mort. Durée totale = 24 mois Partie 2 : 360 souris recevront 2 injections par semaine pendant 6 semaines de l’inducteur de fibrose ou de son contrôle (30 sec/intervention) puis 2 injections par semaine pendant 3 semaines du traitement ou de son contrôle (30 sec/intervention). 180 souris recevront 2 injections par semaine pendant 6 semaines de l’inducteur de fibrose ou de son contrôle (30 sec/intervention) puis 1 gavage par jour (60 sec/intervention) pendant 1 cycle de 7 jours, répété 2 fois avec un intervalle de 2 semaines entre les 2. 180 souris recevront 2 injections par semaine pendant 6 semaines de l’inducteur de fibrose ou de son contrôle (30 sec/intervention) puis 1 gavage (60 sec/intervention). Elles seront également pesées 2 fois par semaine pendant 4, 6 ou 7 (en fonction du groupe) semaines (1 min/pesée) et subiront un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (2min30) avant leur mise à mort. Durée totale = 7 semaines. Partie 3 : 360 souris recevront 1 injection de l’inducteur de fibrose ou de son contrôle (30 sec/intervention) puis 2 injections par semaine pendant 3 semaines du traitement ou de son contrôle (30 sec/intervention). 180 souris recevront 2 injections par semaine pendant 6 semaines de l’inducteur de fibrose ou de son contrôle (30 sec/intervention) puis 1 gavage par jour (60 sec/intervention) pendant 1 cycle de 7 jours, répété deux fois avec un intervalle de 2 semaines entre les 2. 180 souris recevront 2 injections par semaine pendant 6 semaines de l’inducteur de fibrose ou de son contrôle (30 sec/intervention) puis 1 gavage (60 sec/intervention). Elles seront également pesées 2 fois par semaine pendant 5, 7 ou 8 semaines (en fonction du groupe) (1 min/pesée) et subiront un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (2min30) avant leur mise à mort. Durée totale = 8 semaines. Partie 4 : Étape 1 : 224 souris recevront 2 injections ou non / sem. pendant 6 semaines (30 sec). Étape 2 : 668 souris recevront 2 injections ou non / sem. pendant 6 semaines (30 sec) puis seront isolées pendant 16h pour le recueil passif des urines (répété 3 ou 4 fois en fonction des groupes). Un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (2min30) sera réalisé sur l'ensemble des souris avant leur mise à mort. Durée totale = 9,5 semaines à 24 mois en fonction des groupes.
Impact sur les animaux
Notre projet implique l’induction de lésions de fibrose hépatique ou rénale chez la souris. De plus, les souris déficientes pour le gène col4a3 présentent à 6-8 semaines une perte auditive neurosensorielle modérée et développent à 10 semaines une glomérulosclérose associée une fibrose rénale.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes (reins et/ou foie) dans le but d’étudier la fibrose et la sénescence dans ces organes.
Remplacement
Des résultats préliminaires in vitro obtenus au sein de notre laboratoire nous ont permis de : - démontrer l’implication de certains gènes tel que miR-21 ou de processus cellulaires comme la sénescence dans la fibrose. - pouvoir sélectionner 5 candidats médicaments pour nos évaluations de potentiel anti-fibrotique. Cependant, les modèles cellulaires ne permettent pas de refléter de manière satisfaisante le développement des lésions de fibrose. En effet, le processus de fibrose étant un processus dynamique mettant en jeu de nombreux types cellulaires, son étude ne peut se concevoir que sur organisme entier et de ce fait nécessite de recourir à l’expérimentation animale.
Réduction
Nos études in vitro effectuées en amont au laboratoire nous ont permis de réduire significativement le nombre de molécules d’intérêt à tester et de ce fait, de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour notre recherche. En ce qui concerne le nombre d’animaux utilisés dans notre étude, en émettant l'hypothèse d'une fréquence de l'événement de 10% sans traitement et de 75% avec traitement, il est nécessaire d'inclure 7 souris par groupe. Du fait de la variabilité de réponse pouvant être observée lors du processus de fibrose, nous envisageons d’utiliser 9 souris par groupe expérimental. De plus, les modèles utilisés dans ce projet sont complémentaires et utilisent des procédures déjà mises au point et couramment décrites. Les différentes procédures mises en œuvre pour ce projet ont été élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants. Pour la mise en œuvre de ce projet qui durera 5 ans, le nombre total d'animaux estimé est de 986 souris.
Raffinement
Le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques en expérimentation animale. Afin de limiter au minimum toute souffrance, stress ou angoisse des animaux, ces derniers seront hébergés selon les recommandations établies à raison de maximum 5 animaux par cage dans un environnement enrichi avec des cotons de nidification, et dans des conditions classiques de stabulation (température régulée, cycle jour/nuit). Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés de 7 à 10 jours dans leur salle d’hébergement. Les animaux seront manipulés individuellement avant la mise en place de l’expérimentation et dans une pièce séparée des autres animaux afin de réduire leurs stress et angoisse. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé de manière à s’assurer qu’ils ne présentent pas de signes de souffrance nécessitant l’arrêt des procédures et leur mise à mort. La souffrance sera évaluée par l’observation de paramètres de poids, de comportement et d’apparences reportés dans une grille standard permettant d’établir un score à ne pas dépasser. Tout animal dépassant ce score sera exclu du protocole et mis à mort.
Choix des espèces
Le modèle murin constitue un modèle de choix pour l’étude de la fibrose tissulaire de par notamment les nombreuses similitudes avec la pathologie observée chez l’homme. Le choix des lignées utilisées est dépendant des protocoles déjà existants et décrits dans la littérature. La fréquence de la plupart des pathologies fibrotiques étant fortement augmentée après 50 ans, nous inclurons dans notre étude des souris jeunes adultes et âgées pour être plus représentatifs de la pathologie humaine. Seul le modèle de fibrose rénale spontanée inclura de jeunes souris de 4 semaines en raison du développement précoce des lésions de la pathologie.
Prediction du volume d ‘ablation thermique par micro-onde dans le foie et le poumon.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles respiratoires
Issus de l'élevage porcin de type charcutier et pesant 50 à 60 kilos à trois ou quatre mois, 22 cochons vont être opérés sous anesthésie générale d'environ cinq heures et tués avant tout réveil. Chaque animal subit des brûlures par micro-ondes en plusieurs points du foie et du poumon, le porteur multipliant les sites d'ablation et les organes cibles sur un même individu pour réduire le nombre d'animaux. L'objet est de prédire le volume détruit par le dispositif, dont l'étendue varie du simple au quintuple d'un patient à l'autre à réglages identiques. Le porteur écrit qu'aucune nuisance n'est attendue puisque les animaux ne reprendront pas conscience, et présente la validation chez le cochon comme une étape "indispensable" avant la transposition à l'être humain.
Objectifs
Une piste thérapeutique prometteuse dans le traitement des "petites" tumeurs du foie et des poumons consiste à les brûler pour les détruire et guérir le patient. Le principe est de guider un cathéter d’ablation thermique à l’intérieur de la tumeur soit par guidage échographie ou radiologique (mise en place du dispositif à travers la peau - percutanée) soit à l'intérieur des bronches via le canal opérateur d'un fibroscope (pour la forme endobronchique du dispositif). L'utilsation d'un tel dispositif nécessite un parfait contrôle de la zone traitée. En effet, d’un patient à l’autre et d’un endroit à l’autre dans le foie ou le poumon, le volume d’ablation peut varier du simple au quintuple avec les mêmes paramètres imposés au niveau du dispositif qui génère les micro-ondes (générateur). Cela peut entrainer (i) des traitements dangereux : une zone d’ablation incontrôlée peut provoquer un trou dans le foie ou le poumon, dont les conséquences peuvent être catastrophiques pour le patient, (ii) des traitements inefficaces : une zone d’ablation trop petite n’ayant pas détruit la tumeur dans son ensemble ne guérit pas le patient. L’objectif du projet est de confirmer en conditions réelles dans l’animal (in vivo) les résultats déjà obtenus en laboratoire sur des tissus isolés (ex vivo). Nous réaliserons des ablations thermiques dans différentes conditions de réglages au niveau du générateur (puissance et durée), nous mesurerons la température en profondeur dans le tissu pendant l’ablation afin de vérifier qu’elle permet bien de prédire la taille de la zone détruite, puis nous contrôlerons ensuite cette taille réelle grâce à un scanner et à l’examen direct des organes prélevés après l’expérience.
Bénéfices attendus
L'objectif du projet est de proposer une nouvelle technique de traitement des petites tumeurs du foie et du poumon par abalation thermique à l'aide de micro-onde. Le projet permettra de valider la sécurité et de définir le meilleur schéma d'utilisation du dispositif d'ablation thermique pour le traitement des petites tumeurs isolées (moins de 2 cm) avant de pouvoir proposer cette alternative thérapeutique chez l'Homme.
Procédures
Les animaux de cette étude subiront une anesthésie générale d'environ 5h avec ponction percutanée et/ou fibroscopie bronchique.
Impact sur les animaux
L’ensemble des procédures expérimentales sera réalisé sous anesthésie générale. A aucun moment l’animal ne sera conscient ni susceptible de ressentir la douleur. S'agissant de procédures expérimentales sans réveil, aucun effet indésirable ni nuisances ne sont attendus pour l'animal qui sera euthanasié en fin de procédure.
Devenir
A la fin de l'étude, tous les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des études histologiques comparatives entre les images obtenues lors des interventions et les pièces anatomiques (foie et poumon) prélevées post-mortem.
Remplacement
Les modèles numériques et ex-vivo actuels ne permettent pas de reproduire de manière satisfaisante la dynamique respiratoire et la perfusion physiologique des organes cibles ainsi que l'effet isolant des structures anatomiques (cage thoracique, tissus péri-organe) sur la propagation de la chaleur. Ces paramètres physiologiques conditionnent à la fois le volume d'ablation obtenu et la fiabilité du signal de température. La validation in-vivo constitue donc une étape indispensable pour affiner nos algorithmes prédictifs dans des conditions représentatives de la pratique clinique, préalablement à leur transposition chez l'Homme.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude, deux animaux seront utilisés à la phase préliminaire afin de déterminer le protocole de faisabilité et la répétabilité de la plateforme d'administration qui sera ensuite appliquée dans chacun des groupes. La mutliplication des sites d'ablation par organe et en choisissant de réaliser, pour un même animal, les tests sur deux organes cibles, nous permet de réduire considérablement le nombre d'animaux.
Raffinement
Une période d’acclimatation d’une semaine minimum sera respectée entre l’arrivée à l’animalerie du laboratoire et l’inclusion des sujets dans le protocole de recherche. L’hébergement en groupe de deux favorisera le contact régulier entre congénères. Un environnement adapté à chaque phase de l’expérimentation réduira l’angoisse des animaux (accompagnement et anxiolyse durant le transfert depuis l’animalerie jusqu’en salle d’intervention). L'environnement sera enrichi (activité de fouissement encouragée, medecine ball, jeux dans le couloir, pesée sous forme de jeux avec récompense, planche à gratter, distributeur d’aliment). Un contrôle quotidien du bien-être animal sera effectué par un animalier. Lors de ce contrôle, des observations basées sur l’apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales attendues aux stimuli externes (peu enclins aux manipulations, tentative de fuite) seront réalisées. Ces contrôles permettront de repérer tout animal malade ou blessé et de prendre les mesures appropriées en suivant les grilles d'évaluation.
Choix des espèces
Le modèle animal choisi est le porc. La physiologie circulatoire et l’anatomie du système pulmonaire chez le porc est proche de celle de l’Homme. Par ailleurs, les dimensions de la cage thoracique du cochon permettent d’insérer entièrement notre dispositif dans son poumon ce qui n’est pas possible chez des animaux de petite taille (rongeurs par exemple). De même les dimensions et l'anatomie du foie du porc est proche de celle de l'Homme ce qui facilite le transfert de la technologie de l'animal à la pratique clinique humaine. Nous utilisons des porcs de type charcutier entre 50kg et 60 kg (3-4 mois) qui possèdent des caractéristiques anatomiques correspondants aux besoins de nos procédures.
Réparer l’œsophage chez l’enfant : test préclinique d’un greffon chez le mini-porc
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
8 mini-porcs Yucatan vont être utilisés, tous tués à l'issue pour l'analyse de la zone greffée, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Opérés jeunes, à un âge que le porteur rapproche de celui d'un nourrisson, ils reçoivent sous anesthésie générale de deux à trois heures un greffon d'œsophage tiré d'un tissu adulte vidé de ses cellules, tenu par un tube souple qu'une endoscopie retire trois mois plus tard. Ils sont nourris de liquide pendant quatre semaines. Le porteur annonce une douleur possible pendant un à deux jours, une gêne pour avaler et le risque que le tube se bouche ou se déplace, avec toux, fausses routes et atteinte de la couture de l'œsophage, pour offrir "à terme" une autre option que les opérations actuelles chez l'enfant, si la méthode se confirme "sûre et réalisable". Il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative non animale permettant d'évaluer complètement cette technique", les méthodes sans animaux ne reproduisant pas, selon lui, la déglutition, la cicatrisation, les défenses immunitaires et la croissance.
Objectifs
Certaines maladies sont à l’origine de la perte de certaines parties de l’œsophage chez l’enfant, ou le rendent inutilisable. Les opérations chirurgicales actuelles pour les traiter (par exemple remplacer l’œsophage par un morceau d’estomac ou de côlon) sont lourdes et peuvent entraîner des complications et des réinterventions. Nous testons une autre voie : un greffon d’œsophage préparé en laboratoire à partir d’un tissu d’adulte dont on a retiré toutes les cellules. Il ne reste que la charpente du tissu, comme une coquille vide que le corps accepte mieux et qui peut se recoloniser par des cellules ensuite. Ce greffon est remodelé pour avoir un diamètre adapté à l’enfant. Avant d’aider des enfants, nous devons vérifier la faisabilité et la sécurité dans un organisme vivant. Les mini-porcs sont choisis car leur taille, leur croissance et la chirurgie utilisée se rapprochent de celles d’un enfant. Les tests sur maquette ou au laboratoire ne permettent pas de reproduire la déglutition, la cicatrisation, l’immunité et la croissance. Les connaissances acquises (décellularisation, remodelage, soins après l’opération) pourront aussi bénéficier à d’autres greffes pédiatriques et renforcer le potentiel de l’ingénierie tissulaire.
Bénéfices attendus
Ce projet peut apporter des bénéfices à plusieurs niveaux, à court et à long terme, s’il confirme que la méthode est sûre et réalisable. Pour la recherche médicale. Les résultats enrichiront les données de base (sécurité, faisabilité, tolérance) nécessaires pour préparer un essai chez l’enfant. Les échantillons et observations aideront à comprendre comment le greffon se répare dans le temps. Pour les enfants concernés. Offrir, à terme, une autre option que les opérations actuelles quand l’œsophage manque ou ne fonctionne pas. Le greffon est pensé pour grandir avec l’enfant. On espère moins de complications, moins de réinterventions et une alimentation plus simple après la guérison. Pour la sécurité des soins. Améliorer la technique chirurgicale, définir un suivi après l’opération simple et clair : ce qu’il faut observer au quotidien, quels signes d’alerte surveiller, quand revoir l’animal et quelles actions entreprendre. L’objectif est de repérer plus tôt tout problème, de mieux le traiter et ainsi de réduire les complications et les réinterventions. Pour les familles. Si la méthode fonctionne, elle pourrait conduire à moins d’allers-retours à l’hôpital et à moins d’actes lourds, donc à un stress moindre pour l’enfant et ses proches. Cela peut harmoniser les pratiques entre hôpitaux et améliorer la prise en charge.
Procédures
Chaque animal aura une seule opération, réalisée alors qu’il est endormi complètement (anesthésie générale), pour mettre en place un morceau d’œsophage préparé et un petit tube souple (prothèse) à l’intérieur. Elle sert de tuteur. Elle maintient le passage ouvert, protège les coutures et stabilise le greffon pendant qu’il se fixe et cicatrise. Elle aide à éviter les rétrécissements et à ce que les parois ne se collent pas. Durée : 120 à 180 minutes. À 3 mois, un examen par caméra souple (endoscopie), aussi sous anesthésie générale, servira à retirer le tube. Durée : ~20 minutes. Si un problème apparaît, un deuxième examen pourra être fait. Durée : ~30 minutes. Des pesées rapides seront réalisées (environ 1 à 3 minutes). En dehors de ces actes, aucune autre manipulation ne sera faite sur un animal éveillé. Des médicaments contre la douleur et une surveillance vétérinaire sont prévus.
Impact sur les animaux
Après l’opération, les animaux peuvent avoir mal pendant 1 à 2 jours, être très somnolents, parfois un peu refroidis, et stressés. Ils peuvent ressentir une gêne pour avaler et bouger un peu moins au début. Les examens par caméra (endoscopies) peuvent provoquer une petite irritation locale. Le principal risque que nous voulons éviter est que le petit tube intérieur se bouche ou se déplace. Cela pourrait gêner la déglutition, faire remonter les liquides, provoquer de la toux ou des fausses routes et abîmer la couture de l’œsophage. Pour limiter ces risques : alimentation liquide 4 semaines, antalgiques, et surveillance vétérinaire rapprochée avec retrait du tube à 3 mois.
Devenir
Tous les porcs inclus dans ce projet seront mis à mort en fin d’étude afin de procéder aux analyses histologiques détaillées de la zone de greffe, étape indispensable pour évaluer la réparation tissulaire et au bon fonctionnement du greffon.
Remplacement
Nous avons d’abord cherché des solutions sans animaux (tests en laboratoire, modèles informatiques, mannequins, pièces d’organe artificielles). Ces méthodes aident, mais elles ne reproduisent pas ce qui se passe dans un corps d’enfant vivant : la circulation du sang, la déglutition répétée, la cicatrisation, les défenses immunitaires et la croissance. Pour savoir si le greffon d’œsophage est bien toléré, s’il tient en place, s’il reste ouvert pour laisser passer les liquides et s’il permet une alimentation normale, il faut l’observer dans un organisme vivant. Le mini-porc a été choisi car sa taille et son fonctionnement digestif se rapprochent de ceux d’un enfant ; il permet d’utiliser les mêmes gestes chirurgicaux et outils que chez l’humain. Il n’existe donc pas d’alternative non animale permettant d’évaluer complètement cette technique avant d’envisager une étude chez l’enfant. Si, au cours du projet, une méthode sans animal devenait disponible et suffisante pour répondre aux mêmes questions, elle remplacerait l’essai chez l’animal.
Réduction
Le projet a été conçu pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en assurant des résultats fiables. Des tests préalables en laboratoire ont permis de préparer les greffons et d’anticiper les difficultés mécaniques liés aux sutures. Cela permet d’éviter des essais inutiles chez l’animal. Le nombre d’animaux nécessaires a été défini avec soin, en s’appuyant sur les résultats d’études animales précédentes. Chaque animal suivra un protocole précis permettant d’obtenir un maximum d’informations. Ce projet utilise ainsi le nombre minimal d’animaux possible, dans le respect du bien-être animal et des exigences scientifiques.
Raffinement
Toutes les étapes du projet seront réalisées sous anesthésie générale afin d’éviter toute douleur pendant les interventions. Des traitements contre la douleur seront systématiquement administrés après l’opération et adaptés à l’état de chaque animal. Les animaux seront suivis chaque jour, avec une attention particulière portée à leur comportement, leur alimentation et leur respiration. Un environnement confortable et enrichi sera mis en place pour réduire leur stress. Des points limites clairs ont été définis et seront appliqués. Les animaux seront hébergés dans un cadre favorisant leur bien-être. Ces mesures visent à garantir une prise en charge respectueuse, limitant au maximum la souffrance animale.
Choix des espèces
Le porc a été choisi pour sa ressemblance anatomique avec l’humain, notamment au niveau de l’œsophage. Contrairement aux petits animaux, il permet de réaliser les gestes similaires à ceux effectués chez l’homme. Le minipig Yucatan a été retenu pour sa taille, sa croissance lente et sa bonne tolérance aux manipulations, ce qui permet un suivi prolongé. Il sera utilisé à un âge jeune correspondant au stade de développement d’un nourrisson. Ce choix permet d’évaluer une technique qui pourrait, à terme, éviter des opérations lourdes chez les enfants, en proposant une réparation de l’œsophage sans utiliser d’organes sains.
Impact des PFAS et emulsifiants alimentaires sur la santé de l’axe microbiote-intestin-cerveau en condition de barrière intestinale intègre ou fragilisée par un stress chronique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1 512 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui va du léger au sévère, 540 d'entre elles en sévère. Elles reçoivent des polluants par la bouche dix fois en quatre-vingt-dix jours, passent une heure par jour perchées sur une plateforme au milieu d'un bac d'eau pendant onze jours, puis subissent l'implantation d'un dispositif sous la peau et le gonflement progressif d'un ballonnet dans le rectum, en cinq étapes douloureuses de dix secondes. Arrivées à l'animalerie à quatre semaines, elles servent à étudier l'effet d'une exposition précoce aux PFAS et aux émulsifiants alimentaires sur l'intestin et le cerveau. Le porteur écrit que les effets attendus "demeurent globalement transitoires".
Objectifs
Notre mode de vie moderne nous expose chaque jour à différentes substances chimiques présentes dans l’environnement et dans notre alimentation. Certaines d’entre elles, utilisées pour rendre les objets du quotidien antiadhésifs ou imperméables (comme certains ustensiles de cuisine, emballages ou textiles), attirent aujourd’hui l’attention car elles persistent longtemps dans l’environnement et peuvent s’accumuler dans l’organisme. Leurs effets sur la santé ne sont pas encore totalement connus, mais des données suggèrent qu’elles pourraient influencer le métabolisme, la fertilité, le système immunitaire ou certains processus biologiques à long terme, surtout en cas d’exposition prolongée ou à faibles doses. D’autres additifs alimentaires, utilisés pour améliorer la texture et la conservation des produits transformés, sont considérés comme sûrs dans les conditions actuelles. Cependant, des recherches récentes montrent qu’ils pourraient modifier l’équilibre du microbiote intestinal (les bactéries qui vivent dans nos intestins) et provoquer de légères réactions inflammatoires. Le système digestif joue un rôle clé car il est en contact direct avec ces substances. Un déséquilibre de cet équilibre fragile pourrait contribuer à l’apparition de troubles fonctionnels intestinaux, comme le syndrome de l’intestin irritable, caractérisé par une hypersensibilité abdominale. Ce projet a trois objectifs principaux : Étudier les effets d’une exposition prolongée à certaines substances polluantes environnementales et alimentaires, seules ou combinées, sur la barrière intestinale, le microbiote, les défenses immunitaires et la sensibilité digestive. Évaluer l’impact d’un stress chronique associé à ces expositions, afin de mieux comprendre leurs interactions sur la santé intestinale. Approfondir la compréhension de l’« exposome intestinal », c’est-à-dire l’ensemble des facteurs environnementaux qui peuvent influencer la santé digestive tout au long de la vie. En combinant ces approches, le projet vise à mieux comprendre comment certaines expositions environnementales peuvent contribuer à des déséquilibres digestifs persistants.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment certaines substances présentes dans notre environnement et notre alimentation (comme certains polluants ou additifs alimentaires appelés émulsifiants) peuvent influencer la santé intestinale et la façon dont notre corps perçoit les signaux digestifs. À court terme, il apportera de nouvelles connaissances scientifiques en étudiant, pour la première fois, l’effet combiné de ces expositions sur le microbiote intestinal (les bactéries qui vivent dans nos intestins), sur la barrière intestinale (qui protège l’organisme) et sur la communication entre l’intestin et le cerveau. Ces résultats pourraient permettre d’identifier des signes précoces de déséquilibre intestinal, utiles pour la prévention et le diagnostic. À plus long terme, les données obtenues pourraient contribuer à améliorer les recommandations de santé publique concernant certains additifs ou polluants persistants, et encourager le développement d’alternatives plus respectueuses de la santé et de l’environnement. Enfin, en approfondissant la compréhension des liens entre environnement, microbiote et confort digestif, ce projet pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies destinées à améliorer la qualité de vie des personnes souffrant de troubles intestinaux fonctionnels.
Procédures
Types d’interventions prévues : - Administration orale : les animaux recevront une administration orale répétée 10 fois sur une période de 90 jours. Chaque manipulation, d’une durée d’environ 10 secondes, est réalisée par du personnel expérimenté et formé afin de limiter le stress. - Exposition à un stress chronique : Certains animaux seront placés sur une petite plateforme au centre d’un bac rempli d’eau, pendant 1 heure par jour, et ce durant les 11 derniers jours d'exposition (5 jours de stress, 2 jours de repos, 4 jours de stress). - Prélèvements sanguins : Du sang sera prélevé au niveau de la queue des animaux éveillés, à trois moments de l’étude (avant, au milieu et à la fin). Chaque prélèvement dure moins de 2 minutes et respecte les volumes autorisés par la réglementation. - Mesure de la sensibilité intestinale : sous anesthésie générale, un petit dispositif sera implanté sous la peau pour mesurer la réaction de l’intestin. L’intervention, d’une durée maximale de 30 minutes, sera suivie d’une période d’hébergement individuel d’une durée de 4 jours, afin de permettre une récupération optimale et d’assurer une surveillance individualisée. La mesure de la réaction intestinale consiste à introduire un petit ballonnet dans le rectum, qui est gonflé progressivement en cinq étapes. Chaque étape dure 10 secondes, avec des pauses de 5 à 10 minutes entre elles. Cette procédure est réalisée une seule fois par animal.
Impact sur les animaux
Les effets attendus au cours de ce protocole peuvent varier selon la nature des interventions, mais demeurent globalement transitoires. 1. Administration orale (polluants et traceur fluorescent) : Cet acte peut provoquer un léger stress ou une agitation passagère liée à la manipulation. Dans de rares cas, une irritation mineure de la gorge ou de l’œsophage peut apparaitre. La répétition de l’administration (tous les 10 jours sur une période de 90 jours) peut entraîner un stress limité, surveillé grâce à un suivi comportemental adapté. 2. Administration d’émulsifiants dans l’eau de boisson : Aucun inconfort particulier n’est attendu. De petites variations dans le comportement alimentaire ou le transit digestif peuvent apparaitre, selon la tolérance individuelle des animaux. 3. Exposition à un stress psychologique chronique : Cette étape peut entraîner une contrainte psychologique temporaire, se traduisant par une diminution de la mobilité, une vigilance accrue ou des signes de stress passagers. 4. Évaluation de la sensibilité intestinale : La courte intervention chirurgicale sous anesthésie générale peut s’accompagner d’une baisse transitoire de l’activité ou de l’appétit, ainsi que de signes d’inconfort abdominal modéré. Par la suite, la mesure de la sensibilité intestinale peut s’accompagner d’une douleur modérée pendant 10 secondes à chaque étape, suivie d’inconfort et d’un stress temporaire. 5. Hébergement individuel : Cette situation peut représenter une source de stress social, se manifestant par une anxiété passagère, une baisse d’activité ou des comportements répétitifs.
Devenir
Tous les animaux en fin de procédure, seront mis à mort afin d’effectuer des prélèvements de tissus post-mortem pour différentes analyses et dosages.
Remplacement
Des modèles cellulaires seront utilisés pour étudier les effets potentiels des polluants et des additifs alimentaires sur l’épithélium intestinal. Cependant, à ce stade du projet, les approches in vitro ou ex vivo ne permettent pas de reproduire la complexité de la physiologie digestive et des interactions entre microbiote, système immunitaire et système nerveux entérique. L’utilisation d’un modèle in vivo reste donc nécessaire pour comprendre de manière intégrée les conséquences d’une exposition prolongée à ces composés sur la santé intestinale, notamment sur les mécanismes de régulation de l’inflammation et de la sensibilité intestinale.
Réduction
Les études préliminaires menées dans le cadre de ce projet ont permis d’optimiser la procédure d’évaluation de la sensibilité intestinale, tant sur le plan technique que sur celui du bien-être animal. L’expérience acquise par l’équipe (rapidité d’exécution, maîtrise des gestes, conditions post-opératoires adaptées, maintien temporaire d’une température ambiante de 26 °C) a permis de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables, sur la base d’un calcul de puissance statistique. Ainsi, le nombre de souris par groupe est passé à 12 ou 15 suivant les protocoles, tout en maintenant la robustesse des analyses. Les résultats seront confirmés par deux expérimentations indépendantes afin d’assurer leur reproductibilité. Des analyses statistiques multivariées et corrélatives permettront d’exploiter pleinement les données générées, garantissant une utilisation optimale des animaux inclus. La taille des groupes expérimentaux est strictement limitée au minimum nécessaire pour atteindre la puissance scientifique attendue, conformément au principe des 3R.
Raffinement
Le bien-être des animaux est une priorité tout au long de l’étude. Les souris sont hébergées dans des conditions conformes aux recommandations européennes, avec un environnement enrichi qui favorise leurs comportements naturels. Les manipulations, comme les pesées hebdomadaires, sont réalisées de manière douce et progressive afin de réduire le stress et faciliter l’habituation. Lors des périodes où les animaux doivent être hébergés individuellement, les cages transparentes permettent de conserver des interactions visuelles, olfactives et auditives avec leurs congénères. Des matériaux de nidification (fibres de coton) et des objets d’enrichissement (bûchettes de bois) sont fournis pour stimuler leurs activités naturelles de construction et de rongement. Une observation quotidienne, notamment lors de la distribution des régimes alimentaires, permet de détecter rapidement tout changement de comportement ou d’état général. Des critères précis (points limites) garantissent une intervention rapide en cas de signe de souffrance ou de détérioration du bien-être. Les procédures peuvent être interrompues ou adaptées sur avis vétérinaire. Lors des interventions, toutes les précautions sont prises pour éviter la douleur et assurer une récupération optimale : anesthésie adaptée, maintien de la température corporelle, environnement chauffé après l’opération et réhydratation si nécessaire. L’ensemble du protocole a été conçu pour garantir un haut niveau de bien-être animal tout en préservant la qualité scientifique des résultats. Le projet respecte la réglementation en vigueur (Directive 2010/63/UE et Code rural) ainsi que les principes éthiques de l’expérimentation animale. Chaque étape applique les principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement), avec pour priorités la limitation du nombre d’animaux, la minimisation des contraintes et le maintien du confort. Toutes les procédures seront réalisées par du personnel formé et expérimenté, sous la supervision d’un vétérinaire, afin d’assurer à la fois la prise en charge optimale des animaux et la fiabilité scientifique des résultats.
Choix des espèces
Le modèle murin (Mus musculus) est un modèle de référence pour l’étude de la physiologie digestive et de la sensibilité intestinale. Il est largement utilisé en recherche biomédicale en raison de sa similarité avec l’humain sur les plans immunologique, métabolique et neurophysiologique, ainsi que de la disponibilité de nombreux outils génétiques et analytiques permettant d’explorer finement les mécanismes d’action des expositions environnementales. Ce modèle a été retenu car il est bien caractérisé, stable sur le plan génétique et couramment utilisé dans les études portant sur le microbiote, la réponse immunitaire et les effets du stress. Le modèle de stress (évitement passif de l’eau) a été spécifiquement validé avec cette lignée. Plusieurs travaux récents ont montré que ce modèle reproduit de manière fiable certaines modifications physiologiques observées lors de situations de stress prolongé, notamment une altération modérée de la motricité intestinale, une adaptation de la production de mucine et une modulation des réponses neuroendocrines et immunitaires. Ces caractéristiques font de ce modèle un outil pertinent pour explorer les interactions entre stress, microbiote, inflammation et fonction barrière intestinale. Les souris seront âgées de 4 semaines à leur arrivée à l’animalerie, suivies d’une période d’acclimatation d’une semaine avant le début des expositions. Le choix de jeunes souris permet d’étudier l’impact d’une exposition précoce à un mélange des polluants environnementaux et des additifs alimentaires, seuls ou combinés, et d’en suivre les effets à long terme sur la santé digestive et la communication intestin-cerveau. À la fin du protocole, les animaux auront environ 16 semaines, ce qui correspond à un stade jeune adulte, couramment utilisé pour les études de physiologie intégrée. Le choix de la souris, plutôt que d’une autre espèce, s’explique également par la disponibilité d’un large corpus de données de référence dans des conditions expérimentales similaires. Cela favorise la comparabilité des résultats, limite le nombre d’animaux nécessaires et évite la duplication d’expériences, conformément au principe de Réduction des 3R.
Humanisation du foie de souris et modélisation de pathologies hépatiques [MODIFICATION]
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Les souris de la souche employée sont immunodéficientes et portent une mutation qui tue leurs propres cellules du foie, ce qui permet d'y greffer des cellules hépatiques humaines, parfois avec des cellules souches qui leur donnent aussi un système immunitaire humain. 8800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments contre des infections virales, le cancer du foie, des maladies métaboliques ou l'insuffisance hépatique. Les procédures comprennent quatre à sept injections d'un composé qui détruit les cellules du foie et les cellules souches, la greffe de cellules humaines, notamment par la veine porte avec un risque hémorragique accru, l'induction de maladies, l'administration des candidats médicaments et des prises de sang. Le porteur estime que l'humanisation ne réussit que chez la moitié environ des souris, et dit avoir fixé l'effectif sans approche statistique, d'après les études des années antérieures et une croissance anticipée "en accord avec le plan commercial". Il indique que des souris pourront passer dans d'autres projets de l'établissement, dont une formation interne aux gestes techniques, et que les autres seront tuées parce qu'elles "ne recouvreront pas leur état de santé". 200 souris sont déclarées réutilisées.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de caractériser la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments visant par exemple à guérir les infections virales, le cancer du foie ou des maladies métaboliques, ou encore des traitements indiqués en cas d’insuffisance hépatique. Pour ce faire nous utiliserons des souris au foie humanisé permettant de recréer un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. Le protocole consiste à remplacer les cellules hépatiques de souris par des cellules hépatiques humaines. Dans certains cas, la présence d’un système immunitaire humain, en complément d’un foie humanisé, est indispensable pour étudier des processus physiopathologiques spécifiques, comme dans les maladies métaboliques (ex. : MASH) ou virales (ex. : dengue). Dans ces cas, une double humanisation, incluant à la fois le foie et le système immunitaire des souris, sera envisagée afin de répondre de manière optimale aux besoins scientifiques et aux questions posées. Les cellules hépatiques humaines (et immunitaires, le cas échéant) pourront ensuite, par exemple, être infectées par des virus humains spécifiques. Ce modèle permettra de reproduire le métabolisme du foie humain dans une espèce facilement manipulable et plus acceptable sur le plan éthique que les primates non-humains.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de recréer, chez la souris, un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. En cas de besoin, il sera également possible d’humaniser simultanément le compartiment immunitaire et hépatique. Cette double humanisation constitue un atout majeur, car elle permet de modéliser plus fidèlement les interactions entre le foie et le système immunitaire humain, particulièrement dans le cadre de maladies métaboliques ou infectieuses. De plus, les cellules hépatiques humaines pourront être infectées par des virus humains spécifiques, et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, éthiquement plus acceptable que les primates non-humains, et bien caractérisée au niveau génétique. Les propriétés génétiques de la souche immunodéficiente utilisée pourront également être exploitées pour l’étude des mécanismes d’insuffisance hépatique et des thérapies ciblant cette condition. Enfin, l’intégration d’un système immunitaire humanisé renforcera la pertinence des modèles expérimentaux en permettant d’évaluer les réponses immunitaires humaines face à des pathologies complexes, notamment dans le contexte de traitements antiviraux ou de maladies impliquant des dysfonctionnements immunitaires.
Procédures
[MODIFICATION] 4 à 7 injection(s) de composé(s) induisant la mort des hépatocytes et des cellules souches et permettant au moment de la greffe de réduire la présence des macrophages murins présent dans le foie et empêchant les hépatocytes humains de s’implanter. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Injection d’analgésique : moins d’une minute. Greffe des cellules ou implants thérapeutiques : entre 5 et 30 minutes. En parallèle, des candidats médicaments seront administrés par voie respiratoire, orale, ou injectable pour évaluer leurs activités thérapeutiques. Pour les prélèvements sanguins, les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon une limite fixée. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole d’étude et sera contrôlée par un vétérinaire.
Impact sur les animaux
Des nuisances peuvent être induites par [MODIFICATION] l’identification par puce électronique classique ou thermopuce : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection, la ou les injection(s) de composé induisant la mort des hépatocytes et des cellules souches, les risques inhérents à tout acte chirurgical, la greffe des cellules, une gêne au niveau du transit intestinal liée au déplacement des viscères dans les heures suivant l’injection d’hépatocytes via la veine porte, le risque hémorragique accru pour l’injection d’hépatocytes via la veine porte, l’administration de traitements, la greffe d’implants thérapeutiques (patchs ou autres), l’induction des maladies, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques et/ou les prélèvements sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Dans le cadre d’une utilisation continue, les animaux issus de ce projet et ayant subit une humanisation pourront être utilisés dans d’autres projets autorisés par le Ministère dans l’établissement utilisateur. Des souris pourront être utilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Sinon, les animaux sont euthanasiés car ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.
Remplacement
Il n'existe à ce jour, aucune alternative performante capable de prédire l'activité/toxicité d'un candidat médicament agissant sur le foie, qui présente une architecture et un fonctionnement complexes qui ne peuvent être reproduits in vitro ou chez d'autres animaux (zébrafish, drosophiles, ...). La souris au foie humanisée constitue donc un modèle scientifiquement valide et pertinent pour le développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre les pathologies hépatiques, telles que les maladies virales ou métaboliques, les insuffisances hépatiques et le cancer chez l’humain.
Réduction
Un total de 8800 souris sera utilisé, couvrant une période de [MODIFICATION] 4 ans. 78 études précliniques de 50 souris seront réalisées, sachant que le processus d’humanisation n’est efficient qu’à environ 50%, soit 7800 souris. 1000 souris supplémentaires seront utilisées dans le cadre de la PE2, permettant de réaliser pour chacune des 4 étapes, 5 études précliniques de 50 souris. L’humanisation du foie des souris via injection d’hépatocytes dans la veine porte est une mesure de réduction par l’amélioration attendue de la réussite de la greffe (autour de 50% pour l’injection splénique d’hépatocytes) et donc l’utilisation de moins d’animaux. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum.
Raffinement
En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Les souris seront hébergées dans une atmosphère disposant d’un cycle lumière-obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès que nécessaire (par exemple en cas d’altération de l’état général d’une souris notée lors de l’observation quotidienne). Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Les fréquences des prélèvements sanguins sont limitées et une réhydratation est prévue pour tout prélèvement unique à partir de 8mL/kg. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique et de la perte de poids.
Choix des espèces
90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. La souche immunodéficiente utilisée présente une mutation génétique induisant la mort sélective des hépatocytes murins, ce qui permet de greffer simultanément en plus des cellules souches des hépatocytes humains. Cette approche vise à humaniser à la fois le système immunitaire et le foie. Cette double humanisation offre la possibilité d’évaluer des solutions thérapeutiques pour des maladies métaboliques et virales impliquant le système immunitaire, ainsi que pour les cas de défaillance hépatique. L'humanisation du foie se déroulera sur des animaux âgés de 5 à 10 semaines. Il a été décrit que travailler avec des animaux jeunes permet une meilleure prise de greffe. Par ailleurs, la taille de la rate étant, proportionnellement, supérieure, la transplantation des cellules sera facilitée. Les pathologies hépatiques pourront être induites sur les animaux humanisés ou non.
Exacerbation de la colite expérimentale par la co-exposition à l’alcool et aux mycotoxines
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Gavées une fois par jour, trente-cinq fois au total, sous contention manuelle, 768 souris reçoivent de l'alcool et des mycotoxines puis un agent inflammatoire pendant cinq jours pour déclencher une colite. Toutes sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et tuées à l'issue pour prélever les organes. Le porteur décrit des diarrhées importantes, des déshydratations, une inflammation généralisée et une perte de poids qui durent jusqu'à la mise à mort, l'objet du projet étant de démontrer que l'alcool et les mycotoxines aggravent la sévérité des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. Il classe pourtant le gavage en nuisance modérée, tout en décrivant le risque de fausse route avec détresse respiratoire et hypersalivation.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin touchent un nombre croissant de patients en Europe. L’analyse des données du registre qui répertorie les cas de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin dans le nord de la France montre que le nombre de cas est en forte augmentation, en particulier chez les jeunes et adolescents (10 à 16 ans). Les prédictions pour 2030 sont alarmantes puisque la prévalence des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin pourrait atteindre 0,5% à 1% de la population générale. Ces maladies, marquées par des poussées inflammatoires récurrentes, sont influencées par des facteurs environnementaux, notamment l’alcool et les mycotoxines (toxines naturelles produites par les champignons). L’alcool, en altérant la barrière intestinale, et les mycotoxines, principaux contaminants naturels de notre alimentation, exacerbent l’inflammation intestinale et pourraient aggraver la progression et la sévérité des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Des études ont montré que les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin conservaient une consommation d’alcool équivalente à celle de la population générale et que, malgré les contre-indications, l’abstinence ne fait pas partie des recommandations actuelles. D’autre part, le réchauffement climatique favorise la prolifération des mycotoxines qui contaminent de plus en plus notre alimentation. L’objectif de cette étude vise à démontrer les effets combinés de l’alcool et des mycotoxines sur la sévérité des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin dans un modèle expérimental de colite (inflammation du colon).
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mettre en évidence l’aggravation de la sévérité des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin chez les patients consommateurs d’alcool co-exposés aux mycotoxines. Tandis que l’impact de la consommation d’alcool sur l’incidence de la maladie inflammatoire chronique de l’intestin est débattu, aucune étude n’a, à ce jour, examiné son impact sur la sévérité de ces pathologies. Or une étude démontre une augmentation de la sévérité de la colite dans un modèle expérimental suite à une exposition à l’alcool. Dans ce contexte, aucune donnée à ce jour n’a évalué l’interaction entre la consommation d’alcool et l’exposition aux mycotoxines. Mettre en évidence l’effet de l’interaction alcool/mycotoxines dans ce modèle de colite permettrait d’améliorer les connaissances scientifiques sur cette co-exposition et encourager la prise en compte de ces deux facteurs dans le suivi et la prise en charge des patients. Nos résultats pourraient contribuer à faire évoluer les recommandations actuelles. L’abstinence à l’alcool pourrait devenir une recommandation pour les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Par ailleurs, l’identification des aliments fréquemment contaminés par les mycotoxines permettrait de mieux définir les aliments à risque et d’affiner les conseils nutritionnels destinés à ces patients.
Procédures
Les animaux seront tous exposés aux interventions suivantes : Gavage tous les jours (= 35 gavages) sur animal vigile tout au long du protocole expérimental. Pour cette intervention, les animaux seront maintenus en contention manuelle pour une durée inférieure à 1 minute par administration. Les animaux recevront un agent inflammatoire pendant 5 jours. Anesthésie (2 fois ; moins de 3 minutes). Prélèvement sanguin à la fin du protocole. Le prélèvement sanguin se fera sur animal anesthésié. Le prélèvement sanguin dure moins d’une minute. Ces interventions seront réalisées sur l’ensemble des 768 animaux.
Impact sur les animaux
Lors de cette procédure, plusieurs nuisances pouvant affecter le bien-être des animaux sont identifiés : - Les gavages peuvent générer des nuisances modérées liées au stress de la contention et à la procédure. En cas de fausse route, accident pouvant survenir lors de la procédure de gavage, l’animal peut présenter des signes de souffrance tels que détresse respiratoire et une hypersalivation. - D’après notre expertise, la consommation orale d’alcool peut induire des nuisances importantes. L’administration d’une forte dose d’alcool par gavage peut réduire l’activité motrice et limiter la prise alimentaire pendant quelques heures. Sur le long terme, jusqu’à la mise à mort de l’animal, des signes de déshydratation, de diarrhée et de perte de poids liées à l’exposition répétée à l’alcool peuvent être observés. - Les mycotoxines utilisées devraient induire des nuisances légères. La concentration de mycotoxines choisie pourrait induire une diminution de l’alimentation des souris associées à une légère perte de poids. Quelques modifications des selles pourraient survenir occasionellement jusqu’à la fin de la procédure. - L’induction de la colite est associée à des nuisances sévères jusqu’à la mise à mort de l’animal. L’exposition à l’agent inflammatoire peut entraîner d’importantes diarrhées et donc des déshydratations. De plus, une inflammation généralisée et d’importantes atteintes intestinales sont attendues pouvant entraîner des douleurs. - Le prélèvement de sang entraîne des nuisances légères principalement liées au stress induit par l’anesthésie gazeuse.
Devenir
Afin d’étudier les atteintes induites par le protocole, un prélèvement d’organes est nécessaire, ce qui implique la mise à mort de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Le modèle souris de colite est la méthode de référence dans l’étude des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Dans ce modèle souris de colite expérimentale, nous souhaitons étudier l’interaction entre l’alcool et les mycotoxines qui ont la capacité d’influencer aussi bien le microbiote intestinal que le système immunitaire ce qu’il n’est pas possible d’analyser par les méthodes alternatives. De plus, des effets différents peuvent être observés en fonction du sexe. Pour cela, l’étude chez la souris nous permettra la comparaison entre mâles et femelles, que l’on ne peut pas réaliser in vitro ou in silico. Le développement de la colite va générer des modifications physiologiques, telles qu’une perte de poids, une déshydratation et également des changements de la température corporelle qui peuvent affecter les conditions physiologiques de l’animal. Enfin, l’animal nous permet de mimer le mode de contamination observée chez l’Homme avec une administration par voie orale. Il rend donc possible de prendre en compte la diffusion des contaminants, leur capacité à affecter et traverser la barrière intestinale ainsi que leur métabolisation. Ces variables physiologiques ne peuvent être observées sur des modèles d’explants biologiques ou sur les animaux non vertébrés ou vertébrés moins sentients. Dans ce contexte, les méthodes alternatives actuelles ne sont pas suffisantes pour tenir compte de la complexité des mécanismes de cette pathologie multifactorielle et l’utilisation de modèles animaux expérimentaux demeure essentielle.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, des tests préliminaires in vitro sur cultures cellulaires seront réalisés pour sélectionner 4 mycotoxines d’intérêt à étudier dans le modèle souris de colite. Dans le cadre de cette étude et pour déterminer l’impact de la co-exposition alcool/mycotoxine sur la sévérité de la colite induite chimiquement, des analyses statistiques seront effectuées. Après calcul, le nombre d’animaux nécessaire est de 24 dans chaque groupe pour atteindre la puissance statistique souhaitée. Notre étude comprend 4 groupes différents : colite, alcool/colite, mycotoxine/colite, alcool/mycotoxine/colite 4 mycotoxines x 2 sexes x 4 groupes x 24 animaux par groupe = 768 souris. Ainsi 768 animaux sont nécessaires pour réaliser l’ensemble du protocole. Afin de prendre en compte le principe de réduction, chaque groupe de 24 animaux sera divisé en trois sous-groupes de 8 animaux. A la fin de chaque expérience, une évaluation statistique intermédiaire sera réalisée. Si les résultats sont satisfaisants, nous ne réaliserons pas les expériences sur les sous-groupes suivants afin de limiter et réduire le nombre total d’animaux utilisé.
Raffinement
Dès leur arrivée à l’animalerie et jusqu’à leur mort, nos animaux seront surveillés individuellement et quotidiennement, pesés 2 fois par semaine à l’exception de la 5ème semaine pour laquelle la surveillance sera renforcée et la pesée sera quotidienne. Les animaux seront hébergés par groupe de 4 afin de garantir un enrichissement social suffisant. Les animaux auront accès à volonté à l’eau et à la nourriture en présence d’enrichissement (litière foisonnante, roue d’activité, dôme, copeaux de bois compactés) tout au long du projet. Afin de réduire le nombre de manipulations désagréables pour les animaux, l’administration des molécules par voie orale se fera de façon conjointe. Les opérateurs sont régulièrement entraînés à l’administration orale sur des mannequins de souris afin de perfectionner le geste. L’alcool pouvant altérer le bien-être animal, les cages sont placées, immédiatement après le gavage et pendant quelques minutes, sur tapis chauffant. Des point limites ont été établis pour évaluer la souffrance des animaux. Ils sont relatifs à l’apparence physique, la variation de poids, la déshydratation, et au comportement social. Ces indicateurs sont présentés dans une grille d’évaluation affichée dans les locaux d’hébergement et complétée chaque jour après l’inspection de chaque animal. Toute atteinte de point limite conduira à mener une action corrective. Tout animal présentant des signes de douleur ou de souffrance jugés excessifs, sera immédiatement euthanasié.
Choix des espèces
Nous avons choisi de réaliser l’étude sur des souris pour les raisons suivantes : - Modèle de référence pour analyser l’impact d’une alcoolisation importante sur la perméabilité intestinale et la colite expérimentale - Expertise sur les concentrations d’alcool et de mycotoxine utilisables ce qui limite l’utilisation d’animaux pour des protocoles préliminaires. Le protocole sera réalisé sur des jeunes souris adultes de 9 semaines en adéquation avec le mode de consommation d’alcool et l’apparition des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin chez l’Homme.
Caractérisation d’un composé X dans un modèle d’inflammation intestinale liée au vieillissement
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Jusqu'à soixante-trois jours seules en cage, cinquante-six administrations orales quotidiennes, deux mises à jeun de douze heures et quatre prélèvements de sang à la queue : 80 souris subissent ces procédures, dont soixante âgées de 22 mois. Le niveau de souffrance déclaré est modéré, et toutes sont tuées pour prélever foie, tissu adipeux, muscle, cœur et cerveau. L'étude compare un composé en développement à un composé de référence sur l'inflammation intestinale liée à l'âge, pour le compte d'un client dont le porteur espère qu'il obtiendra une mise sur le marché. Ni l'un ni l'autre composé n'est nommé, et l'effectif est justifié par l'expérience du laboratoire "sur le modèle de souris obèse", quand les animaux utilisés ici sont des souris âgées.
Objectifs
Le vieillissement se caractérise par un état d'inflammation chronique de bas grade, contribuant au développement de troubles métaboliques, gastro-intestinaux et systémiques. Les stratégies visant à restaurer l'intégrité de la barrière intestinale et à réduire les déclencheurs pro-inflammatoires d'origine intestinale sont de plus en plus reconnues comme des approches prometteuses pour atténuer l'inflammation et favoriser un vieillissement en bonne santé. L'objectif du projet est de caractériser l'inflammation intestinale et systémique chez des souris âgées comparées à des souris jeunes, et évaluer l'efficacité d'un traitement chronique pendant 7 semaines d'un composé en développement versus un composé de référence afin d'atténuer l'inflammation intestinale liée à l'âge et restaurer l'intégrité de la barrière intestinale.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à répondre à un enjeu de santé majeur lié au vieillissement : la présence d’une inflammation chronique de bas grade, qui contribue à la progression de nombreuses pathologies métaboliques, gastro-intestinales et systémiques. L’identification de stratégies nutritionnelles ou thérapeutiques capables de moduler l’inflammation intestinale représente une approche prometteuse pour favoriser un vieillissement en meilleure santé. Ce projet s'incrit dans le cadre du développement d'un composé en développement visant à atténuer l'inflammation intestinale chez l'Homme et ainsi de promouvoir un vieillisement sain. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule pour le traitement de l'inflammation intestinale.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1) Hébergement individuel (max. 63 jours / état vigil) ; 2) Administration quotidienne de traitements ou véhicule (max. 56; durée : env. 1 minute / état vigil) ; 3) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (max. 17 mesures; durée : env. 1 minute / état vigil) ; 4) Mise à jeun en présence d'eau (2 fois, durée : 12h / état vigil) ; 5) Administration d'un marqueur fluorescent (2 fois, durée : env. 1minute / état vigil); 6) Prélèvements sanguin à la queue (max. 4 prélèvements, durée du prélèvement : 2 minutes / état vigil).
Impact sur les animaux
De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel avec leurs congénères. Les mesures de poids corporel et autres manipulations et le placement en boîte de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs légères et de stress. La mise à jeun de 12h pourra induire une sensation de faim.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure afin de collecter des organes (foie, tissu adipeux, muscle gastrocnémien, coeur et cerveau) pour analyses biochimiques et histologiques ultérieures.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre d'inflammation intestinal. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Par ailleurs, compte tenu du fait que nous n'attendons pas d'effet sexe-dépendant du candidat médicament, l'étude sera menée sur les deux sexes.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cage individuelle pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts visuels, auditifs et olfactifs entre eux. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs et une crème analgésiante sera appliquée sur la queue avant les prélèvements sanguins. Une alimentation sous forme de gelée sera ajoutée dans chaque cages afin de prevenir les difficultées d'alimentation en raison de l'âge avancé de certaines souris. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.
Choix des espèces
Le modèle murin utilisé est l’un des plus couramment employés et les mieux caractérisés dans le cadre d’études précliniques portant sur l’inflammation intestinale. Le présent projet nécessitera l'utilisation de 20 souris âgées de 2 mois correspondant au stade de développement "jeune adulte", afin de constituer un groupe de référence. Il impliquera également 60 souris âgées de 22 mois représentant un stade "adulte avancé" chez la souris. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par le composé à tester, à savoir une population âgée.
Etudes précliniques non-réglementaires d’une immunothérapie à IgA pour le traitement de maladies inflammatoires
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Pour remplacer une injection sous-cutanée par un anticorps anti-TNF avalé, 821 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. 422 subissent des procédures d'un niveau de souffrance léger, 399 d'un niveau modéré. 160 d'entre elles ingèrent pendant cinq jours du DSS, un produit qui enflamme l'intestin, et 146 le reçoivent trois fois à dix jours d'intervalle, dont 82 avec six semaines de gavage quotidien. Le porteur indique que cette inflammation provoque douleur modérée, stress et diarrhée, suivis par une grille de score qui déclenche la mise à mort quand un point limite est atteint.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), regroupant principalement la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, touchent plus de 10millions de personnes dans le monde, 3 millions de personnes en Europe et environ 300000 personnes en France. Les MICIs sont un groupe de troubles inflammatoires affectant le tube digestif. Les 2 principales MICIs sont : - la maladie de Crohn qui affectant toutes les partie du tractus gastro-intestinal, de la bouche à l'anus, le plus souvent la partie terminale de l'intestin grêle et le côlon. - la rectocolite hémorragique (RCH) qui se limite principalement au côlon et au rectum. Les symptômes communs aux MICIs incluent des douleurs abdominales, diarrhées (souvent sanglantes), fatigue, pertes de poids, et parfois des complications extragastro-intestinales, comme des atteintes articulaires, de la peau, des yeux… Les causes exactes des MICIs sont mal comprises, on pense qu'elles résultent d'une interaction complexe entre des facteurs génétiques, environnementaux et immunologiques. Le traitement vise généralement à contrôler l'inflammation, à soulager les symptômes. Les MICIs n’ont pas encore de traitement curatif, mais il existe des biothérapies et la chirurgie. Parmi les biothérapies, il y a les anti-TNF comme l’Adalimumab qui bloque une protéine responsable de l’inflammation, le facteur de nécrose tumorale (TNF). En inhibant cette protéine, l'Adalimumab réduit l'inflammation et les douleurs. Il est administré par injection sous-cutanée. L’adalimumab est un anticorps monoclonal humain de type IgG. Nous avons créé un anticorps de type sIgA avec les mêmes régions variables, c’est-à-dire celles permettant de reconnaitre les mêmes épitopes (cibles) que l’Adalimumab. La sIgA (immunoglobuline A sécrétoire) joue un rôle clé dans l'immunité des muqueuses. Elle est présente dans les sécrétions comme la salive, les larmes, le mucus respiratoire, le lait maternel et les sécrétions intestinales. Le but du projet est d’obtenir un nouvel anticorps de type sIgA ciblant le TNFα et ayant un effet supérieur ou au minimum équivalent à l’Adalimumab. Cet anticorps pourra être administré par voie oral ce qui facilite la vie quotidienne des patients, diminue la toxicité du produit et donc les effets secondaires. Cette molécule pourra aussi servir de traitement pour certaines maladies inflammatoires ou lors d’arthrite rhumatoïde.
Bénéfices attendus
Cet anticorps pourra être administré par voie orale ce qui facilite la vie quotidienne des patients, diminue la toxicité du produit et donc les effets secondaires. Cette molécule pourra aussi servir de traitement pour certaines maladies inflammatoires ou lors d’arthrite rhumatoïde.
Procédures
Tous les animaux vont avoir un prélèment de tissus au niveau de la queue sous anesthésie gazeuse ce qui va entrainer un léger stress de quelques minutes. Elles seront bouclées lors de cette anesthésie.15 souris vont avoir une injection par voie intra-veineuse et 2 prélèvements sanguin sous mandibulaire sous anesthésie gazeuse le même jour. 25 souris vont avoir une injection sous-cutanée, 30 auront une administration par voie orale (gavage). Ces 75 souris auront ensuite une injection par voie intra-veineuse et un prélèvement sanguin sous mandibulaire sous anesthésie gazeuse le même jour. 160 souris vont ingérer du DSS pendant 5 jours. Parmi ces animaux, 7 auront une seule injection en sous-cutanée, 25 auront de 2 à 6 injections en sous-cutanée. Ensuite 82 souris auront un gavage pendant 7 jours. Les autres n’auront pas de traitement. Pour finir, 146 souris vont ingérer 3 fois du DSS pendant 5 jours, espacé de 10 jours. Puis 32 auront 1 à 6 injection sous-cutanée et 82 autres auront 6 semaines de gavage. Les injections par voie intra-veineuse, en sous-cutanée, les gavages et le prélèvement de sang vont entrainer un stress de quelques minutes à chaque manipulation.
Impact sur les animaux
Les injections par intra-veineuse ou en sous-cutanée n’entraineront pas de douleur supérieure à celle d’une piqure d’aiguille. Elles entraineront un léger stress de quelques secondes pour les injections en sous-cutanées et de quelques minutes pour les injections intra-veineuse (contention dans un tube spécifique). L’ingestion du DSS va induire une inflammation de l’intestin qui peut entraîner une douleur modérée, du stress, de la diarrhée, durant le traitement et quelques jours après, et qui seront étroitement surveillés grâce à une grille de score des points limites. Dans la littérature, il n'y a pas de perte de poids durant les 4-5 premiers jours de taitement et le DSS dans l'eau de boisson n'impacte pas la quantité ingérée par les animaux.
Devenir
Après le traitement, chaque cohorte sera mise à mort à un temps donné afin de prélever les organes (colon, rate, sang) pour observer la longueur du colo, la taille de la rate... En parallèle, des analyses permettront d’observer les populations immunitaires recrutées au niveau de l'inflammation permettant de valider l’action des anticorps médicaments.
Remplacement
Des tests in vitro ont été au préalable effectués afin d’évaluer le potentiel thérapeutique de notre traitement cependant le recours à des techniques totalement in vitro ou sur organes isolés est impossible car la complexité de l’environnement cellulaire est primordial et la voie d’administration de notre molécule est primordial sur la biodistribution. En effet, les différents traitements testés ont besoin de l’environnement cellulaire afin d’être efficaces car ils engendrent des mécanismes cellulaires (par exemple, le recrutement des cellules du système immunitaire muqueux ou le trafic sanguin et lymphatique). Enfin, ces techniques in vivo nous permettent de vérifier l’accessibilité de notre traitement à la zone de l’inflammation.
Réduction
Afin de tester ces différentes conditions de manière fiable, il faut un nombre suffisant d’animaux afin d’obtenir des résultats robustes nous permettant de passer à des études pré-cliniques réglementaires puis cliniques chez l’Homme. Les doses et conditions testées ont été longuement réfléchies afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaire. Une approche statistique a aussi été étudiée afin d'obtenir un nombre suffissant de données permettant de valider l'étude expérimentale avec le nombre minimal d'animaux nécessaire.
Raffinement
Afin de limiter le stress des animaux, une période minimale de 5 jours d'acclimations à la zone d'hébergement expérimentale sera effectuée. Ils seront également progressivement manipulés régulièrement lors du change et des surveillances afin de les habituer aux contentions et autres manipulations. Toutes les manipulations et expérimentations seront effectué par du personnel qualifié. Les animaux seront surveillés strictement tout au long de l'expérimentation grâce à la grille de score permettant de détecter tous signes de souffrance et pouvoir évaluer si un point limite est atteint.
Choix des espèces
L’espèce a été choisie pour son temps de gestation court, de plus, cette espèce est utilisée à des fins scientifiques internationalement et possède un système immunitaire proche de celui de l’Homme. Les animaux utilisés auront entre 2 et 8 mois afin d'avoir un système immunitaire non défaillant.