Troubles gastrointestinaux

Deux à trois heures d'opération sous anesthésie pour poser un greffon d'œsophage et une prothèse interne: 12 mini-cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Quatre d'entre eux portent en plus une sonde nasogastrique pendant quatre semaines, et une endoscopie sous anesthésie retire la prothèse à deux mois. Les animaux sont suivis quatre à six mois puis tués pour analyser au microscope la zone de greffe. Le projet vise à préparer une future greffe d'œsophage chez l'enfant, un bénéfice que le porteur formule au conditionnel et subordonne à la confirmation de la faisabilité.

Objectifs

Certaines maladies sont à l’origine de la perte de certaines parties de l’œsophage chez l’enfant, ou le rendent inutilisable. Les opérations chirurgicales actuelles pour les traiter (par exemple remplacer l’œsophage par un morceau d’estomac ou de côlon) sont lourdes et peuvent entraîner des complications et des réinterventions. Nous testons une autre voie : un greffon d’œsophage préparé en laboratoire à partir d’un tissu d’adulte dont on a retiré toutes les cellules. Il ne reste que la charpente du tissu, comme une coquille vide que le corps accepte mieux et qui peut se recoloniser par des cellules ensuite. Ce greffon est remodelé pour avoir un diamètre adapté à l’enfant. Avant d’aider des enfants, nous devons vérifier la faisabilité et la sécurité dans un organisme vivant. Les mini-porcs sont choisis car leur taille, leur croissance et la chirurgie utilisée se rapprochent de celles d’un enfant. Les tests sur maquette ou au laboratoire ne permettent pas de reproduire la déglutition, la cicatrisation, l’immunité et la croissance. Les connaissances acquises (décellularisation, remodelage, soins après l’opération) pourront aussi bénéficier à d’autres greffes pédiatriques et renforcer le potentiel de l’ingénierie tissulaire.

Bénéfices attendus

Ce projet peut apporter des bénéfices à plusieurs niveaux, à court et à long terme, s’il confirme que la méthode est sûre et réalisable. Pour la recherche médicale. Les résultats enrichiront les données de base (sécurité, faisabilité, tolérance) nécessaires pour préparer un essai chez l’enfant. Les échantillons et observations aideront à comprendre comment le greffon se répare dans le temps. Pour les enfants concernés. Offrir, à terme, une autre option que les opérations actuelles quand l’œsophage manque ou ne fonctionne pas. Le greffon est pensé pour grandir avec l’enfant. On espère moins de complications, moins de réinterventions et une alimentation plus simple après la guérison. Pour la sécurité des soins. Améliorer la technique chirurgicale, définir un suivi après l’opération simple et clair : ce qu’il faut observer au quotidien, quels signes d’alerte surveiller, quand revoir l’animal et quelles actions entreprendre. L’objectif est de repérer plus tôt tout problème, de mieux le traiter et ainsi de réduire les complications et les réinterventions. Pour les familles. Si la méthode fonctionne, elle pourrait conduire à moins d’allers-retours à l’hôpital et à moins d’actes lourds, donc à un stress moindre pour l’enfant et ses proches. Cela peut harmoniser les pratiques entre hôpitaux et améliorer la prise en charge.

Procédures

Chaque animal aura une seule opération, réalisée alors qu’il est endormi complètement (anesthésie générale), pour mettre en place un morceau d’œsophage préparé et un petit tube souple (prothèse) à l’intérieur. Elle sert de tuteur. Elle maintient le passage ouvert, protège les coutures et stabilise le greffon pendant qu’il se fixe et cicatrise. Elle aide à éviter les rétrécissements et à ce que les parois ne se collent pas. Durée : 120 à 180 minutes. [MODIF] À 2 mois, un examen par caméra souple (endoscopie), aussi sous anesthésie générale, servira à retirer le tube (endoprothèse). Durée : ~20 minutes. Si un problème apparaît, un deuxième examen pourra être fait. Durée : ~30 minutes. [AJOUT] Pour 4 animaux, une sonde d’alimentation nasogastrique sera mise en place au moment de la chirurgie et utilisée pendant 4 semaines pour une alimentation liquide, avec contrôles quotidiens. Des pesées rapides seront réalisées (environ 1 à 3 minutes). En dehors de ces actes, aucune autre manipulation ne sera faite sur un animal éveillé. Des médicaments contre la douleur et une surveillance vétérinaire sont prévus.

Impact sur les animaux

Après l’opération, les animaux peuvent avoir mal pendant 1 à 2 jours, être somnolents, parfois un peu refroidis, et stressés. Ils peuvent ressentir une gêne pour avaler et bouger un peu moins au début. Les examens par caméra (endoscopies) peuvent provoquer une petite irritation locale. Le principal risque est que le tube intérieur (endoprothèse) se bouche ou se déplace.. [AJOUT] Pour 4 animaux portant une sonde nasogastrique, une irritation locale ou un arrachement sont possibles.

Devenir

Tous les porcs inclus dans ce projet seront mis à mort en fin de suivi afin de procéder aux analyses histologiques détaillées de la zone de greffe, étape indispensable pour évaluer la réparation tissulaire et le fonctionnement du greffon. [MODIF] Le suivi est programmé à 6 mois pour la cohorte principale (8 animaux) et à 4 mois pour le lot qui portera la sonde nasogastrique (4 animaux).

Remplacement

Nous avons d’abord cherché des solutions sans animaux (tests en laboratoire, modèles informatiques, mannequins, pièces d’organe artificielles). Ces méthodes aident, mais elles ne reproduisent pas ce qui se passe dans un corps d’enfant vivant : la circulation du sang, la déglutition répétée, la cicatrisation, les défenses immunitaires et la croissance. Pour savoir si le greffon d’œsophage est bien toléré, s’il tient en place, s’il reste ouvert pour laisser passer les liquides et s’il permet une alimentation normale, il faut l’observer dans un organisme vivant. Le mini-porc a été choisi car sa taille et son fonctionnement digestif se rapprochent de ceux d’un enfant ; il permet d’utiliser les mêmes gestes chirurgicaux et outils que chez l’humain. Il n’existe donc pas d’alternative non animale permettant d’évaluer complètement cette technique avant d’envisager une étude chez l’enfant. Si, au cours du projet, une méthode sans animal devenait disponible et suffisante pour répondre aux mêmes questions, elle remplacerait l’essai chez l’animal.

Réduction

Le projet a été conçu pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en assurant des résultats fiables. Des tests préalables en laboratoire ont permis de préparer les greffons et d’anticiper les difficultés mécaniques liés aux sutures. Cela permet d’éviter des essais inutiles chez l’animal. Le nombre d’animaux nécessaires a été défini avec soin, en s’appuyant sur les résultats d’études animales précédentes. Chaque animal suivra un protocole précis permettant d’obtenir un maximum d’informations. Ce projet utilise ainsi le nombre minimal d’animaux possible, dans le respect du bien-être animal et des exigences scientifiques.

Raffinement

Toutes les étapes du projet seront réalisées sous anesthésie générale afin d’éviter toute douleur pendant les interventions. Des traitements contre la douleur seront systématiquement administrés après l’opération et adaptés à l’état de chaque animal. Les animaux seront suivis chaque jour, avec une attention particulière portée à leur comportement, leur alimentation et leur respiration. Un environnement confortable et enrichi sera mis en place pour réduire leur stress. Des points limites clairs ont été définis et seront appliqués. Les animaux seront hébergés dans un cadre favorisant leur bien-être. Ces mesures visent à garantir une prise en charge respectueuse, limitant au maximum la souffrance animale.

Choix des espèces

Le porc a été choisi pour sa ressemblance anatomique avec l’humain, notamment au niveau de l’œsophage. Contrairement aux petits animaux, il permet de réaliser les gestes similaires à ceux effectués chez l’homme. Le minipig Yucatan a été retenu pour sa taille, sa croissance lente et sa bonne tolérance aux manipulations, ce qui permet un suivi prolongé. Il sera utilisé à un âge jeune correspondant au stade de développement d’un nourrisson. Ce choix permet d’évaluer une technique qui pourrait, à terme, éviter des opérations lourdes chez les enfants, en proposant une réparation de l’œsophage sans utiliser d’organes sains.

8 800 souris vont être utilisées sur quatre ans, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées et 200 réutilisées dans d'autres projets. On remplace leurs cellules hépatiques par des cellules humaines pour tester des candidats médicaments, après des injections détruisant leurs propres hépatocytes. Le porteur présente ce modèle comme plus acceptable que le recours aux primates non-humains. Il reconnaît n'avoir mené aucun calcul statistique, l'effectif reposant sur le nombre d'études des années précédentes et sur un plan commercial de croissance.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments visant par exemple à guérir les infections virales, le cancer du foie ou des maladies métaboliques, ou encore des traitements indiqués en cas d’insuffisance hépatique. Pour ce faire nous utiliserons des souris au foie humanisé permettant de recréer un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. Le protocole consiste à remplacer les cellules hépatiques de souris par des cellules hépatiques humaines. Dans certains cas, la présence d’un système immunitaire humain, en complément d’un foie humanisé, est indispensable pour étudier des processus physiopathologiques spécifiques, comme dans les maladies métaboliques (ex. : MASH) ou virales (ex. : dengue). Dans ces cas, une double humanisation, incluant à la fois le foie et le système immunitaire des souris, sera envisagée afin de répondre de manière optimale aux besoins scientifiques et aux questions posées. Les cellules hépatiques humaines (et immunitaires, le cas échéant) pourront ensuite, par exemple, être infectées par des virus humains spécifiques. Ce modèle permettra de reproduire le métabolisme du foie humain dans une espèce facilement manipulable et plus acceptable sur le plan éthique que les primates non-humains.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de recréer, chez la souris, un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. En cas de besoin, il sera également possible d’humaniser simultanément le compartiment immunitaire et hépatique. Cette double humanisation constitue un atout majeur, car elle permet de modéliser plus fidèlement les interactions entre le foie et le système immunitaire humain, particulièrement dans le cadre de maladies métaboliques ou infectieuses. De plus, les cellules hépatiques humaines pourront être infectées par des virus humains spécifiques, et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, éthiquement plus acceptable que les primates non-humains, et bien caractérisée au niveau génétique. Les propriétés génétiques de la souche immunodéficiente utilisée pourront également être exploitées pour l’étude des mécanismes d’insuffisance hépatique et des thérapies ciblant cette condition. Enfin, l’intégration d’un système immunitaire humanisé renforcera la pertinence des modèles expérimentaux en permettant d’évaluer les réponses immunitaires humaines face à des pathologies complexes, notamment dans le contexte de traitements antiviraux ou de maladies impliquant des dysfonctionnements immunitaires.

Procédures

4 à 7 injection(s) de composé(s) induisant la mort des hépatocytes et des cellules souches et permettant au moment de la greffe de réduire la présence des macrophages murins présent dans le foie et empêchant les hépatocytes humains de s’implanter. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Injection d’analgésique : moins d’une minute. Greffe des cellules ou implants thérapeutiques : entre 5 et 30 minutes. En parallèle, des candidats médicaments seront administrés par voie respiratoire, orale, ou injectable pour évaluer leurs activités thérapeutiques. Pour les prélèvements sanguins, les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon une limite fixée. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole d’étude et sera contrôlée par un vétérinaire.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être induites par l’identification par puce électronique classique ou thermopuce : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection, la ou les injection(s) de composé induisant la mort des hépatocytes et des cellules souches, les risques inhérents à tout acte chirurgical, la greffe des cellules, une gêne au niveau du transit intestinal liée au déplacement des viscères dans les heures suivant l’injection d’hépatocytes via la veine porte, le risque hémorragique accru pour l’injection d’hépatocytes via la veine porte, l’administration de traitements, la greffe d’implants thérapeutiques (patchs ou autres), l’induction des maladies, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques et/ou les prélèvements sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Dans le cadre d’une utilisation continue, les animaux issus de ce projet et ayant subit une humanisation pourront être utilisés dans d’autres projets autorisés par le Ministère dans l’établissement utilisateur. Des souris pourront être utilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Sinon, les animaux sont euthanasiés car ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.

Remplacement

Il n'existe à ce jour, aucune alternative performante capable de prédire l'activité/toxicité d'un candidat médicament agissant sur le foie, qui présente une architecture et un fonctionnement complexes qui ne peuvent être reproduits in vitro ou chez d'autres animaux (zébrafish, drosophiles, ...). La souris au foie humanisée constitue donc un modèle scientifiquement valide et pertinent pour le développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre les pathologies hépatiques, telles que les maladies virales ou métaboliques, les insuffisances hépatiques et le cancer chez l’humain.

Réduction

Un total de 8800 souris sera utilisé, couvrant une période de 4 ans. 78 études précliniques de 50 souris seront réalisées, sachant que le processus d’humanisation n’est efficient qu’à environ 50%, soit 7800 souris. 1000 souris supplémentaires seront utilisées dans le cadre de la PE2, permettant de réaliser pour chacune des 4 étapes, 5 études précliniques de 50 souris. L’humanisation du foie des souris via injection d’hépatocytes dans la veine porte est une mesure de réduction par l’amélioration attendue de la réussite de la greffe (autour de 50% pour l’injection splénique d’hépatocytes) et donc l’utilisation de moins d’animaux. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum.

Raffinement

En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 12 heures par semaine avec un maximum de 6h consécutives. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Les souris seront hébergées dans une atmosphère disposant d’un cycle lumière-obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès que nécessaire (par exemple en cas d’altération de l’état général d’une souris notée lors de l’observation quotidienne). Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Les fréquences des prélèvements sanguins sont limitées et une réhydratation est prévue pour tout prélèvement unique à partir de 8mL/kg. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique et de la perte de poids.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. La souche immunodéficiente utilisée présente une mutation génétique induisant la mort sélective des hépatocytes murins, ce qui permet de greffer simultanément en plus des cellules souches des hépatocytes humains. Cette approche vise à humaniser à la fois le système immunitaire et le foie. Cette double humanisation offre la possibilité d’évaluer des solutions thérapeutiques pour des maladies métaboliques et virales impliquant le système immunitaire, ainsi que pour les cas de défaillance hépatique. L'humanisation du foie se déroulera sur des animaux âgés de 5 à 10 semaines. Il a été décrit que travailler avec des animaux jeunes permet une meilleure prise de greffe. Par ailleurs, la taille de la rate étant, proportionnellement, supérieure, la transplantation des cellules sera facilitée. Les pathologies hépatiques pourront être induites sur les animaux humanisés ou non.

Gavées chaque jour pendant cinq semaines, soit 35 administrations, 80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles vivent seules en cage, sont pesées onze fois, puis subissent un prélèvement sanguin sous anesthésie avant d'être tuées pour doser l'ocytocine dans leurs tissus. Le porteur affirme que la complexité du microbiote intestinal ne peut pas encore être modélisée in vitro et qu'il est "nécessaire" de vérifier l'efficacité des composés dans un "organisme entier". Les trois composés testés appartiennent à un client du laboratoire, à un stade que le RNT qualifie de très précoce, et l'éventuelle mise sur le marché d'un médicament reste au conditionnel.

Objectifs

Le microbiome intestinal a été montré comme ayant un impact sur un très grand nombre de fonctions physiologiques. En effet, un nombre croissant de données indique que de nombreuses pathologies s'accompagnent d'un déséquilibre du microbiote et que la restauration de ce microbiote s'accompagne souvent d'une amélioration, voire d'une disparition des symptômes. Ainsi, certaines bactéries, et notamment L. reuteri, réduisent l'inflammation intestinale, freinent la perte osseuse, ou encore favorisent la cicatrisation des plaies cutanées. Or il a été montré que l'intestin possède des cellules capables de secréter de l'ocytocine et que cette dernière joue un rôle majeur dans l'équilibre de certaines population bactériennes et en particulier dans les effets bénéfiques. Ainsi, d'intense recherche visent aujourd'hui au développement de thérapies induisant une augmentation de la sécrétion intestinale d'ocytocine. L'objectif du présent projet est de tester la capacité d'une série de composés en développement (Composés X, Y et Z), développé par notre client, a induire une augmentation de la sécrétion d'ocytocine chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement de composés visant à traiter certaines pathologies inflammatoires de l'intestin ainsi que l'ostéoporose via une production accrue d'ocytocine. Bien que le projet soit une phase très précoce du développement, si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir, à terme, à la mise sur le marché de nouveaux médicaments.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (11 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration quotidienne de placébo ou d'un candidat médicament par gavage orale (35 administrations; durée de l'administration : 1 minute); 3) Prélèvement sanguin sous anesthésie (prélèvement; durée : 3 minutes).

Impact sur les animaux

De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les mesures régulières du poids corporel peuvent provoquer un stress léger, notamment en raison de la manipulation et de la restriction temporaire des mouvements. Les traitements par gavage oral, réalisés pendant 5 semaines, peuvent entraîner une gêne légère et un stress modéré. Bien que des études préliminaires aient été conduites préalablement à notre étude, des effets indésirables pourraient être induits par les composés testés. Enfin, au dernier jour de l’étude, les animaux seront anesthésiés ce qui pourra engendrer un stress de courte durée pour permettre la réalisation d'un prélèvement sanguin.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de réaliser un dosage d'Ocytocine tissulaire.

Remplacement

Une première série d'étude a été conduite in vitro afin de vérifier l'impact des composé testés sur un modèle de cultures cellulaires ensemencées à l'aide de la bactérie L. reuteri. Néanmoins, la complexité du microbiote intestinal ne peut pas encore être modélisée in vitro et l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il est nécessaire de vérifier l'efficacité des composés dans un organisme entier.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été calculé et rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Les données seront analysées à l'aide de tests statistiques appropriés.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs expérimentés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude, avec accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. Les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels, et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour les rongeurs. Le prélèvement sanguin réalisé au jour 28 (D28) sera précédé d’une anesthésie afin de limiter le stress des animaux. Enfin, un suivi quotidien des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une intervention rapide en cas d’atteinte des seuils établis. Ces interventions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l’emploi d’analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

La souris, comme tout modèle animal, est un modèle qui présente des différences dans la composition exacte du microbiote comparativement à l'humain. Néanmoins, on observe une bonne conservation des grands types bactériens entre humain et souris. Par ailleurs, l'interaction microbiote/ocytocine est conservé chez les deux espèces. La souris reste donc un modèle d'intérêt sur le plan préclinique. Les animaux seront utilisés au stade adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant jusqu'à 63 administrations et quatre prélèvements sanguins. Une colite chronique leur est provoquée par un composé chimique ajouté trois semaines durant à l'eau de boisson, avec diarrhées, sang dans les selles et douleurs abdominales, et chaque souris est hébergée seule alors que le porteur reconnaît des animaux sociaux. Le projet aligne dix études sur cinq ans pour tester des composés en développement contre les maladies inflammatoires de l'intestin. Les retombées annoncées pour les patients passent par des essais cliniques et une autorisation de mise sur le marché qui restent au conditionnel, quand l'inflammation infligée est programmée.

Objectifs

Les maladies chroniques de l’intestin, comme la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, touchent plusieurs millions de personnes dans le monde, et leur fréquence augmente, surtout dans les pays industrialisés et chez les jeunes adultes. Cette augmentation résulte d’une combinaison de facteurs génétiques, environnementaux, alimentaires et liés au mode de vie. Les traitements existants sont encore limités et une partie des patients ne répond pas aux médicaments actuels ou perd leur efficacité avec le temps. Cela montre l’importance de développer de nouvelles solutions pour réduire l’inflammation et améliorer la santé intestinale. Le projet utilise un protocole standardisé et prévoit 10 études sur cinq ans. L’objectif est de tester l’efficacité de nouveaux composés susceptibles de réduire l’inflammation de l’intestin. Les résultats permettront de mieux comprendre leur fonctionnement et, si les résultats sont positifs, de poursuivre leur développement pour un usage chez l’homme.

Bénéfices attendus

La présente étude devrait permettre de mettre en évidence l’efficacité de composés d’intérêt thérapeutique en cours de développement pour réduire la colite, et d’apporter une confirmation de leur mode d’action. En cas d’efficacité avérée, ces composés pourront être testés ultérieurement dans le cadre d’études cliniques et pourraient, à terme, obtenir une autorisation de mise sur le marché.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1) Administration des traitements (7 administrations lors de l'habituation et 56 administrations lors de la phase de traitement : < 1 minute). 2) Hormis pour les 10 souris du groupe expérimental contrôle du modèle de colite, les animaux seront exposés à trois reprises pendant une semaine à un composé chimique induisant une inflammation du colon via leur eau de boisson (3 semaines). 3) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel deux fois par semaine avant traitement et quotidiennement pendant l'ensemble de la période de traitement (durée des pesées < 1 minute). 4) Prélèvements sanguins (4 prélèvements sanguins par souris : 5 minutes).

Impact sur les animaux

Le modèle utilisé est un modèle de colite chronique chez la souris. La concentration du composé chimique employée permet d’induire une colite légère. Cette concentration est inférieure à celle utilisée dans les modèles de colite aiguë afin de tenir compte du caractère chronique du modèle et de la répétition des phases d’exposition à ce composé. Dans ce contexte, les souris peuvent présenter des épisodes de diarrhée, parfois accompagnés de la présence de sang dans les selles, ainsi que des douleurs abdominales. Les différentes procédures réalisées au cours de l’étude, telles que les administrations, ainsi que les pesées quotidiennes à l’état éveillé, peuvent être sources de stress ou d’inconfort. Enfin, l’hébergement individuel, bien que nécessaire pour le bon déroulement du protocole, constitue également une contrainte pour les souris, qui sont des animaux sociaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure. En effet, l'étude implique des analyses biochimiques et histologiques sur les colons et les rates qui doivent ainsi être collectés à l'issue de la procédure.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques est justifiée dans ce projet, car il n’existe actuellement aucune méthode de substitution permettant d’étudier l’impact d’un composé sur l’inflammation du côlon sans recourir à un animal de laboratoire. Les inflammations chroniques de l’intestin sont des maladies complexes faisant intervenir plusieurs mécanismes biologiques, notamment inflammatoires et immunitaires.Des modèles alternatifs, comme les tests in vitro, sont utilisés en amont pour évaluer l’efficacité potentielle des composés. Toutefois, l’étude sur l’animal entier demeure indispensable afin de mieux comprendre les effets globaux du composé et constitue une étape nécessaire avant toute demande d’autorisation pour la réalisation d’études cliniques chez l’humain.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés a été calculé et rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Le nombre de 15 animaux par groupe a été défini comme le minimum nécessaire pour mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés, en tenant compte de l’hétérogénéité du modèle employé. Un total de 70 souris sera utilisé, réparties en 1 groupe de 10 souris (groupe contrôle du modèle) et 4 autres groupes de 15 animaux chacun. Le groupe contrôle du modèle a été réduit à 10 animaux, puisqu’il ne présente pas de colite, ce qui réduit la variabilité des mesures.

Raffinement

Le modèle animal utilisé est un modèle d’inflammation du côlon chez la souris, induite par l’administration d'un composé chimique, largement décrit et validé dans la littérature scientifique. Le protocole a été conçu afin de limiter au maximum le stress et la souffrance des animaux, et des points limites adaptés ont été définis. La dose du composé chimique utilisée a été réduite par rapport aux modèles de colite aiguë, afin de tenir compte des administrations répétées et de limiter la sévérité de l’inflammation. Les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien à l’aide de grilles d’évaluation standardisées permettant d’identifier précocement tout signe de souffrance ou d’aggravation de la colite. En cas d’atteinte de seuils prédéfinis, un traitement antalgique sera administré afin de prévenir toute douleur. Si l’inflammation devenait trop sévère, l’animal concerné serait retiré de l’étude. Les animaux seront hébergés individuellement pour les besoins du protocole, tout en conservant des contacts visuels et olfactifs avec leurs congénères. Un enrichissement renforcé de l’environnement sera mis en place, comprenant des briquettes de bois adaptées aux rongeurs, des abris en carton et du matériel de nidification.

Choix des espèces

Le modèle animal utilisé est un modèle d’inflammation colique induite par administration d'un composé chimique chez la souris qui est très bien caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans le cadre d'études précliniques. Les animaux seront réceptionnés à 7 semaines d'âge et les traitements débuterons à 9 semaine d'âge. Cela correspond à un stade de jeune adulte mimant la population cible majoritaire des inflammations chroniques de l'intestin chez l'humain.

Ni réutilisées ni replacées parce que la colite qu'on leur inflige modifie durablement leur état biologique, 686 souris sont tuées à l'issue pour prélever intestin, sang et organes lymphoïdes. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'inflammation du côlon est provoquée par le DSS ou par instillation intrarectale de TNBS sous anesthésie, avec perte de poids allant jusqu'à 15 à 20 %, diarrhée parfois sanglante, pelage ébouriffé et posture voûtée pendant cinq à sept jours. Le porteur cite organoïdes, organes sur puce et modèles informatiques, puis les écarte au motif qu'aucun ne reproduit à la fois le système immunitaire, la paroi intestinale et le microbiote.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, comme la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn, provoquent une inflammation durable du côlon et altèrent fortement la qualité de vie des patients. Les traitements actuels ne sont pas efficaces chez tous les patients, ce qui rend nécessaire le développement de nouvelles solutions thérapeutiques. Ce projet vise à développer puis utiliser un modèle d’inflammation du côlon chez la souris afin de tester de nouvelles molécules ou formulations ayant un effet anti-inflammatoire. Dans un premier temps, deux méthodes d’induction de l’inflammation, le DSS et le TNBS, seront comparées chez des souris non transgéniques afin de sélectionner le modèle le plus adapté et reproductible. Une fois le modèle établi, il sera appliqué à des souris transgéniques exprimant une protéine humaine impliquée dans l’inflammation intestinale, afin de mieux se rapprocher de la maladie humaine et d’évaluer des traitements ciblés. Sur la durée du projet, un nombre limité de nouvelles molécules sera testé de manière progressive. L’évolution de l’inflammation sera suivie par des méthodes d’imagerie non invasives, permettant de limiter les manipulations et de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Bénéfices attendus

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), comme la colite ulcéreuse ou la maladie de Crohn, sont des maladies de longue durée qui altèrent fortement la qualité de vie. Les traitements actuels ne fonctionnent pas chez tous les patients et peuvent perdre leur efficacité avec le temps, ce qui souligne la nécessité de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. À court terme, ce projet permettra de mieux comprendre comment l’inflammation du côlon s’installe et évolue dans des modèles expérimentaux chez la souris. Il apportera des informations claires sur le rôle d’une protéine impliquée dans l’inflammation intestinale, l’IL-26, en comparant des souris classiques et des souris modifiées pour se rapprocher de la situation humaine. Le projet permettra également d’identifier les conditions les plus adaptées pour tester de nouveaux traitements (choix du modèle, doses, schémas d’administration). L’utilisation d’une méthode d’imagerie non invasive permettra de suivre l’évolution de l’inflammation chez un même animal, d’améliorer la qualité des données et de réduire le nombre d’animaux utilisés. À long terme, ce projet ne vise pas à aboutir directement à un traitement pour les patients, mais à générer des données solides permettant d’orienter le développement de nouvelles molécules ou formulations dans des projets ultérieurs. Les résultats positifs serviront de base à des études précliniques plus avancées et à des collaborations industrielles ou académiques. En cas de résultats négatifs ou non concluants, les données produites permettront d’écarter certaines approches, d’optimiser les modèles expérimentaux et d’éviter des essais inefficaces par la suite. Ainsi, quels que soient les résultats, le projet contribuera à faire progresser la recherche et à guider plus efficacement le développement de futurs traitements contre les MICI.

Procédures

Au cours des procédures expérimentales, les animaux peuvent présenter des effets transitoires liés aux manipulations et aux modèles d’inflammation étudiés. Chaque animal pourra faire l’objet d’un prélèvement sanguin unique au niveau d’une veine du cou. Ce prélèvement sera réalisé sous anesthésie générale légère à l’isoflurane, un gaz anesthésiant couramment utilisé chez la souris. La durée d’anesthésie sera courte, comprise entre 5 et 15 minutes. Les animaux pourront également subir jusqu’à trois séances d’imagerie non invasive sur une période maximale de 48 heures. Ces séances, d’une durée de 5 à 15 minutes chacune, seront réalisées après l’administration d’un marqueur fluorescent, soit par injection dans une veine, soit par voie orale. Cette technique permet de suivre l’évolution de l’inflammation sans chirurgie ni douleur durable. Pour les animaux recevant le produit TNBS, l’induction de l’inflammation du côlon sera réalisée par administration intra-rectale, sous anesthésie générale à l’isoflurane afin d’éviter toute douleur ou stress. La durée d’anesthésie sera également limitée à 5 à 15 minutes. Les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure expérimentale concernée, après la dernière séance prévue pour chaque animal. La mise à mort sera réalisée par une méthode réglementaire et adaptée à l’espèce, sous anesthésie profonde, afin d’éviter toute souffrance.

Impact sur les animaux

Les procédures prévues reposent sur l’induction contrôlée d’une inflammation colique chez la souris par administration de DSS (dextran sulfate de sodium) ou de TNBS (trinitrobenzènesulfonique). Ces modèles bien établis reproduisent certains aspects physiopathologiques des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Les effets indésirables attendus sont principalement liés à la réponse inflammatoire locale et systémique ainsi qu’aux manipulations expérimentales. Dans le modèle DSS, les signes cliniques typiques incluent une perte de poids progressive (jusqu’à 15–20 %), une diarrhée plus ou moins marquée, parfois teintée de sang, et une diminution transitoire de la prise alimentaire. Un aspect ébouriffé du pelage, une posture voûtée et une baisse modérée de l’activité peuvent également être observés. Ces symptômes apparaissent entre le 3ᵉ et le 6ᵉ jour après l’induction et régressent généralement 7 à 10 jours après l’arrêt du DSS. Dans le modèle TNBS, l’instillation intra-rectale sous anesthésie peut induire une inflammation plus aiguë, avec douleurs abdominales modérées, réduction temporaire de la mobilité et diarrhée hémorragique dans certains cas. Ces signes surviennent dans les 24 à 48 h suivant l’administration et persistent 3 à 5 jours avant amélioration. Une surveillance rapprochée permettra d’adapter les soins (hydratation, réchauffement, arrêt anticipé ou euthanasie) en cas de souffrance excessive. Les injections sous-cutanées ou intrapéritonéales d’anticorps monoclonaux entraînent des nuisances mineures et transitoires (gêne au point d’injection). L’imagerie par fluorescence (NIR-dextran) est non invasive et sans effet délétère attendu. Les effets globaux sont donc qualifiés de modérés selon la classification réglementaire. L’inconfort est limité à la phase aiguë d’inflammation (environ 5 à 7 jours).

Devenir

À la fin des procédures, la majorité des animaux seront mis à mort de manière rapide et indolore, sous anesthésie, afin de pouvoir prélever les tissus nécessaires aux analyses (intestin, sang, organes lymphoïdes, etc.). Ces prélèvements sont indispensables pour observer au microscope l’état de la paroi intestinale, mesurer précisément l’inflammation et étudier l’effet des traitements sur les cellules et les molécules impliquées dans la maladie. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées sur des animaux vivants et sont essentielles pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Les animaux ne seront ni réutilisés dans d’autres expériences, ni replacés, car la maladie induite et les traitements reçus modifient durablement leur état biologique et ne permettent pas une réutilisation dans des conditions éthiques et fiables.

Remplacement

La stratégie de remplacement a été soigneusement examinée avant la conception de ce projet. Il existe des méthodes alternatives, comme des cellules cultivées en laboratoire, des mini-tissus (organoïdes), des systèmes de type « organes sur puce » et des modèles informatiques. Ces outils permettent de mieux comprendre certains mécanismes de l’inflammation de l’intestin, mais ils ne reproduisent pas le fonctionnement d’un organisme entier. Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin sont en effet très complexes. Elles impliquent à la fois le système immunitaire, la paroi de l’intestin, les bactéries présentes dans le tube digestif et d’autres systèmes du corps. Aujourd’hui, aucune méthode uniquement en laboratoire ne permet de prendre en compte toutes ces interactions en même temps. L’objectif du projet est de tester de nouveaux traitements dans des modèles de colite chez la souris, qui reproduisent les mécanismes principaux de la maladie chez l’être humain. Pour évaluer ces traitements, il faut observer non seulement ce qui se passe au niveau des tissus et des molécules, mais aussi l’état général de l’animal, sa perte de poids et sa réaction inflammatoire globale. Cela n’est possible que chez un organisme vivant. Les souris choisies sont les modèles les plus pertinents pour ce type de recherche, car elles permettent de reproduire de façon contrôlée les caractéristiques essentielles de la maladie humaine. L’utilisation d’animaux reste donc nécessaire pour déterminer les bonnes doses, tester d’éventuelles associations de traitements et vérifier leur efficacité. Ce recours à l’animal s’inscrit dans une démarche stricte visant à limiter son utilisation autant que possible, à réduire le nombre d’animaux et à améliorer leurs conditions de prise en charge.

Réduction

Le nombre de souris prévu dans ce projet a été calculé avec des méthodes statistiques, afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en obtenant des résultats fiables. La variabilité des modèles de colite utilisés, la perte de poids, le niveau d’inflammation et l’effet attendu des traitements testés ont été pris en compte. Les expériences sont conçues pour tirer un maximum d’informations de chaque animal. Par exemple, une technique d’imagerie par fluorescence (NIR-dextran), non invasive, permet de suivre au cours du temps l’état de l’intestin et l’évolution de l’inflammation chez les mêmes souris. Cela évite de devoir en sacrifier davantage à différentes étapes et limite la création de groupes supplémentaires. Les résultats d’imagerie seront associés à d’autres mesures cliniques et d’analyse des tissus, afin de valoriser au mieux chaque animal inclus. Avant les grandes études, de petites études pilotes seront réalisées pour ajuster les doses de produits utilisés (DSS, TNBS et molécules testées). Cela permet de réduire le risque d’échec par la suite et d’éviter de devoir répéter les expériences. Les données recueillies serviront également à affiner les protocoles pour les étapes suivantes, toujours dans le but de limiter le nombre d’animaux. Les tissus prélevés à la fin des études seront utilisés pour des analyses complémentaires ou partagés avec d’autres projets, afin de ne pas devoir recréer les mêmes modèles de maladie. Enfin, des critères d’arrêt précoces, une surveillance clinique attentive et des examens répétés par imagerie permettront de réduire au maximum la durée de la maladie chez les animaux et d’éviter le recours à des animaux supplémentaires. L’ensemble de ces mesures vise à trouver un équilibre entre la qualité scientifique des résultats et le respect de principes éthiques stricts, en veillant à ce que chaque animal contribue de manière significative aux objectifs du projet.

Raffinement

Dans ce projet, les chercheurs mettent en place plusieurs mesures pour limiter au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. Les produits utilisés pour provoquer l’inflammation de l’intestin sont administrés à la dose la plus faible possible permettant de mener l’étude. Les animaux sont observés chaque jour afin de vérifier leur état de santé. Si un animal perd trop de poids, paraît très affaibli, ne mange presque plus, se déplace très peu ou montre des signes de détresse, il est retiré immédiatement de l’expérience et euthanasié de façon rapide et indolore. Les injections et manipulations sont réalisées par un personnel formé, pour que les gestes soient précis et les moins traumatisants possibles. Les animaux sont hébergés dans de bonnes conditions (température adaptée, environnement enrichi, vie en groupe lorsque c’est possible), avec un accès permanent à l’eau et à la nourriture, sauf exception clairement justifiée. Les chercheurs utilisent aussi des techniques d’imagerie non invasives pour suivre l’évolution de l’inflammation chez les mêmes animaux, ce qui évite des interventions plus lourdes et limite le nombre d’animaux sacrifiés. L’ensemble des procédures est régulièrement réévalué afin d’améliorer en continu les pratiques et de respecter au mieux le bien-être animal.

Choix des espèces

La souris a été choisie pour sa physiologie immunitaire bien caractérisée et sa grande sensibilité aux modèles expérimentaux de colite, en particulier après exposition au DSS ou au TNBS, qui reproduisent fidèlement les mécanismes inflammatoires observés chez l’humain. La souche C57BL/6 est la plus couramment utilisée pour ces modèles, offrant une référence robuste et reproductible pour l’évaluation de nouvelles molécules. L’emploi de souris transgéniques exprimant la cytokine humaine IL-26 permet d’explorer le rôle spécifique de cette voie dans la physiopathologie colique et d’évaluer la pertinence de cibles thérapeutiques humaines. Ces modèles combinent pertinence biologique et transposabilité clinique, tout en minimisant le recours à d’autres espèces plus sensibles ou complexes à gérer. Leur taille, leur cycle de reproduction court et la disponibilité d’outils analytiques adaptés en font le choix le plus approprié pour atteindre les objectifs scientifiques du projet tout en respectant le bien-être animal. Les expériences seront réalisées exclusivement sur des souris adultes de souche C57BL/6 et sur des souris transgéniques exprimant la cytokine humaine IL-26, âgées de 8 à 12 semaines, correspondant à un stade physiologique stable et à une pleine maturité du système immunitaire. Ce choix permet de limiter la variabilité biologique liée au développement et d’assurer une réponse homogène aux inducteurs de colite (DSS ou TNBS) ainsi qu’aux traitements testés. Les souris plus jeunes, non sevrées ou en croissance, présentent une immaturité immunitaire et métabolique pouvant modifier la réponse inflammatoire et la tolérance aux traitements, tandis que les animaux âgés développent des altérations spontanées du microbiote et des tissus intestinaux susceptibles de biaiser les résultats. Aucune procédure ne sera réalisée sur des embryons, des fœtus ou des individus en gestation. Le recours à des animaux adultes garantit donc la pertinence scientifique, la comparabilité inter-groupes et le respect du bien-être animal.