Autres troubles humains

120 souris, mères et souriceaux, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux sont exposés dès la naissance à 75 % d'oxygène pendant quatorze jours pour reproduire une dysplasie bronchopulmonaire, puis reçoivent deux injections intrapéritonéales par jour, avant d'être mis à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur indique que l'hyperoxygénation provoque une insuffisance respiratoire et peut léser les intestins, les yeux et le cerveau, et vise à tester l'inhibition d'une enzyme, la cathepsine C. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit une réponse immunitaire complète, les retombées pour les enfants prématurés restant formulées au conditionnel.

Objectifs

Les nouveaux nés atteints de la dysplasie bronchopulmonaire ont une inflammation chronique dans les poumons, liée à la présence d’enzymes qui sont délétères. Leur inhibition pourrait donc être bénéfique d’un point vue thérapeutique. L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet de l’inhibition indirect de toutes ces enzymes, via l’inhibition de la cathepsine C, dans un modèle murin de la dysplasie bronchopulmonaire.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre l'identification d’un nouveau traitement préventif et/ou curatif pour les enfants prématurés sous ventilation mécanique. Un traitement préventif ou qui diminue les conséquences de la pathologie pourrait améliorer l’espérance et la qualité de vie à l’âge adulte de ces patients.

Procédures

Hyperoxygénation pour les mères et leurs souriceaux : 75% d'oxygène pendant 14 jours, ou 75% d'oxygène 1 heure par jour pendant 14 jours. Injection intrapéritonéale 2 fois par jours pendant 14 jours pour les souriceaux.

Impact sur les animaux

La première nuisance est l’exposition à l’oxygène qui entrainera la pathologie pulmonaire, qui chez les humains se traduit par une insuffisance respiratoire. L’exposition à l’O2 peut également entrainer des dommages au niveau des intestins, des yeux et du cerveau. Les autres nuisances seront les douleurs liées aux injections et le stress lié aux manipulations.

Devenir

Les mères et les souriceaux soumis à l'hyper-oxygénation seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d'organes et analyses.

Remplacement

La dysplasie bronchopulmonaire est une pathologie inflammatoire qui fait intervenir le système immunitaire et notamment les neutrophiles. A ce jour il n’existe pas de modèle in vitro ou in silico permettant de mettre en place une réponse immunitaire complète et l’effet qu’un traitement pourrait avoir dessus. Cette pathologie atteint la morphologie pulmonaire au niveau des alvéoles, et du système vasculaire notamment ; il n’existe pas de modèle pulmonaire in vitro permettant d’avoir une bonne représentation de la maladie. Ainsi l’efficacité du traitement ne pourra être réalisée que sur un modèle in vivo.

Réduction

D'après des expériences réalisées par d'autres laboratoires avec de la fumée de cigarette ou de l'ozone, les lots devront être constitués d'au moins 8 animaux pour atteindre des différences statistiques.

Raffinement

Pour le confort des souris les dispositions suivantes sont prévues : manipulation des animaux à l'aide d'un tube, présence de dôme, de papier pour nidation, de nourriture et eau ad libitum, de jeux type rouleaux en de carton et de récompense comme des fruits secs ou des graines après chaque manipulation. Les animaux seront observés quotidiennement. Leur poids sera contrôlé. Le comportement de la mère et des souriceaux sera observé, ainsi que leur aspect physique : poil, oreille. En ce qui concerne le raffinement pour les femelles gestantes : massage abdominal, réchauffement de la femelle sur couverture chauffante, tentative de sortie manuelle de l’embryon coincé.

Choix des espèces

Il y a deux raisons à l’utilisation du modèle murin pour ce projet. La première concerne la mise en place du modèle de dysplasie bronchopulmonaire. En effet, les enfants prématurés atteint de DBP ont un stade de développement pulmonaire au niveau fin caniculaire, début sacculaire, les souriceaux naissent au stade sacculaire. Cela permet d’utiliser les souriceaux à leur naissance, alors que l’on devrait pratiquer une césarienne sur d’autre modèle. La seconde raison est la disponibilité de souris déficiente en cathepsine C, qui nous permet de faire notre preuve de concept. Les souris adultes (8 semaines) seront utilisées pour la reproduction et pour le sevrage des souriceaux dans le cas de la mère. Les souriceaux seront utilisés dès leur naissance pour la mise en place du modèle de la dysplasie bronchopulmonaire. En effet, les enfants prématurés atteint de DBP ont un stade de développement pulmonaire au niveau fin caniculaire, début sacculaire, les souriceaux naissent au stade sacculaire. La mise en place du modèle dure 14 jours, les jeunes souris seront euthanasiées à ce moment-là pour la récupération des échantillons.

40 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés dans d'autres études après une période de repos. Sous anesthésie générale, chaque animal peut subir jusqu'à cinq fois sur deux ans des prélèvements de moelle osseuse, de liquide cérébrospinal, des lavages broncho-alvéolaires ou des prises de sang. L'objectif est de fournir du matériel biologique de primate pour mettre au point des techniques d'analyse. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal, la proximité des primates avec l'humain étant présentée comme sans équivalent.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mettre à disposition de la communauté scientifique du matériel biologique de primate (liquide cérébrospinal, échantillons pulmonaires ou de moelle osseuse, accompagnés ou non de prélèvement sanguin), qui ne peut être collecté que sous anesthésie générale des animaux. Ces prélèvements sont nécessaires à la mise au point de techniques d'analyses sur ces échantillons, à la sélection d'animaux sur certains critères physiologiques, ou encore à la réalisation de test in vitro afin d’appréhender la toxicité ou l'efficacité d’un produit, au lieu de ou avant de le tester chez l’animal. Ce projet vise donc à pouvoir prélever certains échantillons biologiques de primate sous anesthésie, dans le but de réaliser des tests préliminaires ou en remplacement d'études in vivo sur cette espèce.

Bénéfices attendus

Tout test de matériel biologique obtenu lors de protocoles expérimentaux utilisant l'animal nécessite au préalable d'être mis au point, affiné, voir validé selon un certain cadre réglementaire. Ces mises au point nécessitent elles-mêmes l'utilisation de matériel biologique, qui doit être obtenu sur la même espèce. Beaucoup de tests sont basés sur des produits sanguins, mais certains nécessitent d'autres matrices biologiques plus difficile d'accès, comme la moelle osseuse, le liquide cérébrospinal ou les lavages pulmonaires. La moelle osseuse pourrait par exemple être utilisée dans le cadre de la mise au point d'un test visant à caractériser les cellules progénitrices du sang, pour le développement d'une thérapie contre des maladies héréditaires. Le liquide cérébrospinal pourrait être utilisé pour mettre au point une méthode de mesure d'un produit injecté dans le sang d'un patient, pour évaluer sa capacité à passer dans le cerveau. Cela peut avoir des implications pour évaluer la potentielle neurotoxicité d'un produit, ou au contraire sa capacité à atteindre le cerveau pour lutter contre des maladies neurodégénératives. Finalement, les lavages pulmonaires permettent d'avoir accès à du liquide et à des cellules de poumons, sans pour autant sacrifier l'animal : cela permettrait d'étudier le microbiote pulmonaire d'animaux, ou encore d'utiliser ces échantillons pour mettre au point des méthodes d'investigation de virus pulmonaires comme le SARS-CoV-2 (ex: PCR). Ces prélèvements sous anesthésie de matrices biologiques spécifiques pourront potentiellement être accompagnés de prélèvements sanguins dans la limite des recommandations de volume et fréquence pour l'espèce. Ces prélèvements de sang pourront être réalisés seulement s'il est jugé scientifiquement ou éthiquement pertinent de les faire sur le même animal plutôt que sur une cohorte différente. Dans certains cas, ces échantillons pourraient être utilisés pour réaliser des tests in vitro remplaçant l'utilisation de l'animal, comme par exemple dans le cadre de tests de toxicité d'un produit sur les cellules progénitrices de la moelle. Dans ce contexte, les différents prélèvements réalisés sont nécessaires pour mettre au point ou améliorer des méthodes d'analyses existantes. Ce projet contribuera donc à réduire le nombre d’animaux utilisés en étude, en permettant le développement de méthodes d'analyses plus fines ou de test in vitro remplaçant l'animal lors de phases expérimentales précoces.

Procédures

Les animaux seront manipulés afin de réaliser une injection d’anesthésique. Les procédures se déroulent entièrement sous anesthésie générale. Les animaux pourront être soumis à une parmi les 4 procédures différentes, chacune nécessitant entre moins d’une minute et trois minutes . Les prélèvements possibles seront : prélèvement de moelle osseuse, prélèvement de liquide cérébrospinal, lavage broncho-alvéolaire et prélèvements sanguins. Le temps entre l’induction de l’anesthésie de l’animal et son réveil est d’environ 1h.

Impact sur les animaux

Le prélèvement de liquide cérébro-spinal est réalisé sous anesthésie. Une légère gêne au lieu de ponction peut être ressentie au réveil par l’animal. Le lavage broncho-alvéolaire peut provoquer une gêne chez l'animal suite à l'administration de liquide dans les poumons. De plus, dans le cadre de ce protocole, les prélèvements seront par définition ponctuels et donc non répétés dans le temps. Le prélèvement de moelle osseuse peut quant à lui provoquer des douleurs au niveau de la zone de prélèvement. ire un hématome sur la zone de prélèvement.

Devenir

Après une période de repos adéquate, les animaux seront disponibles pour intégrer d'autres études, sur avis vétérinaire.

Remplacement

Il n'est pas possible de remplacer l'animal dans le cadre de ce projet. L'utilisation de celui-ci est indispensable afin d'obtenir le matériel biologique nécessaire à la mise au point, la calibration et la validation de méthodes d'analyses biologiques. Ces méthodes visent en effet directement les cellules de l'espèce animale concernée (cytométrie en flux, tests de stimulation de cellules immunitaires, caractérisation de l'expression de certains gènes…), ou peuvent être fortement influencées par le milieu biologique dans lequel elles sont réalisées (mesure de la quantité d'un anticorps ou d'une protéine exogène par ELISA ou spectroscopie de masse). Le raffinement de ces méthodes d'analyses sert d'une part à transférer des protocoles d'analyses d'une espèce à l'autre, et à améliorer leurs sensibilité et spécificité, réduisant ainsi potentiellement le nombre d'animaux nécessaires lors d'études subséquentes. De plus, la disponibilité de matériel biologique permet de la réalisation d'étude d'efficacité ou de toxicité in vivo, qui pourront potentiellement permettre de remplacer ou réduire le besoin d'études in vivo.

Réduction

Afin de ne pas surestimer le nombre d'animaux utilisés, le nombre d’animaux pour ce projet a été défini par une analyse rétrospective des prélèvements de liquide cérébrospinal et de prélèvements pulmonaires fait au sein de l’entreprise au cours des dernières années, modulée par la trajectoire de croissance de notre activité . Afin d’assurer un nombre minimum d’animaux, les animaux pourront être prélevé un maximum de 5 fois sur une période de 2 ans dans le cadre de cette DAP.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux (mâles et femelles hébergés séparément) sur de la litière pour leur permettre de fourrager. Des jouets sont mis à leur disposition (rotation des jouets une fois par semaine). Des friandises sont distribuées quotidiennement aux animaux (après les manipulations et fin de journée) dans la litière et dans des dispositifs à friandises (tube, jouets...). Les fruits et légumes frais qui leurs seront fournis seront variés d'un jour à l'autre, tout comme la façon de les préparer, afin de stimuler les animaux. Un fond musical sera diffusé dans l'animalerie tout au long de la journée afin d'habitue les animaux à la voix humaine et de masquer les sons liés à l'utilisation quotidienne de l'animalerie. Toutes les procédures décrites dans ce protocole auront lieux sous anesthésie, accompagnées de mesures de soutien en fonction de la procédure en question. Par exemple, les prélèvements de moelle osseuse ou de liquide cérébrospinal seront précédés d'injection d'analgésique, les prélèvements pulmonaires seront accompagnés de monitoring dédié et de supplémentation en oxygène. Les animaux seront gardés sur coussin chauffant durant la procédure afin de ne pas occasionner d'hypothermie. Les volumes maximum de matrice biologique à prélever sont basés sur une analyse de la littérature disponible, ou sur les pratiques utilisées en clinique humaine le cas échéant. L'animal sera suivi par le personnel d’étude tout au long de l'anesthésie et surveillé au moment de son réveil ainsi que durant les heures suivantes. Un suivi clinique quotidien ainsi que la mise en place de points limites spécifique à chaque procédure permet d’évaluer quotidiennement le bien-être de l’animal. En fonction de la procédure réalisée, un score neurologique pourra aussi être réalisé, si nécessaire, les jours suivant les prélèvements afin d’assurer qu’il n’y ait pas de dommage neurologique.

Choix des espèces

Par leur origine phylogénétique, les primates non humains présentent une forte proximité avec les humains en termes de patrimoine génétique, de processus épigénétiques, d’organisation fonctionnelle de leur système nerveux et immunitaire, et de leurs principales caractéristiques physiologiques, cognitives et comportementales. Cette proximité permet de les utiliser dans le cadre de développement de nouvelles stratégies thérapeutiques et/ou prophylactiques. Cette espèce est donc particulièrement utilisée pour tester l'efficacité ou la toxicité de drogues visant des processus biologiques spécifiques à l'homme ou aux espèces proches. Ces études peuvent couvrir les thérapies géniques ou cellulaires visant à corriger l'expression de gènes défectueux, les études infectieuses sur des virus n'infectant que l'homme ou certains primates, ou encore les thérapies visant le système nerveux central (la barrière hémato-encéphalique de l'humain étant très proche de celle du singe). Ce type d'étude nécessites la mise au point de méthodes d'analyses dédiées, pour lesquelles l'accès au matériel biologique de l'espèce cible est nécessaire. Ainsi, des études visant des maladies génétiques ou des leucémies auront besoin d'analyser la moelle osseuse des animaux, les études infectieuses de virus respiratoire (le singe étant le modèle de référence pour l'infection au SARS-CoV-2) auront besoin d'échantillons pulmonaires, et les études visant le système nerveux auront besoin d'échantillons de liquide cérébrospinal pour mettre au point leur méthode de dosage. Les mises au point et/ou test préliminaires de ce projet concerneront des candidats médicaments humains. Les animaux pourront être des juvéniles à mature, en fonction des besoins de l’étude. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou des matures en fonction des objectifs des études. Par exemple, des prélèvements de moelle osseuse peuvent chercher certaines populations de cellules précurseurs plus fréquentes chez le juvénile que chez l'animal mature.

125 chiens, cochons, chèvres et moutons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit des prélèvements sanguins réguliers puis une ou deux chirurgies, dont la création d'une lésion et l'implantation d'un dispositif ORL, avant une euthanasie destinée aux analyses nécropsiques et histologiques. Les bénéfices annoncés pour les patients, implants plus durables et récupération plus rapide, restent renvoyés à l'application future du dispositif. Le porteur affirme que l'expérimentation sur "organisme entier" est "incontournable" et relève d'une "obligation règlementaire" pour valider les dispositifs implantables.

Objectifs

La sphère ORL (pour oto-rhino-laryngologie) est une zone anatomique complexe qui regroupe un large ensemble de structures comme entre autres les oreilles, le nez, les sinus et la gorge (y compris la bouche, la langue, le larynx et la trachée). Elle peut être le siège de différentes pathologies, acquises ou congénitales comme par exemple les cancers des voies aérodigestives supérieures (VADS) qui se situent au 5ème rang des cancers les plus fréquents en France, et dont la chirurgie par voie mini-invasive constitue l’un des traitements de première intention et représente la modalité de référence pour les tumeurs de la cavité buccale et à la suite de laquelle une reconstruction est souvent nécessaire; ou encore des anomalies du développement comme certaines sténoses dont la correction peut nécessiter l'emploi de stents par exemple. Le développement des techniques et des méthodes d’imagerie et de chirurgie interventionnelles, l’essor de la thérapie génique et cellulaire ou la découverte et l’amélioration des connaissances vis-à-vis d'entités pathologiques comme les cancers ont permis ou permettent d’envisager le développement de nouvelles techniques chirurgicales et/ou dispositifs permettant d’améliorer la santé des patients. On entend par dispositif implantable tout dispositif destiné à être implanté de façon invasive en totalité dans le corps humain ou à remplacer une surface épithéliale grâce à une intervention chirurgicale et à demeurer en place après l'intervention. L'évaluation et le développement de nouveaux dispositifs, méthodes et techniques pour le diagnostic et/ou le traitement des affections ORL par des méthodes de chirurgie standard et mini-invasives requièrent une phase de recherche et de développement. Durant ce projet le recours à l’animal vivant est indispensable pour évaluer les différentes versions de prototypes afin de reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire visés par les applications chez les patients et qui ne peuvent être obtenus par des méthodes alternatives. Les objectifs du projet sont doubles : raffiner les prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) dans la phase initiale du projet, puis ces versions entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour valider les dispositifs/méthodes/techniques selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58).

Bénéfices attendus

L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patients, une amélioration de la durabilité et de l’efficacité des implants pour éviter leur rejet, et ainsi les ré opérations parfois multiples des patients, pour réduire les temps de cicatrisation qui handicapent les patients, et réduire le traumatisme tissulaire, corollaire de ces interventions ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections grâce au recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. - Des procédures chirurgicales d'évaluation de dispositif en O.R.L avec ou sans procédure chirurgicale de création de modèle lésionnel préalable. Chaque animal du projet ne subira qu'une seule chirurgie d'évaluation de dispositif O.R.L associée ou non à une chirurgie de création de modèle antérieur soit une seule et parfois deux interventions chirurgicales par animal dont une mini-invasive pour la création de modèle lésionnel. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - La faim ,lors de la mise à jeun (12 heures pour les porcs, 12 à 24 heures pour les ovins/caprins et 6 à 8 heures pour les chiens) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - En fonction des besoins et préalablement à la procédure d'évaluation du dispositif O.R.L, l'induction d'une lésion à la faveur d'une intervention chirurgicale mini-invasive de type anastomose, création d'un defect tissulaire, ligature ou occlusion de vaisseaux par exemple - La douleur en phase postopératoire : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique, pour ces derniers points, des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple le recours systématique à l'anesthésie générale, l'usage systématique de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur opiacés, la protection des plaies, la mise en place d'un suivi clinique quotidien des animaux).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. En effet leur utilisation in fine chez les patients représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en oeuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, une analgésie est mise en place et des protocoles de prise en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (Anti-Inflammatoires Non Stéroidiens et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques détaillés dans la procédure ANIM-WI-015 sont appliqués tout au long du projet. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.

Choix des espèces

Les dispositifs doivent être testés sur une anatomie semblable à celle de l’Homme (de l’enfant à l’adulte de grande taille), cela impose l’expérimentation sur des gros animaux. Les différences interspécifiques tissulaires, anatomiques et fonctionnelles nécessitent différentes espèces pour optimiser l’expérimentation. L’évaluation des différents dispositifs du projet se fera uniquement sur le modèle animal préalablement identifié comme le plus pertinent : Les ovins et les caprins pour l'évalution de la durabilité des stratégies opératoires des dispositifs testés. Leurs intérêts principaux sont leur croissance limitée à l'âge adulte et leur robustesse. Les porcins pour l'évaluation de la durabilité de l’ancrage des dispositifs. Les canins lorsqu’ils sont les seuls à présenter la spécificité anatomique ou fonctionnelle recherchée. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.

Les souris utilisées portent une modification génétique qui provoque un syndrome de Leigh : perte de poids et retard de croissance vers quatre semaines, difficultés croissantes à se déplacer, puis détresse respiratoire peu avant la mort, vers sept ou huit semaines. 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Dès le sevrage, à 21 jours, elles reçoivent dans leur nourriture deux molécules qui freinent le système immunitaire, et passent un test de coordination sur rotarod à 40 jours, après un entraînement à 30 jours. Le traitement dure jusqu'à la mise à mort, décidée par une grille de score : une perte de poids de plus de 20 %, une détresse respiratoire ou une mobilité fortement réduite suffit à atteindre le seuil de 3 points. Le porteur mesure l'efficacité au retard d'apparition des signes cliniques, et garde donc les souris en vie jusqu'à ce que leur état franchisse ce seuil.

Objectifs

Il n'existe aucun traitement disponible pour la plupart des maladies mitochondriales, maladies génétique du métabolisme entraînant un handicap grave et une mort prématurée. Le syndrome de Leigh en est une des formes plus graves. Il est causé par des mutations dans de nombreux gènes différents affectant la fonction des mitochondries, les centrales énergétiques de nos cellules. Cliniquement, cette maladie affecte généralement le cerveau et les muscles. Une étude récente a rapporté un effet positif de deux médicaments agissant sur l'inhibition du système immunitaire chez un modèle de souris développant un syndrome de Leigh suite à l'inactivation d'un gène mitochondrial particulier. Le but de notre projet est de tester ces deux molécules sur un deuxième modèle de souris du syndrome de Leigh, impliquant un autre gène, afin de déterminer si ces deux traitements peuvent être généralisable à tous les patients atteints par cette maladie.

Bénéfices attendus

Le projet vise à étudier l'implication du système immunitaire en tant que mécanisme principal à l'origine du syndrome de Leigh et la possibilté d'approches thérapeutiques le ciblant . Si les résultats sont solides et montrent des améliorations significatives, cela devrait permettre le développement de traitements cliniques pour le syndrome de Leigh et potentiellement pour d’autres maladies mitochondriales.

Procédures

Traitement pharmacologique: administration de deux molécules thérapeutiques dans la nourriture, de l'âge de 21 jours jusqu'à la mise à mort de l'animal basée sur l'observation de signes cliniques. Basé sur une publication sur un modèle similaire, le traitement pourrait s'étendre sur 6 mois. Test de coordination motrice: les souris seront placées sur une machine (rotarod) permettant de vérifier leur capacité à coordonner les mouvements de leurs pattes. Il y aura une phase d'entrainement à l'âge de 30 jours, puis une phase de mesure à 40 jours. Basé sur des publications scientifiques, les souris restent en moyenne 10 minutes sur le rotarod, par mesure. Trois mesures seront effectuées, espacées de 15 minutes de récupération.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées sur ce projet ont un phénotype dommageable qui commence par une perte de poids et un retard de croissance (vers 4 semaines), puis des difficultés progressives à se mouvoir, et enfin des difficultés respiratoires peu avant le décès (à 7-8 semaines). Les traitements pharmacologiques en question ont été déjà appliqués dans des études scientifiques publiés qui ne semblent pas attribuer effets indésirables spécifiques.

Devenir

Tous les animaux prévus sur ce projet seront mis à mort en fin de protocole expérimental en vue de prélèvements post-mortem

Remplacement

Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle en absence d’autre modèles cellulaires qui permettent d’étudier la réponse du système nerveux à des immunotraitements in vivo. De plus, les modèles physiopathologiques par définition étudient les conséquences pathologiques de la mutation sur l’ensemble de l’organisme. Les lignées cellulaires tels que les cellules de peau de patients atteints par le syndrome de Leigh ne peuvent pas reproduire les mécanismes complexes d'adaptation physiologique systémiques liés à ces dysfonctionnements des mitochondries.

Réduction

Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux à utiliser pour obtenir des résultats exploitables au niveau statistique et les effectifs ont été calculés à l'aide d'un logiciel. Ainsi nous allons utiliser les mêmes souris pour les analyses cliniques, pathologiques et moléculaires.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la structure de bien-être animal, les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). En raison du phénotype dommageable des souris, nous ajoutons de la nourriture directement dans les cages, et utilisons des biberons avec tétine longue, pour permettre aux animaux de s'alimenter plus facilement. Pour limiter l’inconfort lié aux procédures, les manipulations seront réalisées par des personnes compétentes et expérimentées. Le bien-être des animaux fera l’objet d’un contrôle quotidien par le personnel de l'établissement utilisateur et du laboratoire. De plus, dans le cadre du protocole expérimental, à partir du début du traitement à lâge de 3 semaines, le poids corporel, la température rectale, la consommation alimentaire, l’état clinique seront évalués en aveugle au moins trois fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi). Une pesée supplémentaire sera effectuée le dimanche à partir de l’âge de 6 semaines. Un score sera attribué aux signes cliniques selon la grille de points suivante: Perte de poids 20% = 3 points; Détresse respiratoire = 3 points; Diminution de la mobilité: légère = 1 point; modérée = 2 points; sévère = 3 points. Dès que les souris obtiendront un score de 3 points, elles seront sacrifiées (point limite).

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines, car l'organisation de ses gènes est très similaire à celle de l'homme. De plus, la disponibilité de souris génétiquement modifiées permet d'étudier finement les mécanismes sous-tendant la pathogenèse de ces maladies mitochondriales. Dans le cas présent, cela permettra de tester l'efficacité de molécules thérapeutiques sur le syndrome de Leigh à l'échelle d'un organisme par des observations concrètes sur la survie et l'évolution pondérale. Le début du traitement commencera dès le sevrage des animaux à 21 jours car les molécules testées étant dans la nourriture, il faut que les souris puissent se nourrir seules. Le traitement continuera jusqu'au moment de la décision d'euthanasier les souris, basée sur notre grille de score, car le critère principal d'efficacité du traitement pharmacologique est la survenue plus tardive des signes cliniques pathologiques.

270 souris, 270 rats et 270 cochons d'Inde vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cette société de prestations teste pour ses clients des molécules dont elle indique ignorer la nature et les effets, administrées par des voies multiples, avec des prélèvements sanguins par ponction rétro-orbitale, sublinguale ou intracardiaque et des séjours de 24 heures en cage à métabolisme qui isolent chaque animal. Le porteur reconnaît qu'il lui est difficile d'anticiper les nuisances puisqu'il ne connaît pas les composés testés. Il conclut que l'absence de modèle in vitro rend le recours à l'animal "incontournable" et fixe six animaux par groupe d'après quinze ans d'expérience, sans test statistique.

Objectifs

Ce projet approuvé par la direction de la société permettra d’évaluer l’absorption, la distribution et le métabolisme de candidats médicaments dans l’organisme après administration afin d’obtenir des données de pharmacocinétiques et pharmacodynamie. Etant une société de prestations de service, nous testons les molécules de nos clients dont nous n’avons aucune connaissance sur le type/famille de molécule. Cependant, ces molécules seront testées dans le cadre de la recherche de pathologies rénales, urologiques, oncologiques, gastro-entérologiques…nos principales thématiques de recherche.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de récolter du matériel biologique (sang, organes, urines, fecès, salive….) afin d’avoir des données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques de candidats médicaments. Ces différentes données, obtenues au tout début des études pré-cliniques, permettront par la suite d’adapter les doses et la fréquence d’administration des composés dans des études plus complexes (pouvant mimer une pathologie).

Procédures

Les animaux seront traités par des molécules par différentes voies possible (per os, intrapéritonéale, intra-veineuse, sous-cutanée, intradermique, intra-vésicale…). Ces gestes sont en général rapides et durent moins d’une minute/animal. Les animaux pourront être anesthésiés pour certains gestes ou prélèvements (gazeuse : isoflurane ou fixe : xylazine/kétamine). Ces anesthésies devraient être rapides et ne pas durer plus de 1 heure (pour les administrations intra-vésicales). Des prélèvements sanguins sur animal vigil ou anesthésié au niveau des veines caudales, saphènes, de la veine abdominale, en sublinguale, submandibulaire, rétro-orbital ou intracardiaque pourront être réalisés. Ces gestes sont rapides et durent moins de 5 min. Les animaux pourront être mis dans les cages à métabolisme et seront donc isolés de leurs congénères quelque temps (24H maximum).

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux. Cependant, les animaux vont être manipulés et vont recevoir des administrations de produits, pouvant engendrer un stress et une légère douleur. Les animaux pourront être mis dans des cages à métabolisme, et donc être isolés temporairement de leurs congénères (24 heures maximum), avoir des prélèvements sanguins, être anesthésiés…tout cela peut provoquer une nuisance.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés car des prélèvements de sang et d’organes seront réalisés.

Remplacement

Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent fournir du matériel biologique afin de réaliser différents tests de pharmacocinétique ou pharmacodynamie. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle). Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. En général, ces études préliminaires de pharmacocinétique et pharmacodynamie ne sont pas réalisées sur un grand nombre d’animaux car ce sont des études préliminaires aux tests pré-cliniques. Aucun test statistique n’est utilisé pour déterminer le nombre d’animaux par groupe. Cependant, de par notre expérience de plus de 15 ans, nous savons qu’un nombre de 6 animaux par groupe est suffisant pour avoir des données fiables et statistiquement significatives. Dans une même étude, il sera rare que différentes espèces soient utilisées. Nous prévoyons de réaliser 3 études par an par espèce avec 18 animaux par étude.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Différents types d’enrichissement seront ajoutés aux animaux (coton, aspen brick (bout de bois), igloo en polycarbonate, tunnel, carré de coton…). Les procédures nécessitant une anesthésie seront réalisées avec des plaques chauffantes thermorégulées afin d'éviter une hypothermie à l'animal. Les méthodes utilisées pour récolter tout ce matériel biologique (par exemple les cages métaboliques avec une phase d’acclimatation pour réduire le stress) sont peu invasives et ne devraient pas provoquer chez l’animal un grand stress, ni de souffrance particulière et ne nécessitent donc pas l’utilisation d’antalgique. Tous les gestes techniques seront réalisés par du personnel compétent et qualifié diminuant ainsi les temps de contention et la souffrance ou le stress possible. Le personnel, sensibilisé au raffinement et à l’éthique animal, pourra modifier quelques protocoles, enrichissement des cages…. en fonction des nouvelles techniques mises au point et nouvelles obligations dans le but d’améliorer les conditions des animaux de laboratoire. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids supérieure à 20%, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … . Si un animal présentait un signe de douleur, de mal-être, il serait isolé dans un premier temps, hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Dans notre laboratoire, nous utilisons ces 3 espèces (rat, souris et cobaye) selon les modèles et aires thérapeutiques employés. Ces trois espèces seront donc utilisées pour réaliser des études de pharmacocinétique et pharmacodynamie. Les animaux utilisés seront très dépendants des demandes de nos clients et de la thématique étudiée. Nous essayerons le plus possible d’utiliser des animaux âgés de 7 à 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines. Cependant, l’utilisation d’animaux plus jeunes ou plus âgés sera possible.

64 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection unique d'un vecteur délivrant de l'ARN par différentes voies, un prélèvement sanguin sous anesthésie, puis est tué pour prélever ses organes. Le porteur présente cette étude de biodistribution comme exigée par les autorités réglementaires en vue d'un usage futur chez l'humain. Il cite des modèles alternatifs comme les organoïdes ou les organes sur puce, mais conclut qu'aucun ne renseignerait sur la dissémination de l'ARN dans un "organisme complet".

Objectifs

La caractérisation du profil de biodistribution d'un produit après administration in vivo est un élément majeur du programme de développement préclinique. Les études de biodistribution, exigées par les autorités réglementaires, ont pour objectif de déterminer la dissémination du matériel biologique dans les tissus et les fluides ciblés et non-ciblés, ainsi que leur transmission dans les lignées germinales. Ce projet a pour objectif d’évaluer la biodistribution d’un vecteur non intégratif délivrant de l’ARN chez l’animal, nécessaire pour comprendre la pharmacologie du produit. C’est un requis pour l’utilisation future de ce vecteur in vivo, et notamment chez l’Homme à des fins thérapeutiques. Plusieurs voies d’injection vont être testées, avec un ensemble d’organes analysés post mortem, en relation avec la voie d’injection en question.

Bénéfices attendus

Cette étude de Biodistribution chez l’animal va permettre : - d’évaluer la sécurité du produit en déterminant comment il se répartit dans les différents organes et tissus de l’organisme; - de valider l’expression transitoire de l’ARN distribué sans évènement(s) d’intégration dans le génome; - d’évaluer son efficacité de dissémination pour optimiser les doses et les schémas posologiques pour maximiser son efficacité thérapeutique; - de conceptualiser la thérapie adaptée à l’utilisation du produit en termes de contenu du vecteur et de méthodes d’administration appropriées pour atteindre les cibles biologiques.

Procédures

Les animaux recevront 1 seule injection, soit par voie intraveineuse, ou intramusculaire, ou sous-cutanée, ou intradermique (durée 2-3 minutes). On réalisera un prélèvement sanguin (durée 2-3 minutes) sous anesthésie gazeuse, avant l'euthanasie en vue du prélèvement d'organes et des analyses post-mortem.

Impact sur les animaux

Dans le cadre d’une étude de biodistribution, l’administration in vivo d’un produit peut entrainer des effets indésirables, notamment des réactions allergiques, des effets toxiques…. Dans cette étude, l’administration in vivo du vecteur de transfert d’ARN se fera par voie intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée ou intradermique. Ces injections peuvent entrainer un stress ou une douleur chez l'animal. Par ailleurs, ces souris subiront une anesthésie pouvant induire un stress lors de la contention.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à l'issue des procédures expérimentales afin de collecter les organes pour des analyses moléculaires et histologiques.

Remplacement

Le Remplacement du modèle animal pour une étude de biodistribution peut se faire selon : - L’utilisation de modèles alternatifs tels que la culture de cellules adaptées, les modèles bio-informatiques ou les organoïdes; - l’utilisation d’organes sur puce qui permettent de modéliser la biodistribution dans un environnement plus proche de la réalité. Cependant, aucun de ces outils ne pourra apporter de réponses précises sur la biodissémination des ARN dans un modèle d’organisme physiologique complet nécessaire à la validité scientifique requise. La fonctionnalité du vecteur de transfert d’ARN prévu pour cette étude est systématiquement validée sur des modèles cellulaires in vitro en amont.

Réduction

La Réduction du nombre d’animaux lors de la mise en place d’une étude implique une réflexion sur la planification expérimentale pour laquelle la conception de l’étude vise à réduire le nombre d’animaux nécessaires tout en garantissant des résultats statistiquement significatifs. Le design associé à ce projet prend en considération les objectifs fixés correspondant au minimum requis pour une étude statistique. Nous utiliserons ainsi 8 souris par groupe, en comparant les résultats des études moléculaires et histologiques entre animaux ayant eu le vecteur non-intégratif amenant un ARN et les controles ayant eu le véhicule. Par ailleurs, afin de réduire le nombre d'animaux, les mêmes organes seront utilisés pour l'ensemble des analyses, moléculaires et histologiques, évitant ainsi de doubler le nombre de souris.

Raffinement

Le Raffinement implique la mise en place de procédures assurant: - l’amélioration du bien-être des animaux pour minimiser la douleur et la détresse éventuelles des animaux participant à l’étude; - une surveillance non-invasive pour collecter les données sur le bien-être des animaux; - la présence de produits d’enrichissements dans les lieux d’hébergement des animaux. En particulier, nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation et les sites d'injection. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux par spray de dermidine(R) seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

La souris est l’un des modèles animaux les plus couramment utilisés dans les études de biodistribution pour les raisons suivantes : - Similitudes génétiques, anatomiques et physiologiques avec l’Homme - Disponibillité et coûts - Simplicité de manipulation - variété de souches permettant de simuler des conditions pathologiques spécifiques si nécessaire Les souris qui seront utilisées auront entre 10 et 12 semaines, s’assurant ainsi de leur maturité et de leur taille adulte. Cela facilite la manipulation, la collecte d’échantillons et la réalisation des expériences à suivre.

20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit deux injections intraveineuses à trois semaines d'intervalle, d'un vecteur lentiviral non intégratif conçu pour délivrer de l'ARN, d'un vecteur intégratif ou du seul véhicule pour les 4 témoins, et subit six prises de sang pour doser les cytokines de l'inflammation. Le porteur prévoit de possibles réactions allergiques ou effets toxiques, présente l'étude comme "un requis pour l'utilisation future de ce vecteur in vivo", chez l'humain notamment, et affirme qu'elle permettra de "prédire les réponses immunitaires humaines possibles". Il énumère lui-même organes sur puce, organoïdes, biobanques de tissus humains et simulations informatiques, avant d'affirmer qu'aucun de ces outils ne rendra compte de la réponse inflammatoire dans un "organisme physiologique entier".

Objectifs

L’étude de la réponse inflammatoire dans un modèle de souris est essentielle pour évaluer la sécurité, l’efficacité et la faisabilité de l’utilisation d’un produit à visée thérapeutique. Elle contribue à orienter son développement, optimiser les protocoles d’administration, et à garantir la sécurité de ce type de thérapie. Ce projet a donc pour objectif d’évaluer la réponse inflammatoire pouvant survenir après l’injection d’un vecteur non intégratif pouvant délivrer de l’ARN chez l’animal. C’est un requis pour l’utilisation future de ce vecteur in vivo, et notamment chez l’Homme à des fins thérapeutiques. L’injection intra veineuse sera testée, avec un rappel d’injection 3 semaines plus tard. Les analyses consisteront en un dosage de la sécrétion de cytokines dans le sang.

Bénéfices attendus

Cette étude de la réponse inflammatoire chez l’animal va permettre : - d’évaluer la sécurité du produit en évaluant la réaction du système immunitaire; - d’identifier les caractéristiques du produit pouvant provoquer une réponse inflammatoire; - de prédire les réponses immunitaires humaines possibles.

Procédures

Les animaux recevront 2 injections par voie intraveineuse (durée 2-3 minutes). On réalisera 6 prélèvements sanguins (durée 2-3 minutes)

Impact sur les animaux

Dans le cadre d’une étude de la réponse inflammatoire, l’administration in vivo d’un produit peut entrainer des effets indésirables, notamment des réactions allergiques, des effets toxiques…. L’administration in vivo du vecteur de transfert d’ARN par voie intraveineuse peut entrainer un stress ou une douleur chez l'animal, Par ailleurs, ces souris subiront des prélèvements sanguins pouvant également induire un stress.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à l'issue des procédures expérimentales. Etant donné que ces souris seront injectées avec un vecteur lentiviral, on ne pourra pas les ré-utiliser. Les animaux seront ainsi euthanasiés en fin de procédure expérimentale, pour ne pas les maintenir en vie inutilement.

Remplacement

Le Remplacement du modèle animal pour une étude de de la réponse inflammatoire peut se faire selon l'utilisation : - de modèles in vitro, avec des cellules du système immunitaires; - d’organes sur puce qui permettent de créer des modèles miniatures d’organes ou tissus humains; - de modèles bio-informatiques et de simulation; - de biobanques de tissus humains; - des organoïdes, version miniature et simplifiée d'un organe fabriqué in vitro et qui présente une anatomie et une fonction proches de la physiologie. La fonctionnalité du vecteur de transfert prévu pour cette étude est ainsi validée sur des modèles cellulaires in vitro en amont. Cependant, aucun de ces outils ne pourra générer l’ensemble des données attendues sur la réponse inflammatoire induite par l’injection d’un vecteur viral dans un modèle d’organisme physiologique entier. La réponse inflammatoire étant la somme d’une cascade de réponses physiologiques, elle est impossible à évaluer de façon exhaustive sans le modèle animal et doit donc s’étudier in vivo.

Réduction

La Réduction du nombre d’animaux lors de la mise en place d’une étude implique une réflexion sur la planification expérimentale pour laquelle la conception de l’étude vise à réduire le nombre d’animaux nécessaires tout en garantissant des résultats statistiquement significatifs. Le design associé à ce projet prend en considération les objectifs fixés correspondant au minimum requis pour une étude statistique. Nous utiliserons ainsi 8 souris par groupe (sauf pour le groupe controle où un effectif de 4 souris sera suffisant), cet effectif constituant un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction du nombre d'animaux, en comparant les animaux ayant eu un vecteur non-intégratif, un vecteur intégratif ou le véhicule. Des études similaires antérieures ont notamment permis de réduire le nombre d’animaux tout en garantissant des données interprétables et statistiquement utilisables. Le nombre de contrôles peut ainsi être limité à 4 souris. Par ailleurs, 4 femelles et 4 males permettront d’évaluer la réponse inflammatoire potentielle après injection des vecteurs lentiviraux. Nous ne nous attendons notamment pas à un dimorphisme sexuel dans cette réponse.

Raffinement

Le Raffinement implique la mise en place de procédures assurant: - l’amélioration du bien-être des animaux pour minimiser la douleur et la détresse éventuelles des animaux participant à l’étude; - une surveillance non-invasive pour collecter les données sur le bien-être des animaux; - la présence de produits d’enrichissements dans les lieux d’hébergement des animaux. En particulier, nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation et les sites d'injection. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. Lors des prélèvements sanguins, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux par spray d'un antiseptique seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires

Choix des espèces

La souris est l’un des modèles animaux les plus couramment utilisés dans ce type d’étude pour les raisons suivantes : - Similitudes génétiques, anatomiques et physiologiques avec l’Homme - Disponibillité et coûts - Simplicité de manipulation - variété de souches permettant de simuler des conditions pathologiques spécifiques si nécessaire Les souris qui seront utilisées auront entre 10 et 14 semaines, s’assurant ainsi de leur maturité et de leur taille adulte. Cela facilite la manipulation, la collecte d’échantillons et la réalisation des expériences à suivre.