Autres troubles humains
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- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
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- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Développement d’un modèle de migraine à l’aide d’injections répétées d’isosorbide dinitrate (ISDN) chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
1 994 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent une injection quotidienne d'isosorbide dinitrate pendant cinq jours pour induire une migraine chronique, puis subissent des tests répétés de sensibilité douloureuse tactile de la face et de la patte et de sensibilité thermique de la patte. Le porteur indique que les animaux restent douloureux et sont pour cette raison tués dès la fin de l'expérience. Il conclut que l'étude d'un analgésique doit se faire sur l'animal vigile, seule option selon lui pour restituer les composantes sensorielle et émotionnelle de la douleur.
Objectifs
La migraine est un trouble de la douleur neurologique. Elle a un impact sur la santé mais aussi socio-économique. Selon des rapports épidémiologiques, la migraine touche 1 personne sur 10 dans le monde et son incidence continue d'augmenter (2017). La migraine était la sixième maladie la plus courante parmi 328 maladies et méfaits. En plus des céphalées, les migraineux présentent d’autres symptômes comme des nausées, de la fatigue, une photo et/ou phonophobie et des allodynies mécaniques et thermiques. L’allodynie est un stimulus normalement non douloureux ressentie comme douloureux. Il est particulièrement ressenti au niveau de la face des patients. Les traitements médicamenteux actuelles sont pas sans effets secondaires. De plus, certains patients répondent mal à ces traitements. Il est donc important de développer de nouveaux traitements. Pour cela, nous souhaitons mettre au point un modèle de douleur migraineuse induit par injection intrapéritonéale répétée d’isosorbide dinitrate. Ce modèle, décrit dans la littérature, permet de montrer les mêmes symptômes qu’une personne migraineuse (allodynie thermique et mécanique). De plus la physiologie de l’animal est impactée de la même manière que chez l’homme. Dans le cadre de ce travail, nous souhaitons donc mettre au point ce modèle et tester la détection d’allodynie mécanique et thermique. Dans un second temps, nous testerons la réversion de l’allodynie par une molécule de référence.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est la mise au point d’un modèle fiable et reproductible. Ce modèle pourra servir à la mise au point de nouveaux traitements afin de proposer une meilleure prise en charge poiur le patient. La caractérisation de ce modèle par de nombreux tests pourra donner lieu à un poster dans le cadre d’un congrès afin de partager la connaissance du modèle.
Procédures
Les animaux subissent 1 injection intrapéritonéale par jour pendant 5 jours (30 sec pour injection). Selon les procédures ils peuvent être soumis à des mesures de sensibilité douloureuse tactile (face, patte), de mesure de sensibilité thermique (patte). Ces tests durent moins d’une minute chacun et sont répétés durant une cinétique de 5 points de mesures (15 min minimum de repos entre chaque). Ces animaux pourront recevoir une molécule de références selon une voie d’administration courantes (Intrapéritonéale, gavage orale, sous-cutanée ; temps d'injection de 30sec maximum) afin de tester la réversion de la sensibilité à la douleur.
Impact sur les animaux
Les nuisances que vont subir les animaux sont les injections répétées d’isosorbide dinitrate en intrapéritonéale (1 fois par jour pendant 5 jours). Les tests sont : des stimulations mécanique ou thermique d’une durée inférieure à 1 min par stimulation. La stimulation douloureuse est stoppée dès réaction de l’animal. Cette opération est réalisée au maximum 2 fois par jour de D0-D5. Une cinétique de test pourra être réalisée allant jusqu’à 5 points de mesures espacés de 15min minimum. Lors de ce test les animaux sont isolés dans un compartiment en plexiglass ou dans un gant pour la stimulation de la face, le temps de la cinétique. Des traitements en intrapéritonéale, sous-cutanée ou gavage orale pourront être réalisés afin de tester la réversion par la pharmacologie de référence (injection rapide).
Devenir
L’ensemble des animaux sont mis à mort. Le développement du modèle agit sur les mécanismes inflammatoires. Il est donc difficile de connaitre l’impact neurophysiologique sur d’autres modèles utilisés au sein du laboratoire. De plus, les animaux ont un modèle de migraine chronique. Ils restent donc douloureux. Pour l’ensemble de ces raisons, ils sont mis à mort dès la fin de l’expérience.
Remplacement
L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon la définition officielle, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les données bibliographiques disponibles. Cet effectif par groupe sera confirmé lors des stades initiaux de développement du modèle par la réalisation d’un calcul de puissance. A la fin de la procédure 1, le nombre d’animaux pourra être réajusté en fonction des résultats.
Raffinement
De l’enrichissement est présent dans les cages afin de limiter le stress et d’améliorer la qualité de vie des animaux (Tunnel en plastique, papier kraft et briquettes en bois à ronger). Des points limites, précoces et spécifiques pour chaque protocole d’étude sont définis et résumé en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints. Au vu du domaine d’expertise du laboratoire (spécialisation dans l’étude de la douleur), les expérimentateurs sont strictement formés au respect de l’animal et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. La maitrise des gestes techniques est contrôlée régulièrement. Les animaux sont surveillés chaque jour. Pour les tests, des cut-off (valeur maximale de stimulation) ont été fixé afin de limiter la douleur. De l’habituation aux tests/contention est faite afin de limiter le stress.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein de la structure. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie récemment et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionné pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés seront des rats adolescents. Nous garderons les animaux environ 2 semaines. Nous ne souhaitons pas avoir des animaux trop gros afin de pouvoir réaliser les tests sereinement. De plus, les crises de migraines chez l’homme sont souvent intensifiées à la période de l’adolescence avec les changements hormonaux.
Mesure de l’ammoniémie chez le rat et recherche d’un traitement contre l’hyperammoniémie
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
3 368 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit une hyperammoniémie par médicament puis on administre des composés par voie intrapéritonéale ou par gavage, avec des prélèvements sanguins sous anesthésie et un prélèvement terminal intracardiaque, pour chercher un traitement de l'excès d'ammoniaque dans le sang. Le porteur indique que les gavages répétés peuvent irriter et que les prélèvements se font sous anesthésie pour réduire le stress. Il conclut qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne reproduit l'ensemble des symptômes et qu'il est donc "nécessaire" de travailler sur un "organisme entier".
Objectifs
Le but du projet est de rechercher des produits efficaces pour diminuer significativement une hyperammoniémie induite par un traitement médicamenteux. Chez l'humain adulte, une petite partie de l'ammoniaque est utilisée pour la synthèse des protéines et d'autres composés essentiels. Le reste est un déchet neurotoxique et il doit être éliminé. La majeure partie de l'ammoniaque est excrétée dans l'urine sous forme d'urée. Cependant, l'ammoniémie, qui représente la concentration d'ammoniaque dans le sang, peut être fortement augmentée par différents facteurs comme certains médicaments (valproate de sodium, fluorouracil), une insuffisance hépatique, une anomalie du cycle de l'urée, ou un déficit enzymatique. Dans ces conditions, une hyperammoniémie aigûe sévère peut entraîner l'apparition d'une encéphalopathie avec oedème qui peut être mortelle. Une hyperammoniémie moins sévère peut entraîner une léthargie, des maux de tête, un état de confusion et de l'agitation. De même, une hyperammoniémie chronique légère pourrait favoriser des troubles neuropsychiatriques. La neurotoxicité de l'ammoniaque entraîne également des perturbations au niveau des neurotransmetteurs, de la production d'énergie et du débit sanguin cérébral notamment. Ce projet consiste à identifier des produits inducteurs d'hyperammoniémie, et de rechercher des produits qui pourraient réduire et/ou prévenir cette hyperammoniémie, selon un protocole établi à partir de données de la littérature. Actuellement, il n'y a pas de guide ou de protocole pour faire face à une hyperammoniémie induite par un médicament. Les solutions proposées sont l'arrêt du traitement médicamenteux, la diminution des doses ou la poursuite du traitement en mesurant l'ammoniémie régulièrement. Une hémodialyse est la thérapie la plus efficace pour supprimer une hyperammoniémie, mais c'est très invasif. Deux procédures seront utilisées dans notre projet : la première procédure permettra valider la méthode de prélèvement du sang et la méthode de dosage de l'ammoniémie, et d'identifier des produits inducteurs d'hyperammoniémie; la deuxième procédure consistera à évaluer l'effet de différents traitements capables de réduire et/ou de prévenir cette hyperammoniémie.
Bénéfices attendus
Actuellement, il n'y a pas de guide ou de protocole pour faire face à une hyperammoniémie induite par un médicament. Il est important de développer de nouveaux traitements qui permettraient de réduire et/ou de prévenir une hyperammoniémie.
Procédures
Deux prélèvements sanguins à 30 ou 90 minutes d'intervalle auront lieu sous anethésie générale pour réduire le stress et la douleur. Le protocole de chaque prélèvement comprend l'anesthésie, le prélèvement et l'arrêt du saignement, et dure environ 10 minutes. Une ou deux administrations de produits seront réalisés par voies intrapéritonéale ou par gavage.
Impact sur les animaux
Les animaux sont observés attentivement en respectant les points limites et ils seront euthanasiés en cas d'atteinte des points limites. L’administration répétée par gavage peut entraîner des irritations, c’est pourquoi les traitements seront effectués par une personne expérimentée à l’aide de sondes souples pour limiter le stress et les irritations liés aux gavages répétés. Les prélèvements sanguins des animaux se feront sous anesthésie générale afin de réduire le stress de la manipulation et toute souffrance.
Devenir
En fin de procédure, chaque animal sera euthanasié après prélèvement de sang par voie intracardiaque et recueil d'un grand volume de sang.
Remplacement
L'étude de l'ammoniémie chez l'animal implique l'utilisation d'animaux entiers. L’hyperammoniémie est une pathologie complexe avec des symptômes qui touchent différents organes. L'utilisation de modèle avec des organes isolés ne permet pas d'enregistrer l'influence de différents produits sur l'hyperammoniémie. Des résultats obtenus lors de précédentes études et des données de la littérature permettent de sélectionner les produits à étudier (doses, voies d'administration, volumes). Des alternatives non animales ne peuvent être envisagées pour rechercher l'ensemble des objectifs prévus. Les méthodes expérimentales in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire l’ensemble des symptômes de l'hyperammoniémie, il est donc nécessaire de travailler sur un organisme entier.
Réduction
La variabilité des réponses aux effets d’un traitement chez le rongeur justifie une taille de groupe de minimum 12 animaux par condition expérimentale. Un effectif inférieur expose à un risque de devoir reproduire les procédures pour valider statistiquement la solidité des résultats obtenus par une analyse de la variance (ANOVA). En cas de résultat significatif, les différences entre chaque groupe et le groupe contrôle seront explorées à l’aide d’un test de comparaisons multiples adapté (Dunnett ou Tukey). En cas de trop petit nombre d'animaux, il faudrait refaire une étude pour confirmer les effets et observer des différences significatives entre les groupes. En cas de faible ou non efficacité d'un produit, son étude sera arrêtée.
Raffinement
Une surveillance attentive des animaux est réalisée. Les animaux seront hébergés à plusieurs afin de maintenir leur socialisation et dans des cages enrichies. Les administrations par voie orale seront effectuées sur des animaux vigiles par du personnel expérimenté, à l’aide de sondes souples pour limiter les irritations. Les prélèvements de sang se font sous anesthésie générale. Les animaux seront observés attentivement en respectant les points limites. Ils seront euthanasiés en cas d'atteinte des points limites mis en place pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse.
Choix des espèces
Après recherche bibliographique, le rat est apparu parmi les modèles animaux les plus fréquemment décrits, et les mieux appropriés pour ce projet. Les animaux utilisés sont des adultes conformément aux publications de référence.
Evaluation des effets anti-allodyniques/hyperalgésiques d’une ou plusieurs molécules dans différents modèles de douleur neuropathiques associés à différents tests chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
12 490 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 10 990 en gravité sévère. Une douleur neuropathique leur est provoquée par chirurgie ou injection, puis ils subissent des stimulations mécaniques ou thermiques répétées jusqu'à six fois par jour et l'administration de composés par de multiples voies avec prélèvements sanguins, pour tester des candidats analgésiques. Le porteur décrit des atteintes possibles, paralysie, automutilation dans de rares cas, amaigrissement, anémie et perte de tonus, et indique que la plupart des modèles restent douloureux dans le temps, ce qui exclut selon lui toute réutilisation. Il affirme que l'étude de la douleur chez l'animal vigile reste la "seule option" avant le passage à l'humain, l'in vitro ne portant que sur la nociception.
Objectifs
La douleur est encore dans les principales causes d’arrêt maladie. Très mal soignée ou avec de nombreux effets secondaires, il est important de continuer la recherche pour développer de nouvelles pharmacologies de références. Le but de ce projet est d’offrir la possibilité de tester des candidats-médicaments dans différents modèles de douleur neuropathique et pour différent type de douleur (mécanique, thermique). Ces modèles et tests sont couramment décrit dans la littérature et sont réalisés dans le laboratoire depuis plusieurs années. La douleur neuropathique est liée à une atteinte des nerfs. Elle a différentes origines. La première origine est un traumatisme ou une compression. Elle peut aussi être due à un agent chimique tel que l’oxaliplatine (anticancéreux), Les maladies telles que le diabète, le cancer, les infections au VIH et le zona peuvent aussi entrainer une neuropathie. Ces douleurs se traduisent majoritairement par une allodynie (douleur induite par un stimulus normalement non douloureux) ou une hyperalgésie (sensation de douleur ressentie plus intensément) induite par le toucher, la pression, le froid ou chaud. En France, c’est 7 à 10% de la population qui est atteint de douleurs chroniques. Cette hypersensibilité a un impact sur la qualité de vie (troubles du sommeil, anxiété et dépressions). Ceci engendre donc une augmentation des visites chez les professionnels de santé (médecins généralistes, psychiatres…) ainsi qu’une augmentation des prescriptions de médicaments L’objectif de ce projet est de proposer des modèles et tests pertinents qui permettront l’évaluation de l’efficacité de nouvelles molécules à visée analgésique qui pourront ensuite être utilisés en clinique. Le but, à long terme, étant de mieux traiter les patients souffrant de douleurs neuropathiques et de limiter les effets secondaires des composés utilisés.
Bénéfices attendus
Les molécules de référence dans le traitement de la douleur sont soit peu efficaces, soit avec de nombreux effets secondaires (Opiacés : Impact sur le transit, tolérance…). Le but de ce projet est de tester de nouveaux candidats médicaments dans des modèles de douleur reconnus. Ils seront comparés aux molécules de références testées en cliniques. Le bénéfice à long terme de ce projet est donc la mise au point de nouveaux composés antalgiques efficaces et avec peu d’effets secondaires destinés à l’évaluation en étude clinique puis à la mise à disposition des patients. A plus court terme, la publication de posters/articles scientifiques pour mettre en évidence certains résultats encourageants sera envisagée.
Procédures
Induction du modèle : chirurgie ou injection en intrapéritonéale afin d’induire le modèle. Ils seront ensuite testés avec un des tests suivants. Tests : stimulation mécanique ou thermique d’une durée inférieure à 1 min par stimulation. La stimulation est stoppée dès réaction de l’animal. Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limité de 6 points de mesure par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. Les animaux recevront des traitements de composés (voie intrapéritonéale, orale, sous-cutanée, intramusculaire, intranasale, intra-rectale, intra-colonique, intraveineuse, intrathécale, intra-articulaire). Ces actes durent quelques secondes. Ils pourront être réalisés une seule fois, ou plusieurs fois par jour espacé de 0min (simultanément) à plusieurs heures (2-4-6-8-12) ou même de plusieurs jours (une fois par semaine, un jour sur deux) Ceci est dépendant de la pharmacocinétique du composé testé. De plus, les animaux pourront subir des prélèvements de sang en répétés ou en prélèvement unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé testé. Les prélèvements de sang durent maximum 3 minutes et les animaux peuvent être sous anesthésie pendant 5minutes. Les prélèvements sont limités à un maximum par jour selon les recommandations en vigueur.
Impact sur les animaux
Les 6 modèles décrits dans ce projet sont des modèles de douleur neuropathique chronique ou aigue. Les autres nuisances liées au développement de ces modèles sont des paralysies ou automutilations (dans de rares cas, nuisances sévères), une patte qui se recroqueville plus ou moins (nuisance modérée), une hyperglycémie, un amaigrissement (nuisance modérée), une perte de poids, parfois une anémie et une perte de tonus. Les nuisances liées aux tests sont liées à l’application d’un stimulus douloureux (mécanique ou thermique) qui sera stoppé suite à la réaction de l’animal. Les tests sont pratiqués sur animal en contention manuelle ou dans une boîte en plexiglass avec une mobilité réduite mais possible (nuisance légère). Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limité de 6 points de cinétique par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. De plus, l’ensemble des animaux pourra subir des nuisances liées à l’administration unique ou répétée de composés (lésion superficielle, nuisance légère). Les composés administrés peuvent induire des effets secondaires listés dans les points limites. Enfin, les animaux peuvent subir des prélèvements de sang unique ou répétés afin d’évaluer la pharmacocinétique du composé (nuisance légère
Devenir
Une grande partie des modèles utilisés ici sont des modèles stables dans le temps. Les animaux restent donc douloureux. Il n’est donc pas concevable de les replacer. Seul le modèle d’administration aigue à l’oxaliplatine pourrait être replacé. Bien que les animaux ne présentent plus d’allodynie après une semaine nous ne connaissons pas les impacts potentiels que l’administration en systémique a pu réaliser. Nous ne pouvons donc pas exclure un impact potentiel lors de la réutilisation des animaux. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont euthanasiés par le personnel habilité.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments analgésiques. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par IASP (International Association for the Study of Pain) , la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Ces modèles sont couramment utilisés au sein de la structure. De nombreuses données ont été générées afin de calculer au mieux le nombre d’animaux minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques à postériori. Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les données disponibles. Il est attendu que le nombre d’animaux effectivement nécessaire soit inférieur aux prévisions de cette demande d’autorisation de projet.
Raffinement
Les animaux ont accès dès leur arrivée dans l’animalerie à de l’enrichissement (tunnel en polycarbonate rouge transparent, briquettes en bois) et sont habitués à la salle d’expérimentation et aux tests (contention, enceinte…) afin de limiter leur stress. Lors des tests, des valeurs dites de cut-off sont fixées et correspondent à la stimulation maximale que peut subir l’animal. Ceci permet d’éviter les lésions dues au test ou les stimuli plus douloureux que nécessaire. Dans le cadre d’immersion de la patte ou de mVF, le choix des températures ou de la gamme de filaments est fait afin de limiter la douleur et de mesurer une allodynie (stimulus non douloureux pouvant être ressentie comme douloureux par des animaux pathologiques). Une anesthésie est appliquée avant chaque acte le nécessitant et le permettant : chirurgie, prélèvements, traitements particuliers, … Une surveillance accrue des animaux est mise en place au vu de la thématique de la recherche. Des points limites sont clairement établis et des mesures sont mise en place suite aux inductions des modèles : soins post opératoires, aliments placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir, sous cutanée de NaCl ou de Glucose en post chirurgie ou en cas de déshydratation. Un système de fiche de scoring est également mis en place afin de donner une vision objective des paramètres à suivre.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par d’autres espèces est critique et suivie avec attention au sein du laboratoire. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l'assoication internationnal de l'étude de la douleur est récente et les modèles in vitro d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionné pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés dans l’ensemble des procédures sont des animaux juvéniles à adolescents lors de l’induction de la pathologie (21 à 49 jours ; 80-280g pour des mâles). Ces stades ont été choisis car ils sont adaptés au développement des modèles, ils permettent un suivi sur plusieurs semaines des animaux, évitant d’avoir des animaux âgés pour lesquels des pathologies liées à l’âge pourraient interférer avec nos résultats. Ces stades de développement permettent aussi d’avoir des animaux dans une gamme de poids adaptée aux tests réalisés ce qui limite le stress engendré par la contention.
REALISATION DE TESTS DE TOXICITE ANORMALE CHEZ LE RONGEUR
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Cochons d'Inde : 5000
16 250 souris et cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Ils reçoivent une injection unique d'un produit pharmaceutique, déjà commercialisé ou nouveau, par voie intraveineuse, intrapéritonéale, orale ou sous-cutanée, pour un test réglementaire dit de toxicité anormale. Le porteur affirme s'attendre à prouver l'"innocuité" du produit et écrit qu'aucune mortalité ni signe clinique n'est attendu, alors qu'il déclare 5 625 souris en gravité sévère. Sur le remplacement, il indique qu'il n'existe "pas d'équivalent in vitro" et que ce test devient obligatoire dès qu'il figure au dossier d'autorisation de mise sur le marché.
Objectifs
L’objectif de ce test est de détecter une éventuelle toxicité d’un produit pharmaceutique, après son administration aux animaux. Les produits administrés aux animaux sont des produits pharmaceutiques déjà sur le marché ou nouvellement produits. Nous recherchons par ce test une toxicité anormale, c’est-à-dire que nous nous attendons à prouver l’innocuité du produit. A noter que ce test est réalisé en respect des Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF).
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est de pouvoir mettre à disposition des médicaments à des patients. Le test de toxicité anormale sur rongeurs est décrit dans les Pharmacopées, et dans de nombreux dossiers d’AMM. Dans ce cadre, ce test est obligatoire réglementairement comme test libératoire de produits pharmaceutiques.
Procédures
Administration par injection intraveineuse, sur souris uniquement : volume maximum 0,5 ml / souris, Administration par injection intrapéritonéale : volume maximum 1 ml / souris et 5 ml / cobaye, Administration par voie orale : volume maximum 1 ml / souris et 25 ml / cobaye, Administration sous-cutanée pour les cobayes : volume maximal 10 ml. La durée d’injection est d’une dizaine de secondes à 5 minutes selon la voie. Des injections uniques sont prévues dans les deux procédures de ce projet.
Impact sur les animaux
Les tests sont réalisés sur des produits pharmaceutiques fabriqués selon les Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF). Ce test est à visée libératoire – c’est un test requis pour la mise à disposition de certains médicaments aux patients. La mortalité d’un animal ou l’apparition d’un signe clinique sur celui-ci n’est donc pas attendue sur ce type de test libératoire. Les principales nuisances pour l’animal sont : Douleur et stress liés à l’administration des produits pharmaceutiques (par injection IP, IV, SC ou gavage), Stress lié à la contention, Tous signes cliniques potentiels faisant suite à la toxicité anormale, L’euthanasie de l’animal utilisé en fin de protocole.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés par inhalation d’une concentration progressive de CO2 en fin de protocole ou en cas d'atteinte de points limites (sauf pour la procédure 1). La réutilisation des animaux pour un autre test de toxicité anormal n’est pas possible car cela pourrait interférer avec le résultat de ce second test.
Remplacement
Cet essai ne peut pas aujourd’hui être réalisé ex vivo pour plusieurs raisons : Il n’existe pas aujourd’hui d’équivalent in vitro au test de toxicité anormale. Il s’agit d’un test réglementaire, obligatoire à partir du moment où il est enregistré dans le dossier d’AMM du produit pharmaceutique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est le nombre minimal requis par les pharmacopées et les demandes réglementaires (e.g. dossiers d’Autorisation de Mise sur le Marché – AMM). Si l’intervalle de poids requis pour réaliser le test est faible, deux animaux supplémentaires peuvent être commandés. Ce cas peut se présenter par exemple en cas de retest selon la pharmacopée Russe ; il est demandé l’utilisation de 5 souris pesant entre 19 et 21 grammes le jour de l’injection. La marge de poids étant faible, 1 animal supplémentaire sera commandé.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupes sociaux pendant toute la durée du protocole Les souris disposent d’un enrichissement de type enviro-dri, spécialement conçue pour améliorer l'activité de construction de nids afin de pouvoir se cacher. Les cobayes disposent d’un enrichissement de type tunnel afin de pouvoir se distraire et se cacher. Avant les injections intra-veineuses les souris sont positionnées dans une enceinte chauffante à 38°C pendant 10 minutes pour faciliter l’injection intra-veineuse. Une observation quotidienne est réalisée : elle consiste à vérifier l’état clinique des animaux, leur alimentation et leur boisson. En cas de point limite observé, l’animal est euthanasié (sauf pour la procédure 1).
Choix des espèces
Espèces décrites dans les Pharmacopées pour le test de toxicité anormale. Les critères de sélection des animaux sont décrits par les Pharmacopées, ou les dossiers d’AMM : - Entre 17g et 30g au début du protocole pour les souris - Entre 200g et 400g au début du protocole pour les cobayes
Programme d’immunisation de poules pour la génération d’anticorps polyclonaux
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
150 poules vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections intramusculaires d'un antigène couplé à un adjuvant sur soixante-trois jours, puis sont tuées, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur indique que les injections avec adjuvant complet de Freund peuvent provoquer ulcérations, fièvre et baisse de mobilité, et présente le prélèvement des anticorps dans le jaune d'œuf comme un raffinement. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace et que l'immunité de l'animal vivant est "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.
Objectifs
Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tels que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherches publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de poule. La poule est une hôte d’intérêt, pour le développement d’anticorps dirigés contre des protéines hautement conservées chez les mammifères. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole durera 63 jours.
Bénéfices attendus
Les anticorps polyclonaux sont des auxiliaires et des réactifs employés dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie. Ils permettront notamment d’approfondir les connaissances nécessaires pour l’avancement de la recherche et le développement de test de diagnostic voir de nouvelles pistes d’applications thérapeutiques.
Procédures
5 injections en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (10 minutes)
Impact sur les animaux
Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les animaux sont surveillés après injection afin de vérifier qu’aucune douleur n’est apparue.
Devenir
Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J63.
Remplacement
La méthode usuelle pour produire des anticorps polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budgets et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.
Réduction
Le nombre d’animaux (2 poules par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique, a été adapté au plus juste par rapport au besoin pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole
Raffinement
Les animaux sont injectés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. La recherche sur la douleur aviaire est limitée, mais une grande partie des connaissances provient de la science du bien-être avec un intérêt pour les pratiques agricoles de routine. Dans ce cadre, une attention particulière sera portée à 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du plumage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). La récupération des anticorps à partir des œufs de poule constitue un raffinement, car les prélèvements sanguins ne sont pas nécessaires. Lors de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les poules disposeront d’un environnement enrichi (perchoir, miroir, bloc à picorer ou type coquilles d'huîtres...).
Choix des espèces
La poule est utile pour la production d’anticorps contre des protéines de mammifères, car elle est éloignée phylogénétiquement de la classe des Mammalia. L’utilisation de poules pondeuses est en totale conformité avec le principe des 3R et cette méthode est fortement recommandée depuis un certain temps par le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives. Il s'agit d'un raffinement du protocole de production d'anticorps, car ces derniers peuvent être extraits du jaune d’œuf sans avoir à prélever du sang sur l’animal. Un autre avantage est que les poules pondeuses sont capables de produire des anticorps en plus grande quantité, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir les anticorps. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les poules entreront en protocole dès l’âge de 5 mois. Auparavant elles auront subi une période de quarantaine de 14 jours, et si les animaux ne présentent aucun signe clinique, elles seront aptes à rentrer en protocole.
Défaut alvéolaire dans la mandibule de rat : un modèle de chirurgie maxillo-faciale pour l’étude de biomatériaux destinés à la régénération osseuse
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
108 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur mâchoire inférieure est opérée pour y créer un défaut osseux, puis la régénération est suivie au microscanner cinq fois sur deux mois avant la mise à mort pour analyses histologiques, afin de tester des biomatériaux de comblement destinés à la chirurgie dentaire. Le porteur indique que la chirurgie provoque une douleur et une difficulté à mastiquer les premiers jours, compensées par une nourriture ramollie et des analgésiques. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro n'évalue ces matériaux et que le test sur petit animal est un préalable obligé avant l'humain.
Objectifs
Les pertes de substances osseuses en chirurgie orale représentent un réel défi. Les moyens de reconstruction actuels font souvent appel à des greffes autologues qui sont disponibles en quantité limitée et peuvent être source de complications post-opératoires pour les patients. L’ingénierie tissulaire osseuse cherche à développer de nouveaux substituts osseux d'origine naturel pour pallier aux inconvénients de l'autogreffe. A titre d'exemple, dans le cadre de la pose d’un implant dentaire, il est souvent nécessaire de régénérer l’os manquant pour stabiliser l'implant. Cette régénérations peut employer différents dispositifs médicaux tels que : (i) des matériaux de comblement qui remplacent l'os ou favorisent la régénération osseuse et/ou (ii) des membranes qui jouent un rôle barrière pour prévenir l’infiltration cellulaire des tissus mous et préserver les cellules osseuses pour régénérer l’os.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait le développement de nouveaux dispositifs médicaux implantables (matériaux de comblement ou membranes pour la régénération osseuse guidée) dans le domaine de l'ingénierie tissulaire osseuse au vue d'être utilisé en clinique.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie au niveau de la mâchoire inférieure (création d'un défaut). Cette intervention dure environ 30 min par animal. Suite à l'opération, le suivi par micro scanner de la régénération osseuse pour chaque rat sera réalisé à des intervalles de temps espacés de 2 semaines. L'acquisition du microscanner dure environ 15 min. Il est envisagé de réaliser 5 fois cette acquisition sur chaque rat (suivi longitudinal sur 2 mois, avec une acquisition à: T0, 2, 4, 6 et 8 semaines).
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une intervention chirurgicale maxillo-faciale. Cette chirurgie engendra une douleur pour les animaux et une éventuelle difficulté lors de la mastication pour s'alimenter lors des premiers jours post-opératoires. Une surveillance sera établie afin de pallier à ces inconvénients (administration dans les premiers temps de nourriture ramollie pour faciliter la mastication). Les animaux seront aussi imagés à intervalle de temps régulier. L'évolution du défaut ossuex pourra ainsi être suivi et si des complications venaient à être observées, des mesures seront prises pour éviter toute souffrance.
Devenir
Suite à la chirurgie, les animaux seront suivis par microscanner sur 2 mois (examen d'imagerie non invasive). Après les temps pré-définis (2, 4 et 8 semaines après la chirurgie), les animaux seront euthanasiés par les expérimentateurs formés à ce geste, afin de pouvoir réaliser des analyses histologiques sur ces animaux et poursuivre les examens post-mortem permettant de valider le pouvoir ostéogénique et angiogénique du biomatériau étudié.
Remplacement
Les produits destinés à être implantés chez l'homme doivent nécessairement être testés chez l'animal avant les essais cliniques. Il n'existe pas de méthode basée sur une approche in vitro permettant d'évaluer ces matériaux. Les matériaux doivent au préalable être testés dans un modèle de petit animal (ici le rat). Si les résultats obtenus sont satisfaisants d'autres essais seront envisagés permettant de valider tous les aspects nécessaires à une future application chez l'Homme. Ces différentes phases ne peuvent être remplacées actuellement dans le processus de validation d'un nouveau dispositif médical.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux utilisé, un suivi longitudinal par analyse au micro scanner sera réalisé. L'intérêt est qu'il est ainsi possible d'obtenir des informations sur l'aspect cinétique du processus, sans avoir à sacrifier des animaux à différents temps. Il est ainsi possible de s'assurer que le processus se déroule correctement, et de décider de sacrifier les animaux en fonction de ces observations. Ce nombre a également été choisi pour s'affranchir des variabilités inter- et intra-individu concernant la régénération de l'os.
Raffinement
Pour réduire l’angoisse des animaux, une période d’adaptation d’une semaine sera respectée avant le début des expérimentations. Les animaux seront hébergés par groupe. Une cage après l’autre sera amenée à la salle de chirurgie, séparée de la zone d’hébergement pour éviter toute source de stress des animaux opérés et des animaux à opérer. Avant la chirurgie, les animaux recevront une dose d'analgésique pour prévenir toute douleur liée à l'opération. Ils seront ensuite anesthésiés lors de la chirurgie. Après la chirurgie, chaque rat se réveille dans une cage individuelle chauffée à l'aide d'un tapis chauffant afin d'éviter tout contact avec des congénères non anesthésiés. Les animaux seront surveillés par l'expérimentateur le temps de leur réveil. Après le réveil complet, le rat reviendra dans sa cage d’origine. De la nourriture préalablement humidifiée sera mise à sa disposition directement dans la cage afin de faciliter sa mastication après la chirurgie. Pour pallier à la douleur de l'intervention, un traitement quotidien pendant 3 jours sera administré à l'animal. Son bon rétablissement sera observé sur une période de 5 jours. Concernant les compétences des expérimentateurs, ceux-ci possèdent les qualifications nécessaires, la formation réglementaire et des formations continues (formation à l'expérimentation animale de niveau expérimentateur et/ou concepteur). La maîtrise de la contention et des différents types d'injections à appliquer sont également maîtrisés par les expérimentateurs. Le personnel de l'animalerie possède toutes les compètences pour s'assurer du bien être et du suivi des animaux au quotidien. Un raffinement est également mis en place lors de l'hébergement : les animaux sont avec leurs congénères, présence de litière en copeaux de peupliers et de jouets, ainsi que des bâtons à ronger sont mis régulièrement dans les cages.
Choix des espèces
Le rat est une espèce adaptée à la première étape de validation chez l'animal de matériaux destinés au traitement des pertes osseuses alvéolaires. De par sa taille, il permet de réaliser des lésions circulaires de diamètre suffisant dans l'os alvéolaire de la mandibule. L'utilisation du modèle Rat permet ainsi de valider la biocompatibilité, la stabilité dans le temps et l'efficacité thérapeutique du produit. En cas de résultats satisfaisant et supérieur à ce qui est obtenu avec les produits de référence actuellement sur le marché, le processus de validation pourra se poursuivre. Des rats Sprague Dawley adultes de 10 semaines, d'un poids d'environ 300-350 g seront utilisés. En effet les animaux utilisés doivent avoir achevé leur développement et leur croissance.
Evaluation de l’effet d’un nouveau traitement sur la douleur dans un modèle d’inflammation aigüe microcristalline.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
650 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une injection de cristaux d'urate dans une articulation déclenche une crise de goutte, puis leurs pattes subissent des stimulations mécaniques et thermiques répétées jusqu'à six fois par jour et des administrations de composés par de multiples voies, pour tester des candidats analgésiques. Le porteur indique que l'inflammation peut provoquer douleur, gonflement, ulcères et automutilation, et que ce modèle sévère laisse les animaux douloureux, ce qui exclut selon lui de les garder en vie. Sur le remplacement, il affirme que les méthodes in vitro n'étudient que la nociception et non la douleur avec sa composante émotionnelle, et conclut que l'animal vigile reste la "seule option" avant l'humain.
Objectifs
Ce projet répond à un besoin important de santé, celui du traitement des poussées aiguës d’arthrite goutteuse, qui occasionnent une souffrance importante, un handicap, et des séquelles à terme. Les dépôts de cristaux d’urate de sodium au sein des articulations sont fréquents et touchent plus de 17.5% des personnes âgées de plus de 75 ans. Ils peuvent être responsables d’inflammation articulaire aiguë récidivante Certains médicaments utilisés pour contrer cette pathologie induisent des effets secondaires parfois mortels, en particulier chez des patients avec insuffisance rénale. Les anti-inflammatoires non stéroïdiens ou les corticoïdes sont aussi capables de contrôler l’inflammation goutteuse. Enfin, de nombreux patients ne peuvent pas utiliser ces médicaments en raison des comorbidités. Ainsi, il existe un réel besoin de traitement local efficace, et rapidement actif sur la douleur, qui est intense au cours d’un accès goutteux. Les modèles expérimentaux d’arthrite sont utilisés depuis longtemps pour comprendre les mécanismes physiopathologiques de la maladie. Les études pré-cliniques sont menées principalement pour évaluer la capacité de nouveaux traitements à inhiber l’inflammation et la destruction des articulations, et non à inhiber la douleur. Celle-ci est très rarement étudiée dans les modèles animaux d’arthrite, or c’est d’un intérêt clinique majeur pour les patients. L’objectif de ce projet est d’évaluer de nouveaux candidats médicaments innovants dans un modèle d’arthrite induite par des cristaux d’urate.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif d'améliorer la prise en charge des patients par la mise au point de nouveaux traitements. Il répond à un besoin important de santé, celui du traitement des poussées aiguës d’arthrite goutteuse, qui occasionnent une souffrance importante, un handicap, et des séquelles à terme.
Procédures
Induction du modèle : injection intra-articulaire afin d’induire le modèle (quelques secondes à 2-3 minutes). Tests : stimulation mécanique ou thermique d’une durée inférieure à 1 min par stimulation. La stimulation est stoppée dès réaction de l’animal. Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limité de 6 points de mesure par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. Les animaux recevront des traitements de composés (voie intrapéritonéale, intra-articulaire, orale, sous-cutanée, intramusculaire, intranasale, intra-rectale, intra-colonique, intraveineuse, intrathécale, intra-articulaire). Ces actes durent quelques secondes. Ils pourront être réalisés une seule fois, ou plusieurs fois par jour espacé de 0min (simultanément) à plusieurs heures (2-4-6-8-12) ou même de plusieurs jours (une fois par semaine, un jour sur deux) Ceci est dépendant de la pharmacocinétique du composé testé. De plus, les animaux pourront subir des prélèvements de sang en répétés ou en prélèvement unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé testé. Les prélèvements de sang durent maximum 3 minutes et les animaux peuvent être sous anesthésie pendant 5minutes. Les prélèvements sont limités à un maximum par jour selon les recommandations en vigueur.
Impact sur les animaux
L’injection de cristaux d’urate est faite au niveau d’une articulation : Ceci peut entrainer une douleur articulaire ainsi que les symptômes d’une inflammation locale : rougeur, gonflement, chaleur. Quand l’inflammation est trop importante, les animaux peuvent se mutiler ou des zones ulcéreuses peuvent apparaître. - Nuisances liées aux tests : les animaux sont isolés en compartiments plexiglas, et leurs pattes arrière sont stimulées à plusieurs reprises. Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limité de 6 points de cinétique par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. - Nuisances liées à l’administration de composés clients. Les composés administrés peuvent induire des effets secondaires qui sont listés dans les points limites (sédatio, posture anormale..)
Devenir
Le modèle d’arthrite est un modèle sévère. Les animaux restent donc douloureux. Il n’est donc pas concevable de les replacer. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont mis à mort par le personnel habilité.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments analgésiques. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Une expérience préliminaire permettra de valider le modèle et de déterminer le nombre d’injections nécessaires afin de réduire le nombre de groupes et donc d’animaux dans l’expérience principale. Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit au minimum nécessaire pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les données bibliographiques disponibles. En fonction du design de chaque étude des analyses statistiques seront réalisées.
Raffinement
Les animaux ont accès dès leur arrivée dans l’animalerie à de l’enrichissement (briquettes en bois, tunnel en polycarbonate rouge transparent) et sont habitués à la salle d’expérimentation et aux tests (contention, enceinte…) afin de limiter leur stress. Lors des tests, des valeurs dites de cut-off sont fixées et correspondent à la stimulation maximale que peut subir l’animal. Ceci permet d’éviter les lésions dues au test ou les stimulus plus douloureux que nécessaire. Dans le cadre des tests thermiques, le choix des températures est fait afin de limiter la douleur et de mesurer une allodynie (stimulus non douloureux pouvant être ressentie comme douloureux par des animaux pathologiques). Une anesthésie est appliquée avant chaque acte le nécessitant/le permettant : prélèvements, traitements particuliers, … Une surveillance accrue des animaux est mise en place au vu de la thématique de la recherche. Des points limites sont clairement établis et des mesures sont mise en place suite à l’induction du modèle : aliments placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir, sous cutanée de NaCl ou de Glucose en cas de déshydratation. Un système de fiche de scoring est également mis en place afin de donner une vision objective des paramètres à suivre.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par d’autres espèces est critique et suivie avec attention au sein de l'entreprise. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP (International Association for the Study of Pain) est récente et les modèles in vitro d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionné pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés pour l’ensemble des procédures sont des animaux péri-adolescents à adolescents. (5-7semaines ; 190-240g le jour d’induction du modèle). Ce stade a été choisi car il est adapté au développement du modèle, il permet un suivi sur plusieurs semaines des animaux, évitant d’avoir des animaux âgés pour lesquels des pathologies liées à l’âge pourraient interférer avec nos résultats. Ce stade de développement permet aussi d’avoir des animaux dans une gamme de poids adaptée aux tests réalisés ce qui limite le stress engendré par la contention.
Evaluation de l’activité et d’absence de toxicité de produits synthétiques de transfert d’acides nucléiques chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Le but affiché est de commercialiser des agents qui font entrer de l'ADN ou de l'ARN dans les cellules, et les essais sur des souris doivent en vérifier l'activité et l'absence de toxicité. 1 260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit jusqu'à trois injections, sous la peau, dans la veine, le muscle, le péritoine ou par le nez selon le produit, puis une prise de sang sous anesthésie avant d'être tuée pour l'examen de ses organes, avec un risque de thrombose, de réactions inflammatoires et de troubles de la démarche. Le porteur affirme que l'administration par voie locale ou générale est "nécessaire pour permettre de valider l'activité et l'absence de toxicité des produits", et choisit la souris parce qu'elle permet "d'induire une réponse inflammatoire facilement identifiable".
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans le développement de solutions pour la production de thérapies biologiques, cellulaires et géniques. Le but est de commercialiser des agents pour libérer in vivo de l’ADN et de l’ARN. Dans le cadre des développements, de la production commerciale et des études de stabilité des produits précliniques et cliniques, des essais sur des modèles in vitro sont réalisés. Néanmoins, ces derniers ne reflètent pas le comportement des produits in vivo, notamment en termes d’activité et de toxicité. Pour cela, l’administration par voie locale ou systémique est nécessaire pour permettre de valider l’activité et l’absence de toxicité des produits. Ainsi, dans le cadre de ce projet, des vecteurs de transfection ou des acides nucléiques synthétiques seront testés chez la souris selon différents modes d’injection (sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intrapéritonéale ou intra-nasal) en fonction de leur composition. L’objectif sera de valider l’efficacité de transfection in vivo, l’absence de toxicité mais aussi d’évaluer l’élimination des produits testés.
Bénéfices attendus
Ces agents, une fois testés chez la souris, pourraient être transférables à des applications thérapeutiques en clinique humaine. Ce projet aura pour but de dégager des conditions optimales d’utilisation du système ayant une bonne distribution dans différents types cellulaires et sans impact toxique sur la souris.
Procédures
Les animaux recevront aux maximum 3 injections des composés de transfection (durée 2-3 minutes). On réalisera ensuite un prélèvement sanguin (durée 2-3 minutes) avant l'euthanasie en vue du prélèvement d'organes et des analyses post-mortem.
Impact sur les animaux
Les animaux recevront aux maximum 3 injections des composés de transfection et un prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie gazeuse (isoflurane 3%). Une potentielle toxicité suite aux injections pourra être observée dans ces études, avec notamment un risque de thrombose, de réactions pro-inflammatoires, ou encore du trouble du comportement en particulier de la démarche.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à l'issue des procédures expérimentales afin de collecter les organes pour des analyses histologiques.
Remplacement
Ce projet a pour objectif d'évaluer l'administration de produits de transfection délivrant ADN ou ARN. Les premières évaluations seront réalisées in vitro, dans des systèmes cellulaires. Les réactifs retenus seront ensuite évalués in vivo, en vue d'utilisation dans le domaine de la thérapie génique et cellulaire, de l'immunothérapie et de la vaccination.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été déterminé suite à des projets précédents. Nous avons effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que l’effectif de 6 animaux pour chaque condition utilisée dans l'étude constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction de nombre d'animaux. Le test statistique utilisé sera un test paramétrique (comparaison des animaux traités avec des animaux contrôles).
Raffinement
Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique. Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation et les sites d'injection. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires.
Choix des espèces
Le systèmes évalués dans ce projet sont essentiellement utilisés dans les phases de recherche, qui sont majoritairement effectuées chez la souris. Par ailleurs, l’utilisation de modèles animaux standardisés comme la souris permet d’induire une réponse inflammatoire facilement identifiable. Nous utiliserons des animaux âgés de 6 semaines, âge qui permet d'identifier une activité maximale des produits lipidiques, autrement dit des réactifs de transfection.
Evaluation des effets secondaires de composés pharmacologiques de différentes classes à l’aide d’un service de screening basé sur une batterie de tests chez le rat.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
1 840 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 640 d'entre eux et modéré pour 1 200, 800 étant tués pour prélèvement de tissus et 1 040 pouvant être récupérés. Ils reçoivent des candidats médicaments par de multiples voies puis subissent une batterie de tests, dont le Rotarod pour la coordination, un prélèvement d'estomac pour évaluer les ulcères et un test au charbon avec prélèvement d'intestin pour la motilité digestive. Le porteur présente l'ensemble comme une "offre de services" commerciale destinée à profiler les effets secondaires des molécules de ses clients. Il affirme que l'étude de la douleur chez l'animal vigile reste la "seule option" avant le passage chez l'homme.
Objectifs
La dimension sensori-discriminative de douleur a été largement étudiée sur une variété importante de modèles animaux et quasiment la totalité des antalgiques disponibles actuellement sur le marché ont été testés dans des modèles précliniques classiques chez le rongeur. Cependant, l’utilisation de ces antalgiques est souvent associée à de nombreux effets secondaires. Il est donc nécessaire d’évaluer ces effets secondaires indésirables sur l’organisme. De plus, une utilisation abusive des opiacés s’est développée ces dernières années mettant à jour une crise appelée « crise des opioïdes ». D’autres classes de molécules comme les anti-inflammatoires non stéroïdiens présentent également des effets secondaires notamment, la formation d’ulcère qui est le principal effet indésirable. De plus, les Gabapentinoides (Gabapentine, prégabaline) qui sont indiqués dans le traitement des crises partielles d’épilepsie et dans les douleurs neuropathiques, provoquent généralement une forte sédation, une somnolence et ont donc un impact sur la démarche et la coordination motrice. Un autre effet secondaire pouvant apparaitre après une prise d’un composé est la catalepsie. Celle-ci se caractérise par est un état comportemental de rigidité musculaire associé aux médicaments antipsychotiques et à plusieurs autres classes de médicaments. L’objectif de ce projet est de pouvoir caractériser les effets secondaires d’un candidat médicament. Cet outil permettra l’évaluation des effets secondaires cités :la formation d’ulcère, la sédation, la catalepsie, la locomotion, la constipation.
Bénéfices attendus
Cet outil d’évaluation sera proposé à l’offre de services de l’entreprise qui pourra ainsi offrir à ses clients la possibilité d’établir des profils de nouveaux candidats médicament en discriminant les effets secondaires potentiels. Ainsi, les molécules testées pourront être orientées vers un profil antlagique d'une certaine classe pharmacologique.
Procédures
Les animaux peuvent recevoir un traitement par voie orale (p.o), intrapéritonéale (i.p), sous cutané (s.c) intraveineuse (i.v), sous-cutané plantaire (s.c.pl), Intramusculaire (i.m), intrathécale (i.t), Intranasal (i.n). Des traitements en co-adminsitration peuvent également se réaliser. Ces injections durent entre 30 secondes et 1minute. Dans le cadre de certaines études, des prélèvements de sang peuvent être réalisés sous anesthésie (IC, jugulaire, retro-orbital). Ces prélèvements sont rapides et durent quelques minutes. Il peut également y avoir des prélèvements répétés. Le test du Rotarod a pour objectif l'évaluation de la coordination motrice lors d'un test de vitesse de rotation constante. Ce test dure 3minutes, les animaux réalisent 3 passages sur la roue et cela est répété 2 fois. Le test pour évaluer l'apparition d'ulcères consiste à admnistrer un composé qui dure environ 1 minute puis à prélever l'estomac. Le prélèvement dure environ 5minutes. Le test pour évaluer les effets indésirables d'un composé sur la motilité gastro-intestinale consiste à administrer un composé (durée : 1minute) puis une solution de charbon (durée 2minutes) et enfin de prélever l'intestin grêle. Le prélèvement dure environ 2 minutes. Pour ces deux tests décrits (ulcer et test au charbon),une mise à jeun est nécessaire la veille des tests et dure maximum 24h. Enfin le test de l'irwin couplé aux tests de l'openfield et de la catalepsie permettent d'évaluer d'une part les effets d'une nouvelle substance sur le système nerveux et les fonctions physiologiques de l'animal, et d'autre part d'évaluer la rigidité musculaire et la locomotion de l'animal. Pour ces 3 tests, les animaux recoivent une adminsitration d'un composé d'une durée d'environ 1 minute et l'enchainement des 3 tests dure environ 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus dépendent des procédures, mais pour l'ensemble des animaux, les nuisances pourront être liées à l'administration unique ou répétée de composés (risque d'irritation des zones d'injection, lésion superficielle, nuisance légère). Une injection de produit dure environ 1minute. Lles animaux peuvent également subir des prélèvements de sang en répétés ou unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé (nuisance modérée); selon la voie de prélèvement le temps est peut être estimé de 30secondes à quelques minutes. Dans le cadre de certaines études, des prélèvements de sang unique (intracardiaque,) ou en répété peuvent être réalisés sous anesthésie (jugulaire, retro-orbital, veine caudale, nuisance modérée). Pour certains tests, les animaux sont mis à jeun (nuisance modérée). Pour un test, les animaux peuvent chuter du dispositif d'une hauteur de 30cm (nuisance légère).
Devenir
Pour certains tests, les animaux sont soumis à des prélèvements de tissus, ils sont donc mis à mort. De plus, pour tous les tests décrits, les administrations de candidat médicaments peuvent aussi créer des interactions ou des modifications biologiques difficiles à évaluer dans le cadre de ce travail. Il n’est donc pas cohérent de réutiliser ces animaux pour d’autres modèles. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont mis à mort par le personnel habilité de la société. Pour d'autres procédures, les animaux pourront être récupérés sous réserve d'absence d'effets secondaires.
Remplacement
L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par IASP, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle » . L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=5 en se basant sur les tests de puissance réalisés lors du développement du modèle et confirmé lors des études subséquentes réalisées. Cet effectif par groupe a été confirmé lors des stades initiaux de développement du modèle par la réalisation d’un calcul de puissance via BiostaTGV. De plus, cet outil vise à fournir une évaluation rapide des composés testés dans des conditions très calibrées, il est donc réalisé sans les groupes contrôles usuels (groupe recevant le véhicule des composés, groupe recevant une molécule de référence), ce qui permet une réduction du nombre d’animaux et une démarche 3R.
Raffinement
Un soin particulier est apporté à la réduction de la souffrance et du stress des animaux au strict nécessaire et à l’amélioration de leur bien-être (enrichissement et paramètres environnementaux contrôlés tout au long de l’étude, habituation une semaine à la salle de stabulation, habituation des animaux aux dispositifs des tests). Les tests possèdent des valeurs de Cut off afin de limiter le temps d’exposition d’un animal à un stimulus douloureux. De l’enrichissement est présent dans les cages afin de limiter le stress et d’améliorer la qualité de vie des animaux (Tunnel en plastique et briquettes en bois à ronger). L’anesthésie générale est utilisée pour la réalisation de prélèvements par exemple. Des points limites, pour chaque protocole d’étude sont définis et résumé en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints. Au vu du domaine d’expertise du laboratoire (spécialisation dans l’étude de la douleur), les expérimentateurs sont strictement formés au respect de l’animal et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. La maitrise des gestes techniques est contrôlée régulièrement.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein du laboratoire. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP est récente et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionné pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés sont âgés d’environ 5 semaines pour toutes les procédures. Ces âges et gamme de poids correspondent à ceux d’animaux jeunes adultes couramment utilisés dans les différents modèles de douleur sur lesquels les procédures ont été validées dans l’entreprise. De plus, des rats plus âgés pourraient présenter des pathologies supplémentaires et interférer avec le screening de molécules.
Etude des effets anti-hyperalgésiques d’un ou plusieurs composés dans un modèle d’arthrite induit avec de la carragénine chez le rat.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
690 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur provoque une inflammation articulaire par injection de carragénine, censée reproduire une crise de goutte, puis applique des stimulations douloureuses thermiques et mécaniques répétées sur les pattes arrière, jusqu'à six mesures par jour. Il indique que l'inflammation peut conduire les rats à se mutiler et à développer des lésions ulcéreuses, et prévoit de les tuer parce qu'ils restent douloureux. Ce modèle sert à tester des candidats-médicaments analgésiques, et le porteur affirme que seul l'animal vigile permet d'étudier la douleur, et non la seule nociception mesurable in vitro.
Objectifs
La douleur altère gravement la qualité de vie des patients atteints de la maladie de la goutte. La douleur inflammatoire peut être due à une action directe des cytokines inflammatoires sur les neurones nociceptifs, abaissant leur seuil d'excitabilité et provoquant ainsi une hyperalgésie. Le but de ce projet est d’offrir la possibilité de tester des candidats-médicaments dans un modèle de douleur inflammatoire et pour différent type de douleur (mécanique, thermique). Cela est couramment décrit dans la littérature. La carragénine (CAR) est actuellement utilisée comme déclencheur d'une inflammation aiguë dans différents tissus. L'arthrite induite par la carragénine chez les rongeurs a été largement utilisée comme modèle d'arthrite aiguë. La physiopathologie de l'arthrite induite par la CAR implique des cytokines inflammatoires. Elle imite la crise de goutte telle qu'elle peut se produire chez l'homme. Elle a été largement étudiée pour tester des composés anti-goutteux et des molécules anti-inflammatoires en tant que modèle animal. En revanche, de nombreux patients ne peuvent pas utiliser de médicaments anti-inflammatoires en raison de leurs comorbidités. Il existe donc un réel besoin de traitement local efficace et rapidement actif de l'inflammation et de la douleur qui sont intenses lors d'une crise de goutte.
Bénéfices attendus
Les molécules de référence dans le traitement de la douleur sont soit peu efficaces, soit avec de nombreux effets secondaires (Opiacés : Impact sur le transit, tolérance/ Antiinflammatoires : ulcères …). Le but de ce projet est de tester de nouveaux candidats médicaments dans un modèle de douleur reconnu. Ils seront comparés aux molécules de références testées en cliniques. A long terme, l’objectif est de pouvoir développer de nouvelles stratégiques thérapeutiques pour lutter contre les pathologies arthritiques.
Procédures
Les animaux peuvent développer des paralysies ou s’automutiler. Les animaux reçoivent des injections par voie intra-articulaire (site d’injection à surveiller). Ils peuvent également présenter une perte de poids, une perte de tonus, un stress. De plus selon les tests, les animaux sont soumis à la contention, isolés dans des compartiments (durée de 3minutes à maximum 2h30 selon le test) et une stimulation douloureuse thermique ou mécanique des pattes arrière est réalisée (durée de 1minute à 1.5 minutes selon le test). Les tests peuvent être réalisés sur plusieurs jours et peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans limite de 6 points de mesures. Les animaux pourront également subir des nuisances liées à l’administrations de composés (durée de quelques secondes à 3 minutes maximum). Ils pourront être réalisés une seule fois ou plusieurs fois par jour. Les administrations répétées peuvent causer des lésions superficielles. Les composés administrés peuvent induire des effets secondaires listés dans les points limites. Enfin, les animaux peuvent subir des prélèvements de sang en répétés ou unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé. Les prélèvements durent maximum 3 minutes et les animaux peuvent être sous anesthésie pendant 5 minutes.
Impact sur les animaux
L’injection de l’agent inflammatoire (carragénine) est faite au niveau d’une articulation : Ceci peut entrainer une douleur articulaire ainsi que les symptômes d’une inflammation locale : rougeur, gonflement, chaleur. Quand l’inflammation est trop importante, les animaux peuvent se mutiler ou créer des zones ulcéreuses. - Nuisances liées aux tests, les animaux sont isolés en compartiments plexiglas, et leurs pattes arrière sont stimulées à plusieurs reprises. Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limité de 6 points de cinétique par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. - Nuisances liées à l’administration de composés clients. Les composés administrés peuvent induire des effets secondaires qui sont listés dans les points limites. De plus, les animaux pourront subir des prélèvements de sang en répétés ou en prélèvement unique afin de suivre la pharmacocinétique.
Devenir
Le modèle d’arthrite est un modèle sévère et stable. Les animaux restent donc douloureux. De plus, le réactif injecté est un agent inflammatoire. Il n’est donc pas concevable de les replacer. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont mis à mort par le personnel habilité.
Remplacement
L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par IASP (International Association for the Study of Pain), la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit au minimum nécessaire pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les données bibliographiques disponibles et sur des approches statistiques.
Raffinement
Les animaux ont de l’enrichissement (briquettes en bois, tunnel en polycarbonate rouge transparent) et sont habitués à la salle d’expérimentation et aux tests (contention, enceinte…) afin de limiter leur stress. Lors des tests, des valeurs dites de cut-off sont fixées et correspondent à la stimulation maximale que peut subir l’animal. Ceci permet d’éviter les lésions dues au test ou les stimulus plus douloureux que nécessaire. Dans le cadre d’immersion de la patte ou de mVF, le choix des températures ou de la gamme de filaments est fait afin de limiter la douleur et de mesurer une allodynie (stimulus non douloureux pouvant être ressentie comme douloureux par des animaux pathologiques). Des points limites strictes sont mis en place en association avec une grille de scoring afin de limiter la douleur des animaux. Une anesthésie est appliquée avant chaque acte le nécessitant/le permettant : chirurgie, prélèvements, traitements particuliers, … Une surveillance accrue des animaux est mise en place au vu de la thématique de la recherche. Des points limites sont clairement établis et des mesures sont mise en place suite aux inductions des modèles : soins post opératoires, aliments placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir, sous cutanée de NaCl ou de Glucose en cas de déshydratation.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs est critique et suivie avec attention au laboratoire. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP (International Association for the Study of Pain) est récenteet les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. LE rat a été sélectionnée pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente (suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. es animaux utilisés pour l’ensemble des procédures sont des animaux juvénils/ pré-adolescents. (5-7semaines ; 190-240g le jour d’induction du modèle) Ce stade a été choisi car il est adapté au développement des modèles, il permet un suivi sur plusieurs semaines des animaux, évitant d’avoir des animaux âgés pour lesquels des pathologies liées à l’âge pourraient interférer avec nos résultats. Ce stade de développement permet aussi d’avoir des animaux dans une gamme de poids adaptée aux tests réalisés ce qui limite le stress engendré par la contention.
Diagnostic rapide d’intoxication et évaluation de molécules thérapeutiques dirigées contre des toxines végétales
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
8 480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 1 420 d'entre elles et sévère pour 7 060. Le porteur les intoxique avec deux toxines végétales qu'il décrit comme "faciles à produire" puis teste des molécules thérapeutiques et des tests de diagnostic, avec des injections et jusqu'à quinze prélèvements sanguins. Il indique que l'intoxication provoque perte de poids, mobilité réduite et difficultés respiratoires et peut entraîner la mort des animaux. Il inscrit le projet dans un objectif de biodéfense, visant à "doter l'Europe" de tests rapides, et affirme le modèle murin "nécessaire", les effets sur un "organisme entier" n'étant selon lui pas prévisibles in vitro.
Objectifs
Certaines toxines de plantes présentent une toxicité telle qu’il est nécessaire de développer des tests de diagnostic et des solutions thérapeutiques performantes pour contrer une intoxication accidentelle ou volontaire. A ce jour, aucune molécule thérapeutique ni traitement n’est commercialisé pour deux de ces toxines, faciles à produire. Des molécules (chimiques ou biologiques) ont cependant été développées et ne sont que partiellement caractérisées. Afin de déterminer spécifiquement leur efficacité, il est nécessaire de les évaluer dans un même modèle animal. Le modèle d’intoxication chez la souris nous permet de faire une première évaluation de l’efficacité des différentes molécules. Le projet présente deux objectifs majeurs : 1) Evaluer différentes molécules thérapeutiques contre deux toxines de plante. Ces molécules seront administrées seules ou combinées afin de déterminer la meilleure stratégie thérapeutique. 2) Améliorer les méthodes de diagnostic clinique d’une intoxication à ces toxines dans des fluides et/ou tissus biologiques (par exemple sang). Un test de diagnostic d’une intoxication à une des toxines est en cours de commercialisation. Il s’agit de préparer la prochaine génération, plus sensible et permettant une détection encore plus précoce. Il n’existe pas à l’heure actuelle de test de diagnostic pour la deuxième toxine d’étude. L’objectif est de doter l’Europe de tests de diagnostic rapides et performants afin de détecter ces toxines le plus rapidement possible pour la prise en charge des patients et administrer les contremesures médicales nécessaires.
Bénéfices attendus
A terme, l’objectif est d’améliorer la prise en charge des personnes intoxiquées en évaluant l’efficacité de différentes molécules thérapeutiques en fonction des différentes voies d’administration. La fenêtre de temps pour administrer les traitements et leur efficacité restent restreintes pour le moment. L’objectif est donc de disposer de molécules au meilleur de l’état de l’art pour élargir cette fenêtre de temps, en particulier après l’intoxication. Il est également nécessaire de disposer de tests de diagnostics rapides et performants (sensibles et spécifiques) dans différentes matrices biologiques pour mettre en évidence une action malveillante de dispersion de toxines et une contamination humaine éventuelle, afin de mettre en place une thérapie adaptée le plus rapidement possible.
Procédures
Toutes les manipulations pouvant entrainer des nuisances (prélèvements de sang, injections) seront réalisées sur des souris anesthésiées. Le prélèvement se fait en 30 à 60 secondes. Majoritairement, il y a 3 prélèvements et ils pourront aller jusqu’à 15 prélèvements selon les procédures.. Le volume prélevé sera adapté en conséquence, excepté pour les prélèvements terminaux effectués en fin de protocole, qui seront donc plus importants, mais toujours réalisés sur animaux anesthésiés. Dans le cas des injections, nous en avons 1 pour l’administration des toxines et 1 pour l’injection des anticorps, qui se font toutes les deux sur animal anesthésié en 30 à 60 secondes. Pour les protocoles courts (21 jours au maximum), ces gestes ne sont réalisés qu’une seule fois. Nous avons également, et ce pour un seul projet, des injections par voie sous cutanée 2 fois par jours dans les 10 jours de l’expérience. Pour les protocoles longs, les animaux étant réexposés, ils subissent une deuxième fois l’administration de la toxine en intra-nasale.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables dans ce modèle d’intoxication sont la perte de poids, la mobilité réduite, des difficultés respiratoires ainsi que des douleurs lors des injections et/ou prélèvements et du stress lors des pesées. A l’extrême, cela peut entrainer la mort des animaux.
Devenir
Dans l’ensemble des procédures, les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole, le but étant de prélever le sang pour effectuer des mesures plasmatiques des antigène et/ou des anticorps ainsi que différents tissus pour nous permettre de procéder à des analyses d’histopathologie au niveau des poumons, mais également caractériser l’inflammation suite à l’intoxication.
Remplacement
Des tests préliminaires in vitro sont mis en place dans le laboratoire (avec différentes lignées cellulaires : lymphocytes T humains, cellules épithéliales de reins de singe, cellules pulmonaires humaines) afin de déterminer et de sélectionner les molécules ou les combinaisons de molécules qui semblent être les plus efficaces avant de réaliser les tests in vivo. Ces tests cellulaires permettent de réaliser un grand nombre de combinaisons, et ainsi d’éviter une utilisation massive d’animaux. Cependant, nous savons d’ores et déjà que même si ces modèles sont pertinents pour une présélection/pré-évaluation, il existe encore des disparités entre les résultats obtenus in vitro et ceux obtenus in vivo (nous avons ainsi pu observer qu’un anticorps apportant une très bonne neutralisation à l’échelle d’une lignée cellulaire dans le modèle in vitro avait une efficacité très modérée in vivo. Ainsi, les mécanismes d’action des anticorps peuvent être multiples et un effet à l’échelle cellulaire ne reflète pas toujours un effet sur un organisme entier. Il est donc nécessaire de passer par des modèles d’études plus complexes, prenant en compte la distribution de la toxine comme celle de la molécule thérapeutique, la réponse inflammatoire et immunitaire, comme c’est le cas avec des modèles murins. A ce jour, aucun modèle in vitro ou in silico n’est capable de prédire à 100% la capacité protectrice des molécules thérapeutiques. Un modèle animal est donc nécessaire. Pour les tests de diagnostic, des échantillons prélevés sur des souris naïves, c’est-à-dire n’ayant reçues aucun traitement, mais auquel de la toxine aura été ajouté ont déjà été utilisés pour les mises au point des protocoles avant de faire les essais sur des échantillons d’animaux intoxiqués. Cela permet d’optimiser les échantillons utilisés et de réduire la quantité d’animaux en expérimentation.
Réduction
Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés pour ce projet, nous avons décidé de réduire le nombre de molécules qui seront testées. Pour cela, les essais in vitro réalisés sur différents modèles cellulaires nous ont permis de sélectionner les molécules montrant le meilleur potentiel thérapeutique. De plus, nous avons décidé de limiter les voies d’injection de ces molécules pour réduire le nombre d’animaux nécessaires. Aux regards de tests statistiques, le nombre d’animaux par lot a été déterminé pour nous permettre d’avoir suffisamment de données pour évaluer la sensibilité du test diagnostic ainsi que la performance des molécules thérapeutiques. Certains animaux seront prélevés deux fois (intervalle de 15 jours) afin de réduire le nombre de groupe nécessaire pour les cinétiques plus longues. Par ailleurs, pour les projets où différents temps d’administration sont envisagés, un seul sera testé pour commencer : seulement si celui-ci fonctionne, les autres pourront être testés.
Raffinement
Les animaux seront en cage collective afin de favoriser les relations sociales. Une maison en carton ainsi qu’une feuille de cellulose seront également ajoutées et changée chaque jour pour maximiser le bien-être des animaux et leur permettre de faire leur nid. Les animaux seront également observés une fois par jour durant toute la durée des essais, lorsque leur état de santé est bon puis une surveillance matin et soir sera mise en place en cas de dégradation de l’état de santé d’un ou de plusieurs animaux. L’ensemble des procédures sera réalisé par du personnel qualifié. Avec le vétérinaire de l’installation, nous avons déterminé des points limites à ne pas dépasser pour ces essais (notamment les signes cliniques suivis quotidiennement ou biquotidiennement afin d’assurer au mieux le bien-être des animaux, et d’éviter une souffrance trop importante. Lors des essais avec les toxines de l’aliment hydraté sera ajouté dans les cages pour éviter la déshydratation et la dénutrition à hauteur des animaux pour permettre même aux animaux les plus faibles d’accéder à l’aliment. L’ensemble des procédures sera également réalisé sur animaux anesthésiés.
Choix des espèces
De nombreuses études dans la littérature sur ce sujet ont déjà utilisé le modèle murin, assez sensible aux intoxications avec des toxines végétales. Leur système immunitaire très caractérisé et assez proche de celui de l’être humain ainsi que la facilité d’élevage et manipulation font des souris un modèle approprié pour faire ces essais. Les expériences seront réalisées sur souris à l’âge adulte, pourvues d’un système immunitaire mature.
Suivi de l’efficacité d’une molécule en suspension sur les souris modèle de progéria G609G
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Injectées dans le péritoine deux fois par semaine pendant dix semaines au plus, et anesthésiées pour un prélèvement de sang dans le cœur, 108 souris d'une lignée reproduisant la progéria vont toutes être tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chez les souris homozygotes de cette lignée, le porteur décrit un poids qui dépasse rarement 17 g chez les mâles et 15 g chez les femelles, des anomalies du squelette et de la peau, des troubles cardiaques et une survie moyenne de 117 jours. Elles reçoivent une molécule dérivée d'une première qui, testée chez la souris, "ne remplit pas tous les critères thérapeutiques", avec une inflammation légère des yeux possible après plus de huit semaines de traitement. Le porteur affirme que la souris est le "seul mammifère modèle de la maladie" utilisable pour des essais précliniques, puis ajoute aussitôt : "Il existe aussi un modèle de porc".
Objectifs
Ce projet a pour objectif de tester l’efficacité in vivo d’un traitement sur un modèle murin de la Progéria (Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome, HGPS). Cette maladie génétique extrêmement rare se déclare dès l’enfance et conduit à l’apparition d’un vieillissement prématuré et à une mortalité précoce, vers l’âge de 13,5 ans, des suites d’infarctus du myocarde ou d’accidents vasculaires. Il existe donc un fort besoin médical pour ces patients. Cette pathologie est due à l’accumulation d’une protéine toxique dans le noyau des cellules de patients, appelée la progérine. La quantité de progérine présente chez les patients est directement corrélée avec la sévérité de la maladie. La réduction de la quantité de cette protéine toxique est donc une cible potentielle pour changer le cours de cette pathologie dévastatrice. Récemment une molécule avec un bon index thérapeutique sur un modèle d’étude in vitro a été sélectionnée pour poursuivre le développement. Cette molécule a été testée ensuite chez la souris. Le traitement hebdomadaire avec cette molécule a montré des signes d’efficacité mais ne remplit pas tous les critères thérapeutiques. Ainsi, dans ce nouveau projet nous testerons une nouvelle molécule dérivée de l’ancienne molécule. Le but sera ici d’évaluer : la diminution de la progérine en évaluant l’efficacité de cette nouvelle molécule, ainsi que sa pharmacocinétique, sa toxicité in-vivo et l’effet thérapeutique à long terme.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet nous permettra : - de démontrer que la nouvelle approche thérapeutique envisagée est efficace sur les symptômes de la pathologie humaine ; - d’établir une relation pharmacocinétique/pharmacodynamique de la molécule testée. Un des effets attendus de cette utilisation est une meilleure tolérance et efficacité. A plus long terme, ce projet se poursuivra par un développement thérapeutique de cette molécule visant à obtenir une preuve clinique de son efficacité chez l’homme, avec pour objectif final de proposer un traitement efficace pour les patients atteints de Progéria.
Procédures
Injections intrapéritonéales (2X/semaine, sur une durée maximale de 10 semaines). Les animaux seront injectés avec des anesthésiques (durée de l’injection moins d’une minute) avant que le sang soit prélevé par voie intracardiaque (durée 5 minutes).
Impact sur les animaux
Le modèle animal utilisé présente de nombreux signes cliniques retrouvés dans la pathologie humaine. Les souris homozygotes présentent des poids ne dépassant que très rarement 17g pour les mâles et 15g pour les femelles. La lignée est également caractérisée par une mortalité prématurée. En effet, la moyenne de survie basée sur l’ensemble des 7 publications utilisant ce modèle et présentant ce type d’étude est de 117 jours, soit 16,5 semaines environ. Des anomalies squelettiques sont également à noter ou des anomalies cutanées avec un pelage pouvant devenir épars. Enfin, des problèmes cardiaques importants sont souvent responsables de la mort prématurée de ces souris. Par ailleurs, nous nous attendons possiblement à la présence d’une inflammation légère au niveau des yeux sur les animaux traités avec la molécule pendant plus de 8 semaines.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus pour des analyses protéiques.
Remplacement
Notre projet s’inscrit dans la continuité d’une étude in vitro menée sur des cellules de patients. Cependant, ce modèle cellulaire ne permet pas d’explorer l’intégralité des mécanismes qui peuvent avoir lieu dans un organisme. Le passage au modèle in vivo est donc une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’Homme. Il nous est nécessaire de disposer d'un organisme entier pour pouvoir mieux comprendre la pathologie de la progéria. Le seul mammifère modèle de la maladie qui nous permet de réaliser des essais pré-cliniques en vue d’une mise en œuvre d’essais thérapeutiques chez l’Homme est la souris. Il existe aussi un modèle de porc, cependant, le phénotype de ce second modèle est moins documenté dans la littérature et la mise en place d’une telle étude serait plus complexe. Le choix de l’espèce est donc le plus approprié à l’objectif de l’étude proposée.
Réduction
Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats interprétables. Dans ce sens la cohorte destinée à l’analyse de l’efficacité précoce comporte 6 animaux par groupe. L’estimation du nombre d’animaux par groupe nécessaire a été réalisée sur le critère principal suivant : comparaison du niveau moyen de progérine entre chaque groupe de traitement (comparaison de moyennes). La deuxième cohorte destinée à l’évaluation d’un possible espacement du traitement comporte 7 animaux par groupes et par temps d’analyse. Enfin la dernière cohorte destinée à l’observation plus tardive d’un phénotype clinique mesurable comporte 10 animaux par groupe. Pour l’ensemble des cohortes, le nombre d’animaux utilisés a ainsi été optimisé pour permettre d’observer un effet du traitement.
Raffinement
Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation, l’apparence physique. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas d’inflammation des yeux, les animaux seront traités avec une crème ophtalmique 1 à 2 fois par jour pendant minimum 5 jours. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal blessé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés 2x/semaine et observés quotidiennement. Afin de maintenir un état nutritionnel correct, nous utiliserons, si nécessaire, une alimentation sous forme de gel, facile à ingérer par les souris afin d’éviter toute malnutrition.
Choix des espèces
Le modèle murin est le seul modèle envisageable pour tester des approches thérapeutiques dans le cadre de cette pathologie, puisqu’il s’agit d’une maladie génétique qui a été modélisée sur la souris. Le modèle que nous utilisons récapitule à la fois la mutation génétique de la maladie, ainsi que la majorité des caractéristiques cliniques et de l’évolution de la pathologie observée chez l’Homme. Une seule autre espèce génétiquement modifiée existe, il s’agit d’un modèle de porc. Cependant, le phénotype de ce second modèle est moins documenté dans la littérature et la mise en place d’une telle étude serait plus complexe. Le choix de l’espèce est donc le plus approprié à l’objectif de l’étude proposée. Les animaux seront traités à partir de l’âge de 5 semaines, avant que la pathologie ne se développe et jusqu'à maximum 15 semaines pour étudier l'efficacité tardive.