Autres troubles humains

Un substitut osseux en poudre, développé pour être réhydraté par le chirurgien avec le liquide de son choix, va être testé sur 133 rats dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat subit une chirurgie du crâne d'au plus vingt minutes, pendant laquelle un ou deux trous sont percés dans les os pariétaux puis comblés avec le matériau. Les animaux sont gardés trois, sept ou huit semaines, avec un risque de douleurs postopératoires et de gêne au site d'implantation, avant d'être tués pour récupérer les échantillons. Présentée comme une démonstration d'efficacité, l'étude vise à moyen terme, selon le porteur, "la mise sur le marché d'un produit innovant".

Objectifs

Le traitement de la fragilisation osseuse liée au vieillissement, ainsi que des maladies et des traumatismes touchant le tissu osseux, est un enjeu sociétal majeur et nécessite dans la plupart des cas une intervention chirurgicale pour régénérer le tissu osseux lésé. Plusieurs procédés permettent de restituer l’intégrité osseuse mais l’utilisation d’os venant du patient lui-même reste le traitement de référence dans la majorité des cas (autogreffe). Les substituts osseux synthétiques sont développés et utilisés en clinique depuis plusieurs décennies. Leurs propriétés sont améliorées, tant au niveau de la facilité d’utilisation que de l’efficacité en terme de régénération osseuse. A l’heure actuelle, les solutions synthétiques proposées se limitent à des formes solides (granules ou blocs) ou à des « pâtes » prêtes à l’usage ou à hydrater à des ratios stricts. Nous avons récemment développé une formulation sous forme de poudre sèche composée de granules de calcium, constituants de l’os, et d’un polymère formant un gel une fois hydraté. Cette formulation permet au clinicien de réhydrater cette dernière par le liquide de son choix (sérum physiologique, sang, moelle osseuse mais également antibiotiques ou autres molécules). Ces réhydratations/mélanges sont possibles dans des quantités modulables afin d’obtenir une pâte dont les propriétés de manipulation sont supérieures à celles des produits présents sur le marché. Ces mélanges apportent des cellules du patient dans le matériau, visant ainsi à améliorer les propriétés de notre produit . L’objectif de ce travail est donc de démontrer l’efficacité de ce produit sous forme de poudre à réhydrater avec des ratios/solution de réhydratation sélectionnés suite à des essais préalables. Nous nous questionnerons aussi sur l’impact de l’espacement des granules dans la préparation ainsi que des propriétés de surfaces des biomatériaux sur la régénération osseuse.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de déterminer l’efficacité des granules contenus dans notre produit dans le cadre de la régénération osseuse. Nous étudierons leur répartition dans le défaut grâce à la présence d’un gel pour les maintenir à distance . Elle nous permettra aussi d’évaluer l’efficacité des différents produits présents sur le site opératoire en combinaison avec notre produit. Cette étude pourra nous apporter de nouvelles connaissances sur les phénomènes impliqués dans la régénération osseuse chez l’Homme lors de l’utilisation de cellules du patient combinées à un substitut. A moyen terme, la mise sur le marché d’un produit innovant est envisagée.

Procédures

Les rats seront chacun soumis à une unique procédure chirurgicale consistant à la réalisation et d’un ou deux défauts osseux (en calvaria). Ces défauts seront comblés avec nos substituts osseux afin d’observer les propriétés de régénération osseuse. Cette chirurgie n’excédera pas 20 minutes, durant lesquelles les animaux seront endormis. Suite à celle-ci les animaux seront surveillés et leur bien-être sera assuré jusqu’à leur euthanasie après 3, 7 ou 8 semaines.

Impact sur les animaux

Au vu des précédentes études menées au laboratoire avec les composants de notre matériau, peu de souffrances sont attendues lors des manipulations prévues grâce aux anti-douleurs injectés aux animaux. Il est possible que des douleurs post-opératoires adviennent, comme des difficultés de récupération suite à l’anesthésie, une gêne fonctionnelle ou des douleurs au site d’implantation. Pour éviter cela, les animaux seront médicamentés les jours suivants l’opération

Devenir

La mise à mort des animaux est nécessaire afin de récupérer et analyser les échantillons.

Remplacement

A l’heure actuelle, l’utilisation de rongeurs reste nécessaire afin de valider les propriétés des biomatériaux en terme de capacité à promouvoir la formation d’os. De plus, afin de développer des techniques et protocoles chirurgicaux chez le gros animal avant d’aller en clinique chez l’homme, la démonstration d’une preuve de concept sur le petit animal est nécessaire pour sélectionner la ou les meilleures formulations

Réduction

Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les composants présents dans le biomatériau utilisé ont été sélectionnés en amont et déjà testé s pour leur biocompatibilité et bioactivité in vitro. De même les mélanges sélectionnés pour cette étude ont été étudiés et choisi s préalablement pour leurs propriétés texturales. Pour la première procédure les défauts osseux seront réalisés sur chaque os pariétal qui compose la calvaria de rat, soit 2 défauts par animaux, réduisant de fait le nombre d’animaux tout en préservant la puissance statistique. Par ailleurs une approche statistique nous a aidé à calculer le nombre d’implants nécessaires à l’obtention de résultats significatifs afin de constituer des groupes avec un nombre d’animaux nécessaires et suffisants à l’obtention de résultats significatifs et à la valorisation des résultats de cette étude.

Raffinement

Afin de raffiner la méthodologie, les procédures de manipulation et de surveillance régulière sont élaborées avec l’objectif d’éliminer toute forme de souffrance animale. Les animaux seront anesthésiés et recevront une analgésie adaptée en prémédication et jusqu’à 48 heures après la chirurgie. La surveillance régulière des animaux permettra d’évaluer des points limites selon une grille d’évaluation détaillée . Selon les points limites identifiés, les animaux pourront recevoir une analgésie adaptée ou seront retirés de l’étude. Chaque étape de l’étude tiendra compte du bien-être de l’animal, de son arrivée dans l’animalerie spécialisée à son sacrifice en fin d’étude. Les animaux seront hébergés en groupe sociaux de 3 individus par cage avec enrichissement sous forme de frisottis et recevront une nourriture standard et de l’eau à volonté. Nous raffinerons les conditions d'hébergement des animaux par un enrichissement des milieux dans chaque cage. Les animaux seront observés de manière quotidienne par les animaliers de l’unité expérimentale pour s’assurer du bien-être des animaux.

Choix des espèces

Un des modèles les plus pertinents utilisés pour étudier la régénération osseuse est le défaut critique de calvaria chez le rongeur. Le modèle de régénération osseuse chez le rongeur est bien décrit dans la littérature. Le choix du rat permet de travailler sur des proportions convenables d’os à régénérer et les outils d’analyses chez animaux sont très développés : scanner du petit animal, outils de chirurgie adaptés. Les animaux inclus dans cette étude seront des rats d’environ 8 semaines au début de la procédure. Ceci permet d’avoir des animaux matures sans maladies associées au vieillissement tout en limitant les biais liés à la croissance de l’animal.

Jusqu'à sept prélèvements sanguins en vingt-quatre heures et sept anesthésies par animal : 50 600 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent les composés par gavage, injection intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée, intraveineuse caudale ou dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, et peuvent être hébergées en cage métabolique. Le porteur annonce qu'aucune dégradation de leur état de santé n'est attendue, tout en listant les effets non prédictibles possibles, perte de poids, hypothermie ou hyperthermie, comportement anormal, vocalisations. L'objet réel est de mesurer où va une molécule dans le corps avant une première administration humaine, à raison de 580 études par an, un rythme que le RNT chiffre sans le justifier.

Objectifs

L’objectif du projet est de déterminer les paramètres pharmacocinétiques et/ou les concentrations tissulaires d’entités thérapeutiques chimiques ou biologiques après administration chez la souris. Dans la recherche préclinique et la recherche de candidats, ces paramètres sont essentiels pour la sélection et l’évaluation des candidats médicaments. Les entités testées sont préalablement analysées lors de tests in-vitro. Une première sélection est ainsi réalisée pour n’administrer aux animaux que des entités avec des caractéristiques favorables en terme pharmacocinétique. Ces études préliminaires permettent d’objectiver les processus d’absorption, de dégradation, de distribution et d’élimination de chaque entité afin de prédire le comportement de ces entités chez l’homme. Ce projet s’inscrit dans une stratégie globale de caractérisation de nouveaux composés en vue de la première administration chez l’homme, c’est donc une étape clé dans le cycle de vie de tout médicament en développement. Nous estimons réaliser 580 études par an répartie sur les trois procédures décrites dans le projet, soit 50600 animaux sur cinq ans.

Bénéfices attendus

A court terme, les expérimentations de ce projet permettront de déterminer les paramètres essentiels pour l’avancée du développement préclinique pour les entités testées. Ces résultats permettront de sélectionner les candidats potentiels ainsi que les doses et les voies d’administration les plus adaptées. A long terme, les entités sélectionnées constitueront la base pour un traitement applicable à l'Homme.

Procédures

Les gestes techniques concernent tous les animaux : • Pesées : Durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Administrations des composés à potentiel thérapeutiques o par voir orale (gavage à l'aide d'une sonde gastrique), intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée: Durée 30 secondes sur animaux vigiles. Unique ou répétée max 2 ou 3 fois par jour selon la voie o par voie intraveineuse à la veine caudale sur animal vigile: Durée 30 secondes. Unique ou répétée max 2 fois par jour o par voie intraveineuse au sinus rétro orbitale : Durée 30 secondes sous anesthésie générale gazeuse ou chimique. Maximum deux administrations par sinus. Cette technique ne sera utilisée que très occasionnellement et seulement sur justification scientifique. Prélèvements de sang o via la veine caudale en microsampling: Durée 30 secondes sur animal vigile. Maximum 7 fois sur 24h. o via ponction cardiaque en phase terminale : Durée 1 minute sous anesthésie générale gazeuse ou chimique. Les volumes et la fréquence des prélèvements seront selon les critères de la consigne en vigueur. Les volumes seront généralement de 20 à 50 µL. Le volume total prélevé n'excédera pas 7.5% du volume estimé de sang total de l'animal sur une période de 24 heures. Des périodes de récupération seront mises en place entre les prélèvements. • Anesthésie pour imagerie : anesthésie gazeuse de 30 minutes maximum ; 7 anesthésies maximum par animal sur la durée de l'étude.

Impact sur les animaux

Aucune dégradation de l'état de santé de l'animal n’est attendue par l’application des procédures de ce projet. Toutefois dans ces phases précoces de développement, des effets secondaires non prédictibles peuvent survenir : perte de poids, hypo- ou hyperthermie, comportement anormal (animaux hypo ou hyperactifs), vocalisations. Tout effet observé sera noté selon une grille spécifique et donnera lieu à une action adaptée à la gravité des signes ; les points-limite anticipés permettent de limiter la nuisance à un niveau de gravité modéré au maximum. Au cours des études, les animaux peuvent être soumis à une ou plusieurs anesthésie(s), des administrations et des prélèvements sanguins, ou un hébergement en cage à métabolisme, qui peuvent induire un certain stress (manipulation de l'animal, administration orale, cage métabolique) ou une douleur passagère lié au geste lui-même (injection de l'administration ou réalisation du prélèvement); ces nuisances sont de niveau léger, à modéré par leur cumul.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures. D’une part, les études nécessitant des prélèvements d’organes ne permettent pas une réutilisation D’autre part, le but de ces études étant de générer les premières données PK sur les composés étudiés, il n’est pas possible d’anticiper une période de wash-out permettant une réutilisation. De plus, l’homogénéité d’âge des animaux utilisés en étude est nécessaire pour limiter la variabilité et ainsi augmenter la fiabilité des résultats et la comparaison entre études appartenant à un même projet scientifique.

Remplacement

De nombreux tests in vitro existent et permettent de sélectionner les entités d'intérêt uniquement sur la base de leurs caractéristiques pharmacocinétiques, notamment l'absorption et le métabolisme. Il n'existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de déterminer l'ensemble des propriétés pharmacocinétiques d'un composé d'intérêt. Seul un modèle animal peut permettre de caractériser ces entités et discriminer celles qui pourront être envisagées pour un traitement chez l’homme.

Réduction

Les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d'interaction du composé avec la cible d'intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme). Cette approche préalable permet de réduire fortement le nombre d’entités à tester. La forte sensibilité des méthodes analytiques permet la mise en œuvre de techniques de prélèvements sanguins de volumes réduits autorisant la réalisation de prélèvements répétés sur un même animal. Il est ainsi possible d’obtenir une cinétique complète à partir d’un seul animal. Cela augmente aussi la robustesse des données obtenues pouvant mettre en évidence une éventuelle variabilité inter-individuelle. Le nombre d’animaux s’appuie sur des recommandations internationales dans le domaine de la pharmacocinétique et des publications scientifiques (European Medicines Agency). Autant que possible, il est réduit au minimum scientifique de 3 animaux par groupe pour les études de pharmacocinétique et 5 animaux par groupe pour les études de biodistribution par imagerie.

Raffinement

Les animaux seront hébergés conformément aux standards réglementaires de la directive n°2010/63/UE. Ils seront groupés dans des cages contenant de l'enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Les locaux d'hébergement font l'objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux, des systèmes d'hébergement et d'animaux sentinelles. Des soins adaptés seront donnés aux animaux affectés, par ou sous l'autorité du vétérinaire désigné ou mis à mort selon les recommandations définies dans la consigne en vigueur. Un plan d'action sera établi et mis en place lors d'apparition d'évènements inattendus. Des critères d'arrêt anticipé seront mis en place pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile. Les procédures potentiellement douloureuses ou source d'inconfort ou de stress se feront sous anesthésie gazeuse. Le nombre de manipulations sur l'animal sera réduit au strict nécessaire. Le projet sera mis en œuvre par du personnel qualifié et habilité conformément à la réglementation en vigueur. De plus, les procédures sont fortement améliorées grâce à l’organisation de formations complémentaires pour le personnel en relation directe avec les animaux sur les techniques d’administrations et de prélèvements de liquides biologiques.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus communément utilisées lors d’essais de pharmacocinétique préclinique. De nombreuses publications le démontrent comme suit: • Surgical and pharmacological animal models used in drug metabolism and pharmacokinetics, K.A. Landskroner, P. Hess, and A. Treiber, Xenobiotica, 2011; 41(8): 687–700. • Experimental models for predicting drug absorption and metabolism - Saeed Alqahtani, Loqman A Mohamed & Amal Kaddoumi, Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. (2013) 9(10):1241-1254. Le choix de l’espèce est dicté par différents impératifs : - techniques : quantités de composé disponibles - scientifiques : comparaison de résultats pharmacodynamiques et pharmacocinétiques chez la même espèce animale, homologie de récepteur de l’espèce choisie avec le récepteur humain. Le stade adulte sera utilisé par défaut (à partir de 7 semaines) car c’est celui qui permet de déterminer les paramètres pharmacocinétiques de l’espèce pour une entité donnée. Toutefois, il sera possible d’utiliser des animaux à un stade plus précoce (âgés de 15 jours) pour établir des données d’exposition spécifique à un modèle ou une cible thérapeutique.

150 lapins vont recevoir dans le derme, vigiles ou anesthésiés, des produits de comblement destinés au marché de la chirurgie esthétique et reconstructrice, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils passent ensuite des scanners sous anesthésie générale, jusqu'à trois le premier jour, un par jour les quinze jours suivants, un par semaine pendant deux mois, puis un par mois jusqu'à la fin de l'étude. Le porteur situe ce travail sur un marché "en constante évolution" et parle d'un "enjeu de santé publique", en citant la restauration du visage après un accident et la perte de graisse faciale liée au VIH. 140 lapins sont tués pour l'analyse histologique du site d'injection, les 10 autres pouvant être adoptés ou replacés si aucun prélèvement n'est requis.

Objectifs

Le marché mondial de la chirurgie reconstructrice est en constante évolution avec des demandes pour des procédures de moins en moins invasives. Les dermal fillers (remplisseurs cutanés) sont généralement utilisés pour des traitements peu invasifs, tels que la restauration du volume du visage dans des cas de dégradations physiques sévères (lésions postaccidentelles, restauration et correction des signes de perte de graisse faciale (lipoatrophie) chez les personnes atteintes du VIH, ... ). Certains produits de comblement se résorbent naturellement avec le temps nécessitant pour les patients de répéter les injections, il est donc nécessaire d'améliorer la persistance de ces produits. La recherche de nouveaux produits, performants et sains pour le patient, est donc un enjeux de santé publique. Ce projet a pour objectif de tester et d’évaluer des dispositifs médicaux injectables de comblement sur le modèle lapin. Il comporte plusieurs protocoles visant à évaluer leur comportement (persistance et potentielles réactions locales de type inflammatoire) après injections dans le derme. Lors de ce projet, l'imagerie médicale sera utilisée afin de suivre l'évolution (volume, hauteur, étalement, densité et forme) des produits injectés au cours du temps. Un effet inflammatoire des produits pourra également être mis en évidence par analyse histologique.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera aux développements de nouveaux produits dermatologiques de comblements et éventuellement à leur mise sur le marché dans le but de proposer des produits plus performants et persistants.

Procédures

Les animaux pourront être vigiles ou anesthésiés lors de l’injection des produits expérimentaux intradermique en respectant les volumes d’injections recommandés. Ces injections seront réalisées en maximum 10 minutes (anesthésie comprise) Des examens scanners seront réalisées sous anesthésie générale. Un examen scanner dure jusqu’à 20 minutes (anesthésie comprise). La fréquence des examens scanners sera de maximum 3 acquisitions par jour le premier jour, puis maximum 1 acquisition par jour pendant les 15 jours suivants, puis maximum 1 acquisition par semaine pendant les 2 premiers mois puis maximum 1 acquisition par mois jusqu’à la fin de l’étude.

Impact sur les animaux

Les manipulations bien que réalisées avec le plus grand soin par du personnel formé seront susceptibles d’induire un stress chez le lapin. De plus, l’injection de produits par voie intradermique peut induire une douleur potentielle causée par une potentielle inflammation (rongeur et/ou gonflement) au site d’injection.

Devenir

Si des prélèvements du site d’injection ou d’organe doivent être réalisés afin de réaliser des analyses histologiques, les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole. Si aucun prélèvement n’est nécessaire à la fin de l’étude , dans la mesure du possible, un replacement ou une adoption des animaux sera envisagé.

Remplacement

Afin de répondre aux objectifs de ce projet ainsi qu’à des exigences réglementaires, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser le comportement de produits injectés dans un organisme entier vivant de manière fiable. Ce comportement dépend de très nombreux facteurs tels que la zone d’injection, les tissus environnant et l’activité de l’animal, etc.

Réduction

Le suivi du comportement des produits injectés réalisé par imagerie médicale permet de suivre les mêmes animaux au cours du temps et donc de diminuer le nombre d’animaux par projet. Afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables et pouvoir utiliser des tests statistiques permettant d’étudier la performance du produit au cours du temps, des groupes de minimum 6 sites d’injection par éléments d’essai seront constitués (plusieurs sites d’injection pourront être réalisés sur un même animal réduisant le nombre d’animaux à utiliser).

Raffinement

Une période d’acclimatation de 7 jours minimum sera respectée pour les lapins. Les lapins seront hébergés en parc de manière collective durant toute la durée de l’étude (sauf exception en cas de bagarre ou blessure où ils seront hébergés en individuel, en parc ou cage) avec des enrichissements appropriés. Pour que l’hébergement collectif des mâles soit une réussite, une demande auprès du fournisseur pourra être faite pour que les animaux de l’étude soient hébergés de manière collective jusqu’à réception dans nos locaux. Au cours de l’étude, les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tout signe clinique anormal et ainsi prendre le plus rapidement possible les mesures nécessaires : mesure de soutien ou la mise à mort des animaux ayant un état clinique jugé moribond. Le poids des animaux sera contrôlé régulièrement tout au long de l’étude. Une pesée ainsi qu’un suivi clinique approfondi sera réalisé dans les 24h à 72h après l’injection des produits afin de détecter les signes suivants : Signes cliniques généraux : comportement général de l’animal pour déceler une éventuelle baisse d’activité, une prostration une apathie, une non réponse à la stimulation ou des oreilles basses avec un rythme respiratoire accéléré voire la présence d’écoulement nasaux et/ou oculaires. Signe cliniques en lien avec l’administration du produit : inflammation, lésion ou nécrose du site d’injection. Toute anomalie clinique sera rapportée au vétérinaire responsable du suivi et des examens cliniques approfondis pourront être réalisés. Les signes cliniques observés seront pris en charge si les actions n’interfèrent pas avec les produits administrés et l’objectif de l’étude. S’il n’est pas possible de le soigner sans interférer avec les objectifs de l’étude alors il sera euthanasié. Des fluides pourront être injecté. Du gel oculaire sera également appliqué à chaque examen d’imagerie pour éviter le dessèchement cornéen pendant les anesthésies.Des analgésiques pourront être administrés par voie sous-cutanée pour diminuer toute douleur éventuelle ; la fréquence sera décidée par un vétérinaire. Des antibiotiques pourront également être administrés sur avis du vétérinaire (la voie et la posologie seront précisées par le vétérinaire). La fréquence des administrations sera adaptée en fonction des besoins et des conseils apportés par le vétérinaire.

Choix des espèces

Le lapin permet de tester des volumes importants et ainsi mimer les volumes d’injections les plus importants réalisés chez l’humain. Les lapins pourront être utilisés à partir de 10 semaines. Le stade de développement jeune adulte est celui habituellement utilisé (pas de contrainte spécifique lié à l’âge pour cette procédure).

Une anesthésie tous les deux jours pendant deux semaines, chacune précédée d'une injection intrapéritonéale: 936 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse des organes. Elles reçoivent des cellules tumorales par voie intraveineuse ou intrapéritonéale, développent des tumeurs pulmonaires ou péritonéales, et certaines déclarent une réaction du greffon contre l'hôte avec perte de poids et perte de poils. L'objet est de tester deux modifications génétiques de cellules immunitaires humaines, censées mieux attaquer les tumeurs solides. Le porteur décrit les cocultures en deux et trois dimensions déjà menées au laboratoire, puis conclut que le modèle animal reste "indispensable" avant toute application clinique.

Objectifs

Le développement des récepteurs antigéniques chimériques (CAR) a révolutionné l'immunothérapie du cancer pour certains types de cancer. Ce nouveau type de traitement par immunothérapie consiste à prélever les cellules immunitaires du patient, de les modifier génétiquement en laboratoire pour qu’elles expriment le CAR, puis elles sont réinjectées au patient afin qu’elles reconnaissent et combattent les cellules cancéreuses. Cependant, des améliorations des thérapies CAR restent nécessaires afin de cibler d'autres types de tumeurs et d'assurer une fonction antitumorale durable des cellules modifiées. Nous proposons ici deux nouvelles stratégies de modification génique ciblant chacune des cellules immunitaires différentes, les lymphocytes T et les macrophages, dans le but d'amplifier leurs fonctions antitumorales. Ces cellules sont des leucocytes (globules blancs) qui ont pour but de détruire d’autres cellules : les lymphocytes T détruisent les cellules reconnues comme étrangères (immunité cellulaire) ; et les macrophages phagocytes « mangent » les cellules étrangères ou leurs débris et participent à la présentation des antigènes et à la libération de cytokines. Dans la première stratégie, nous augmenterons la fonction antitumorale des cellules CAR issues de lymphocytes T, augmentant leur production d'interféron (cytokine/protéine produite par les cellules immunitaires afin d’activer la réponse immunitaire chez d’autres cellules impliquées dans la réponse inflammatoire) grâce à de nouveaux mécanismes que nous avons récemment découverts. Dans la deuxième stratégie, nous améliorerons la survie des CAR issus de macrophages, en les dotant d'une protection anti-apoptotique (=mécanisme de mort cellulaire). Nos résultats in vitro dans des modèles de tumeurs en 3D sont très encourageants, il nous faut les confirmer in vivo au sein d’un organisme entier permettant les interactions avec tous les types cellulaires. Nous utiliserons des approches expérimentales similaires dans les deux stratégies, pour établir la preuve de concept d'une activité antitumorale accrue in vivo. De plus, ce projet ayant une visée clinique, il est essentiel d’évaluer certains critères tels que les toxicités, le dosage et l’efficacité grâce à un modèle in vivo. Nous voulons également comprendre davantage les mécanismes liés au contrôle tumoral et les interactions entre les différentes populations immunitaires permettant d’éliminer les cellules tumorales.

Bénéfices attendus

L’immunothérapie cellulaire par récepteurs antigéniques chimériques (CAR) permet de cibler et de tuer les cellules tumorales. Néanmoins, elle représente deux limites i) elle n’a pas permis de cibler les tumeurs solides, ii) elle rencontre des rechutes et des résistances chez près de 50% des patients répondeurs à deux ans. Nous proposons donc deux stratégies pour contrer ces limites et améliorer les capacités à cibler les cellules tumorales, le tout en s'accompagnant de moins d'effets secondaires. La première stratégie permet l’amélioration de la fonction antitumorale des CAR-T (lymphocytes T modifier génétiquement). Cela est assuré par le contrôle de la production d’interféron par les cellules T. La forte production d’interféron induite par ces manipulations a permis l’augmentation de la capacité de destruction des cellules tumorales. La deuxième stratégie tend à améliorer la persistance et la survie des CAR-MAC (macrophages modifier génétiquement). Ces cellules sont prometteuses pour la thérapie cellulaire contre les tumeurs solides par leur capacité à se diriger vers la tumeur et leur capacité de phagocytose des cellules tumorales. La solution apportée pour améliorer leur survie a permis d’obtenir des effets thérapeutiques plus importants. De plus, elle a l’avantage de reposer sur une ingénierie génétique stable. Les monocytes ont non seulement la capacité de tuer directement les cellules tumorales via la phagocytose, mais aussi de sécréter des facteurs solubles qui peuvent à leur tour attirer d'autres cellules immunitaires. Celles-ci peuvent à leur tour rendre l'environnement de la tumeur plus accessible aux cellules « Natural Killer » du système immunitaire (sous-catégorie de lymphocytes, proches des lymphocytes T, qui ont un rôle cytotoxique). Une meilleure compréhension du mécanisme peut également contribuer à l'avenir au développement de méthodes thérapeutiques encore plus efficaces.

Procédures

Dans les trois procédures, nous visons à évaluer l’effet d’un traitement cellulaire sur la progression tumorale, par différentes étapes : A. Plusieurs lots (un par lignée tumorale) d’animaux vigiles recevront une injection de cellules tumorales par voie intraveineuse ou par voie intra-péritonéale (durée du geste inférieure à 30 sec, 1 fois au cours de l’expérience), puis 4 jours après cette injection, les animaux seront anesthésiés pour être imagés. Ces imageries seront renouvelées tous les 2 jours pendant 2 semaines (durée de l’anesthésie : 15 min). 15 minutes avant chaque session d’imagerie, les animaux recevront une injection intrapéritonéale (durée du geste inférieure à 10 sec). Cela afin de comparer la cinétique de progression des différentes lignées tumorales. B. D’autres lots d’animaux vigiles recevront les cellules thérapeutiques par voie intraveineuse (durée du geste inférieure à 30 sec). 3 heures après cette injection, les animaux seront anesthésiés pour être imagés. Ces imageries seront renouvelées tous les 2 jours pendant 2 semaines (durée de l’anesthésie : 15 min). 15 minutes avant chaque session d’imagerie, les animaux recevront une injection intrapéritonéale (durée du geste inférieure à 10 sec). Cela afin de déterminer la localisation et la persistance des cellules. C. D’autres lots d’animaux vigiles recevront une injection de cellules tumorales par voie intraveineuse ou par voie intra-péritonéale (durée du geste inférieure à 30 sec, 1 fois au cours de l’expérience), puis 4 jours après les animaux vigiles recevront un traitement par voie intraveineuse (durée du geste inférieure à 30 sec). 3 heures après cette injection, les animaux seront anesthésiés pour être imagés. Ces imageries seront renouvelées tous les 2 jours pendant 2 semaines (durée de l’anesthésie : 15min). 15 minutes avant chaque session d’imagerie, les animaux recevront une injection intrapéritonéale (durée du geste inférieure à 10 sec). Cela afin de déterminer l’efficacité de notre traitement sur la croissance tumorale.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons à un stress et à une douleur minimale au moment des injections, mais nous nous efforçons de les maintenir à un niveau aussi bas que possible grâce à une manipulation professionnelle. L'un des effets attendus de ces essais est l'apparition de GvHD au cours de certains protocoles. La "Graft versus Host Disease" est une maladie dans laquelle les cellules immunitaires humaines transplantées attaquent le corps de l'hôte, ce qui entraîne des symptômes tels que la perte de poids et la perte de poils. Dans le cas des greffes de tumeurs, les animaux développeront des tumeurs pulmonaires ou dans le péritoine, en fonction de la voie d’injection. Ces effets se manifesteront de façon croissante au cours de l’expérience. Les nuisances attendues lors de l’administration de cellules tumorales par voie intraveineuse ou intrapéritonéale seront celles liées à l’injection elle-même (gêne de courte durée).

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour des analyses post mortem sur des organes ex vivo.

Remplacement

Les approches thérapeutiques décrites dans ce projet, avec des lymphocytes T et monocytes modifiés, ont déjà été évaluées in vitro à l’aide de méthodes alternatives telles que la coculture en 2D et la coculture 3D formant des sphéroïdes qui nous ont permis de sélectionner les meilleurs candidats prometteurs pour une efficacité contre les cellules tumorales. De plus, ces techniques in vitro nous ont également permis de mieux comprendre certains mécanismes d’action des monocytes modifiés. Néanmoins, malgré le développement de méthodes alternatives in vitro auxquelles le laboratoire a eu recours (coculture en 2D, coculture en 3D) l’utilisation du modèle animal reste indispensable pour la suite du projet avant d'envisager une application clinique chez l'homme en thérapie cellulaire. Une étape passant par un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré est nécessaire. Cette étape est indispensable pour tester les mécanismes de régulation et d’action, ainsi que la toxicité éventuelle de cette thérapie cellulaire.

Réduction

En nous basant sur notre expérience dans le domaine de l'immunothérapie, nous pouvons déjà nous appuyer sur quelques résultats. Les expériences de croissance des lignées de cellules tumorales in vivo, en particulier, ont été récemment établies dans notre institut et nous utilisons ces connaissances pour planifier nos expériences. Nous savons également que nous pouvons nous attendre à une croissance homogène des lignées de cellules tumorales in vivo, ce qui nous permet de limiter à 6 ou 8 le nombre de souris par groupe d'expériences selon l’objectif des expériences. Nous observons la croissance des tumeurs dans l'abdomen à l'aide d'un système d'imagerie in vivo, ce qui nous permet de garder les animaux sous surveillance pendant toute la durée de l'expérience. Néanmoins, nous allons travailler avec des cellules sanguines humaines primaires, ce qui entraîne souvent une grande variabilité. C'est pourquoi il est indispensable de répéter les expériences au moins trois fois avec des donneurs différents afin de pouvoir prouver les résultats de manière statistique. Le nombre de souris par groupe est ajusté au minimum selon que ce sont des expériences de mise au point ou des expériences de test d'efficacité de traitements afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Afin d’assurer le bien-être des animaux, ils auront une période d’acclimatation d’une semaine afin de s’habituer à leur nouvel environnement. Nous surveillerons régulièrement leur état général. Les lignées cellulaires tumorales qu’on utilisera expriment la luciférase, ce qui permet de suivre la croissance tumorale par bioluminescence qui sera faite deux fois par semaine. Une corrélation entre le niveau de bioluminescence pour chaque lignée cellulaire utilisée et l’état général des souris (évalués à l’aide de la grille de score jointe) sera faite, afin de s’assurer que les tumeurs ne dépassent pas un niveau maximal de bioluminescence et éviter le mal-être des animaux. Nous pèserons également les souris pour s’assurer qu’il n’y ait pas de perte de poids ou prise de poids anormale traduisant un mal-être. Nous travaillons avec des personnes ayant une grande expérience avec les souris et reconnaissant rapidement les comportements et signes de douleur et d’inconfort. Nous agirons en fonction de la grille de score jointe au document. Des soins complémentaires seront apportés si nécessaire tels que des compléments alimentaires.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les expériences menées en recherche de thérapeutique du cancer et elle a depuis longtemps servi à l'étude de thérapies antitumorales, notamment parce que la physiologie de la souris est proche de celle de l'Homme. La souris est aussi le modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins, et de la disponibilité de souches murines parfaitement définies. La connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques permettant d'identifier des cibles précises pour la thérapie. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (entre 6 et 10 semaines) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux. De plus, cet âge est adapté pour générer des modèles de tumeurs par la greffe de lignées de cellules tumorales. Pour chaque protocole expérimental on utilisera des groupes d’animaux d’âge identique.

Blessés volontairement par brûlure, découpe d'un morceau de peau ou délabrement cutané, 100 cochons et 50 moutons seront tous tués pour autopsie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une ou deux chirurgies pouvant durer plusieurs heures, des prélèvements sanguins jusqu'à une fois par semaine et un jeûne de douze à vingt-quatre heures avant chaque anesthésie, avec une douleur post-opératoire que le porteur annonce sur plusieurs jours. Le nombre d'animaux a été fixé sans calcul de puissance, le porteur écrivant qu'"aucune approche statistique n'a été réalisée". Il justifie le choix de ces espèces par une anatomie de taille comparable à celle de l'humain et qualifie l'expérimentation sur l'"organisme entier" d'"incontournable" et d'obligation réglementaire.

Objectifs

La cicatrisation cutanée est un phénomène complexe au cours duquel des évènements dermiques et épidermiques sont étroitement impliqués. Cette capacité de réparation tissulaire peut être compromise en condition pathologiques (plaies du diabétique, escarres, accident radiques, maladies génétiques, etc…). De nombreuses stratégies ont besoin d’être améliorées et de nouvelles approches sont proposées pour stimuler la cicatrisation, diminuer les complications et la douleur. Le projet de recherche a pour objectif de valider de nouvelles approches innovantes, l’apprentissage des personnels de santé, et le développement de nouvelles stratégies pouvant réduire le traumatisme tissulaire, améliorer le diagnostic et pallier une dysfonction de la réparation du tissu cutané. L’évaluation et le développement des nouveaux dispositifs, molécules et techniques pour la réparation des tissus cutanés, nécessite une phase de recherche et développement. Les différentes itérations de prototypes doivent être confrontées à la modélisation animale dans un contexte qui reproduit fidèlement le contexte clinique, fonctionnel et anatomique / tissulaire qui sera celui visé par les applications chez les patients. Ainsi la phase initiale du projet s’appliquera à raffiner les prototypes afin de pouvoir en geler les versions jugées efficaces et sécuritaires. Ces versions ultimes entreront ensuite dans la phase règlementaire du projet en vigueur.

Bénéfices attendus

L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patients, une amélioration de la durabilité et de l’efficacité des implants pour éviter leur rejet, et ainsi les ré opérations parfois multiples des patients, pour réduire les temps de cicatrisation qui handicapent les patients, et réduire le traumatisme tissulaire, corollaire de ces interventions, ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections grâce au recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes : - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. - Des procédures chirurgicales d'évaluation de dispositif en réparation cutanée avec ou sans procédure chirurgicale de création de modèle lésionnel préalable. Chaque animal du projet ne subira qu'une seule chirurgie d'évaluation de dispositif en réparation cutanée associée ou non à une chirurgie de création de modèle antérieur soit une seule et parfois deux interventions chirurgicales par animal. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - La faim, lors de la mise à jeun (12 heures pour les porcs, 12 à 24 heures pour les ovins/caprins) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - En fonction des besoins et préalablement à la procédure d'évaluation du dispositif ou de la méthode de réparation cutanée, l'induction d'une lésion à la faveur d'une intervention chirurgicale mini-invasive de type anastomose, création d'un defect tissulaire, brûlure, délabrement cutané, ligature ou occlusion de vaisseaux par exemple - La douleur en phase postopératoire : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique, pour ces derniers points, des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple le recours systématique à l'anesthésie générale, l'usage systématique de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur opiacés, la protection des plaies, la mise en place d'un suivi clinique quotidien des animaux).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs et techniques testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables et des méthodes techniques innovantes dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. Le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes afin de reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients est indispensable. En effet leur utilisation in fine chez les patients représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Le nombre d'études intéressant ce projet a été estimé jusqu'à une dizaine impliquant chacune une douzaine d'animaux. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en œuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, des protocoles de prises en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (Anti-Inflammatoires Non Stéroïdiens et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques sont appliqués tout au long du projet. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.

Choix des espèces

Les dispositifs doivent être testés sur une anatomie semblable à celle de l’Homme (de l’enfant à l’adulte de grande taille), cela impose l’expérimentation sur des gros animaux. Les différences interspécifiques tissulaires, anatomiques et fonctionnelles nécessitent différentes espèces pour optimiser l’expérimentation. L’évaluation des différents dispositifs du projet se fera uniquement sur le modèle animal préalablement identifié comme le plus pertinent : Les ovins pour la durabilité des stratégies opératoires des dispositifs testés. Ses intérêts principaux sont sa croissance limitée et sa robustesse. Les porcins pour la durabilité de l’ancrage des dispositifs (feuillets valvulaires épais par exemple pour les dispositifs cardiaques). Ils sont utilisés pour la robotique digestive. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.

1 704 rats vont être utilisés, tous tués pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent trois irradiations de l'abdomen espacées de 48 heures, vivent seuls pendant cinq à seize semaines et subissent un prélèvement de sang dans l'artère mésentérique avant la mise à mort. Le porteur indique que l'irradiation peut toucher l'intestin grêle et provoquer des signes cliniques irréversibles, amaigrissement et gonflement de l'abdomen, et que le régime cétogène testé entraîne une forte perte de poids puis de fortes carences. L'hébergement individuel imposé à des animaux sociaux pendant plusieurs mois figure parmi les procédures, quand la rubrique raffinement met en avant un tunnel et une étagère.

Objectifs

L'objectif de ce projet de recherche est d'évaluer le bénéfice thérapeutique de différents régimes alimentaires sur la toxicité digestive radio-induite. Plus précisément, ce projet visera à démontrer, via l’utilisation de régimes alimentaires renforçant ou fragilisant l’homéostasie au sein de l’écosystème colique, qu’après irradiation, la dégradation des relations de symbiose entre le système immunitaire de l’hôte et le microbiote, joue un rôle important dans les lésions digestives et notamment dans celles de l’épithélium colique. Ce travail revêt un intérêt majeur pour réduire la prévalence de patients souffrant de « Pelvic Radiation Disease » (PRD) ou améliorer leur prise en charge. La PRD est une maladie de certains patients bénéficiant d’une radiothérapie pelvienne et souffrent de complications gastrointestinales.

Bénéfices attendus

Le projet de recherche scientifique vise à apporter des bénéfices dans le domaine de la prévention et du traitement des lésions radio-induites du côlon dans un contexte de complications gastrointestinales après une radiothérapie pelvienne. Cela passe en premier lieu par une meilleur compréhension de la dynamique précoce des lésions radio-induites. Le projet permettra d'approfondir notre compréhension des mécanismes sous-jacents aux lésions radio-induites de l’épithélium colique. Cela inclut l'identification des processus cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement initial des lésions, et son évolution, ici interactions entre microbiote et système inflammatoire de l’hôte au sein de l’écosystème colique. Cette étude pourrait permettre d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques personnalisées basées sur l’alimentation (facilement applicable en clinique, prescrit par un nutritionniste), qui en renforçant de façon préventive l’intégrité de la barrière épithéliale colique permettraient de réduire la toxicité digestive au cours de la radiothérapie pelvienne, d’augmenter la tolérance au traitement antitumoral et ainsi d’optimiser son efficacité tout en préservant la qualité de vie des patients. D’un point de vue fondamental, la partie mécanistique de cette étude viserait à proposer une signature du microbiote, comme prédictifs des lésions radio-induites du côlon (i.e., « biomarqueur »), mais aussi de nouvelles cibles thérapeutiques sur la base d’une modulation des interactions hôte/microbiote et enfin pourrait appuyer le passage de l’étude expérimentale vers un transfert clinique éventuel.

Procédures

- Hébergement individuel pendant toute la durée de l’étude (min 5 semaines, i.e., pour la majorité des protocoles et max 12 à 16 semaines (dépendant de la longueur du régime alimentaire) pour 3 expériences potentielles et impliquant 432 rats maximum au total - Irradiations locales au niveau de l'abdomen sous anesthésie gazeuse (maximum 6 minutes), 3 fois avec un intervalle de 48 heures entre chaque séance. - Prélèvement de fèces de façon hebdomadaire pendant tout le temps de l’expérimentation. Ce prélèvement sera effectué au moment de la pesée de l’animal (réduction de la fréquence de manipulation des animaux et de leur stress). - Prélèvement de sang à partir de l'artère mésentérique avant l'euthanasie, d'environ 2 minutes, sous analgésique et anesthésie gazeuse.

Impact sur les animaux

Les deux modèles d’irradiation localisée du côlon, chez le rat, utilisés dans ce projet sont déjà utilisés dans le laboratoire. Ce modèle d’irradiation du côlon peut toucher une petite zone de l’intestin grêle, qui est mobile, entraînant des signes cliniques spécifiques irréversibles : amaigrissement de l’animal accompagné d’un gonflement au niveau de l’abdomen. Les régimes alimentaires pourraient favoriser des modifications de la masse graisseuse des animaux entraînant une variation de leur métabolisme. Le régime alimentaire dit « occidental » sera celui qui pourrait le plus induire d’effets néfastes (prise de poids, réduction de la mobilité, troubles métaboliques). Une attention particulière sera également portée à la suite du régime cétogène et notamment durant les 3 premières semaines de prise (perte de poids importante pendant cette période et période latence de l’efficacité de ce régime sur la santé). A long terme ce régime nécessitera des compléments alimentaires car il induit de fortes carences. Il est possible que les animaux sous ces deux régimes alimentaires présentent des signes cliniques et comportementaux.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de prélever des tissus pour des analyses histologiques, cellulaires ou moléculaires.

Remplacement

Dans le but d’évaluer les bénéfices thérapeutiques de certains régimes alimentaires sur la sphère digestive après exposition aux rayonnements et particulièrement pour le passage en clinique, nous sommes dans l’obligation d’utiliser des modèles in vivo. Il n'existe pas de test in vitro substitutif permettant de répondre aux questions soulevées dans ce projet. Le bénéfice thérapeutique d’un traitement passe par une action multiple au sein de l’organe d’intérêt, en agissant sur différents systèmes de cet organe, ici écosystème colique i.e., microbiote et hôte (système immunitaire, la barrière épithéliale mais aussi le micro-environnement, le système nerveux…). Seul un modèle animal intégré permet de façon pertinente de tester une telle efficacité, ici celle de différents régimes alimentaires sur la fonction de barrière du côlon.

Réduction

Pour atteindre la pertinence statistique, les groupes sont classiquement constitués de 8 à 12 individus selon le paramètre analysé. Pour certaines parties de l’étude, 2 expérimentations indépendantes seront réalisées afin de reproduire un effet observé (2x6 animaux par expérience et par groupe). A minima, une analyse statistique sera réalisée afin de comparer tous les groupes entre eux.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement pendant toute la durée des expérimentations. Le bien-être de l’animal sera évalué quotidiennement par le suivi de son comportement et de son aspect physique (aspect du poil, prise alimentaire, présence de fèces dans la cage, perte de mobilité…). Les animaux seront pesés toutes les semaines. De plus, des dispositifs d'enrichissement (tunnel rouge et cage haute avec étagère) seront mis en place dans les cages pour créer un environnement stimulant pour les animaux. Si au cours de l’expérience un animal montre des signes caractéristiques de souffrance, il sera retiré de l’expérimentation et euthanasié si son état est jugé irréversible.

Choix des espèces

Le modèle rat est approprié dans notre étude et a été validé au laboratoire dans le cadre de l’étude des complications gastro-intestinales radio-induites. Nous utilisons au laboratoire, le modèle d’irradiation localisée au niveau colorectal sur une fenêtre de 2cm/3cm La taille du rat permet aisément la réalisation d’irradiations fractionnées. Les lésions obtenues au cours du temps sont histologiquement proches de celles qui ont pu être observées chez des patients ayant bénéficié d’une radiothérapie pour le traitement de tumeurs abdomino-pelvienne. D’autre part, nous avons choisi le rat qui possède l’intégralité de son patrimoine immunitaire nécessaire à la réparation tissulaire. De plus, le rat est un modèle clé en recherche préclinique, en particulier dans la recherche pharmacologique et toxicologique mais aussi dans le cas plus précis de cette étude pour l’étude des variations fonctionnelles du microbiote, en raison de sa similitude avec l'être humain (par rapport à la souris). Les animaux seront reçus à l’âge de 13 semaines, ceci correspondant au stade adulte qui a été choisi afin d’éviter une potentielle hétérogénéité liée à l’âge. Ils seront irradiés à l’âge de 17 semaines minimum soit 4 semaines minimum après leur arrivée et leur accessibilité aux différents régimes alimentaires testés et ce, afin de permettre la modification et la stabilisation du microbiote à la suite du changement alimentaire.