Autres troubles humains
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Validation d’un modèle porcin dédié à l’évaluation de biomatériaux de substitution osseuse destinés aux greffes alvéolaires secondaires des patients en cours de croissance porteurs de fentes faciales
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
8 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Âgés de trois mois pour rester en croissance, ils subissent une chirurgie d'environ deux heures sous anesthésie pour l'implantation de biomatériaux osseux, avec des risques de douleur, de saignement et d'infection reconnus par le porteur, puis des examens buccaux sous sédation aux jours trois et sept. L'objectif est de valider un modèle porcin pour évaluer des substituts osseux destinés aux enfants porteurs de fentes faciales. Le porteur affirme que les modèles de culture peinent à reproduire la perfusion et les contraintes mécaniques de la mastication, ce qui rendrait "pertinent" de disposer d'un modèle animal.
Objectifs
En France, l’incidence des fentes labiales et / ou palatines, toutes formes cliniques confondues, est de 1 pour 700 à 1000 naissances. Leur prise en charge nécessite plusieurs temps de réparation chirurgicale. La greffe osseuse alvéolaire secondaire (GOAS) intéresse les enfants en cours de croissance cranio-faciale, entre 5 et 7 ans. Bien que les biomatériaux soient utilisés en reconstruction osseuse adulte, leur emploi dans le domaine des fentes reste peu courant. Ils permettraient pourtant de s’affranchir de prélèvements iliaques aux complications multiples. En outre, l’amélioration des biomatériaux doit se confronter à un nombre limité de modèles animaux à même de retranscrire les particularités d’une greffe en site en cours de croissance cranio-faciale. Le choix du modèle porcin s’est fait en raison de son utilisation dans la littérature comme modèle dans l’étude des defects osseux maxillo-faciaux. En effet, il est considéré comparable à l’homme aux vues de sa ressemblance en terme d’anatomie, de morphologie, de sa capacité de guérison, de remodelage osseux et de sa densité minérale. De ce fait, sa pertinence est largement supérieure à celle du modèle rongeur pour les objectifs visés ici. L’objectif de ce projet est de valider un modèle gros animal (porcin) dédié à l’évaluation de biomatériaux de substitution osseuse destinés aux GOAS réalisée en cours de croissance cranio-faciale, par l’intermédiaire de l’implantation in-vivo de matériaux conventionnels et de nouveaux biomatériaux mis forme par impression 3D.
Bénéfices attendus
Les nouvelles approches thérapeutiques, comme l'ingénierie tissulaire, utilisent des échafaudages de biomatériaux (scaffolds) pour stimuler et guider la régénération tissulaire. Ils constituent un réseau tridimensionnel qui imite le micro-environnement extracellulaire favorisant la viabilité, la fixation, la croissance et la migration des cellules tout en maintenant la structure du tissu régénéré in-vivo. La littérature montre que les scaffolds sur mesure améliorent la précision et réduit le temps d'opération, tout en étant associés à de meilleurs résultats cliniques. Les principales applications de ce projet sont la mise à disposition d’un modèle gros animal à même de permettre l’évaluation de tel scaffolds implantés en site de croissance, ainsi que les premières évaluations de nouveaux biomatériaux de reconstruction utilisables pour les GOAS des fentes.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale afin d'implanter les biomatériaux de substitution osseuse sous anesthésie générale. La manipulation de chaque animal devrait durer environ 2h en comptant les phases pré et post-opératoires. Ils recevront en post-opératoire une antibiothérapie (Amoxicilline 1 g 3 fois par jour pendant 3 jours) ainsi que des antalgiques (anti-inflammatoires) systèmatiques pendant 48h. Il s'agit là d'injections réalisées en quelques secondes. A J3 et J7 post-opératoire, un examen clinique sous sédation ou anesthésie générale (la choix sera fait en fonction des résultats du pré-essai)sera réalisé sur l'ensemble des animaux pour effectuer un examen endo-buccal pour surveiller la cicatrisation. L’animal sera aussi pesé. Ces examens devraient durer environ 30min.
Impact sur les animaux
Durant l’intervention la douleur sera prise en charge puisque la réalisation du geste s'effectuera sous anesthésie générale et analgésie. Risque inhérent à l’anesthésie générale. Risque de saignement per opératoire. En post opératoire, les animaux seront particulièrement surveillés sur les points suivant: signes de douleurs, problèmes de cicatrisation, infection du site opératoire. Les douleurs et le risque infectieux sont principalement existant durant les 48 premières heures post opératoire. Difficultés d’alimentation en post opératoire pouvant résulter en une perte de poids. Une nouvelle évaluation clinique sera réalisée à 3 et 7 jours, source potentielle de stress et douleur liée à l’injection d’anesthésique en intramusculaire.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issu des procédures pour réaliser une évaluation radiologique et anatomopathologique.
Remplacement
L’évaluation physico-chimique et biologique in vitro est un préalable à l’utilisation de nouveaux biomatériaux en chirurgie oro-faciale. Pour autant, mêmes les modèles de culture tridimensionnels peinent à reproduire la physiologie humaine, notamment la perfusion constante des zones greffées et l’application de contraintes mécaniques à la mastication. A ce titre, il devient pertinent de disposer de modèles animaux d’évaluation des biomatériaux.
Réduction
Notre étude est une étude interventionnelle. Pour répondre à l’objectif principal qui est la validation du modèle, les défauts laissés vacants devront constituer des défauts critiques. Pour répondre aux objectifs secondaires, à savoir l'efficacité des matériaux implantés, l’évaluation se fera en comparaison à l’absence d’implantation de matériel correspondant au témoin sur le même animal. Une pré-étude afin de valider les protocoles chirurgicaux sera réalisé en amont sur 1 à 2 animaux. Pour évaluer les résultats nous réaliserons une analyse radiologique et anatomopathologique à 3 périodes, 30 jours, 60 et 120 jours. Ainsi nous réaliserons les expérimentations sur 3 lots de deux animaux. Ceci permettra une fiabilisation des résultats et de ne pas mettre en péril l’étude en cas de problème sur un animal. S’agissant de la validation d’un modèle, l’objectif principal reposera sur la bonne cicatrisation des zones greffées et le maintien de la physiologie des animaux, tout en validant la taille du défaut critique. Pour répondre à cette approche, l’utilisation de deux animaux par lot permettra d’obtenir des résultats tout en s’affranchissant de la variabilité individuelle. En parallèle, les paramètres de densité et volume osseux seront étudié de manière descriptive sans emploi de méthode statistique.
Raffinement
Afin de diminuer le stress péri-opératoire, il sera prévu une période d’acclimatation des animaux avant la prise en charge chirurgicale ainsi que l’administration d’une prémédication. L’intervention chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale et pour éviter toute douleur pendant l’intervention des antalgiques seront administrés en per opératoire, une couverture chauffante sera mise en place afin de prévenir l’hypothermie, un protocole d’asepsie sera strictement appliqué pour éviter le risque d’infection du site opératoire et une antibioprophylaxie préviendra également ce risque. Une injection de lidocaïne sera faite au niveau du site opératoire afin de diminuer les douleurs post opératoires et le risque de saignement per opératoire. Des antalgiques seront administrés de façon systématique afin de prévenir les douleurs en post opératoire.
Choix des espèces
Le porc est un animal de choix pour tester les biomatériaux de substitution osseuse car son taux de régénération osseuse (1,2-1,5 μm/j) est comparable à celui des humains (1,0-1,5 μm/j). De plus, il est considéré comme un des modèles représentatifs proches des processus de régénération osseuse chez l'homme en ce qui concerne l'anatomie, la morphologie, la capacité de guérison, le remodelage, la densité minérale. Le modèle porcin adulte a récemment été validé pour tester l’efficacité de greffe osseuse au niveau maxillo-facial. Pour autant, aucun travail n’a porté sur l’individu en cours de croissance. Les animaux seront âgés de 3 mois pour qu’ils soient toujours en cours de croissance.
Hébergement de lignées de rongeurs génétiquement altérés
- Conservation des espèces
- Enquêtes médicolégales
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Production de routine
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 25000
250000 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie expédiée aux scientifiques qui les ont commandés et le reste tué. Ce projet d'élevage industriel de lignées génétiquement modifiées prévoit identification, jusqu'à quatre biopsies à l'oreille ou à la queue et des prélèvements sanguins par animal, certaines lignées exprimant un phénotype dommageable comme un diabète, une hémophilie ou une immunodéficience. Le porteur indique que les animaux "appartiennent au scientifique" et ne peuvent être replacés. Il présente l'élevage sur mesure de rongeurs "à fournir aux scientifiques" comme un service rendu à la communauté de recherche.
Objectifs
Ce projet a pour objectif la création, caractérisation et/ou l’élevage de lignée transgéniques à phénotypes dommageables ainsi que la réalisation d'une biopsie par méthode invasive séparément du geste d'identification sur des lignées transgéniques dans le but d'héberger ou de maintenir des lignées de rongeurs génétiquement modifiés pour le compte de la communauté scientifique. Les animaux génétiquement modifiés sont utilisés comme modèle expérimental pour la recherche (compréhension de maladies d’origine génétique comme par exemple la mucoviscidose, l’hémophilie ou encore la myopathie dans différents domaines : facteurs de risque, mécanismes physiopathologiques, essais thérapeutiques, ...) ou pour le développement de médicaments. A la réception ou à la création de lignées transgéniques, si la présence d’un phénotype dommageable n’a pas été analysée, une caractérisation de la lignée sera réalisée afin d'évaluer le bien-être animal et permettre la gestion optimale des possibles expressions cliniques du phénotype dommageable, leur prévention ou leur traitement adéquat. Lorsque le phénotype dommageable est avéré et connu, la gestion de cette lignée sera adaptée à ce dernier par la définition / surveillance des possibles signes cliniques associés à l'expression de ce phénotype ainsi que leur prévention et traitement. Pour toute lignée transgénique hébergée/élevée, il est important de connaitre le génotype des animaux, ainsi, en plus de l’identification, une biopsie avec une méthode invasive sera réalisée. Le but de cette biopsie est donc d’analyser le génotype de chaque animal afin de sélectionner celui d'intérêt. En 2022, sur 505 projets transgéniques au total (225 000 animaux), seulement 95 lignées étaient signalées avec un phénotype dommageable (19%, soit 43 000 animaux). Parmi ces 19%, moins de 1% ont réellement exprimé un phénotype dommageable. Ces phénotypes peuvent être catégorisés en tant qu’immunodéficient ; hémophile ; maladie métabolique ; trouble neurologique ; pathologie musculaire et articulaire ou cancer, mais nous ne pouvons prévoir précisément le nombre de lignées par catégories, cela dépend des sujets de recherche des scientifiques. Pour ce projet, nous comptons 250 000 animaux (ajout de 10% en prévision de la hausse d’activité) répartis entre 500 et 600 projets d’élevage de lignées transgéniques différentes. Entre 15- 20% de ces projets concerneront des lignées dont une partie des animaux pourront exprimer des phénotypes dommageables.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux transgéniques (avec un statut génétique et sanitaire connu) qui leur permettront de réaliser leurs études sur des organismes entiers et vivants. Ainsi, le bénéfice de ce projet sera de permettre une évaluation et une prise en charge des nuisances causées par la mutation génétique des lignées génétiquement altérées et une standardisation et raffinement des méthodes de prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique de ces lignées. Le tout permettra d’avoir une meilleure maitrise de la production et de la qualité génétique, sanitaire et zootechnique des animaux génétiquement altérés à fournir aux scientifiques pour leurs expérimentations.
Procédures
Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis par animal : A une identification unique, acte d’une durée maximale de 20 secondes, à maximum 4 biopsies (à l’oreille préférentiellement ; à la queue sur justification scientifique), acte d’une durée maximale d’une minute, à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale d’une minute. Un hébergement isolé peut être nécessaire en cas d’animal fragile ou d’animal agressif. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront être de phénotype dommageable.
Impact sur les animaux
Expression possible d’un phénotype dommageable due à la mutation génétique (immunodépression, arthrite, diabète, hémophilie, …). Chaque effet indésirable est notifié si connu à l’arrivée des animaux ou estimé lors de l’hébergement. Un suivi adapté et des mesures de raffinement spécifiques sur avis vétérinaire sont mis en place en fonction de l’impact observé / attendu chez l’animal. Sur la base du suivi rapproché effectué sur ces souches et des raffinements mis en place, la nuisance sur l’animal est légère à modérée. Stress suite à la contention pour identification Douleur et stress dus aux biopsies (nombre maximum de 4) si besoin d’identifier le génotype d’intérêt. La biopsie à l’oreille est privilégiée (environ 3mm x 3mm ou languette de 5mm de large maximum, plusieurs biopsies peuvent être faite si nécessaire et justification, âge minimum : 7 jours). Compte tenu de la taille de la biopsie et de la zone (oreille peu sensible), la nuisance sur l’animal est légère. Les biopsies à la queue sont possibles sur justification scientifique (biopsies de queue de 5mm maximum, une 2eme biopsie peut être réalisée sous justification du scientifique, âge minimum : 7 jours). Compte tenu de la taille de la biopsie et de la zone, la nuisance sur l’animal est légère pour les animaux de moins de 3 semaines (queue peu sensible) et modérée pour les animaux de plus de 3 semaines. Douleur et stress dus aux prélèvements de sang (volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur et les bonnes pratiques et raffinements internes). Une anesthésie pourra être appliquée en fonction du lieu du prélèvement. Hébergement isolé la période de récupération post opératoire pour les femelles réimplantées ou en cas d’agressivité au sein du groupe social afin de limiter la douleur et le stress liés à cette agressivité. Mise en place d’enrichissements supplémentaires et adaptés en cas d’hébergement isolé.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux sont soit expédiés, soit mis à mort (les animaux appartiennent au scientifique et ne peuvent être replacés).
Remplacement
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. Ceci implique l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle et nécessite de disposer d’organismes vivants et entiers afin de pouvoir observer l’impact de l’altération génétique ou d’une molécule thérapeutique dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels projets sur des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux hébergé et mis en accouplement est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et nous mettons en œuvre des améliorations continues de nos méthodes de reproduction pour réduire le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un niveau d'élevage correspondant aux objectifs du projet (par exemple : Adaptation du sexe du reproducteur transgénique quand il est accouplé avec des animaux non transgéniques afin de maximiser les chances de fertilités (phénotype impactant la reproduction), ou d’éviter les mères dont le phénotype réduit les comportements maternels).
Raffinement
Les observations par le personnel permettent d’évaluer le stress, la douleur et la souffrance et d’y répondre au plus vite en contactant les techniciens qualifiés, compétents et le vétérinaire. Si un point limite est atteint, le technicien met en place des soins particuliers, un enrichissement adapté, un isolement et/ou si besoin la mise à mort de l’animal. En cas de signe clinique particulier, un suivi adapté est mis en place et géré par des techniciens qualifiés, compétents au suivi vétérinaire des animaux. Les lignées connues pour pouvoir présenter un phénotype dommageable peuvent être observées et vérifiées de manière plus fréquente et plus spécifique avec des points limites et des raffinements précis. Ceci est évalué lors de la caractérisation du phénotype de la lignée ou en lien avec le scientifique en charge de cette lignée et le vétérinaire lorsque le phénotype attendu est connu. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score. En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort. Pour chaque phénotype dommageable, une mise en place de points limites non terminaux est adoptée afin de réaliser un suivi plus précis et plus optimum et la mise en place de soins adaptés (soutien nutritionnel, enrichissement spécifique, …). Si des animaux présentent des signes cliniques qui peuvent être atténués ou guéris à l’aide d’un traitement, avec accord du scientifique, ce traitement est mis en place. Les animaux déclarant un phénotype dommageable léger à modéré mais aptes à voyager seront expédiés avec une communication auprès de l’utilisateur final afin qu’il puisse gérer selon les règles éthiques et de bien-être animal leur réception et utilisation. En cas de prélèvements sanguins, les volumes prélevés ainsi que les périodes de récupération suivront la réglementation, les recommandations de la « Federation of European Laboratory Animal Science Associations » (FELASA) ainsi que les raffinements et bonnes pratiques internes. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisées que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique. A chaque abord d’une voie vasculaire, un point de compression sera effectué le temps suffisant pour assurer l’arrêt du saignement. Une observation de l'animal sera réalisée au retour dans sa cage pour s'assurer de sa récupération immédiate.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les espèces pour lesquelles les manipulations génétiques sont les plus développées, les mieux maitrisées et pour lesquelles les données scientifiques sont nombreuses. De plus, ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables. Ce sont les espèces qui permettent à la communauté scientifique de réaliser un certain nombre d’études en recherche et développement grâce aux données historiques et à leur connaissance de ces modèles animaux. Lors de la caractérisation des lignées, l’observation détaillée et l’analyse de la présence du phénotype dommageable sont réalisées à la naissance, au sevrage et 8 semaines d'âge. Il est également possible de prolonger sur l'âge adulte si les animaux sont conservés plus longtemps. - Hébergement des lignées à phénotypes dommageables fait à tout âge. -Biopsies réalisées le plus souvent (99% des cas) une semaine avant le sevrage ou au sevrage. Dans environ 1% des cas, une recoupe à l’âge adulte peut être demandé par le client. - Prélèvement de sang dans la plupart des cas fait en submandibulaire après 4 semaines d’âge minimum (adulte).
Etude d’excrétion chez le rat après application cutanée d’un produit chimique
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
1 760 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est isolé jusqu'à sept jours dans une cage à métabolisme, le dos rasé et recouvert d'un dispositif collé, pendant qu'une molécule chimique appliquée sur la peau est suivie dans son organisme. Le porteur reconnaît que l'isolement, la contention sur grille et le dispositif provoquent stress et inconfort, et que le produit testé peut entraîner démangeaisons ou irritation. Il présente ces essais d'excrétion cutanée comme des études de sécurité réglementaires requises par les autorités, et justifie le choix du rat par la guidance OCDE 427.
Objectifs
Ce projet a pour but de décrire les études d’excrétion réalisées chez le rat après l’application cutanée d'un produit chimique dans le contexte de l’approche suivante : la comparaison des résultats obtenus in-vitro sur peau humaine et peau de rat avec les résultats obtenus in-vivo chez le rat pour prédire les résultats lors de l’application chez l’humain. L’objectif de chaque étude réalisée dans le cadre de ce projet est d’évaluer l’absorption, la distribution cutanée au point d'application et l’excrétion d’une molécule chimique chez le rat après l’application cutanée unique de cette molécule. Cette étude permet de connaître la fraction de la molécule chimique d’intérêt qui est susceptible de traverser la peau et d’atteindre la circulation sanguine. Les quantités retenues dans la peau sont également déterminées. Le projet est justifié d’un point de vue de la législation : les études réalisées dans le contexte de cette approche permettent d’évaluer la sécurité de produits chimiques suivant les guidances spéficiques à ces études et sont ainsi requises et inspectables par les autorités. Le projet est également justifié d’un point de vue scientifique : les résultats de l’étude in vivo chez le rat permettent dans le contexte de cette approche de prédire ce qu’il se passe chez l’humain, dans le même contexte d’évaluation de la sécurité des produits chimiques, évaluée par les mêmes autorités.
Bénéfices attendus
Ce type d'étude permet de comprendre comment des molécules sont excrétées de l'organisme et fait partie des études de sécurité obligatoires dans le cadre du développement d'un nouveau produit chimique selon les guidances spécifiques à ce type d’études.
Procédures
Les animaux sont placés individuellement dans les cages à métabolisme pendant maximum 168h après 3 à 4 jours d’acclimatation sur litière. Un dispositif utilisé pour délimiter et protéger le site d'application cutané est collé sur le dos de l'animal dans une zone rasée pendant toute la durée de l'expérimentation (conformément à la guidance spécifique à ce type d’étude).
Impact sur les animaux
« Le placement individuel en cage à métabolisme pendant un maximum de 168h après 3 à 4 jours d’acclimatation sur litière est une situation d’isolement pouvant entrainer un stress de l’animal, tandis que la mise sur grille dans la cage peut entrainer un inconfort (classe de sévérité modérée). La présence d’un dispositif collé sur le dos de l’animal pendant toute la durée de l’expérimentation pour délimiter et protéger le site d’application cutané dans une zone rasée (conformément à la guidance spécifique à ce type d’étude) peut entrainer un inconfort pour l’animal (classe de sévérité légère). Selon le type de produit appliqué sur la peau, les nuisances peuvent être de l’inconfort telles que des démangeaisons ou une irritation (classe modérée). »
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de l'étude, afin d’analyser la quantité de molécule chimique retrouvée dans le corps de l’animal et non excrétée.
Remplacement
L’étude est réalisée à la suite d’études menées in vitro : la variabilité observée sur les résultats obtenus in vitro permet d’évaluer le nombre d’animaux nécessaires in vivo. Ainsi, selon les guidances, le nombre minimum d'animaux est défini à 12 (3 temps de collecte et 4 animaux par temps de prélèvement). En fonction de la variabilité attendue au niveau des résultats et suivant la guidance EFSA, le nombre d’animaux au dernier temps de prélèvement terminal peut être porté à 8 afin d'augmenter la puissance statistique de l'analyse des résultats en réduisant la variabilité.
Réduction
L’étude est réalisée à la suite d’études menées in vitro : la variabilité observée sur les résultats obtenus in vitro permet d’évaluer le nombre d’animaux nécessaires in vivo. Ainsi, selon les guidances, le nombre minimum d'animaux est défini à 12 (3 temps de collecte et 4 animaux par temps de prélèvement). En fonction de la variabilité attendue au niveau des résultats et suivant la guidance spécifique à ce type d’étude, le nombre d’animaux au dernier temps de prélèvement terminal peut être porté à 8 afin d'augmenter la puissance statistique de l'analyse des résultats en réduisant la variabilité.
Raffinement
Dans le cadre de l'utilisation des cages à métabolisme ou le placement seul dans une cage, toutes les cages sont maintenues dans la même pièce et sur le même portoir afin de favoriser l'instinct grégaire (visuel, odeur, communication). Afin de réduire l’inconfort de l’animal des panneaux opaques sont placés sur un des quatre côtés de la cage pour éviter l’exposition directe à la lumière. Les animaux sont observés tous les jours et les points limites basés sur l’apparence et le comportement de l’animal sont définis dans une grille afin de décider si l’animal doit être soulagé de son inconfort. De plus une plaque métallique recouvrant un tiers de la cage sera systématiquement placée sur la grille de la cage à métabolisme pour permettre à l’animal d’avoir un espace de repos sans gêner la collecte des urines et fèces.
Choix des espèces
Selon la guidance OCDE427 concernant la sélection de l’espèce animale, le rat est l’espèce la plus communément utilisée : Les espèce utilisées sont des espèces présentant un taux d’absorption cutanée proche de celle de l’homme. .Les animaux utilisés ont 6 à 7 semaines conformément aux recommandations de la guidance spécifique à ce type d’étude : (animaux entre 200 et 250g).
Induction de modèles de dégénérescence des photorécepteurs pour tester l’innocuité et l’efficacité de la transplantation de cellules souches
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
20 macaques crabiers vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit trois chirurgies oculaires de deux heures et une imagerie mensuelle sous anesthésie pendant 18 mois, pour créer un modèle de dégénérescence des photorécepteurs et tester une greffe de cellules souches. Le porteur décrit une inflammation oculaire transitoire et affirme qu'aucune douleur n'est attendue, sans détailler de test de la vision. Il indique qu'aucun système synthétique ne reproduit la rétine et présente le macaque comme le seul modèle à l'œil proche de celui de l'humain.
Objectifs
La dégénérescence des photorécepteurs (PR) est l'une des principales causes de perte de vision incurable dans le monde. La plupart des maladies dégénératives de la rétine sont causées par la mort irréversible des photorécepteurs (PR) ou de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) adjacent. Ce projet fait suite à la validation de l’étude préclinique du remplacement de l’épithelium pigmentaire rétinien chez le primate non-humain. Cette étude préclinique a ouvert la voie à un essai clinique démarré cette année à l’hôpital des 15-20. Dans ce nouveau projet, le remplacement des cellules photoréceptrices est considéré comme un traitement prometteur pour les maladies impliquant une dégénérescence des PR. Grâce aux avancées de la biologie des cellules souches, des progrès considérables ont été réalisés dans la production de cellules rétiniennes. Les celles souches pluripotentes induites (iPSC) représentent la source la plus favorable à la production illimitée de PR et de cellules EPR. Nous proposons ici de générer un modèle primate de dégénérescence rétinienne externe où le véritable potentiel de transplantation des PR dérivés des iPSC humaines pourra être évalué pour leur capacité à rétablir l'anatomie et la fonction de la rétine.
Bénéfices attendus
Les stratégies de développement de thérapies cellulaires visant à remplacer les cellules dégénérées constituent une issue thérapeutique majeure. Les premières études de sécurité ont déjà commencé pour l'EPR dérivé d'iPSC chez des patients atteints de DMLA (égénérescence maculaire liée à l'âge) et de Rétinite Pigmentaire. Nous proposons d’utiliser un nouveau modèle de dégénérescence des photorécepteurs chez le primate non humain basé sur notre expertise rétrospective sur l'implantation de prothèses rétiniennes. Le potentiel d'innovation de ce projet est très élevé puisqu'il n'existe actuellement aucun modèle robuste et reproductible de dégénérescence des photorécepteurs chez les PNH et que la transplantation d'une population homogène purifiée de photorécepteurs n'a donc pas été démontrée chez ces animaux. Ce projet nous permettra de répondre à des questions cruciales en matière de thérapie cellulaire en modifiant les paradigmes actuels de la recherche et de la clinique en matière de thérapie cellulaire.
Procédures
Tous les animaux de ce projet seront anesthésiés pour intervention chirurgicale et examens longitudinaux. Chirurgie : 3 chirurgies chez tous les animaux d’une durée de 2h Examens longitudinaux : imagerie du fond d’œil et ERG : 1 fois par mois pendant 18 mois chez tous les animaux - anesthésie pendant 3h, examen non invasif. Nous profiterons de ces anesthésies pour effectuer le prélèvement de larmes (2 minutes)
Impact sur les animaux
L’effet indésirable pouvant se manifester est une inflammation oculaire post chirurgie. Cette inflammation est transitoire et si elle a lieu dure 2 à 3 jours. Nous nous basons sur les effets indésirables constatés en clinique humaine. Aucune douleur n’est attendue. De même, en clinique humaine aucune douleur liée à la dégénérescence rétinienne n’est rapportée. Du stress peut être associé lors de la phase d’initialisation et du réveil des différentes anesthésies (chirurgie et examens longitudinaux). La répétition des anesthésies relativement longues pourrait entrainer des nuisances également pour l’animal (mise à jeun, temps de réveil post anesthésie désagréable).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des études histologiques.
Remplacement
Le recours à l’animal est nécessaire, car aucun milieu de culture ou système synthétique ne permet aujourd’hui de reproduire la complexité architecturale des cellules de la rétine, en particulier les interactions structurelles et fonctionnelles de ces cellules, ainsi que la réponse immunitaire potentiellement induite par l'administration sous-rétinienne des photorécepteurs dérivés de cellules souches.
Réduction
La mise en œuvre d’un suivi longitudinal non invasif (imagerie in vivo sur les animaux anesthésié) ainsi que par électrorétinogramme (étude fonctionnelle) permet de diminuer le nombre d’animaux utilisés ainsi que la contrainte imposée aux animaux.
Raffinement
Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale renforcée par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. L’acuité visuelle des animaux sera évaluée par des tests d’électrorétinogramme (ERG). Les animaux seront euthanasiés en fin d’étude et une analyse histologique sera effectuée. Leur état de santé sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille d’observation postopératoire, cela nous permettra d’intervenir immédiatement s’il y a signe de souffrance et de veiller au bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés en paire, dans des conditions enrichies en favorisant les interactions sociales.
Choix des espèces
Le macaque est retenu comme modèle d'étude sur les critères suivants : - cette étude fait partie d'un projet préclinique qui vise à valider un produit de thérapie cellulaire qui sera ensuite utilisé chez l'homme. Elle ne peut pas être menée chez le rongeur car l’organisation de l’oeil n’est pas comparable à celle de l’Homme. Seul le primate non-humain possède une anatomie de l'œil proche de l'homme, avec notamment la présence d'une région maculaire dans la rétine centrale. - le macaque permet d'intégrer des méthodes d'évaluation fonctionnelle. Uniquement des animaux adultes entre 2 et 15 ans seront utilisés. La rétine de ces animaux est comparable à celle de l’homme à l’âge adulte.
Evaluation de la rémanence d’un produit injecté en intra articulaire chez le lapin. EU 1/2
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
68 lapins vont être utilisés puis proposés à l'adoption, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent des injections dans les deux genoux puis jusqu'à neuf séances d'IRM sous anesthésie répétée, pour évaluer la durée de présence d'un produit contre l'arthrose. Le porteur indique que la répétition des anesthésies constitue la principale nuisance et affirme une bonne tolérance du produit, testée au préalable. Il précise qu'aucun prélèvement terminal n'est prévu et que tous les animaux devraient être adoptés, sous réserve d'autorisation, l'étude servant le développement commercial d'un produit.
Objectifs
Ce projet de recherche et de développement a pour objectif d’évaluer au cours du temps la rémanence d’un produit administré au niveau de la région synoviale articulaire du genou chez le lapin par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM). La rémanence se définit par un maintien dans le temps des effets d’une action ou d’un phénomène. Dans le cadre de notre projet, l’objectif est d’évaluer le maintien dans le temps de produits à action prolongée injectés en intra articulaire dans le traitement de l’arthrose et cela grâce à une quantification du volume de produit présent dans l’articulation à des temps définis. D’après l’organisation mondiale de la santé, l’arthrose est l’une des dix maladies les plus invalidantes dans les pays développés. A l’échelle mondiale, environ 10% des hommes et environ 20% des femmes âgés de 60 ans en souffrent. Dans les prochaines décennies, le vieillissement de la population, couplé à des facteurs de risques tels que l’obésité, laisse suggérer que le nombre de personnes atteintes d’arthrose va continuer d’augmenter. Cette pathologie, d'étiologie plurifactorielle, est caractérisée par la présence de lésions du cartilage associée à des anomalies pathologiques diverses au niveau des articulations. Il n'existe pas, à l'heure actuelle, de traitement médicamenteux permettant de régénérer le cartilage, les produits sur le marché ne permettant que de soulager et retarder l’avancée de la maladie avant une éventuelle chirurgie (prothèse). Ainsi, l’étude de produit innovant, notamment à base d’Acide Hyaluronique (HA), permettant notamment de restaurer les propriétés viscoélastiques du liquide synovial, la capacité d’absorption des chocs et de lubrification de la région synovial est donc un enjeu majeur. Le devenir des animaux dépendra des procédures réalisées durant l’étude. Les animaux qui n’auront subi aucuns prélèvements terminaux (prélèvements d’organes ou prélèvements de sang trop important pour le rétablissement des animaux) et dont le certificat sanitaire le permet pourront être placés sous réserve de trouver des adoptants pouvant leur offrir une retraite dans le respect du bien-être animal.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera au développement et à la mise sur le marché de nouveaux produits contre l’arthrose, avec notamment une meilleure rémanence des produits.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés (induction en fixe puis relais en volatile) et intubés pour les injections intra articulaire (sous condition stérile) puis pour chaque session d’imagerie selon la durée totale de l’étude et le nombre de délai d’imagerie applicable. Un total de 10 interventions seront prévues au maximum (injection, puis 9 délais d'imagerie avec une première session 24h à 48h après, puis 7 jours de délai au minimum entre chaque session suivante d'imagerie).
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables sur les lapins seront essentiellement dus à la répétition des anesthésies réalisées premièrement par une injection intramusculaire puis l’animal sera maintenu sous anesthésie gazeuse par intubation. Cette procédure d’anesthésie sera régulière selon la durée totale de l’étude et le nombre d’IRM applicables, espacées de 24h minimum entre chaque temps par animal. Aucune nuisance ou effet indésirable de l’injection intra-articulaire n’est attendu étant donné que la tolérance du produit aura été testé au préalable et qu’il aura été démontré une bonne tolérance du/des produits injectés. Cependant, le transport jusqu'au lieu de réalisation des examens d’imagerie pourrait induire également un stress.
Devenir
Le devenir des animaux dépendra des procédures réalisées durant l’étude. Les animaux qui n’auront subi aucuns prélèvements terminaux (prélèvements d’organes ou prélèvements de sang trop important pour le rétablissement des animaux), dont le certificat sanitaire le permet et sous réverse d’une autorisation par les autorités réglementaires, pourront être placés chez des adoptants qui leur fourniront une retraite dans le respect du bien-être animal. Il est prévu à ce jour de faire adopter tous les animaux, aucun prélèvement terminaux n’étant prévus.
Remplacement
Afin de répondre aux objectifs de ce projet, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable le comportement de produits injectés dans un organisme entier vivant. Ce comportement dépend de très nombreux facteurs tels que la zone d’injection, les tissus environnants, l’activité de l’animal… L'articulation du genou étant une zone très spécifique (mouvements, isolement du reste de l'organisme, ...), les méthodes in vitro ou in silico ne permettent pas à ce jour à mimer de manière fiable le comportement d'un produit injecté dans cette zone sur le long terme.
Réduction
Une étude pilote permettant de valider la bonne visualisation et la bonne quantification par imagerie des produits injectés à 24h et 48h post injection sera réalisée sur 4 animaux. Si le produit candidat n’est pas visible ni quantifiable à ces temps courts post injection, la/les étude(s) principale(s) ne seront pas réalisées. La tolérance du produit a déjà été testée préalablement in vitro/in vivo. Ainsi, les 2 genoux seront injectés. L’injection dans les 2 genoux de chaque lapin permet d’administrer 2 traitements différents par animal, ce qui permet d’optimiser l’utilisation des animaux et ainsi réduire leur nombre nécessaire pour atteindre des données scientifiques robustes (nombre de lapins réduits à son strict nécessaire pour avoir 8 genoux par groupe soit 12 lapins). Avec 8 genoux comparables par groupe, une approche statistique est prévue : si un test paramétrique peut être utilisé, un test t de Student sera utilisé pour comparer 2 groupes et une Anova avec test de Dunett sera utilisé pour comparer un groupe versus un groupe contrôle ou test de Newman-Keuls pour comparer des groupes entre eux 2 à 2. Si un test non paramétrique doit être utilisé, un test de Wilcoxon sera utilisé pour comparer 2 groupes et un test de Kruskall-Wallis sera utilisé pour comparer n groupes versus un groupe contrôle et un test de Friedman pour comparer n groupes entre eux 2 à 2.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 4 jours minimum sera respectée. Toutefois, une période d’acclimatation de 7 jours sera privilégiés dès que cela sera possible. Les animaux seront hébergés en groupe tout au long du projet avec des enrichissements appropriés à leur besoin (balles, abris, bois à ronger, …). L’injection du produit stérile par voie intra articulaire ainsi que tous les actes techniques nécessitant une contention importante seront réalisés sous anesthésie induite en IM puis maintenue par voie volatile, afin d’éviter tout stress aux animaux. Les sites d’injection seront suivis à minima pendant 8 jours après administration intra articulaire. Tout au long de l’étude, un suivi clinique quotidien sera réalisé. Le poids des animaux et un suivi clinique avec grille de scoring seront réalisés minimum 1 fois par semaine. Tout signe clinique d’appel (voir §4, grille de scoring) sera remonté au vétérinaire, si l’animal présente des douleurs ou un inconfort, le vétérinaire pourra prescrire un antalgique (exemple : meloxicam à 0.4mg/kg). Enfin, tout examen clinique complet témoignant d’un état de santé considérablement dégradé de l’animal et sans possible rétablissement conduira à une euthanasie étique des animaux concernés. Le projet se déroulant sur deux établissements utilisateurs, des transports sont prévu entre les deux établissements. La température sera adaptée et suivie (environ 20°C, avec sonde de température) et les cages de transports seront suffisamment grandes pour assurer le bien-être des animaux pendant le trajet. De la nourriture et de l'eau pourront être mis à disposition à l'arrivée des animaux et une période de calme sera respectée à l'arrivée avant tout anesthésie afin de limiter au maximum le stress.
Choix des espèces
Le lapin est une espèce couramment utilisée comme modèle pour les pathologies de l’arthrose et du genou. En effet, la taille du genou facilite les analyses histologiques et d'imagerie par rapport à des espèce plus petites. De plus, il s'agit d'un animal couramment employé en expérimentation animale, permettant ainsi d'une part de gérer plus facilement son bien-être au cours de l'étude et d'autre part de travailler sur des lots homogènes (âge et sexe fixés). [McCoy AM. Animal Models of Osteoarthritis: Comparisons and Key Considerations. Veterinary Pathology. 2015; 52(5):803-818. doi:10.1177/0300985815588611] Des lapins adultes de 11 semaines minimum seront utilisés dans ce projet pour avoir des articulations et des cartilages matures sur des animaux n’étant plus en forte période de croissance osseuse.
Induction d’un modèle de dégénérescence rétinienne par inhibition du système S chez le primate non humain
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
12 macaques crabiers vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie oculaire d'une heure puis des anesthésies répétées, mensuelles sur six mois puis tous les deux mois jusqu'à 24 mois pour la moitié d'entre eux, afin d'induire par injection une dégénérescence des photorécepteurs à cônes. Le porteur décrit une inflammation oculaire transitoire et affirme qu'aucune douleur n'est attendue en s'appuyant sur la clinique humaine, sans mentionner de test de la vision. Il indique qu'aucun milieu de culture ne reproduit la complexité de la rétine et qualifie ce modèle d'"indispensable" pour tester ensuite des thérapies chez les patients atteints de rétinite pigmentaire.
Objectifs
La Rétinopathie Pigmentaire (RP) est une maladie oculaire génétique grave qui touche environ une personne sur 3000 au niveau mondial. Cette maladie se caractérise par une perte progressive de la vision. Elle se caractérise sur le plan clinique par une perte progressive des photorécepteurs à bâtonnet suivie de la diminution de fonction des photorécepteurs à cône jusqu’à la cécité. Le système S joue un rôle essentiel dans la protection des photorécepteurs contre le stress oxydant. Nous avons démontré chez le rongeur que le système S jouait un rôle crucial dans la survie des photorécepteurs à cônes, cellules indispensables à la vision centrale et des couleurs. Il n’existe à ce jour, aucun modèle chez le primate non humain de dégénérescence des photorécepteurs à cônes. Un tel modèle est indispensable pour pouvoir tester par la suite des thérapeutiques ciblant la macula (région riche en cônes) et ainsi pouvoir envisager des traitements sur des patients atteints de rétinite pigmentaire. Le but de cette étude est de bloquer le système S par injection d’une molécule inhibitrice chez le primate non humain et de montrer une altération des cellules à cônes. La structure de la rétine sera analysée par imagerie du fond d’œil in vivo et la fonction rétinienne sera évaluée par électrorétinogramme. Nous procéderons par la suite à une analyse histologique de la rétine.
Bénéfices attendus
A ce jour, aucun modèle de dégénérescence rétinienne des photorécepteurs à cônes n’existe chez le primate non humain. Récemment, nous avons démontré chez le rongeur que le système S jouait un rôle crucial dans la survie des photorécepteurs à cônes, cellules indispensables à la vision centrale et des couleurs. Il n’existe à ce jour, aucun modèle chez le primate non humain de dégénérescence des photorécepteurs à cônes. Le but de cette étude est de créer un modèle de dégénérescence des cellules à cônes afin de pouvoir comprendre les mécanismes sous tendant cette dégénérescence et également de pouvoir tester par la suite des thérapeutiques ciblant la macula (région riche en cônes) et ainsi pouvoir envisager des traitements sur des patients atteints de rétinite pigmentaire. Le but de cette étude est de bloquer le système S par injection d’une molécule inhibitrice chez le primate non humain et d’étudier les mécanismes de la dégénérescence des photorécepteurs à cônes. Cette étude sera réalisée sur des temps courts (8 mois) afin de montrer histologiquement les modifications de la rétine et sur des temps plus longs (24 mois) afin de détecter des anomalies tardives. Nous évaluerons les changements structurels et fonctionnels de la rétine.La structure de la rétine sera analysée par imagerie du fond d’œil in vivo, la fonction rétinienne sera évaluée par électrorétinogramme et nous réaliserons une étude histologique. Un tel modèle est indispensable pour pouvoir tester par la suite des thérapeutiques ciblant la macula (région riche en cônes) et ainsi pouvoir envisager des traitements sur des patients atteints de rétinite pigmentaire.
Procédures
Tous les animaux de ce projet seront anesthésiés pour intervention chirurgicale et examens longitudinaux. Chaque animal aura une chirurgie d’une durée de 1h. Les examens longitudinaux, imagerie du fond de l’œil et électrorétinogramme durent respectivement 1 et 2 heures. Les animaux seront anesthésiés une fois par mois pendant 6 mois (n=12 animaux) et tous les 2 mois de 7 à 24 mois pour 6 animaux.
Impact sur les animaux
L’effet indésirable pouvant se manifester est une inflammation oculaire post chirurgie. Cette inflammation est transitoire et si elle a lieu dure 2 à 3 jours. Nous nous basons sur les effets indésirables constatés en clinique humaine. Aucune douleur n’est attendue. De même, en clinique humaine aucune douleur liée à la dégénérescence rétinienne n’est rapportée. Du stress peut être associé lors de la phase d’initialisation et du réveil des différentes anesthésies (chirurgie et examens longitudinaux). La répétition des anesthésies relativement longues pourrait entrainer des nuisances également pour l’animal (mise à jeun, temps de réveil post anesthésie désagréable).
Devenir
Tous les animaux n=12 seront euthanasiés afin de réaliser des études histologiques.
Remplacement
Le recours à l’animal est nécessaire, car aucun milieu de culture ou système synthétique ne permet aujourd’hui de reproduire la complexité architecturale des cellules de la rétine, en particulier les interactions structurelles et fonctionnelles de ces cellules, ainsi que la réponse immunitaire potentiellement induite par l'administration sous-rétinienne des photorécepteurs dérivés de cellules souches.
Réduction
La mise en œuvre d’un suivi longitudinal non invasif (imagerie in vivo sur les animaux anesthésié) ainsi que par électrorétinogramme (étude fonctionnelle) permet de diminuer le nombre d’animaux utilisés ainsi que la contrainte imposée aux animaux. Différents marqueurs de survie des photorécepteurs et des autres cellules rétiniennes, de cellules inflammatoires seront utilisés lors des analyses histologiques sur les 12 rétines traitées comparées aux 12 contrôles.
Raffinement
Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale renforcée par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. L’acuité visuelle des animaux sera évaluée par des tests d’électrorétinogramme (ERG). Plusieurs marqueurs indiqueront l’état inflammatoire, la qualité des photorécepteurs et des cellules ganglionnaires. Leur état de santé sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille d’observation postopératoire, cela nous permettra d’intervenir immédiatement s’il y a signe de souffrance et de veiller au bien-être des animaux.
Choix des espèces
Le macaque est retenu comme modèle d'étude sur les critères suivants : - cette étude fait partie d'un projet qui vise à valider un modèle de dégénérescence des photorécepteurs à cônes Elle ne peut pas être menée chez le rongeur car l’organisation de l’œil n’est pas comparable à celle de l’Homme. Seul le primate non-humain possède une anatomie de l'œil proche de l'homme, avec notamment la présence d'une région maculaire dans la rétine centrale. - le macaque permet d'intégrer des méthodes d'évaluation fonctionnelle, telles que l'imagerie du fond de l’œil, et l'électro-rétinographie, qui peuvent être directement extrapolées à l'homme dans une démarche translationnelle. Uniquement des animaux adultes entre 2 et 15 ans seront utilisés. La rétine de ces animaux est comparable à celle de l’homme à l’âge adulte.
VOIES D’AMELIORATION DE LA PRODUCTION DE LAIT MATERNEL PAR SUPPLEMENTATION NUTRITIONNELLE PENDANT LA GESTATION DANS UN MODELE RONGEUR (RAT)
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
480 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les rates reçoivent une supplémentation nutritionnelle pendant la gestation, une injection d'eau marquée, un prélèvement de lait sous anesthésie et des prélèvements de sang, leurs petits des prélèvements d'urine, un test de tolérance au glucose et un prélèvement de sang, avant une mise à mort par ponction cardiaque pour prélever la glande mammaire. Le porteur teste des acides aminés censés augmenter la production de lait maternel, une éventuelle étude chez la femme renvoyée au conditionnel. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne rend compte de la mise en place de la lactation.
Objectifs
L’Organisation Mondiale de la Santé recommande l’allaitement exclusif jusqu’à 6 mois. Le taux d’allaitement exclusif, en France, de l’ordre de 65% à la naissance, chute à 35% dès la fin du premier mois. La raison invoquée est évidemment le retour des mères au travail ; toutefois, la perception d’une production insuffisante de lait maternel est souvent citée mais repose soit sur une impression subjective, soit sur une mesure indirecte et imprécise de la production de lait, qui consiste à peser les enfants, avant et après tétée. Nous avons mis au point une méthode plus précise, basée sur la méthode d’enrichissement isotopique. Cette méthode requiert l’administration à la mère d’une dose d’eau marquée au deutérium, isotope stable de l’hydrogène, puis de suivre la diffusion de ce traceur chez le petit allaité. L’eau du lait maternel étant la seule source d’eau ingérée par le petit, on peut en déduire le flux de lait entre la mère et le petit. Nous avons utilisé cette méthode pour quantifier la production de lait maternel chez un modèle de petite taille (rongeur, rat), largement utilisé pour la recherche périnatale du fait de son cycle court de reproduction. Dans l’idée de tester des stratégies pour améliorer la lactation par des interventions nutritionnelles chez des femmes allaitantes, nous allons utiliser cette méthode pour explorer, sur un modèle animal rongeur, des molécules « galactologues » susceptibles d’améliorer la production de lait maternel. Ces molécules seront testées pendant la gestation, qui est la période de croissance in utero du fœtus et aussi la période de préparation de la glande mammaire à la lactation. C’est une période de vie qui mérite d’être mieux étudiée avec un objectif d’améliorer la lactation. Les molécules galactologues qui nous intéressent sont deux acides aminés, arginine et citrulline, qui participent au contrôle de la lactation. L’arginine, est un acide aminé semi-essentiel, seul précurseur endogène de l’oxyde nitrique (NO). L’arginine supplémentée pendant la gestation et la lactation augmente le flux de lait de 20% chez la rate allaitant une portée de 12 ratons sous régime normo-protéique alors que l’effet est nul lorsque l’arginine est supplémentée pendant la lactation seule. La citrulline est un acide aminé non essentiel qui échappe à l'absorption hépatique, n'est pas incorporée dans les protéines, et est absorbée par les reins où elle est transformée en arginine.
Bénéfices attendus
La supplémentation du régime alimentaire de la mère sera testée pendant la gestation de façon à étudier cette période de vie. La période de gestation, en particulier le dernier trimestre chez la femme, est d’abord la phase de croissance in utero du fœtus, mais elle correspond également à la période où les glandes mammaires se préparent à la lactation, avec l’initiation de leurs mécanismes physiologiques. Nous avons donc décidé de la considérer pour étudier ses effets potentiels sur la lactation. Les bénéfices attendus sont une meilleure initiation de la lactation, dès les premiers jours après la naissance, et au final, une meilleure production de lait maternel, tout au long de la lactation. Le meilleur indicateur en termes de bénéfice serait, à terme, une amélioration du taux d’allaitement. Si les résultats de cette supplémentation s’avéraient positifs sur ce modèle de rate, nous pourrions aller vers une étude clinique chez la femme pendant la grossesse. Si les bénéfices en termes de lactation sont positifs chez la rate, rien ne prouve qu’il en serait de même chez la femme et seule une étude clinique permettrait de le prouver. Supplémenter le régime maternel avec un acide aminé, uniquement en fin de gestation, serait envisageable puisque les doses en arginine et citrulline sont celles déjà testées chez l’homme adulte, sans que des effets indésirables n’aient été observés. La prise en considération de la vulnérablité accrue de la femme en période de grossesse serait évidemment à considérer.
Procédures
Les rates seront soumises à une manipulation nutritionnelle durant la gestation (15 jours), à une injection d’eau deutérée en intra-veineuse pendant la lactation (10 min/femelle), à 1 prélèvement manuel de lait (30 minutes), et à des prélèvements de sang (2 min/animal). Leur descendance sera soumise à des prélèvements d’urine pendant la lactation (2 min/petit) et à un test de tolérance orale au glucose (120 minutes) et des prélèvements de sang à la veine caudale à 150 jours de vie (2 min/animal).
Impact sur les animaux
Pour les animaux, l’évaluation de la douleur sera faite à l’aide d’observations physiologiques (poids), comportementales (consommation de nourriture, fuite ou défense de l’animal à la manipulation, activité) et en fonction de l’apparence de l’animal (poil, posture). Aucune souffrance (ou très faible) n'est attendue lors des manipulations prévues. Les animaux seront observés tous les jours y compris le Week-end. De la douleur et/ou du stress peuvent être ressentis par l’animal, pendant l’injection d’eau deutérée (mère), et les prélèvements de sang (mères et ratons). Du stress peut être ressenti par l’animal pendant le prélèvement de lait (mère), et le prélèvement d’urine et le gavage du glucose lors du test de tolérance orale (ratons).
Devenir
Si aucun évènement n’a justifié la mise à mort prématurée des animaux, ils seront mis à mort aux temps de prélèvements de tissus préalablement établis dans les procédures expérimentales. Pour la procédure 1, les rates sont suivies jusqu’à l’involution (J21), temps auquel elles sont mises à mort, notamment pour un prélèvement de glande mammaire. Les ratons à J21 sont séparés en 2 : les ratons non sevrés (8 sur 12 par portée) sont mis à mort à ce même temps, pour un prélèvement de sang intracardiaque, les ratons sevrés (4 sur 12 par portée) sont suivis jusqu’à 150 jours, temps auquel ils sont mis à mort. Pour la procédure 2, les mères sont suivies jusqu’à J18 (date de fin de mesure du flux de lait par méthode d’enrichissement à l’eau deutérée), temps auquel elles sont mises à mort, notamment pour un prélèvement de glande mammaire. Tous les ratons (toute la portée) sont également mis à mort à ce temps car aucun suivi n’a été prévu à long terme: Un prélèvement de sang intracardiaque sera alors effectué sur ces animaux. Tout animal sera exclu du protocole et mis à mort si un comportement anormal de l’animal (prostration, poil hérissé, refus d’alimentation, courbe de prise de poids anormale) est observé.
Remplacement
Il s’agit d’une étude in vivo visant à évaluer des stratégies nutritionnelles sur la production de lait maternel. Il n’existe donc pas de modèle in vitro permettant le remplacement de l’étude animale. Tous les animaux utilisés pour ce projet proviennent d’élevages reconnus et sont nés en captivité. Il n’existe pas encore de méthode alternative (modélisations, modèles in vitro) permettant de rendre compte de la complexité des mécanismes physiologiques dans la mise en place de la lactation, pendant la phase de gestation.
Réduction
Le nombre d'animaux a été réduit au minimum. Il prend en compte la nécessité d’avoir au moins 6 mères différentes par groupe expérimental pour des raisons de calcul statistique et de garder 2 ratons mâles et 2 ratons femelles par mère pour tenir compte d’un effet sexe et d’un effet « portée ». Si un galactologue ne montre pas d’effet significatif sur la production de lait ou la croissance de la portée par rapport au contrôle dans le protocole 1, la procédure 2 ne sera pas réalisée pour ce galactologue.
Raffinement
Des mesures sont mises en place lors des différents prélèvements de sang, avec une analgésie locale de lidocaïne 2% qui sera appliqué 15 min avant l’incision. Pendant le prélèvement de lait, les femelles seront gardées sous anesthésie avec induction en boite (mélange isoflurane 4 à 5%/L d’oxygène), puis maintien au masque (mélange isoflurane 2.5 à 3%/L d’oxygène). Les rattes sont placées sur un tapis chauffant pendant pendant toute la durée du prélèvement jusqu’à leur réveil. Les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel agréé et seront pesés 3 fois par semaine ce qui permettra de surveiller une éventuelle perte de poids et de vérifier leur état général. Les rats sont hébergés dans des portoirs ventilés avec différents enrichissements de milieu (frisottis, tunnels, morceau de bois) afin de réduire leur stress. Les points limites de cette procédure qui conduiront à la mise à mort de l’animal seront les suivants : Pour les mères : - anomalies détectées lors de l’observation générale de l’animal : posture (dos vouté, ventre rétracté) ou masque (yeux plissés, museau gonflé) suggérant une douleur sévère ; Pour les petits : - incapacité à téter ; absence prolongée d’interaction avec la mère et l’environnement ou de réponse aux stimulations ; dégradation de l’état du poil ; perte de poids 2 jours consécutifs Pour les mères et les petits : - anomalies détectées à l’examen clinique : baisse significative du poids corporel (plus de 20% persistant pendant 72 heures) ou arrêt de la croissance pour les petits ; déshydratation sévère ; signes de défaillance des organes (détresse respiratoire, dilatation du ventre…).
Choix des espèces
L'avantage du modèle rat sur le modèle porcin utilisé dans certaines références bibliographiques est la petite taille des animaux (permettant d'augmenter les effectifs et donc de diminuer la variance des mesures) et la rapidité de croissance et de reproduction, permettant de réaliser des protocoles expérimentaux en beaucoup moins de temps. Les mères seront commandées gestantes auprès du fournisseur (J1). Les rates seront utilisées pendant la gestation et la lactation puisque la gestation est la période au cours de laquelle la supplémentation du régime alimentaire sera testée et la lactation est la période de mesure du flux de lait. La descendance sera utilisée pendant l’ensemble de la période de lactation. Afin de déterminer l’impact des galactologues sur le métabolisme de la descendance à long terme, 2 mâles et 2 femelles par mère seront sevrés et suivis jusqu’à l’âge adulte (5 mois maximum)
Etude de la biocompatibilité et de la tumorigénicité d’implants actifs et non actifs en sous-cutané chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des implants sous la peau du dos, du crâne et du genou sous anesthésie, avec un risque annoncé de douleur, d'infection et de développement de tumeurs liées aux cellules souches humaines implantées. Le porteur vise des implants de comblement osseux pour l'arthrose, une application renvoyée au long terme. Il affirme que la complexité de l'environnement sous-cutané est impossible à reproduire in vitro et que la réglementation rend l'étude du cancer "nécessaire" sur animal vivant.
Objectifs
Dans le but de développer de nouveaux types d’implants synthétiques contenant des composés actifs sur le plan biologique et d’étudier leur efficacité dans le comblement osseux, nous envisageons tout d’abord de tester leur biocompatibilité et leur tumorigénicité en sous-cutané chez la souris, en vue de leur utilisation en préclinique. Les implants seront constitués d’une matrice fonctionnalisée ou non avec des molécules et/ou des cellules souches mésenchymateuses humaines. Trois sites d’implantation ont été choisis sous la peau du dos, du crâne et du genou. Les implants actifs seront fonctionnalisés avec des molécules et/ou des cellules souches, les implants inactifs sans cellules serviront de témoins. Notre objectif est donc d’optimiser le non-rejet des implants ainsi que l’absence de développement de tumeurs après une intervention chirurgicale en développant des implants contenant des molécules présentant des activités biologiques et/ou des cellules souches humaines (implants vivants de troisième génération). Après des études in vitro, notre projet consistera à étudier in vivo sur modèle animal les performances des implants en termes de biocompatibilité, de toxicité et d’efficacité. Nous devrons également optimiser des dispositifs approuvés par la FDA (Food and Drug Administration) qui est l’agence américaine des produits alimentaires et médicamenteux. Ce projet consiste donc à valider sur des modèles animaux des implants pouvant se résorber dans l’organisme.
Bénéfices attendus
Nous espérons valider de nouveaux implants osseux pour les tester dans certaines pathologies comme l’arthrose. A terme, ces implants pourraient être utilisés dans le traitement régénératif de lésions articulaires (arthrose) ou osseuse.
Procédures
La procédure chirurgicale sous-cutanée est réalisée sous anesthésie générale et couverture antalgique et dure au maximum 30 minutes.
Impact sur les animaux
Nuisances prévisibles : douleur liée à la chirurgie, inflammation, infection au niveau du site d’implantation, gêne dans la locomotion, développement de tumeurs dues aux cellules souches humaines.
Devenir
A l’issue de la procédure tous les animaux implantés seront mis à mort pour la récupération des implants et des tissus (peau) pour des analyses complémentaires approfondies.
Remplacement
Après des études in vitro validant l'efficacité des implants comme la minéralisation, la survie des cellules, la différenciation…, il est nécessaire de passer à des études in vivo étant donnée la complexité de l'environnement physiologique sous-cutané, impossible à reproduire in vitro (vascularisation, cellules du système immunitaire, molécules inflammatoires…). Seuls les implants efficaces in vitro seront testés sur les animaux. Selon la règlementation, l’étude d’un éventuel développement de cancer par des implants est nécessaire sur animal vivant.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux a été évalué sur la base du nombre d’analyses nécessaires (études histologiques, immunohistologiques…) afin d’obtenir des résultats fiables. De plus, uniquement les implants validés in vitro seront testés en implantation sous-cutanée. Il n’y aura pas de tests statistiques, nous effectuerons des observations directes de type présence/absence. Par exemple, pour la biocompatibilité, nous regarderons en priorité le recrutement et l’infiltration éventuel de cellules inflammatoires.
Raffinement
Le raffinement prend en compte le bien-être des animaux. Tous les actes chirurgicaux seront réalisés stérilement sous anesthésie générale avec une analgésie locale pour réduire la douleur post-opératoire au site implanté. Le réveil complet des animaux sera activement surveille le jour de l’intervention et le suivi journalier de leur bien-être sera ensuite mis en place. Les souris immunodéficientes seront hébergées dans des portoirs ventilés séparées des autres souris et l’aliment, l’eau de boisson et la litière seront autoclavés. Pour l’ensemble des animaux un enrichissement du milieu (tunnels, bâtonnets, nids, coton…) sera ajouté dans les cages. Des points limites adaptés ont été établis afin de pouvoir soustraire l’animal à la douleur.
Choix des espèces
La souris est un modèle validé et utilisé classiquement dans ce type d’études, et qui permettra de comparer nos résultats avec les travaux similaires. Pour tester la biocompatibilité nous utiliserons des souris contrôles pour des implants sans cellules ainsi que des souris immunodéficientes pour des implants contenant des molécules actives et/ou des cellules humaines et pour l’étude de la tumorigénicité de ces implants. Les animaux utilisés à l’âge adulte (après 8 semaines minimum) pour présenter des systèmes physiologiques (notamment immunitaire) matures.
Restauration d’une spermatogenèse fonctionnelle chez des souris infertiles par une nouvelle thérapie in vivo 2/2
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
5040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. 720 d'entre elles subissent trois chirurgies des testicules, une laparotomie et des aspirations de l'épididyme, puis une vingtaine de séances d'imagerie sous anesthésie sur 120 jours, les 4320 autres une chirurgie testiculaire avant une mise à mort échelonnée pour prélever les spermatozoïdes. Le porteur vise une thérapie de l'azoospermie masculine, un bénéfice renvoyé au stade préclinique et au conditionnel. Il affirme que la spermatogenèse ne se reproduit pas in vitro et conclut que le modèle souris est "incontournable".
Objectifs
L’infertilité est un problème fréquent : 1 couple sur 7 serait concerné en France. L’infertilité est définie comme étant l’incapacité à obtenir une grossesse après un an de rapports sexuels réguliers sans moyen de contraception. On estime que dans la moitié des cas, l’infertilité est d’origine masculine. Certains hommes souffrent d’une absence totale de spermatozoïdes dans leur sperme. Ce phénomène concerne environ 15 % des hommes infertiles et se nomme « azoospermie non obstructive ». À l’heure actuelle, des solutions sont apportées aux couples souffrant d’infertilité grâce au développement des techniques de Procréation Médicalement Assistée (PMA). Néanmoins, ces approches ne s’appliquent pas aux patients souffrant d’azoospermie non obstructive, car elles nécessitent la présence de spermatozoïdes. De nouvelles stratégies thérapeutiques doivent être mises en place pour ces patients. L’azoospermie non obstructive est souvent liée à des défauts au niveau d’un seul gène, ce qui entraine l’absence de la protéine normalement produite grâce à ce gène. L'objectif de ce projet est de développer de nouvelles approches pour ces hommes infertiles qui ne peuvent pas être traités par la PMA. Il s’agit de réintroduire dans les cellules germinales productrices de spermatozoïdes, le message génétique capable de produire cette protéine manquante: soit de l’ADN du gène manquant ; soit de l’ARNm qui code pour la protéine manquante. Il ne s’agit pas de thérapie génique, car il n’y aura pas d’intégration dans le génome des cellules germinales, ce dernier ne sera donc pas modifié. Les molécules, ADN ou ARNm, seront injectées au niveau des testicules. Le message génétique ainsi introduit permettra ensuite aux cellules de produire la protéine manquante et de restaurer la fertilité.
Bénéfices attendus
Ce projet pré-clinique pourrait conduire à la mise au point d’une technique innovante de prise en charge de l’azoospermie non obstructive, une cause importante d’infertilité masculine.
Procédures
Les animaux sont répartis en deux procédures : -Les animaux de la première procédure PE1 (720) vont subir 3 chirurgies de 30 min sous anesthésie générale une au niveau des testicules, une laparotomie et 3 aspirations maximum au niveau des épididymes pour prélever des spermatozoïdes. Les chirurgies seront réalisées avec un intervalle de 7 jours minimum entre deux chirurgies. Ils subiront 20 séances d'imagerie sous anesthésie générale d'une durée de 10 min maximum et espacée de 7 jours sur une période de 120 jours. Seules les souris de la PE1 injectée avec ADN subiront en plus 20 injections de luciférines pour permettre l'imagerie in vivo par bioluminescences. . À la fin du cycle d’imagerie de chaque souris (120 jours), les souris seront euthanasiées pour réaliser des coupes histologiques des testicules. - Les animaux de la deuxième procédure PE2 (4320) vont subir une chirurgie de 30 min sous anesthésie générale au niveau des testicules. Ensuite, les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale à 6 temps 1-2-7-15-21-35 jours post injection afin de prélever les spermatozoïdes et les testicules. Dans cette deuxième procédure, aucun prélèvement ne sera réalisé sur animaux vivants.
Impact sur les animaux
L'anesthésie des animaux demandera leur préhension. Suite à la chirurgie, les males pourront perdre du poids et avoir une mobilité réduite sur quelques jours seulement. Les animaux transportés entre les deux animaleries pour réaliser les séances d'imagerie pourraient avoir un stress engendré par le transport.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, les testicules seront prélevés pour réaliser des coupes histologiques. Ce qui nous permettra de vérifier la qualité de la restauration de l’infertilité.
Remplacement
L’étude des mécanismes de la spermatogenèse et de l’ovogenèse, ainsi que de l’infertilité nécessite l’utilisation des animaux car ces processus ne sont pas reproductibles in vitro, et il n’existe pas de système de culture cellulaire permettant d’obtenir des gamètes viables. La fécondation nécessite l’obtention de gamètes matures, qui ne peuvent être obtenus que sur des animaux. L’étude des phénotypes d’infertilité humaine nécessite des animaux présentant les mêmes défauts que ceux observés chez les patients. En conclusion, il nous est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. En effet, aucun modèle alternatif ne permet encore de reproduire en globalité la complexité de la gamétogenèse et les impacts sur la fertilité.
Réduction
Le nombre minimal d'animaux sera utilisé dans chaque procédure tout en garantissant une étude statistique correcte . La procédure d'imagerie in vivo va nous permettre de réduire le nombre d'animaux utilisé puisque les souris seront imagées à différents temps post-chirurgie sur une période de 4 mois. L'aspiration micro-chirurgicale de spermatozoïdes épididymaire et l'aspiration percutanée de spermatozoïdes épididymaires permettra de réduire le nombre d'animaux utilisés puisque chaque souris sera utilisée pour plusieurs mesures. Les deux testicules de chaque souris seront injectés, le testicule gauche sera injecté avec du PBS, il va servir de contrôle et le testicule droit sera injecté avec l’ADN ou de l'ARN. Cela va nous permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés. Les deux techniques de transfection sonoporation et électroporation évoquées en PE1 et PE2 seront effectuées en parallèle mais nous n’utiliserons pas la technique non efficace dans la P2.
Raffinement
Les douleurs associées à la chirurgie sont traitées avec des anti-douleurs et des anesthésiques. L'acte chirurgical sera réalisé sur des tapis chauffants et le réveil se fera dans une cage chauffée. La personne réalisant la chirurgie attendra le réveil de tous les animaux. Suite à l'opération, des croquettes mouillées seront disposées dans la litière. Pendant l'opération, les yeux seront recouverts d’une pommade pour les yeux (Vitamine A Dulcie). Les opérations seront réalisées le matin et le comportement des animaux sera suivi toutes les heures dans l’après-midi. L’état de santé des animaux opérés sera quotidiennement suivi aprés l'opération pendant 7 jours . En cas d'inflammation et/ou suppuration, la souris sera traitée avec un antibiotique non critique par voie intra-péritonéale pendant 5 jours. Le suivis de l’état de santé des animaux est réaliser dans le respect des 3R et se basent sur un arbre décisionnel en fonction des observations faites pour l’application des points limites gradés précis, et qu’en cas de dépassement des points limites les souris sont sortie de l’étude et sacrifiées (critères d’arrêt).
Choix des espèces
Grâce aux connaissances acquises ces dernières années sur la génétique de la souris et du fait de la conservation, entre l’homme et la souris, de la majorité des gènes impliqués dans la gamétogenèse et la fécondation, la souris représente actuellement le modèle de choix pour étudier les causes génétiques de l’infertilité. L'utilisation du modèle de souris est incontournable car il n'existe à l'heure actuelle aucune technique permettant la production de spermatozoïdes ou d’ovocytes in vitro. Dix modèles de souris transgéniques seront utilisés pour les besoins de cette étude. Toutes les lignées de souris utilisées constituent des modèles d’inactivation génique ou de transgenèse additive qui ne concerneront que des gènes impliqués dans la fonction de reproduction. Lors de leur entrées dans les procédures les souris males utilisées seront matures, âgées minium de 6 semaines,car la spermatogenése n'est pas fonctionnelle avant 6 semaines
DMPK : Evaluation chez le rongeur, de la biodistribution de composés chimiques ou biologiques
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Rats : 500
2 000 souris et 500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tués pour prélever organes et sang, 250 pouvant être gardés vivants et réutilisés. Les composés sont administrés par de nombreuses voies, dont intracérébrale, intravésicale et intrapéritonéale, avec mises à jeun jusqu'à 16 heures et une phase in vivo pouvant durer douze mois. Le porteur présente ce travail comme une étape de biodistribution préalable à des études d'efficacité, dans un contexte de cancer colorectal. Sur le remplacement, il affirme que les tests in vitro ne suffisent pas à prédire la biodistribution réelle et qu'il faut la vérifier chez le rongeur.
Objectifs
Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Parmi les cancers, le cancer colorectal est le deuxième plus mortels (plus de 900 000 décès en 2020 pour environ 1,93 million nouveaux cas). Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer coliques déjà mis en place dans notre établissement ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la pathologie cancéreuse humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter ces tumeurs viscérales coliques chez l’homme. Pour cela, nous étudierons ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte pathologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer la pharmacocinétique in vivo de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, sur une période allant de 1 jour à 12 mois. Cette évaluation est critique afin de pouvoir ensuite réaliser des études d’efficacité.
Procédures
Des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure; intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie; orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon). Des administrations intravésicales (par cathéterisation de l’urètre) pourront être réalisées (anesthésie générale de moins d’une heure) après privation d’eau sur maximum 4h et vidange de la vessie par pression légère sur le ventre. Il sera aussi possible de réaliser des administrations intracérébrales. Ce geste sera réalisé lors d’une anesthésie de moins d’une heure avec analgésie. Pour les administrations orales où l’alimentation pourrait biaiser la pharmacocinétique, les animaux pourront être mis à jeun au maximum 16h. Ils seront pesés et éventuellement réhydratés après le jeûne. Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. La phase in vivo pourra durer jusqu’à 12 mois. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés afin de suivre la biodistribution et l’élimination des produits administrés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement En fin de projet, la plupart des animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie. Dans le cas particulier d’animaux ayant subi une administration unique de produit et ayant été gardés en procédure au maximum une semaine, ils pourront être gardés en vie sur avis du vétérinaire.
Impact sur les animaux
Dans ce modèle, nous attendons n’attendons pas d’effets indésirables particuliers chez les animaux. Dans le cas de phénotypes dommageables, celui-ci n’affectera pas le bien-être animal, bien que les animaux pourraient boire plus d’eau et/ou être obèses. Il ne peut toutefois pas être exclu que les composés administrés causent de la toxicité, ce qui sera surveillée.
Devenir
Dans une grande partie des cas, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer la cinétique et la biodistribution des composés testés. Les animaux ayant reçu une administration unique de composé et étant restés en procédure moins d’une semaine pourront être gardés en vie pour réutilisation.
Remplacement
Les molécules chimiques ou biologiques dont la pharmacocinétique sera évaluée dans ce projet auront été si possible sélectionnées au préalable dans des tests in vitro (tests sur hépatocytes, microsomes, etc.) afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules. La pharmacocinétique réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal.
Réduction
Le nombre d’animaux par lot a été déterminé sur la base des expériences passées dans notre centre, pour choisir le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus, ex. collecte de peau à plusieurs points de temps), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Dans le cas de criblage de nouvelles molécules, au maximum 5 animaux par groupes seront inclus. Le nombre sera adapté en fonction de la variabilité attendue de la pharmacocinétique du composé. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux.
Raffinement
Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : • A partir de 10% de perte du poids, les animaux seront pesés quotidiennement et une de l’alimentation et de l’eau gélifiées seront mises à disposition dans les cages. • Entre 10 et 15% du poids : les animaux seront réhydratés avec du Ringer Lactate, 0.5mL, une fois par jour. Une perte de poids de plus de 15% ou se maintenant plus de 3 jours au-delà de 10% constituera un point limite. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, un arbre décisionnel validé par la SBEA et le comité d’éthique (document de référence) sera utilisé pour décider de l’arrêt du traitement, de traitements de support et/ou de l’euthanasie de l’animal. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal sont listés en détail dans les procédures. Les administrations intracérébrales, intrathécales ou intravésicales seront réalisées sous anesthésie générale avec analgésie pré-, per- et post-opératoire (analgésique opioïde et alpha2 agoniste au préalable). Les administrations intramusculaire et intradermique seront réalisées après administration d’un analgésique (analgésique opioïde et alpha2 agoniste).
Choix des espèces
Si le profil pharmacocinétique in vitro est adéquat dans cette espèce, la souris sera privilégiée pour évaluer la pharmacocinétique des nouveaux composés in vivo, car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation de molécules chimiques ou biologiques. Les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.
preuve de concept thérapeutique dans les maladies glomérulaires prolifératives et liées à l’hypertension artérielle chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées d'un anticorps, des injections rétro-orbitaires sous anesthésie, subissent pour certaines une néphrectomie ou la pose de pastilles induisant une hypertension, et passent en cage métabolique, avant d'être tuées pour analyser les reins. Le porteur décrit une douleur minime aux injections intrapéritonéales et les conséquences physiologiques de l'insuffisance rénale et de l'hypertension induites. Il affirme que les analyses in vitro et in silico ne conviennent pas à l'étude des maladies glomérulaires, testée ici avant un éventuel usage chez l'humain.
Objectifs
Les glomérulopathies sont un groupe de maladies touchant le glomérule. Le glomérule fait partie du rein et est à la base de la filtration du sang et de la production de l'urine. Les glomérulopathies conduisent donc rapidement à l'insuffisance rénale. Un type de cellule du glomérule, les cellules épithéliales pariétales (CEP), joue un rôle majeur dans ces glomérulopathies. En effet, l'activation des CEP est à l'origine des lésions du glomérule qu'on retrouve dans les glomérulopathies. Nous avons à disposition un anticorps bloquant l’activation de ces CEP. Nous voulons tester cet anticorps dans des modèles murins de glomérulopathies afin d’évaluer sa capacité à prévenir l’apparition de l’insuffisance rénale avant une éventuelle utilisation comme médicament chez l'humain.
Bénéfices attendus
Ce projet pourra mettre en évidence l'efficacité d'un nouveau traitement dans deux types de glomérulopathies qui sont deux causes majeures d'insuffisance rénale terminale. Il permettra également de mieux appréhender les mécanismes physiopathologiques de ces glomérulopathies et notamment le rôle des CEP dans celles-ci.
Procédures
104 souris de la procédure "efficacité de l'anticorps anti-claudin 1 humaine dans un modèle de glomérulonéphrite proliférative extra-capillaire, le modèle NTS" subiront une injection de l'anticorps d'interêt ou de son contrôle en intra périntonéale deux fois par semaine pendant 2 ou 3 semaines en fonction de la procédure, ces injections seront effectués sur animaux vigiles. Ces injections intra péritonéales durent une minute. Ces 104 mêmes souris subiront trois injections en rétro-orbitaire de NTS 3 jours de suite aprés anésthésie à l'isoflurane, cette injection dure 30 secondes. Ces souris seront également mises en cages metaboliques une fois par semaine pour une durée maximale de 14 heures et enfin subiront un prélévement de sang en intracardiaque sous anésthesie générale gazeuse à l'isoflurane et sédation à la buprénorphine, qui dure 2 minutes. Ces 104 souris de la P1 subiront une mise à mort par dislocation cervicale après anesthésie à l'isofurane. Pour ces 104 souris, cela fait au total 5 différents types d'intervention. 58 souris de la procédure "efficacité de l'anticorps anti claudin 1 humaine dans un modèle d'HSF, le modèle DOCA salt" subiront une uni-néphrectomie et la mise en place de pellet doca salt sous anesthésie générale gazeuse à l'isoflurane et sédation à la buprénorphine, cette intervention dure 25 minutes. Ces 58 souris subiront une injection de l'anticorps anticlaudin 1 humaine ou de son isotype en intra périntonéale deux fois par semaine pendant 58 jours, ces injections seront effectués sur animaux vigiles. Ces injections intra péritonéales durent une minute. Ces mêmes 58 souris seront mises en cages metaboliques une fois par semaine pour une durée maximale de 14 heures pendant 6 semaines et subiront un prélévement de sang en intracardiaque sous anésthesie générale gazeuse à l'isoflurane et sédation à la buprénorphine. Ce prélèvement dure deux minutes. Enfin, ces 58 souris subiront une mise à mort par dislocation cervicale après anesthésie à l'isofurane. Pour ces 58 souris, cela fait au total 5 différents types d'intervention.
Impact sur les animaux
Les souris subiront le stress d'être isolées pendant le passage en cage métabolique. Elles subiront une douleur minine lors des injections intra péritonéales. Lors des procédures plus invasives comme les injections rétro orbitaires, la néphrectomie ou la mise en place des pellets DOCA, elles seront anesthésiées à l'isoflurane et analgésiées. Enfin, elles subiront les conséquences physiologiques de l'insuffisance rénale et de l'hypertension artérielle induites par les modèles expérimentaux
Devenir
Etant donné que les reins de ses animaux seront analysés, les animaux de ce projet seront mis à mort.
Remplacement
le modèle animal permet de réaliser des expériences de physiopathologie rénale en prenant en compte tous les paramètres physiologiques qui existent in vivo. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas relevantes en ce qui concerne l'étude des maladies glomérulaires car il existe beaucoup de paramètres physiologiques qui entrent en jeu. Des tests in vitro ont été réalisés afin de sélectionner les clones d'anticorps, ces tests ont permis de mettre en évidence leur spécificité et leur efficacité d'anticorps bloquant.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d'animaux requis afin de permettre une analyse statistiquement pertinente des résultats en prenant compte de la variabilité inter et intra expérience. Le calcul des effectifs nécessaires a été fait avec un risque alpha de 5%, une puissance de 95%, une moyenne du groupe contrôle de 12, une moyenne pertinamment différente attendue de 8 dans le groupe traité, une déviation standard de 4 et un ajustement de 10%; ce qui donnait 26 animaux par groupe requis. 3 animaux de plus sont prévus pour pallier les risques du modèle expérimental (mortalité liée à la chirurgie odans le modèle DOCA salt).
Raffinement
Afin de réduire l'angoisse et la souffrance des animaux des mesures seront prises: 1)Une surveillance des animaux, quotidienne par les zootechniciens et bi-hebdomadaire par l'expérimentateur, sera réalisée. Une grille de score d'évaluation de la douleur a été établie permettant d'évaluer la souffrance des animaux et de déterminer des points limites. 2) La procédure terminale sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse + buprénorphine . 3)Les procédures invasives tel que les injections retro-orbitaires seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse et les souris recevront un traitement analgésiques qui sera renouvelé et poursuivie si les animaux présentent des signes de souffrance. 4)Les souris seront hébergées en groupe et l’enrichissement de leur environnement sera à base de coton déchiquetable, préservant ainsi une activité et un exercice naturel. 5) une double litière sera mise en place pour pallier à la production excessive d'urine par les souris du modèle DOCA salt, et les cages seront changées 3 fois par semaine.
Choix des espèces
Les mécanismes des maladies du rein sont similaires chez l'homme et la souris et ce sont dans les maladies du rein qu'il existe un interet à bloquer l'activation des cellules appelées CEP et donc à utiliser l'anticorps anti claudin 1. Les souris utilisées seront des souris adultes âgées de 2 à 6 mois car il faut des adultes au système immunitaire mature (>2 mois) et suffisamment jeunes pour ne pas observer des maladies du rein liées au vieillissement.
Evaluation de la rémanence d’un produit injecté en intra articulaire chez le lapin EU 2/2
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
68 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, sans être tués à l'issue, le porteur prévoyant de les faire adopter faute de prélèvement terminal. Chaque animal reçoit une injection dans les deux genoux puis jusqu'à dix anesthésies successives pour des séances d'IRM, les deux genoux servant à tester deux produits par lapin. Le porteur indique n'attendre aucun effet indésirable de l'injection et rattache les nuisances à la répétition des anesthésies. Il affirme qu'aucune méthode ne modélise le comportement d'un produit injecté dans un "organisme entier vivant" et décrit un projet de développement de produits contre l'arthrose.
Objectifs
Ce projet de recherche et de développement a pour objectif d’évaluer au cours du temps la rémanence d’un produit administré au niveau de la région synoviale articulaire du genou chez le lapin par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM). La rémanence se définit par un maintien dans le temps des effets d’une action ou d’un phénomène. Dans le cadre de notre projet, l’objectif est d’évaluer le maintien dans le temps de produits à action prolongée injectés en intra articulaire dans le traitement de l’arthrose et cela grâce à une quantification du volume de produit présent dans l’articulation à des temps définis. D’après l’organisation mondiale de la santé, l’arthrose est l’une des dix maladies les plus invalidantes dans les pays développés. A l’échelle mondiale, environ 10% des hommes et environ 20% des femmes âgés de 60 ans en souffrent. Dans les prochaines décennies, le vieillissement de la population, couplé à des facteurs de risques tels que l’obésité, laisse suggérer que le nombre de personnes atteintes d’arthrose va continuer d’augmenter. Cette pathologie, d'étiologie plurifactorielle, est caractérisée par la présence de lésions du cartilage associée à des anomalies pathologiques diverses au niveau des articulations. Il n'existe pas, à l'heure actuelle, de traitement médicamenteux permettant de régénérer le cartilage, les produits sur le marché ne permettant que de soulager et retarder l’avancée de la maladie avant une éventuelle chirurgie (prothèse). Ainsi, l’étude de produit innovant, notamment à base d’Acide Hyaluronique (HA), permettant notamment de restaurer les propriétés viscoélastiques du liquide synovial, la capacité d’absorption des chocs et de lubrification de la région synovial est donc un enjeu majeur. Le devenir des animaux dépendra des procédures réalisées durant l’étude. Les animaux qui n’auront subi aucuns prélèvements terminaux (prélèvements d’organes ou prélèvements de sang trop important pour le rétablissement des animaux), dont le certificat sanitaire le permet et sous réverse d’une autorisation par les autorités réglementaires, pourront être placés chez des adoptants qui leur fourniront une retraite dans le respect du bien-être animal.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera au développement et à la mise sur le marché de nouveaux produits contre l’arthrose, avec notamment une meilleure rémanence des produits.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés (induction en fixe puis relais en volatile) et intubés pour les injections intra articulaire (sous condition stérile) puis pour chaque session d’imagerie selon la durée totale de l’étude et le nombre de délai d’imagerie applicable. Un total de 10 interventions seront prévues au maximum (injection, puis 9 délais d'imagerie avec une première session 24h à 48h après, puis 7 jours de délai au minimum entre chaque session suivante d'imagerie).
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables sur les lapins seront essentiellement dus à la répétition des anesthésies réalisées premièrement par une injection intramusculaire puis l’animal sera maintenu sous anesthésie gazeuse par intubation. Cette procédure d’anesthésie sera régulière selon la durée totale de l’étude et le nombre d’IRM applicables, espacées de 24h minimum entre chaque temps par animal. Aucune nuisance ou effet indésirable de l’injection intra-articulaire n’est attendu étant donné que la tolérance du produit aura été testé au préalable et qu’il aura été démontré une bonne tolérance du/des produits injectés.
Devenir
Le devenir des animaux dépendra des procédures réalisées durant l’étude. Les animaux qui n’auront subi aucuns prélèvements terminaux (prélèvements d’organes ou prélèvements de sang trop important pour le rétablissement des animaux), dont le certificat sanitaire le permet et sous réverse d’une autorisation par les autorités réglementaires, pourront être placés chez des adoptants qui leur fourniront une retraite dans le respect du bien-être animal. Il est prévu à ce jour de faire adopter tous les animaux, aucun prélèvement terminaux n’étant prévus.
Remplacement
Afin de répondre aux objectifs de ce projet, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable le comportement de produits injectés dans un organisme entier vivant. Ce comportement dépend de très nombreux facteurs tels que la zone d’injection, les tissus environnants, l’activité de l’animal… Afin de répondre aux objectifs de ce projet, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable le comportement de produits injectés dans un organisme entier vivant. Ce comportement dépend de très nombreux facteurs tels que la zone d’injection, les tissus environnants, l’activité de l’animal… L'articulation du genou étant une zone très spécifique (mouvements, isolement du reste de l'organisme, ...), les méthodes in vitro ou in silico ne permettent pas à ce jour à mimer de manière fiable le comportement d'un produit injecté dans cette zone sur le long terme.
Réduction
Une étude pilote permettant de valider la bonne visualisation et la bonne quantification par imagerie des produits injectés à 24h et 48h post injection sera réalisée sur 4 animaux. Si le produit candidat n’est pas visible ni quantifiable à ces temps courts post injection, la/les étude(s) principale(s) ne seront pas réalisées. La tolérance du produit a déjà été testée préalablement in vitro/in vivo. Ainsi, les 2 genoux seront injectés. L’injection dans les 2 genoux de chaque lapin permet d’administrer 2 traitements différents par animal, ce qui permet d’optimiser l’utilisation des animaux et ainsi réduire leur nombre nécessaire pour atteindre des données scientifiques robustes (nombre de lapins réduits à son strict nécessaire pour avoir 8 genoux par groupe soit 12 lapins). Avec 8 genoux comparables par groupe, une approche statistique est prévue : si un test paramétrique peut être utilisé, un test t de Student sera utilisé pour comparer 2 groupes et une Anova avec test de Dunett sera utilisé pour comparer un groupe versus un groupe contrôle ou test de Newman-Keuls pour comparer des groupes entre eux 2 à 2. Si un test non paramétrique doit être utilisé, un test de Wilcoxon sera utilisé pour comparer 2 groupes et un test de Kruskall-Wallis sera utilisé pour comparer n groupes versus un groupe contrôle et un test de Friedman pour comparer n groupes entre eux 2 à 2.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 4 jours minimum sera respectée. Toutefois, une période d’acclimatation de 7 jours sera privilégiés dès que cela sera possible. Les animaux seront hébergés en groupe tout au long du projet avec des enrichissements appropriés à leur besoin (balles, abris, bois à ronger, …). L’injection du produit stérile par voie intra articulaire ainsi que tous les actes techniques nécessitant une contention importante seront réalisés sous anesthésie afin d’éviter tout stress aux animaux. Les sites d’injection seront suivis à minima pendant 8 jours après administration intra articulaire. Tout au long de l’étude, un suivi clinique quotidien sera réalisé. Le poids des animaux et un suivi clinique seront réalisés minimum 1 fois par semaine. Tout signe clinique d’appel sera remonté au vétérinaire, si l’animal présente des douleurs ou un inconfort, le vétérinaire pourra prescrire un antalgique. Enfin, tout examen clinique complet témoignant d’un état de santé considérablement dégradé de l’animal et sans possible rétablissement conduira à une euthanasie étique des animaux concernés. Le projet se déroulant sur deux établissements utilisateurs, des transports sont prévu entre les deux établissements. La température sera adaptée et suivie et les cages de transports seront suffisamment grandes pour assurer le bien-être des animaux pendant le trajet. De la nourriture et de l'eau pourront être mis à disposition à l'arrivée des animaux et une période de calme sera respectée à l'arrivée avant tout anesthésie afin de limiter au maximum le stress.
Choix des espèces
Le lapin est une espèce couramment utilisée comme modèle pour les pathologies de l’arthrose et du genou. En effet, l’anatomie du genou du lapin est proche de celle de l’homme et sa taille facilite les analyses histologiques et d'imagerie par rapport à des plus petites espèces. De plus, il s'agit d'un animal couramment employé en expérimentation animale, permettant ainsi d'une part de gérer plus facilement son bien-être au cours de l'étude et d'autre part de travailler sur des lots homogènes (âge et sexe fixés). Des lapins adultes de 11 semaines minimum seront utilisés dans ce projet pour avoir des articulations et des cartilages matures sur des animaux n’étant plus en forte période de croissance osseuse.