Autres troubles humains

2 400 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rats subissent l'ablation des cinq sixièmes de leurs reins en deux opérations chirurgicales, puis une exsanguination terminale, tandis que les souris reçoivent une injection de glycérol provoquant une destruction musculaire avant d'être décapitées sous sédation. Le porteur reconnaît une douleur modérée et continue liée à la chirurgie rénale. Il teste des molécules contre la maladie rénale chronique et présente les modèles in vivo comme "les plus adaptés et les plus prédictifs", écartant les cultures cellulaires limitées à un seul type de cellule.

Objectifs

La maladie rénale chronique est une détérioration lente et progressive de la capacité des reins à filtrer les déchets métaboliques du sang. Les causes majeures sont le diabète et l’hypertension artérielle. Les conséquences sont une acidification du sang, le développement d’une anémie, l’endommagement des nerfs, une détérioration du tissu osseux et un risque augmenté d’athérosclérose. De plus, une atteinte rénale aiguë peut devenir une maladie rénale chronique si la fonction rénale n’est pas rétablie après le traitement et dure plus de trois mois. Les traitements actuels visent à limiter les liquides, le sodium et le potassium dans l’alimentation ; la prise de médicaments destinés au traitement d’autres pathologies (telles que le diabète, l’hypertension artérielle, l’anémie et les déséquilibres électrolytiques) et, le cas échéant, à faire appel à la dialyse ou à une greffe de rein. Il existe un ensemble de données concordantes révélant que l’existence d’une atrophie continue et la diminution de la masse musculaire constituent des facteurs de risque indépendants de la mortalité chez les patients ayant une maladie rénale chronique. La lutte contre l’atrophie musculaire apparait donc comme une composante majeure pour améliorer le pronostic des patients ayant une altération de la fonction rénale. L’objet de ce projet est d’évaluer chez l’animal le potentiel de nouvelles molécules sur les fonctions musculaires et rénales, molécules dont on a démontré préalablement des effets bénéfiques sur le muscle squelettique in vitro. Deux modèles animaux ont été retenus ; le premier est un modèle aigu comparable à la rhabdomyolyse chez l’homme et le deuxième un modèle chronique avec une forte altération métabolique. • Quel est l’impact du muscle squelettique sur le bon fonctionnement du rein ? • Des molécules actives sur la fonction musculaire peuvent-elles préserver la fonction rénale ? • L’ensemble des données collectées permettront-elles de développer une nouvelle stratégie thérapeutique dans les maladies rénales afin de retarder et/ou diminuer le nombre de personnes dialysées ?

Bénéfices attendus

- Amélioration de la fonction musculaire - Amélioration de la fonction rénale - Retardement du moment de dialyse - Amélioration de la fonction d’autres organes. Pour l’homme, les molécules actives permettraient d’envisager une nouvelle stratégie thérapeutique pour les maladies rénales. La protection du muscle et du rein permettrait d’envisager un retardement du moment de la dialyse et de meilleures conditions de vie.

Procédures

Sur rats néphrectomisés, la procédure chirurgicale consiste à réaliser une résection au 5/6ème des 2 reins du rat. Elle est réalisée en 2 fois à une semaine d'intervalle; le rein droit est enlevé au cours de la 1ère opération, les 2/3 du rein gauche au cours de la 2nde opération. Chacune des opérations réalisées sous anesthésie a une durée moyenne par animal de 30 minutes. 2 prélèvements de sang de 500µl seront réalisés à l'extrémité caudale sur animaux vigiles (extrémité caudale après anesthésie locale) 2 semaines avant et 6 semaines après l'opération chirurgicale. Chaque prélèvement sanguin a une durée de 2 à 3 minutes. Une exsanguination terminale des rats et un prélèvement d'organes d'intérêt sont réalisés 10 à 12 semaines suivant l'opération après sédation à l'isoflurane 4%. Pour le modèle de souris présentant une atteinte rénale aigue, l'animal reçoit une injection (10 secondes) intramusculaire unique de glycérol sous anesthésie. 48 ou 72h après, chaque souris sera décapitée après sédation à l'isoflurane 4% pour permettre le recueil du sang terminal et des organes.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales entrainent une douleur modérée et continue. La chirurgie sous anesthésie générale et l'analgésie appropriée permettent d'atténuer cette douleur, la souffrance postopératoire et le trouble de l'état général. Aucune perte pondérale significative n'est attendue dans le modèle 5/6Nx ni aucun effet sur les paramètres comportementaux (activité motrice, anxiété, exploration, altération de la mémoire) malgré une forte variabilité et une fluctuation dans le temps de ces paramètres. Les différents travaux déjà réalisés sur ce modèle ne montre pas de lien entre l’aggravation des fonctions rénales et une baisse de l’activité motrice, de la cognition ou des émotions.

Devenir

Tous les rats ayant subi la procédure expérimentale de néphrectomie seront traités avec les molécules d'intérêt pendant 12 semaines minimum puis euthanasiés (prélèvement de sang + organes) Toutes les souris utilisée dans la procédure d'atteinte rénale aigue seront euthansiées au plus tard 72h après l'induction de la rhabdomyolyse (prélèvement de sang + organes)

Remplacement

Pour tester les molécules dans le cadre des pathologies rénales, les modèles vivo sont les plus adaptés et les plus prédictifs. En effet, le rein est un organe dont la structure tri-dimensionnelle est importante pour sa fonction de filtration et formé de plusieurs types cellulaires (podocytes, cellules mésangiales, cellules épithéliales). Les modèles in vitro sont restreints à l’observation d’un seul type cellulaire, sans prise en compte des interactions intercellulaires et environnementales caractéristiques d’un tissu dans son milieu d'origine. Il existe des organoïdes, cependant les structures obtenues ne sont pas organisées comme dans un rein et l’absence de l’uretère dans ces modèles empêche l’évaluation de l’ensemble des fonctions rénales. De plus, le but de ce projet est d’évaluer l’influence des muscles sur cette fonction rénale et les nouvelles thérapies envisagées sont de traiter le muscle. Ce but ne peut être atteint qu'en utilisant un modèle animal qui présente cette intégrité physique.

Réduction

Modèle de pathologie aigue (rhabdomyolyse) Une à deux études pilotes seront réalisées pour confirmer l’obtention du modèle avec un taux de réussite estimé proche de 100%. Il est donc envisagé d’injecter 10 souris par lot sur les 2 premières cohortes pour lesquelles les paramètres d’atteinte rénale et musculaire seront mesurés afin d’évaluer la robustesse du modèle obtenu (48 à 72h après induction) Les 2 lots de chacune de ces 2 premières cohortes seront des animaux contrôles injectés en intramusculaire avec du sérum physiologique (sham) et des animaux pathologiques injectés avec du glycérol 50%. Par la suite, si la mise au point est conforme aux attentes, les cohortes seront constituées de 5 à 6 lots de 10 souris pour permettre le test de 2 à 3 molécules. Il est prévu de réduire le nombre d’animaux induits à n=6 dans les lots sham et référence (quinacrine) en consolidant les données obtenues avec celles générées à l’occasion des études pilotes. Seules les molécules présentant une activité sur le modèle de rhabdomyolyse (pathologie rénale aiguë) seront évaluées sur un modèle de pathologie rénale chronique. Modèle de pathologie chronique (néphrectomie) Une à deux études pilotes seront réalisées afin de déterminer le nombre d’animaux nécessaires dans chaque lot test. L’induction de la pathologie rénale par néphrectomie pouvant présenter une légère variabilité, il est estimé nécessaire d’opérer 12 rats/lot pour obtenir 8 à 10 animaux présentant les signes cliniques de la maladie rénale chronique. A l’issue de la mise au point, les lots envisagés dans chaque cohorte d’étude d’un composé sont Contrôle Sham, Contrôle pathologique, référence (MnTBAP), molécules à tester. Chaque lot sera constitué de 8 à 10 animaux pour mettre en évidence des effets statistiques interprétables. Les molécules seront évaluées sur une période de 12 semaines et les cohortes seront constituées au minimum de 5 à 6 lots d’animaux pour permettre de tester 2 à 3 molécules. L’objectif est de réduire le recours à l’opération systématique d’animaux pour les lots sham, contrôle pathologique et référence. A l’issue des 2 premières études, il est prévu de ramener entre 6 et 8 le nombre d’animaux affectés au groupe sham et référence, les résultats sur ces 2 groupes seront consolidés avec les données obtenues lors des tests pilotes.

Raffinement

Pour le modèle de néphrectomie 5/6Nx, 48h avant l’opération, une analgésie pré-opératoire sera réalisée par voie orale L'anesthésie et l'analgésie pour l'opération chirurgicale seront obtenues avec l'association d'un sédatif, d'un analgésique et d'un anesthésique. Pendant l’opération, la température corporelle sera suivie et les animaux maintenus sous lampe chauffante. En fin de chirurgie, les rats recevront 2 fois/jour une dose d'antalgique pendant 3 jours. Les rats seront mis en boite individuelle jusqu'à cicatrisation complète. L'aliment dans la mangeoire sera également disposé dans la cage et un enrichissement type sizzle dry sera disposé avec la litière. La surveillance post opératoire sera quotidienne avec une grille de score associée à une feuille d'observation individuelle.

Choix des espèces

Les espèces choisies, souris pour l'atteinte rénale aigue (rhabdomyolyse), rat pour l'atteinte rénale chronique (néphrectomie) sont celles les plus couramment utilisées pour étudier ces pathologies et l'effet de nouvelles molécules permettant un traitement potentiel. Ces modèles permettent l’étude conjointe de l’atteinte musculaire et rénale. Les animaux sont des rats adultes (6-7 semaines) pour la néphrectomie et des souris adultes (7-8 semaines) pour le modèle de rhabdomyolyse. Pour ces 2 modèles, l'âge retenu permet d'inclure des animaux n'ayant pas une atteinte rénale spontanée et d'éviter une variabilité des paramètres biochimiques rénaux et plasmatiques liée à l'âge qui pourrait interférer avec l’effet attendu du traitement.

920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des injections intrapéritonéales répétées tous les quatre à sept jours pendant deux à sept mois, un séjour de 48 heures en cage métabolique, un prélèvement rétro-orbital, puis une mise à mort par dislocation cervicale pour prélever les organes. Le projet teste des doses croissantes d'une molécule contre la néphronophtise, une maladie rénale génétique. Le porteur indique avoir mené les premières recherches sur cellules mais affirme qu'aucun modèle cellulaire ne permet d'étudier un rein, et renvoie le bénéfice, éviter la greffe rénale, au long terme.

Objectifs

Récemment, une molecule a montré un potentiel thérapeutique après 2 mois de traitement dans un modèle murin qui reproduit en partie la néphronophtise humaine, avec l’observation de lesions rénales à partir de 3 mois. L’objectif de ce travail est d’évaluer dans ce modèle murin l’efficacité thérapeutique de doses croissantes de la molécule, administrée pendant une durée plus longue (de 1 à 5 mois de vie) pour prévenir l’apparition de lésions rénales, ou administrée à un stade plus tardif de la maladie (5 mois de vie) pour évaluer l’efficacité à guérir les lésions rénales apparues.

Bénéfices attendus

L’ensemble des résultats de ce projet devrait permettre de valider l’administration intrapéritonéale d’un composé thérapeutique, participant ainsi au développement d’un médicament qui permettra à terme d’éviter la greffe rénale aux patients souffrant de néphronophtise.

Procédures

Les 920 animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales uniques (durée : 5-10 secondes/injection), ou répétées tous les 4 ou 7 jours pendant 2, 4 ou 7 mois à l’aide de seringues très fines qui donnent une injection quasi indolore grâce à la forme biseautée de l’aiguille. Les 920 animaux seront également soumis à une mise en cage métabolique, dans le calme dans une pièce dédiée, pendant 48 h : 24h d’adaptation et 24h de recueil des urines. Pendant les 48h, les souris ont accès à l’eau et à la nourriture. A la fin du recueil, les souris sont regroupées dans leur cage d’origine dont la litière n’a pas été changée. Enfin, chacun des 920 animaux sera soumis à un prélèvement rétro-orbital sous anesthésie générale (durée : 30 secondes/prélèvement), une seule fois le jour de la mise à mort à l’aide de micro-capillaires héparinés. A la fin du prélèvement, les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale (durée : 2 secondes/dislocation).

Impact sur les animaux

L’administration répétée par injection intrapéritonéale comporte un risque d’irritation au point d’injection. Si cela est observé, les injections seront suspendues jusqu’à disparition de celle-ci et une solution apaisante sera appliquée. Par ailleurs, la mise en cages métaboliques des animaux pendant 48h peut générer un stress lié à l’isolement.

Devenir

A la fin de ce projet, les 920 animaux seront mis à mort afin de collecter les organes post-mortem pour analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Les recherches préliminaires ayant permis l’identification de la molécule thérapeutique qui fait l’objet de cette étude ont été menées sur des lignées de cellules afin de limiter le recours à l’expérimentation animale. Néanmoins, compte tenu de l’absence de modèle cellulaire permettant l’étude d’un rein, il n’a pas été possible du substituer des approches cellulaires aux modèles murins impliqués dans ce projet à visée thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum (entre 5 et 20 animaux par groupe de traitement) permettant d’atteindre des résultats statistiquement significatifs. Pour l’étude statistique, nous utiliserons un test approprié pour comparer les groupes d’animaux deux à deux.

Raffinement

Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie et deux fois par semaine par le responsable du projet afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne en charge du projet. Afin d'assurer aux animaux les meilleures conditions d'hébergement, nous ajouterons dans la cage du coton, des maisonnettes en carton ou des tunnels ainsi que des bâtonnets de bois à ronger. Les souris seront hébergées par 5 en cage ventilée. Afin de limiter la possibilité d’une souffrance due aux injections i.p. répétées, les injections seront réalisées avec des seringues Insuline très fines qui donnent une injection quasi indolore grâce au biseau à trois facettes. Si la zone d’injection présente une irritation, les injections seront suspendues jusqu’à disparition de celle-ci et une solution apaisante sera appliquée (Douxo Calm). Par ailleurs, la mise en cages métaboliques des animaux pendant 48h peut générer un stress lié à l’isolement. Afin de limiter ce stress, une période d’adaptation de 24h est réalisée. La mise en cage métabolique s’effectue dans le calme dans une pièce dédiée afin de diminuer au maximum le stress occasionné. Les souris ont accès à l’eau et à la nourriture. A la fin du recueil, les souris sont regroupées dans leur cage d’origine dont la litière n’a pas été changée. Avant la mise à mort, lors de la phase terminale, les animaux seront anesthésiés via une injection intrapéritonéale d’un mélange de Kétamine/Xylazine (0,1mL/10g souris) à la dose de 160mg/kg pour la Kétamine et 8mg/kg pour la Xylazine. Des points limites spécifiques ont été définis sur une grille de score de sévérité allant de 0 à 3. Les souris sans perte de poids ayant un score compris entre 2 et 3 recevront un analgésique (Ketoprofen 5mg/kg) et seront observées quotidiennement. Les souris avec un score ≥3 ou ayant une perte de poids de plus de 20% par rapport à leur poids initial, seront mises à mort par inhalation progressive de CO2 dans un système dédié. Les souris ayant une perte de poids comprise entre 10 et 20% par rapport à leur poids initial seront observées tous les jours et auront accès à un complément nutritionnel hydraté (DietGel). En cas d’échec de la complémentation ou du traitement par analgésique, les animaux seront mis à mort par inhalation progressive de CO2 dans un appareil dédié.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction et elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, la souris partage avec l’homme un nombre de néphrons fixés après la fin de la néphrogénèse contrairement aux poissons et aux batraciens. C’est également un modèle indispensable pour les essais pré-cliniques. Pour étudier l’efficacité du traitement à prévenir l’apparition de lésions rénales, le traitement sera initié à 1 mois de vie (avant le début de la maladie) et sera poursuivi jusqu’à 5 semaines de vie pour analyser un marqueur de réponse rapidement après le traitement ou jusqu’à 5 mois de vie, pour évaluer l’état des lésions rénales à l’âge de la phase exponentielle de la maladie. Pour évaluer l’efficacité du traitement à guérir les lésions rénales, le traitement sera initié à 5 mois de vie, après apparition des lésions rénales, et l’efficacité du traitement à guérir ces lésions sera évaluée entre 7 et 12 mois de vie.

2 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une administration unique d'un composé par voie orale ou intraveineuse, puis jusqu'à trois prélèvements sanguins, pour étudier le devenir de molécules dans l'organisme. Le projet relève de l'évaluation préclinique d'inhibiteurs de kinases, la sélection des meilleures molécules étant située à "plus long terme". Le porteur affirme que les tests in vitro "ne constituent pas des méthodes alternatives" et que le recours au modèle animal est "indispensable".

Objectifs

Le projet s'inscrit dans un contexte de développement de nouvelles molécules thérapeutiques ciblées de la classe des inhibiteurs de protéines kinases conçues par "fragment based drug design", dans le but de traiter des pathologies à fort besoin médical en santé humaine: maladies inflammatoires, pathologies affectant le système nerveux périphérique et central, et cancers. L’approche du « fragment-based drug design », ou conception de médicaments par la méthode des fragments, consiste à assembler des petites molécules, ou molécules fragments, dirigées contre une cible thérapeutique choisie, dans le cadre d’une pathologie particulière. Chacun des fragments va contribuer à la spécificité de la molécule complète pour sa cible biologique. Ce projet se situera dans la phase d’évaluation préclinique du médicament qui marque les premiers pas de son développement. Les études précliniques ont pour but de collecter des données d’ordre pharmacologique, pharmacocinétique et toxicologique, le tout sur des modèles de protéines recombinantes, de cellules mises en culture et au sein d’organismes animaux vivants. Les études sur les modèles de cellules en culture des composés à tester auront déjà été évaluées en amont de ce projet, qui quant à lui permettra d’obtenir des informations d’ordre pharmacocinétique. L’étude de la pharmacocinétique in vivo d’un nouveau composé permet d’affiner la compréhension et l’analyse du devenir du composé dans l’organisme afin de mieux caractériser son mode d’action et appréhender de potentiels effets indésirables. L'objectif du projet est d'étudier l'effet du système biologique d'un organisme entier sur le devenir d'un composé test au cours du temps suivant son administration.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer les propriétés pharmacocinétiques de nouvelles molécules thérapeutiques ciblées dans le but de déterminer leur capacité à atteindre leur cible in vivo. Cela permettra d’optimiser leur posologie (dose et fréquence d’administration) pour l’évaluation de leur toxicité d’une part et de leur activité biologique sur des modèles murins de pathologies humaines d’autre part. Ce projet s'inscrit dans un contexte de thérapie ciblée qui regroupe un ensemble de traitements qui s’intègrent dans une stratégie thérapeutique dite « de précision ». Ce terme est utilisé en oncologie pour caractériser les médicaments qui ciblent spécifiquement une protéine et/ou un mécanisme impliqués dans le développement tumoral, de manière à les bloquer. En théorie leur cible n’est censée être présente (ou surexprimée) que dans les cellules tumorales de certains patients, ces médicaments sont donc à priori sans effet sur les cellules saines, en opposition aux cytotoxiques qui agissent sur leur cible mais aussi sur de nombreuses autres cellules (d’où leurs effets indésirables). A plus long terme cette évaluation de nouveaux composés a donc pour but de sélectionner les meilleures molécules thérapeutiques, présentant peu ou pas d'effets indésirables dus au traitement, pour le traitement de maladies à forts besoins médicaux non satisfaits (maladies neurodégénératives, inflammatoires et cancer) et ainsi améliorer la prise en charge des patients.

Procédures

Les animaux se verront administrer un composé test une fois par voie orale (quelques secondes) ou intraveineuse (inférieur à 1 minute). Des prélèvements de sang seront réalisés à différents temps après le traitement n’excédant pas 3 prélèvements par animal (durée du prélèvement inférieure à 1 minute).

Impact sur les animaux

L'effet indésirable attendu suite à l'administration d'une nouvelle molécule et suite aux prélèvements sanguins répétés est une perte de poids. Les animaux se verront administrer le composé test une fois : par voie intraveineuse pour la moitié d’entre eux, et par voie orale pour l’autre moitié. Des prélèvements de faibles volumes de sang (microsampling) seront faits au niveau de la veine caudale ou de la veine mandibulaire, 3 fois maximum par animal, répartis sur une durée maximale de 48h.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés, ils ne peuvent pas être réutilisés car cela risquerait d’introduire un biais dû aux possibles interactions entre les composés testés.

Remplacement

Les molécules testées dans ce projet sont systématiquement préalablement évaluées in vitro pour leur paramètres physico-chimiques, leur activité biologique, leur selectivité pour la cible visée et leur toxicité. Ces tests permettent de sélectionner les meilleures molécules candidates d'une part, et d'autre part d'avoir une première approche de la pharmacocinétique des composés (absorption, métabolisme), mais ils ne peuvent fournir l'ensemble des éléments caractérisant le devenir du composé dans un organisme vivant. Ils ne constituent donc pas des méthodes alternatives ou substitutives à la complexité d’un organisme vivant. L'effet de l’administration du composé test in vivo résulte de l'interaction entre de nombreux mécanismes physiologiques qui ne peuvent être reproduits in vitro. Le recours à l’utilisation d’un modèle animal est donc indispensable.

Réduction

En se basant sur les données de la littérature et notre expérience, il est nécessaire d'avoir au minimum 3 prélèvements par temps pour obtenir des paramètres pharmacocinétiques fiables en tenant compte de la variabilité biologique. Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés nous utiliserons la technique du microsampling : des micro-prélèvements de sang seront réalisés sur un même animal à différents temps de prélèvements réduisant ainsi la variabilité des résultats et le nombre d'animaux nécessaires. Il n'est pas prévu de faire une étude statistique sur ce projet. Les effectifs seront limités à 9 animaux par groupe pour tenir compte de la variabilité biologique (3 animaux par temps de prélèvement) et du nombre de prélèvements répétés possibles (chaque animal sera utilisé pour 3 prélèvements maximum).

Raffinement

Afin de limiter le stress des animaux lors du projet et donc d'augmenter la fiabilité des résultats, une période d'acclimatation de 7 jours sera respectée avant le début de la procédure expérimentale. Durant cette période les animaux seront manipulés et habitués à la boite de contention qui sera utilisée pour réaliser les injections intraveineuses. Au cours de la phase expérimentale les animaux seront observés quotidiennement. Dans le cas de l’atteinte de l’un des points limites définis dans le projet l’animal sera euthanasié. Pour les prélèvements de sang, la technique de microsampling (rapide et entrainant une douleur légère liée à la piqure) sera utilisée.

Choix des espèces

Ce projet s'inscrit dans un contexte de développement d'inhibiteurs de kinases pour le traitement de pathologies dans différentes aires thérapeutiques : oncologie, maladies inflammatoires et pathologie du système nerveux. La majorité des modèles animaux développés pour ces pathologies sont des modèles de souris génétiquement modifiées, souris transgéniques pour les pathologies inflammatoires et système nerveux, souris immunodéficientes pour les modèles en oncologie. Afin de tester l'activité biologique in vivo des molécules développées il est donc nécessaire d'avoir recours à ces modèles murins. Dans ce projet il n'y aura pas d'induction de pathologie, cependant les résultats obtenus serviront pour la suite de l’évaluation préclinique du médicament (dose maximale tolérée et efficacité). Il est donc prévu d’utiliser des souris de même fond génétique que les souches nécessaires et choisies pour la cible thérapeutique considérée. De plus, la souris est un modèle tout à fait pertinent pour les études de pharmacocinétiques en raison de ses similitudes avec les humains dans les processus d'absorption, de métabolisme et d'élimination. Les animaux seront adultes, soit 8 à 10 semaines lors du début de l’étude, afin d’avoir un système immunitaire, hormonal et métabolique mature dans le but d’obtenir la réponse recherchée sans biais.

20 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie abdominale d'environ une heure pour l'implantation de deux prothèses, gardées en place deux, quatre ou treize semaines, avant une mise à mort permettant de prélever les implants et des organes. Le projet évalue un dispositif médical de réparation des hernies, en testant la résorption et la résistance mécanique des prothèses. Le porteur affirme que le modèle animal est "indispensable" car ces prélèvements ne sont pas réalisables chez l'humain.

Objectifs

Les hernies abdominales et les éventrations restent compliquées à réparer actuellement même pour les chirurgiens les plus expérimentés. La mise au point d’implants abdominaux destinés à améliorer la prise en charge et la réparation de ces plaies est ainsi primordial. L’objectif de cette étude est d’évaluer in vivo plusieurs paramètres suite à l’implantation d’un dispositif, dont le taux de résorption du dispositif et la résistance mécanique. L'objectif du projet est l’obtention des dispositifs médicaux d'essai après une durée d’implantation in vivo (2, 4 et 13 semaines respectivement). Ces échantillons sont nécessaires pour permettre, par des analyses ex-vivo ultérieures, une étude du taux de résorption du dispositif et une analyse de la résistance mécanique. Le critère de jugement principal est l’obtention des dispositifs (avec débors) après une période d’implantation de 2, 4 et 13 semaines chez le porc. Les autres objectifs seront : - D’évaluer les effets locaux induits par l'implantation du dispositif médical pendant 2 semaines, 4 semaines et 13 semaines, - La colonisation des tissus du dispositif médical à l’issue de 2 semaines, 4 semaines et 13 semaines d’implantation (examen visuel)

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont l’évaluation in vivo de la colonisation de la prothèse en fonction du temps. De plus, grâce aux échantillons prélevés à l’issue de l’étude, une analyse de la résistance de la prothèse en situation in vivo et l’évaluation microscopique de l’adhésion de la prothèse par examen histologique pourront être réalisés.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie abdominale pour l’implantation des deux prothèses d’essai d’une durée d’1 h environ, sous anesthésie générale. D’éventuels prélèvements sanguins pourront être effectués en cas de besoin pour compléter l’examen clinique vétérinaire, afin de vérifier les paramètres biologiques qui seront le témoin d’une éventuelle inflammation ou infection de prothèse par exemple. Un traitement analgésique pourra être administré en cas de besoin en fonction des suites opératoires et de l’examen clinique. La durée des actes de prélèvement et d’injection est limitée à quelques minutes.

Impact sur les animaux

Des nuisances au niveau de la cicatrice sont attendus avec des risques d’infection, d’ouverture de la cicatrice, gêne à la marche etc qui seront particulièrement surveillés.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour le prélèvement des deux prothèses de test et d’éventuels autres prélèvement d’organes, qui ne seraient pas compatibles avec leur réveil.

Remplacement

Toutes les analyses qui ont pu être réalisées in vitro ont été faites. Des données complémentaires sur la résistance nécessitent l’obtention de prélèvements de l’implant intégré et des prélèvements biologiques éventuels, ce qui n’est pas réalisable chez l’Homme. Le modèle animal est donc ici indispensable pour pouvoir effectuer ces tests dans des conditions les plus proches de chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d’animaux dans cette étude est limité au minimum nécessaire pour obtenir un nombre suffisant d’échantillons permettant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs, et ce, sur 3 temps d’étude optimaux pour les résultats escomptés. Deux prothèses seront implantées par animal, ce qui limite d’autant le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans une structure agréée pour l’expérimentation animale, dans des conditions maîtrisées (température, ventilation, éclairage). Ils sont suivis quotidiennement et biquotidiennement dans les premiers jours post-opération. Leur environnement est enrichi par la présence de ballons et d’autres objets permettant de maintenir des comportements normaux. Au cours des procédures, les animaux sont anesthésiés et l’anesthésie est suivie et ajustée par un personnel qualifié. Une analgésie post-opératoire sera mise en place au besoin. En post-opératoire et pour la suite de la manipulation, une grille de cotation évaluera différents paramètres pour identifier des signes de mal-être ou de souffrance de l’animal. L’examen clinique comprendra par ailleurs une surveillance de la tension abdominale, de l’état de la plaie (infection, tenue des sutures) et de la température de l’animal. Si ces signes venaient à apparaître, une analgésie post-opératoire serait mise en place avec un suivi renforcé, conformément à la grille de score et suite à l’examen clinique vétérinaire. Si cette gestion venait à être insuffisante ou inefficace, ou si une complication ne pouvait être gérée, la manipulation sera arrêtée, et l’animal serait mis à mort pour éviter toute douleur inutile.

Choix des espèces

Le modèle porc est le modèle utilisé car il est particulièrement adapté à l’implantation sur des durées longues. De par son anatomie proche de l’homme, le modèle porc se prête à l’implantation preperitonéale (rétromusculaire ou intrapéritonéale) de dispositifs de tailles suffisantes afin de permettre des observations histologiques et mécaniques. Enfin, le modèle porc est un modèle usuellement choisi sur ce type de dispositifs de renforts de paroi de sorte que les résultats obtenus permettront une comparaison des résultats. Les animaux utilisés sont des jeunes de 2 à 4 mois (25-30 kg) car la taille des animaux est compatible avec celle des prothèses implantées.

168 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie abdominale de trente à quarante-cinq minutes sous anesthésie générale pour implanter une prothèse de diaphragme, avec des risques de saignement, de difficultés respiratoires, d'infection et de douleur postopératoire. Les rats sont ensuite tués pour analyser l'intégration de la prothèse dans les tissus. Le porteur présente cette étape in vivo comme "indispensable" avant une application clinique et vise le développement puis la commercialisation d'une prothèse pédiatrique.

Objectifs

Dans le cadre d’un projet de recherche, nous développons une prothèse pariétale pédiatrique et plus précisement, un implant diaphragmatique pour répondre à la problématique des récurrences de hernie diaphragmatique congénitale à large défect. Cette pathologie rare et grave du nouveau-né impose une chirurgie dès les premières heures de vie avec mise en place d’une prothèse pour combler le défect dans les formes les plus graves. Aucune prothèse dédiée n’existe à l’heure d’aujourd’hui et la prothèse la plus couramment utilisée est une prothèse en polytetrafluoroéthylène expansé (e-PTFE) qui présente un taux de lâchage de 30 à 50% imposant une reprise chirurgicale et grévant la morbimortalité de cette pathologie déjà lourde. Nous avons pu démontrer les faiblesses de cette prothèse par des précédents travaux ce qui nous a permis de définir le cahier des charges d’une prothèses dédiée et de développer les premiers prototypes de prothèse pédiatrique diaphragmatique. Nos premiers travaux ont permis de caractériser les propriétés mécaniques de cette prothèse, supérieures à la prothèse référente dans cette indication avec une meilleure étirabilité sans rupture. Les tests biologiques in vitro ont permis de prouver sa biocompatibilité, l’absence de toxicité cellulaire et de carcatère proinflammatoire, la qualité de la colonisation cellulaire à sa surface. Ainsi nous avons pu valider in vitro la pertinence de nos travaux et valider nos prototypes d’implant. Nous avons ainsi une réelle ambition d’innovation en biomatériaux. Après avoir validé les étapes in vitro de notre plan de développement, une analyse in vivo sur petit animal est indispensable pour poursuivre nos travaux vers une application clinique.

Bénéfices attendus

Actuellement, de toutes les prothèses existantes sur le marché, aucune n’est dédiée au diaphragme de l’enfant et les propriétés mécaniques et de biocompatibilité des prothèses les plus utilisées ne semblent pas idéales dans cette indication. Ainsi, nous développons des prothèses spécifiquement pensées pour cette indication mais plus globalement, dédié à l’enfant, organisme en croissance. Nos travaux ont débuté par une analyse des prothèses existantes et des échecs (récupération des explants), permettant de définir les caractéristiques de notre prothèse idéale en termes de propriétés mécaniques et biologiques. Nous avons développé différents prototypes pour lesquels nous testons systématiquement in vitro, les caractéristiques mécaniques et les caractéristiques biologiques, permettant peu à peu d’affiner les critéres de synthèse (type de matériau et prcess de synthèse). Une fois cette première phase validée, il est important de pouvoir tester nos prototypes sélectionnés in vivo in situ (implanté en diaphragmatique) avant d’envisager une application clinique. Si ces tests confirment les données in vitro, alors nous pouvons envisager de développer et commercialisé la première prothèse pariétale pédiatrique prenant en considération le phénomène de croissance de l’enfant mais aussi ses spécificités en termes de réponse biologique aux implants. A long terme, en implant diaphragmatique, nous pouvons espérer faire diminuer drastiquement le risque de récidive et donc de réintervention. Nous améliorerons la survie et la qualité de vie des patients atteinds de hernie diaphragmatique large porteur d’implant.

Procédures

Il s’agira de procédures chirurgicales sous anesthésie générale réalisées sur l’abdomen des individus, d’une durée de 30 à 45 minutes environ

Impact sur les animaux

En peropératoire : saignement, difficultés respiratoires, plaie d’organe En postopératoire : douleur postopératoire, infection du site opératoire, infection de paroi, désunion, perte d’appétit en lien avec la douleur ou un sepsis, ileus intestinal.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en fin de projet pour analyse histologique des explants et comprendre l’integraiton de notre biomatériau aux tissus hôtes.

Remplacement

Les phases expérimentales in vitro du projet ont été décrites et permettent de valider et sélectionner les prototypes les plus abouties des prothèses diaphragmatiques en terme de biocompatibilité, de qualité de colonisation biologique et de prorpiétés mécaniques permettant ainsi de réduire l’experimentation animale aux prototypes les plus aboutis in vitro. Avant un développement clinique de ces prothèses, il est primordial de pouvoir évaluer la réponse biologique in vivo des prothèses ainsi que leur comportement mécanique en implantation orthotopique. Plusieurs équipes ont travaillé sur les diaphragmes de rongeurs (rats) ce qui valide le choix de cette espèce pour nos travaux à cette phase du projet. En effet, parmis les éspèces possible : la souris ne permet pas la réalisation des procédures du fait de la petite taille du diaphragme et le choix d’animaux vertébrés plus gros ne semble pas non plus justifié et imposerait le sacrifice de trop d’animaux, avec des temps d’étude pour l’analyse de la croissance trop important.

Réduction

Nous avons choisi le nombre d’animaux minimal nécessaiez à l’obtention de résultats fiables et robustes La procédure permet d’évaluer la réponse biologique au terme du délai attendu de 15 jours de cicatrisation de 6 prototypes sélectionnés en prenant comme gold standard le e-PTFE faisant référence actuellement.

Raffinement

En préopératoire, les individus bénéficieront d’un temps d’adaptation en cage de deux au sein de l’animalerie selon les conditions habituelles d’hébergement. En postopératoire immédiat, les animaux sont placés en cage individuelle pour une surveillance de 48H. Au-delà, ils seront à nouveau 2 par cage jusqu’au sacrifice. Ils seront surveillés de façon biquotidienne les 2 premiers jours, une fois par jour ensuite. En cas d’apparition de signe de souffrance (score de bien être anormal), les actions de gestion de douleur et de confort seront associées et la surveillance accrue jusqu’à normalisation ou mise à mort en cas d’atteninte des points critiques. L’environnement des cages est enrichi à l’aide de carrés de cellulose et de frisure pour la construction des nids, de tunnels pour permettre aux animaux de se cacher et ainsi diminuer le niveau de stress. Une nourriture adaptée pour les rongeurs et l’eau de boisson sont données ad libitum.

Choix des espèces

Le choix des rats Wistar s’est fait sur plusieurs critères : - Animal de taille adaptée à une chirurgie du diaphragme, - Potentiel de croissance sur une période d’étude concevable, - Résistance et maniabilité de la race wistar, - Travaux faisant référence sur la même pathologie déjà réalisés sur cette souche.

50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infestées par gavage avec des œufs du parasite Echinococcus multilocularis, dont le développement d'une masse larvaire dans l'abdomen provoque une prise de poids progressive et des difficultés de locomotion, avant une prise de sang intracardiaque et une autopsie. Le porteur fixe un point limite de poids à 60 grammes et prévoit la mise à mort des souris présentant des troubles locomoteurs trop importants. Sur le remplacement, il se borne à affirmer qu'il n'existe pas de méthode in vitro pour suivre la dissémination du parasite.

Objectifs

Les échinococcoses sont responsables de zoonoses (infections ou maladies pouvant se transmettre directement ou indirectement entre les animaux et les humains) parasitaires dues à un ver plat (Cestode) qui peut infecter l'homme sous son stade larvaire. Deux formes sont décrites en France: l'échinococcose alvéolaire (EA) et l'échinococcose kystique (EK), causées par des espèces d’échinocoques différentes. Cette demande ne concerne que l'échinococcose alvéolaire. L'échinococcose alvéolaire (EA) touche principalement le foie chez les personnes infectées, après une incubation jusqu‘à 15 ans. Trente cinq nouveaux cas humains d'EA sont diagnostiqués en moyenne tous les ans en France. Chez l'homme la maladie est très invalidante et ce diagnostic, en général tardif, est suivi de l'instauration d'un traitement à vie ou d'une exerèse partielle du foie. Dans certains cas, des antigenes parasitaires sont retrouvés dans la circulation sanguine. L’agent causant cette maladie est Echinococcus multilocularis, qui comme tous les Taenidae, boucle son cycle de développement en passant par 2 hôtes : un rongeur (en général le campagnol terrestre) comme hôte intermédiaire qui héberge le stade larvaire et un carnivore (en général le renard) comme hôte définitif porteur du stade adulte (vers) dans ses intestins. L'homme se contamine par ingestion des œufs microscopiques du parasite disséminés dans l’environnement via les fèces des hôtes définitifs. Ce projet vise à infester des souris avec des œufs d’ Echinococcus multilocularis par voie orale. La forme larvaire du parasite obtenue suite aux infections expérimentales servira : => au suivi du développement de la forme larvaire suite a une infestation par la voie naturelle notamment en vue d’une détection précoce et facilitée pouvant attester de la survie du parasite => à suivre la cinétique d’apparition de marqueurs (antigènes et ADN libre circulant) et leurs localisations dans différents organes en complément du développement usuel de lésions hépatiques.

Bénéfices attendus

Ces données récoltées doivent permettre de 1/contribuer à une meilleure compréhension de la dissémination du parasite notamment des échinoccoses secondaires (dissémination depuis la lésion hépatique initiale), 2/compléter les informations sur la détection d’ADN libre circulant pouvant être un marqueur de la survie du parasite chez les patients sous traitement et 3/émettre des hypothèses sur la potentielle manipulation comportementale de l’hôte par le parasite

Procédures

Tous les animaux seront : 1/ anesthésiés à J0 pour gavage avec des oeufs d'échinocoques (durée totale= moins d'une minute). 2/ anesthésiés (le dernier jour de leur suivi) pour subir une prise de sang totale par voie intra-cardiaque, et une autopsie pour collecte d'organes (durée totale = environ 10/15 minutes)

Impact sur les animaux

L'infestation par le parasite entraine une prise de poids progressive des souris en raison du dévelopement de la masse parasitaire dans l’abdomen, qui à terme entraine des difficultés de mobilité/locomotion.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort pour autopsie puis collecte d'organes/sang.

Remplacement

Il n'existe actuellement pas de méthode alternative in vitro pour le suivi de la dissémination de marqueurs du parasite chez son hôte.

Réduction

Le projet utilisera 50 souris sur 2 ans. Cela se justifie par l’infestation par deux souches parasitaires différentes de 2 fois 5 lots de 5 souris qui seront euthanasiées à 15 jours, 1, 2, 3 et 6 mois post infestation afin de disposer d’une cinétique du developpement parasitaire . De par notre expérience, nous savons qu'environ 3 souris infectées sur 5 développent une forme larvaire au niveau du foie L’effectif a donc été estimé à 25 animaux/an/souche testée, soit 50 souris afin de pouvoir étudier la présence potentielle de marqueurs parasitaires.

Raffinement

Les prises de sang intracardiaques seront réalisées sous anesthésie gazeuse et injectable. Une analgésie sera pratiquée 1 heure avant l'anesthésie. Les souris seront surveillées tous les jours. Une pesée mensuelle permettra de suivre l'atteinte d'un point limite fixé à 60 grammes. Si toutefois, les souris montrent des signes de mal-être, des problèmes locomoteurs trop importants, alors les animaux seront mis à mort. L'observation d'une pathologie intercurrente qui ne peut être soignée (ou entraînant une douleur qui ne peut être contrôlée) entraîne la mise à mort compassionnelle de l'animal.

Choix des espèces

Les hôtes intermédiaires d'Echinococcus multilocularis sont les rongeurs sauvages et plus particulièrement le campagnol. Comme il n'existe pas de méthode alternative in-vitro pour suivre la diffusion de marqueurs dans l’organisme de l’hôte, il est nécessaire d'utiliser un modèle souris. Notre expérience a montré que le stade de développement des animaux n'avait pas d'influence sur la sensibilité au parasite et le developement de la forme larvaire. Les souris utilisées auront un poids compris entre 10 et 20 grammes.

264 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des antibiotiques par voie intraveineuse, intra-péritonéale ou par gavage, puis un prélèvement de liquide céphalo-rachidien après rasage et incision du crâne sous anesthésie, ainsi qu'un prélèvement de sang, pour étudier la diffusion cérébrale de nouvelles molécules. Sur une partie des souris, une inflammation est déclenchée par injection de LPS. Le porteur affirme que l'usage des animaux est "indispensable", les approches in vitro ne prenant selon lui pas en compte la pharmacocinétique, et fixe la mise à mort à une perte de poids de 20 %.

Objectifs

Les infections bactériennes du système nerveux central (SNC) sont des pathologies graves, avec un taux de mortalité élevé. Le traitement de ces infections repose sur un traitement antibiotique adapté. Cependant, en cas de résistance bactérienne, notamment chez les staphylocoques résistants à la méticilline (SRM), les options thérapeutiques peuvent être limitées. A l’heure actuelle, les molécules recommandées dans les infections du SNC à SRM sont la vancomycine et le linézolide (recommandations de la société américaine de maladie infectieuse 2017). Cependant ces antibiotiques peuvent poser le problème d’une tolérance médiocre (effets indésirables hématologique du linézolide, effets indésirables rénaux de la vancomycine) et de résistances acquises émergentes. La dalbavancine et l'oritavancine, le tédizolide, ou la délafloxacine sont des nouveaux antibiotiques, actifs sur les staphylocoques résistants à la méticilline, qui possèdent des propriétés pharmacocinétiques innovantes (longue demi-vie) ou des profils de tolérances favorables. Cependant, malgré leur potentiel intérêt dans les infections du SNC, il n’existe pas de donnée à l’heure actuelle sur leur diffusion dans le système nerveux central. L’inflammation, qui peut être présente en situation infectieuse a également une influence sur la diffusion au niveau cérébral, de part son impact sur la barrière hémato-encéphalique (BHE). Il est donc primordial d’étudier la diffusion de ces molécules en conditions saine et inflammatoire. Ainsi, l’objectif de notre travail est d’étudier la diffusion dans le système nerveux central (pharmacocinétique) de ces nouveaux antibiotiques dans un modèle in vivo (en conditions saine et inflammatoire), et d’explorer les différents facteurs pharmacologiques et moléculaires modulant cette diffusion.

Bénéfices attendus

La possibilité d’usage de ces molécules pour lutter contre les infections cérébrales par des germes résistants est un chalenge. Les données de diffusion de ces nouvelles molécules dans le système nerveux central pourront ouvrir les portes à un essai clinique de pharmacocinétique chez l’Homme, préalable nécessaire à l’utilisation en clinique de ces molécules dans le traitement des infections du système nerveux central.

Procédures

Nous administrerons des antibiotiques aux souris, par voie intra-veineuse (IV) en 10 à 15 secondes, intra-péritonéale (IP) en 10 à 15 secondes ou par voie orale en 5 secondes. Dans le cas d’administration IV, l’injection se fera par voie rétro-orbitale en 10 à 15 secondes. Dans le cas de l’administration par voie orale, l’administration sera réalisée par gavage intra-gastrique 1x/j en 5 secondes, soit par administration continue dans l’eau de boisson. Nous réaliserons des prélèvements de sang (200µl) et de Liquide Céphalo-Rachidien (LCR) (5µl) sur ces animaux. Un seul prélèvement de chaque liquide biologique sera réalisé par animal. Dans l'ordre et après anesthésies de l'animal, le LCR puis le sang seront prélevés. Pour prélever le LCR, le crâne de l'animal, placé sur un tapis chauffant (37°C), est rasé et la peau incisée sur 1cm après injection sur le site de prélèvement en SC de lidocaine 10 min avant l'intervention. Le prélèvement lui-même prend environ 5 min. Puis, le sang sera prélevé dans la veine caudale de l'animal. Pour se faire, l'animal aura au préalable reçu une injection de buprénorphine 30min avant l'acte et ce afin de diminuer la douleur liée à ce prélèvement. L'inflammation systémique est induite par l'administration de LPS (lipopolysaccharide) par voie IP en 10 à 15 secondes. L’administration des antibiotiques aura lieu 2 heures après l’administration de LPS.

Impact sur les animaux

Douleur légère lors de l’injection intraveineuse d’antibiotiques sans effet secondaire. Douleurs légères à modérées suivant l’administration intra-péritonéale de LPS.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront sacrifiés, afin de pouvoir réaliser l’étude histologique et pharmacocinétique au sein des tissus cibles (parenchyme cérébral).

Remplacement

L'utilisation des animaux est indispensable en raison de la complexité des différents acteurs cellulaires et moléculaires qui sont impliqués dans la diffusion du médicament. L'approche in vitro qui permet l'analyse de paramètres définis ne peut pas remplacer l'utilisation des animaux car elle ne prend pas en compte les problèmes de pharmacocinétique du médicament ou des effets physiopathologiques (inflammation). Pour cette étude seront utilisés des souris (Espèce Mus Musculus A1). La souris est le plus petit mammifère utilisable en recherche expérimentale. Son élevage aisé en animalerie permet des conditions environnementales contrôlées. La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertèbres. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez proche de celle de l'Homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine. Des souris C57Bl/6J femelles seront utilisées au stade adulte (8 semaines).

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum. Le nombre de souris (n = 24) par groupe de traitement a été calculé pour avoir un nombre de points pharmacocinétiques minimum (8 points) permettant de réaliser une courbe des concentrations du traitement testé en fonction du temps, dans le plasma et dans le LCR (liquide céphalo-rachidien). Afin d'obtenir un résultat statistique cohérent, un minimum de 3 animaux par point pharmacocinétique est nécessaire (triplicata de chaque point pharmacocinétique). Les analyses statistiques des résultats sont réalisées avec des tests non paramétriques. Le nombre de 264 souris nécessaires au total (10 groupes de traitement + 10% de souris supplémentaires en cas de mortalité) a été calculé au plus juste afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux.

Raffinement

Les prélèvements du LCR (5µl) et sanguin (200µl) se font sous anesthésie par un mélange d'air et d'isofluorane (3% induction et 1,5% maintien). Dans l'ordre et après anesthésies de l'animal : le LCR, puis le sang seront prélevés après injection d'un antalgique général type buprénorphine (SC 0.05 mg/kg) 30 min avant le prélèvement sanguin à la veine caudale et d'une anesthésie locale (SC) type lidocaïne (3mg/kg) 10min avant prélèvement du LCR. L'inflammation systémique est induite par l'administration de LPS (lipopolysaccharide), et les souris seront analgésiées par administration de buprénorpine par voie SC (0,1mg/kg) 30 minutes avant l’injection de LPS. La douleur de l’animal sera suivie toutes les heures suivant l’administration du LPS. Réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse : les animaux sont hébergés à raison de 5 souris par cage de type 2L)). Ils seront expérimentés par du personnel formé et qualifié. Ils seront surveillés quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques et auront en permanence accès à l'eau et à la nourriture. Chaque cage est pourvue d’un enrichissement du milieu (nids de « woodwoll »). Durant les périodes d'expérimentation, ils seront anesthésiés sous l'isoflurane. Des points limites précis de douleur ressentie par les animaux (cf partie suivante) sont définis et les animaux seront euthanasiés si on ne peut soulager leur douleur. L'estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Le score limite est de 12. Au-delà l’animal sera euthanasié sans attendre. SURVEILLANCES REALISEES: Une surveillance quotidienne du poids des animaux sera effectuée. L’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Les critères prépondérant sont les suivants selon les critères de : - Perte de poids des animaux par rapport au poids initial>20%

Choix des espèces

Pour cette étude seront utilisés des souris (Espèce Mus Musculus A1). La souris est le plus petit mammifère utilisable en recherche expérimentale. Son élevage aisé en animalerie permet des conditions environnementales contrôlées. La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertèbres. L'organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l'homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine. Des souris C57Bl/6J femelles seront utilisées au stade adulte (8 semaines). Souris C57Bl/6J utilisées au stade adulte (8 semaines). Le choix d’une souris adulte est nécessaires d’un point de vue pharmacocinétique et physiologique (comparabilité des résultats, système hépatique et rénale fonctionnels, quantité de LCR prélevable).

15 000 rongeurs, soit 7 000 souris, 7 000 rats, 800 hamsters dorés et 200 gerbilles, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des composés chimiques ou radiomarqués par de multiples voies, dont des chirurgies de pose de mini-pompe sous anesthésie, certains étant rendus diabétiques, obèses ou hypertendus, avant mise à mort pour prélever organes et sang. Le porteur décrit une plateforme d'évaluation pharmacologique en série plutôt qu'un projet ciblé, avec un bénéfice réduit à la mesure d'effets sur des biomarqueurs. Il indique que les tests in vitro sont "souvent insuffisants" et retient la souris comme l'espèce la plus décrite.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets pharmacologiques et la distribution in vivo de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, sur une période allant de 1 à 12 jours maximum. Le mécanisme d’action de la molécule évaluée, déterminé préalablement in vitro, conditionnera le choix de l’espèce rongeur (souris, rat, hamster, gerbille) et de la souche à utiliser pour suivre les marqueurs d’efficacité appropriés qu’ils soient circulants, urinaires, fécaux, ou tissulaires. Dans toute étude utilisant des animaux, il est possible de mesurer différents paramètres en utilisant diverses méthodes d’analyse (dosage de protéines ou lipides ou acides animés, expression génique, analyse histologique…). Toutefois, ces techniques d’analyse dites « froides », c’est-à-dire sans utilisation de radioélément, ne sont pas toujours suffisamment sensibles pour quantifier les effets pharmacologiques des composés testés, notamment lorsqu’il s’agit d’études courtes. Les deux premières procédures de ce projet permettent de révéler l’efficacité des composés testés in vivo, soit par administration d’une molécule froide qui activera une voie biologique précise dans l’organisme, soit par administration d’un traceur radioactif qui sera incorporé dans une voie de synthèse particulière. Ces deux méthodes permettront de sensibiliser l’organisme au mécanisme d’action ciblé par le composé testé, et de mieux appréhender la réponse pharmacologique de ce composé in vivo. La troisième procédure de ce projet couvre l’utilisation d’un composé chimique ou biologique test qui a été préalablement radiomarqué afin de suivre son devenir lors d’une administration in vivo et de vérifier qu’il va bien atteindre les organes cibles pour délivrer son efficacité pharmacologique. Ces études pourront nécessiter l’utilisation d’animaux présentant une pathologie dommageable telle que le diabète, l’obésité, l’hypertension, la néphropathie. Un programme de soins spécifiques sera mis en place avec une surveillance rapprochée de ces animaux afin de leur éviter toute souffrance.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer les effets pharmacologiques sur certains biomarqueurs d’intérêt de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, sur une période allant de 1 à 12 jours maximum.

Procédures

Afin d’évaluer la pharmacocinétique et l’effet sur des paramètres biologiques de potentiels traitements, des composés chimiques ou biologiques froids ou radiomarqués seront administrés aux animaux par voie : intranasale ou intratrachéale, sous anesthésie générale de maximum une heure, ou intramusculaire ou intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie, ou orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ), ou sous cutanée ou intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon), ou par minipompe osmotique (intraveineuse, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Pour évaluer l’efficacité des composés sur certains paramètres biologiques, il pourra être nécessaire d’administrer de petites molécules radiomarquées (glucose etc) par voie : intranasale ou intratrachéale, sous anesthésie générale de maximum une heure, ou intramusculaire ou intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie, ou orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ), ou sous cutanée ou intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon), ou par minipompe osmotique (intraveineuse, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Si l’alimentation peut biaiser la pharmacocinétique, les animaux pourront être mis à jeun au maximum 16h. Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. La phase in vivo pourra durer jusqu’à 12 jours. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés afin de suivre la biodistribution et l’élimination des produits administrés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure. Pour les prélèvements individuels d’urine ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement maximum une heure. En fin de projet, les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus, organes, et sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie forte, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie.

Impact sur les animaux

Afin de réaliser certains tests (par exemple les tests métaboliques), il pourra être nécessaire de mettre les animaux à jeun, au maximum 16 heures. Des pertes de poids liées aux composés administrés pourraient être observées.

Devenir

Après les deux procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés.

Remplacement

Les molécules chimiques ou biologiques dont l’efficacité sera évaluée dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Elles auront aussi si possible été sélectionnées in vivo chez le petit animal sur leurs propriétés pharmacocinétiques (vérification de la compatibilité avec une efficacité dans la maladie visée). L’ensemble de ces données est souvent insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez l’homme. Dans le cas de molécules dont la biodistribution serait évaluée, dans la mesure du possible, l’absence de toxicité et les paramètres mesurables in vivo d’ADME auront au préalable été évalués.

Réduction

Le nombre d’animaux par lot pour les études sera défini en fonction de la bibliographie existante sur le modèle animal et les paramètres d’intérêt à mesurer dans l’étude. Une revue bio-statistique a déjà été réalisée sur des données historiques de mesure de quelques paramètres lors d’études internes. Cette analyse nous permet de déterminer le nombre minimal d’animaux requis afin d’obtenir des résultats significatifs malgré les variations interindividuelles. Par exemple, lors d’une étude sur la tolérance orale au glucose (OGTT), il est nécessaire d’avoir 10 animaux par groupe pour obtenir une différence significative de 30% entre 2 groupes sur les AUC de glucose sanguin. Pour les dosages d’acides gras plasmatiques, un nombre minimal de 8 animaux par groupe est requis. Les analyses statistiques à réaliser sur les autres paramètres mesurés en cours d’étude seront effectuées au moyen du test ANOVA.

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2x/semaine / quotidiennement à partir de 10% de perte de poids. La cause de la perte de poids sera évaluée: déshydratation, accès à la nourriture, diarrhée, nausées... Si possible, un traitement pharmacologique symptomatique sera mis en place. Un gel nutritif et de l’eau gélifiée et de la nourriture seront placés au fond de la cage en cas de perte de poids constatée. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, un arbre décisionnel validé par le vétérinaire et la SBEA sera utilisé. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Les animaux présentant des signes de douleur ou de souffrance seront mis en suivi clinique. Ces animaux seront examinés tous les jours et recevront si nécessaire un traitement pharmacologique compatible ou non avec l’objectif de l’étude. Un vétérinaire est joignable tous les jours si besoin. Toute opération chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale en matinée afin d’assurer un meilleur suivi post-chirurgical (observation toutes les 2 heures durant les 6 heures post opératoires puis au moins 1 fois par jour), avec analgésie. En cours d’étude, plusieurs anesthésies seront pratiquées notamment en cas de prélèvements de sang ou d’injections de produits : Les administrations IV, IM, IP, SC, ID ou topiques cutanées ou oculaires de composés tests se feront si nécessaire sous anesthésie générale. Une administration de buprénorphine sera réalisée avant les administrations IM/ID. Afin de minimiser les risques d’infection lors d’injections intradermiques, une tonte de la peau avec désinfection sera réalisée avant injection. Les injections intradermiques se feront sous un volume de 50 µL par site d’injection afin de limiter la douleur. Les administrations IN ou IT de composés tests se feront sous anesthésie générale. L’implantation d’une mini pompe (IP, IV ou SC) ou la pose d’implants diffusant le produit en sous-cutané pourra être nécessaire lors d’une délivrance continue du composé test. La chirurgie d’implantation sera réalisée sous anesthésie générale et dans des conditions d’asepsie, avec une prise en charge analgésique. Le suivi de la cicatrisation sera enregistré, et les sutures désinfectées si nécessaire.

Choix des espèces

Si le profil pharmacocinétique est adéquat dans cette espèce, la souris sera privilégiée pour évaluer des nouveaux composés in vivo, car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation de molécules chimiques ou biologiques. La souris sera aussi préférée dans le cas d’une administration d’un composé ou d’un traceur radioactif, si le mécanisme d’action de la molécule le permet, pour des raisons pratiques de gestion de la radioactivité et de ses déchets. Pour certaines études pré-réglementaires comme l’étude de l’élimination d’un composé radiomarqué in vivo, le rat sera l’espèce préférée. Des hamsters et des gerbilles pourront être occasionnellement utilisés si besoin, en cas d’études préalables à la mise en place d’un modèle particulier bien décrit dans ces espèces (exemple : hamster pour une étude préalable à une étude d’infection au SARS-CoV2). Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.