Autres troubles humains

Une perte de poids de plus de 15 %, ou de plus de 10 % pendant plus de trois jours, constitue un point limite pour les 25 500 rongeurs de ce projet : 12 500 souris, 12 500 rats, 300 hamsters dorés et 200 gerbilles de Mongolie, utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les composés testés, froids ou radiomarqués, leur sont administrés par la bouche, le nez, la trachée, le muscle, la peau, l'abdomen, la veine porte, le cerveau ou la vessie, cette dernière voie après jusqu'à quatre heures de privation d'eau, ou par minipompe implantée par chirurgie. La phase in vivo peut durer jusqu'à 12 mois, avec des jeûnes jusqu'à 16 heures et un hébergement individuel sans enrichissement pour recueillir urines et fèces, afin de mesurer la distribution et l'élimination de composés que le résumé ne nomme pas. Le porteur déclare 10 220 rongeurs réutilisés, et réserve ce maintien en vie à ceux qui n'ont reçu qu'une administration unique de composé non radioactif et sont restés moins d'une semaine en procédure, les autres étant mis à mort pour prélever leurs organes et de grands volumes de sang.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo l’absorption, la distribution, la métabolisation et l’excrétion de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur. Les paramètres de distribution et d’excrétion des composés seront si possible déterminés préalablement in vitro, ce qui conditionnera le choix de l’espèce rongeur (souris, rat, hamster, gerbille) et de la souche à utiliser pour évaluer la biodistribution in vivo dans le sang, les urines, et les différents organes. Dans certains cas, il sera possible d’avoir recours à une forme radiomarquée des composés afin de faciliter leur dosage et l’identification de leur distribution. Ce projet permettra d’une part de révéler la pharmacocinétique des composés testés in vivo, par administration unique ou répétée (dans le respect des recommandations vétérinaires concernant les voies, volumes et fréquences) de la molécule froide. Une seconde partie du projet aura recours à la forme radiomarquée de la molécule. Dans certains cas, les administrations nécessiteront une pose chirurgicale d’implant (de diffusion prolongée sous cutanée, intraveineuse ou intrapéritonéale). Ces chirurgies seront réalisées stérilement, sous anesthésie avec analgésie couvrant toute la durée de la chirurgie et dans le respect des recommandations du comité d’éthique. Des prélèvements divers (sang, urines, fèces, liquide cérébro spinal etc., dans le respect des recommandations vétérinaires) pourront être effectués in vivo afin de doser le composé dans ces fluides, ou des paramètres métaboliques (insulinémie, glycémie) et des prélèvements d’organes pourront avoir lieu, exclusivement post mortem. Dans le cas de l’insulinémie et de la glycémie ou d’autres paramètres métaboliques, une injection de glucose en IP ou SC ou une administration PO pourront être réalisées au préalable des prélèvements sanguins.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer la pharmacocinétique in vivo de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, sur une période allant de 1 jour à 12 mois. Cette évaluation est critique afin de pouvoir ensuite réaliser des études d’efficacité.

Procédures

Des composés chimiques ou biologiques froids ou radiomarqués seront administrés aux animaux par voie: intranasale, intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure; intramusculaire, intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie; orale sur animaux vigiles (acte d’1min environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ 1h); injection intraportale ou minipompe (intraveineuse, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ 1h). Les implants pourront être retirés au plus tôt une semaine plus tard (chirurgie d’environ 15min, anesthésie d’environ 1h). Des administrations intravésicales (par cystocentèse ou cathéter) pourront être réalisées (anesthésie générale de moins d’1h) après privation d’eau sur maximum 4h et vidange de la vessie par pression légère sur le ventre. Il sera aussi possible de réaliser des administrations intracérébrales. Ce geste sera réalisé lors d’une anesthésie de moins d’une heure avec analgésie. Pour les administrations orales où l’alimentation pourrait biaiser la pharmacocinétique, les animaux pourront être mis à jeun au maximum 16h,Ils seront pesés et éventuellement réhydratés après le jeûne. Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. La phase in vivo pourra durer jusqu’à 12 mois dans le cas de composés froids et 2 mois pour les composés radiomarqués. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés afin de suivre la biodistribution et l’élimination des produits administrés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement En fin de projet, la plupart des animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie. Dans le cas particulier d’animaux ayant subi une administration unique de produit non radioactif et ayant été gardés en procédure au maximum une semaine, ils pourront être gardés en vis sur avis du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, nous attendons n’attendons pas d’effets indésirables particuliers chez les animaux. Dans le cas de phénotypes dommageables, celui-ci n’affectera pas le bien-être animal, bien que les animaux pourraient boire plus d’eau et/ou être obèses. Il ne peut toutefois pas être exclu que les composés administrés causent de la toxicité (diarrhée, perte de poids, douleur, signes neurologiques), ce qui sera surveillée. Une douleur transitoire modérée pourrait être générée par les chirurgies. Un stress de courte durée et une douleur légère sera générée par les administrations de produit. Les mises à jeun pourraient générer un stress léger et une déshydratation légère.

Devenir

Les animaux seront la plupart du temps mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés. Les animaux ayant reçu une administration unique de composé non radioactif et étant restés en procédure moins d’une semaine pourront être gardés en vie pour réutilisation.

Remplacement

Les molécules chimiques ou biologiques dont la pharmacocinétique sera évaluée dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro (tests sur hépatocytes, microsomes etc) afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules. La pharmacocinétique réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux par lot a été déterminé sur la base des expériences passées dans notre centre, pour choisir le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus, ex collecte de peau à plusieurs points de temps), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Dans le cas de screening de nouvelles molécules, au maximum 5 animaux par groupes seront inclus. Le nombre sera adapté en fonction de la variabilité attendue de la pharmacocinétique du composé. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux. Des analyses statistiques seront réalisées sur les paramètres mesurés.

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : • A partir de 10% de perte du poids, les animaux seront pesés quotidiennement et une de l’alimentation et de l’eau gélifiées seront mises à disposition dans les cages. • Entre 10 et 15% du poids : les animaux seront réhydratés avec du Ringer Lactate, 0.5mL, une fois par jour. Une perte de poids de plus de 15% ou se maintenant plus de 3 jours au-delà de 10% constituera un point limite. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, un arbre décisionnel validé par la SBEA et le comité d’éthique (document de référence) sera utilisé pour décider de l’arrêt du traitement, de traitements de support et/ou de l’euthanasie de l’animal. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal sont listés en détail dans les procédures. Les administrations intracérébrales, intrathécales, intravésicales, intraportales, les prélèvements de liquide cérébrospinal et les poses et retraits de mini-pompes osmotiques ou d’un implants seront réalisées sous anesthésie générale avec analgésie pré-, per- et post-opératoire (buprénorphine au moins 30 minutes avant). Pour les pompes et implants, les animaux seront hébergés individuellement et suivis quotidiennement le temps de la cicatrisation de la plaie suturée (en général 3-4 jours) et des soins locaux seront apportés si nécessaire. Les administrations IM et ID seront réalisées après administration d’un analgésique (buprénorphine).

Choix des espèces

Si le profil pharmacocinétique in vitro est adéquat dans cette espèce, la souris sera privilégiée pour évaluer la pharmacocinétique des nouveaux composés in vivo, car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation de molécules chimiques ou biologiques. La souris sera aussi préférée dans le cas d’une administration d’un composé ou d’un traceur radioactif, si le mécanisme d’action de la molécule le permet, pour des raisons pratiques de gestion de la radioactivité et de ses déchets. Pour certaines études pré-réglementaires comme l’étude de l’élimination d’un composé radiomarqué in vivo, le rat sera l’espèce préférée. Des hamsters et des gerbilles pourront être occasionnellement utilisés si besoin, en cas d’études préalables à la mise en place d’un modèle particulier bien décrit dans ces espèces (exemple : hamster pour une étude préalable à une étude d’infection au SARS-CoV2). Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.

321 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une irradiation cérébrale sous anesthésie et une administration intranasale, puis passent des tests de mémoire et de locomotion et des échodopplers répétés sur six mois, avant euthanasie pour prélever leurs structures cérébrales. L'objet est de tester des vésicules issues de cellules souches contre les troubles cognitifs qui suivent une radiothérapie du cerveau. Le porteur indique que les transports entre établissements peuvent stresser et amaigrir les animaux, et juge le modèle in vivo incontournable.

Objectifs

La radiothérapie dans le traitement des tumeurs cérébrales peut conduire à la mort de cellules non tumorales comme les cellules constituant les vaisseaux sanguins et les neurones. En effet, 50% à 90% des patients traités par radiothérapie pour des tumeurs du cerveau présentent dans les 6 mois après leur traitement des troubles neurologiques avec des troubles de l’attention, de la mémoire ou de la résolution de problèmes. De nouveaux traitements permettraient d’améliorer la qualité de vie des patients. Dans ce projet, nous allons évaluer l’efficacité thérapeutique des vésicules extracellulaires issues de cellules souches mésenchymateuses (CSM) pour limiter les impacts de la radiothérapie. Les CSM sont un type de cellules souches très utilisé en médecine dite régénérative. Elles ont la capacité de se renouveler pour créer des cellules spécialisées capable de réparer la fonction d’un organe. Elles sont prélevées chez une personne à partir de la moelle osseuse ou de la graisse corporelle. Elles sont mises en culture puis administrées à l’homme. Cependant, cette stratégie thérapeutique cellulaire a ses limites telles que la transplantation autologue (prélèvement et administration chez la même personne) des CSM. Cette technique limite le nombre de patients pris en charge en raison du temps nécessaire à la mise en culture des CMS. On note surtout une efficacité diminuée en fonction de l’âge et de facteurs de risques associés (hypertension, cholestérol). Les cellules peuvent être aussi inutilisables si elles ont été irradiées lors du traitement par radiothérapie. Des études ont démontré que l’effet thérapeutique des CSM serait majoritairement lié à des vésicules extracellulaires (VE) qu’elles sécrètent. Elles sont produites en grand nombre par les CSM suite à leur activation par des facteurs stimulants. Une production de VE in vitro permet de s’affranchir des limites liées à l’utilisation des CSM via le patient. Les VE sont stockées et conservées sous forme lyophilisée simplifiant leur administration. Les VE permettent de limiter la destruction des vaisseaux sanguins (qui est observée après exposition aux rayonnements ionisants) et pourraient donc limiter le développement des troubles cognitifs. Dans le cadre de ce projet, la mesure du flux sanguin cérébral sera réalisée de façon non invasive dans un autre établissement possédant expertise et équipement adaptés .

Bénéfices attendus

Les bénéfices que ce projet pourrait apporter sont multiples tels que : -une nouvelle thérapie non-invasive -une réduction des troubles cognitifs (troubles de l’attention, de la mémoire ou de la résolution de problèmes) -une amélioration de la qualité de vie des patients vis-à-vis des troubles cognitifs

Procédures

Aucune chirurgie. Prélèvement sanguin 1 fois sous anesthésie avant euthanasie, durée du prélèvement sanguin 15 secondes. Perfusion intracardiaque sous anesthésique, durée 15 minutes. Irradiation cérébrale sous anesthésie: 10 min.Administration intra-nasale sous anesthésie : environ 5 min par administration, 1 seule administration. Les animaux subiront plusieurs fois les interventions qui suivent à différents temps. Tests comportementaux 3 à 10 min (mémoire, locomotion) réalisés 4 fois sur une période de 6 mois): Analyse echodoppler 1 fois par mois sous anesthésie : 10 min.

Impact sur les animaux

Pour les irradiations, les animaux étant anesthésiés pour limiter les mouvements, il peut y avoir un effet des anesthésies répétées et les effets potentiels de l’anesthésie sur les variables physiologiques. Pour les administrations, même si les animaux sont légèrement anesthésiés, il est possible de noter un inconfort transitoire après l’administration. Pour les transports, il peut être noté un stress chez les animaux suite aux changements des conditions environnantes. Après irradiation, un animal peut développer des difficultés à se déplacer et/ou une apparence extérieure piloérection, dos rond ou amaigri Après injection nasale, les effets indésirables peuvent être un écoulement nasal important et/ou une tête penchée, difficultés à se déplacer, amaigrissement Le transport des animaux peut également conduire à du stress et de l’angoisse conduisant à un amaigrissement

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser les prélèvements des structures cérébrales.

Remplacement

Le nouveau développement de stratégie thérapeutique doit être validé sur des modèles précliniques (modèles animaux). En effet, lors des demandes d’Autorisation de mise sur le marché (AMM) ou des médicaments de thérapie innovante auprès de l’ANSM les études précliniques (modèle rongeurs, porcins ou primates) sont demandés. De plus, les modèles in vitro (culture isolée de cellules en boîte de pétri) ne permettent pas d’évaluer le réseau vasculaire ni les troubles cognitifs. Par conséquent l’utilisation d’un modèle murin est indispensable pour valider notre approche thérapeutique.

Réduction

Les modèles d’expérimentation animale présentent une certaine variabilité de réponse. De plus le retour d’expérience des médecins, chercheurs et biostatisticiens déterminent qu’un nombre de 12 ou 15 animaux dans chaque groupe expérimental est nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement robustes afin de valider notre nouvelle thérapie.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera réalisé par les personnes compétentes impliquées dans ce projet, afin d’appliquer les points limites pour réduire la souffrance des animaux. De plus, lors de leur transport, les animaux seront placés dans des boites avec sciure, coton et gel qui remplace l’eau et les croquettes (4 animaux par boites de transport, nous ne mélangeons pas les groupes d’animaux). Si un animal présente des signes de souffrance, son euthanasie anticipée sera réalisée.

Choix des espèces

Nous avons déjà démontré dans différents modèles murins soumis aux rayonnements ionisants l’efficacité thérapeutique des VE-CSM dans les processus de néovascularisation et la réparation tissulaire. Pour cette étude nous utliserons un modèle pré-clinique murin à l’age de 8 semaines. Ce stade a été choisi afin d’éviter une hétérogénéité liée à l’âge qui pourrait modifier les paramètres étudiés. Enfin, nous maîtrisons, chez la souris, les techniques et les équipements afin d’évaluer les paramètres vasculaires, inflammatoires (anticorps) et cognitifs indispensable pour démontrer l’efficacité de notre traitement. L’utilisation d’un modèle in vivo est aujourd’hui incontournable pour développer et proposer des thérapies innovantes. En effet, lors des demandes d’Autorisation de mise sur le marché (AMM) ou des médicaments de thérapie innovante auprès de l’ANSM les études précliniques (modèle rongeurs, porcins ou primates) sont demandés.

78 960 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit deux injections d'une suspension de cellules pour l'immuniser, puis subit deux ponctions d'environ soixante millilitres de sang à l'artère de l'oreille à deux jours d'intervalle, avant une ponction cardiaque terminale qui le tue. Ce prélèvement en série produit un médicament anti-rejet de greffe commercialisé, que le porteur présente comme un "life saving drug". Il affirme qu'aucune méthode ne permet de produire ce sérum in vitro et que le lapin est la seule espèce autorisée.

Objectifs

Le projet est la production d'un médicament à usage humain, la THYMOGLOBULINE, visant à lutter contre le risque de rejet de greffe et à améliorer la prise en charge des affections sanguines.

Bénéfices attendus

La production d'un médicament humain, commercialisé dans plus de 80 pays à travers le monde et considéré comme un "life saving drug", c'est-à-dire un médicament vital pour de nombreux patients. Ce médicament est en effet un immunosuppresseur sélectif utilisé pour lutter contre les rejets de greffe chez l'Homme en période pré et post-opératoire, ainsi que pour traiter l'aplasie médullaire.

Procédures

La procédure se résume à une phase d'immunisation comprenant deux injections et une phase de prélèvement comprenant trois opérations. Les immunisations et les prélèvements à l'oreille sont réalisés sur animal vigile, seul le dernier prélèvement est effectué sous anesthésie générale. L'immunisation à J0 consiste en l'injection par voie sous-cutanée de suspension cellulaire avec du sérum physiologique utilisé comme adjuvant. Elle se fait au niveau de 4 points d'injection : 2 lombaires et 2 scapulaires (0,5 mL à chaque point d'injection). L'immunisation à J14 consiste en l'injection par voie intraveineuse au niveau de la veine marginale de l'oreille de 3 mL de suspension cellulaire avec du sérum physiologique utilisé comme adjuvant. Le premier prélèvement sanguin est réalisé 20 jours±1 après la première immunisation, et consiste en la ponction de 60mL de sang environ au niveau de l'artère médiane de l'oreille du lapin. Le second prélèvement, identique au premier, se fait deux jours plus tard sur l'autre oreille du lapin, soit à J22±1. Le dernier prélèvement est réalisé 2 à 4 jours après le second prélèvement à l'oreille (à J25±1). Il est réalisé en intracardiaque et prend fin à la mort de l'animal.

Impact sur les animaux

Le protocole comprend différentes étapes pouvant impacter les animaux inclus dans le projet ; tout d'abord une phase d'immunisation : injection d'une suspension de cellules thymocytaires par voie sous-cutanée puis intraveineuse sur animal vigile puis une phase de prélèvements : deux prélèvements successifs à l'artère médiane de l'oreille sur animal vigile et un prélèvement terminal en intracardiaque sous anesthésie générale.

Devenir

Les animaux élevés dans la procédure n°2 sont destinés à être inclus dans le protocole expérimental de la procédure n°1, et un petit nombre de lapins servira au renouvellement du cheptel de reproducteurs. Les animaux intégrés à la procédure n°1 sont mis à mort à la fin du protocole lors du prélèvement de sang terminal en intracardiaque sous anesthésie générale.

Remplacement

A l'heure actuelle des connaissances scientifiques, il n'existe pas de modèle alternatif au lapin pour la production d'anticorps polyclonaux tels qu'inclus dans la composition du médicament final THYMOGLOBULINE. La diversité et la quantité d'anticorps produits par l'animal permettent une compatibilité sans équivalent avec un nombre très élevé de patients receveurs de greffes dans les différents pays du monde.

Réduction

La procédure expérimentale appliquée a été définie afin d'obtenir la plus grande quantité possible de sérum par animal utilisé (sérum contenant la concentration requise en anticorps polyclonaux). De plus, un travail de sélection génétique mené sur les animaux reproducteurs de l'élevage a permis d'optimiser la quantité totale de sérum prélevée sur chaque lapin en prélèvement intracardiaque, et d'améliorer la concentration en immunoglobulines du sérum produit. Il est donc possible de fabriquer une plus grande quantité de médicament avec un nombre équivalent d'animaux utilisés. Enfin, les lapins mâles et femelles sont utilisés dans le cadre du protocole, ce qui permet d'inclure dans la procédure tous les lapins élevés au sein de l'établissement.

Raffinement

Les lapins sont hébergés dans des cages conformes aux exigences de la règlementation et de respect du Bien-Etre Animal, ils disposent d'un enrichissement adapté (diffusion de radio, mise à disposition de bûchettes de bois à ronger). Le suivi quotidien des animaux est assuré par des personnes expérimentées et formées régulièrement. Une prise en compte et une évaluation de la souffrance animale en référence à une grille établie est réalisée chaque jour. La grille permet également de fixer les points limites et de cesser immédiatement l'expérimentation sur tout lapin présentant des signes de souffrance dépassée. Une prise en charge spécifique de la douleur par l'application d'un protocole d'anesthésie générale validé est appliquée lors du dernier prélèvement de sang. Enfin, l'utilisation de colle chirurgicale en remplacement de pansement papier lors de chaque injection intraveineuse ou prélèvement de sang assure un meilleur confort à l'animal.

Choix des espèces

A l'heure actuelle des connaissances scientifiques, il n'existe aucune méthode alternative permettant de produire la THYMOGLOBULINE in vitro. De plus, le médicament est sous autorisation de mise sur le marché avec utilisation exclusive du lapin, espèce qui fait référence dans la production d'anticorps polyclonaux pour l'usage pharmaceutique. Les lapins ne sont inclus dans la procédure d'expérimentation animale qu'à partir de l'âge de 14 semaines et pour un poids minimum de 2,8Kg. C'est en effet à partir de cet âge que leur système immunitaire est capable de produire les anticorps nécessaires à la fabrication de la THYMOGLOBULINE, en quantité et concentration suffisantes. Les animaux sont également aptes à supporter les différentes phases de la procédure (prélèvements répétés notamment).

200 primates non-humains vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, soit 150 macaques à longue queue, 25 macaques rhésus et 25 singes vervets. Chaque animal reçoit une administration de virus AAV par voie intraveineuse ou intrathécale, suivie de prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien, certains protocoles retirant jusqu'à 20 % du volume sanguin, avant une mise à mort pour analyser la répartition du virus dans les organes. Le porteur juge peu probables les effets secondaires des AAV rendus non réplicatifs et signale surtout un stress lié aux contentions et aux gestes. Il affirme que ces études de biodistribution sont "indispensables" et retient le primate pour sa proximité immunitaire avec l'humain, au service du développement de thérapies géniques.

Objectifs

Ce projet porte sur l’analyse de la biodistribution les organes d’un virus AAV (Adeno-Associated Virus) sur un modèle primates non humains. Ce type de virus est utilisé dans le cadre de thérapie génique, afin notamment de faire exprimer aux cellules des patients des protéines manquantes à cause de maladies génétiques. Ce projet porte sur l’analyse de la biodistribution dans les organes d’un virus AAV (Adeno-Associated Virus) sur un modèle primates non humains. Ce type de virus est utilisé dans le cadre de thérapie génique, afin notamment de faire exprimer aux cellules des patients des protéines manquantes à cause de maladies génétiques. Les virus adéno-associés (AAV) sont un vecteur viable de transfert de gènes. Ils peuvent être conçus pour transporter des séquences d’ADN thérapeutiques dans le noyau de différents types de cellules (hépatiques, musculaires, ou nerveuses par exemple). Leur nature réplicative-déficiente et l'inactivation des outils moléculaires liés à l'inclusion de ces virus dans le génome humain leur donnent un profil de sécurité particulièrement intéressant pour leur utilisation clinique chez l'homme. Selon les types d'AAV, naturels ou chimériques, leur tropisme et leur profil d'infection dans divers organes va être complètement différent. Les phases de développement d'un AAV thérapeutiques passent donc par une phase de "screening" de candidats virus, dont le but est d'évaluer la biodistribution de ceux-ci dans diverses structures biologiques d'intérêts. La proximité immunitaire des singes avec l'humain fait de ces espèces un modèle intéressant et prédictif de la biodistribution attendue chez les patients.

Bénéfices attendus

Les AAV sont utilisés en thérapie génique comme "moyen de transport" pour amener du matériel génétique dans les cellules cibles. Cette étude permettra de sélectionner les « constructions » d'AAV pour traiter des maladies spécifiques, grâce à la distribution d'un transgène thérapeutique dans un tissu particulier.

Procédures

Après une période d’acclimatation de 15 jours minimum, les animaux recevront une unique administration de l’AAV par voie intraveineuse ou intrathécale selon les recommandations du donneur d’ordre et en accord avec les procédures de l’entreprise. Les volumes administrés aux animaux seront en accord avec les recommandations éthiques en vigueur selon la voie d’administration utilisée (iv bolus : 5mL/kg maximum et IT bolus : 1mL/animal maximum). Les administrations étant des bolus, elles seront de courte durée (< 5 minutes). Les administrations intraveineuses seront réalisées dans la mesure du possible sur animal vigile, les administrations intrathécales seront réalisées sous anesthésie. Suite à chaque administration, des prélèvements (principalement de sang ou LCR) seront effectués afin d’analyser les biomarqueurs liés à l’infection par l’AAV dans le sang. Les recommandations suivantes seront suivis pour la récolte de sang (7,50 % du VSC suivi d’un repos de 7 jours ; 10% du VSC suivi d’un repos de 2 semaines; 15% du VSC suivi d’un repos de 3 semaines; 20% du VSC suivi d’un repos de 4 semaines ou suivi d'une euthanasie dans les 24h). Les prélèvements de sang sont de courte durée (

Impact sur les animaux

Les AAV injectés étant des espèces non pathogènes, il est peu probable d’avoir des effets secondaires. En effet, les possibles transgènes inclus dans ces virus sont soit des séquences "rapporteuses" permettant l'identification ou la localisation du virus, ou bien des gènes codant pour des protéines humaines. En termes de contamination et multiplication, ces virus sont rendus inoffensifs et n'ont pas la possibilité de se reproduire ou de s'intégrer au génome de l'hôte. Mise à part des réactions locales au niveau des sites d'administrations et éventuellement une réaction systémique de type fièvre peuvent apparaître les jours suivants les administrations. De plus, la procédure d'injection elle-même peut potentiellement induire des effets secondaires en cas de mauvaise manipulation. Les sites d'administration et la température corporelle seront donc suivis les jours suivants les administrations.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'étude dans le but de récolter les organes et analyser la biodistribution des AAV dans les différents tissus.

Remplacement

Les études de biodistribution in vivo chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles thérapie. En effet, celles-ci permettent de déterminer la localisation des AAV dans les tissus après administration et ainsi déterminer le lieu de distribution d'un futur transgène thérapeutique.

Réduction

Pour chaque procédure réalisée, il sera veillé à utiliser un nombre minimal et suffisant d'animaux pour que les résultats soient interprétables et transposables. Une sérologie sera réalisée sur plus d'animaux que necessaire à l'étude. Au jour de l'infection, seul le nombre d'animaux necessaire à l'étude seront injectés. Au vu du faible nombre d'animaux par groupe, aucun test statistique ne sera réalisé.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages contenant des dispositifs d'enrichissement dans des locaux appropriés, conformes aux standards réglementaires et suivis par un personnel spécifiquement formé. Une attention particulière sera accordée à l’enrichissement du milieu de vie des animaux. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les animaux seront suivis individuellement et quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. L'inclusion de paramètres hématologiques et biochimiques pour le suivi clinique, l'inclusion de prélèvement de fluides pour le suivi du viscérotropisme et du neurotropisme permettent un suivi précis du statut de l'animal. Des périodes de récupération suffisantes seront accordées aux animaux entre les prélèvements. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress seront déterminées au préalable. Avant tout acte techniques, les animaux bénéficieront d'entrainements avec récompenses, ce qui permettra de réduire leur stress durant les manipulations (notamment en cas d'utilisation de la chaise à contention pour habituer l'animal à être dans cette chaise avant le jour de l'administration). Pour certains actes (LCR, administration intratécal,...), les animaux seront anesthésiés (ex: kétamine / midazolam) et recevront un analagésique (type buprénorphine) afin de palier toute douleur lié à l'acte. Les points limites décrits dans le projet permettront de décider l'euthanasie anticipé d'un animal en cas de souffrance.

Choix des espèces

Le primate non humain est un modèle de choix dans l'évaluation préclinique pour évaluer le tropisme des virus recombinants, car les AAV sont connus pour infecter largement les primates non humains et les humains (la preuve en est qu'une forte proportion des singes est séropositives pour certains types d'AAV). Nous devons utiliser des animaux qui sont évolutivement plus proches de l'homme et donc plus susceptibles de représenter fidèlement la machinerie cellulaire impliquée dans la transduction et d'autres aspects de la biologie du virus/vecteur et de l'hôte. Il est donc légitime de penser que les résultats observés chez le primate non humain seront très utiles pour prédire les mêmes phénomènes physiologiques et comportementaux chez l’Homme. De juvéniles à adultes matures selon les questionnement scientifique de l'étude.

108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une greffe de peau sur le dos sous anesthésie, avec un bandage qui gêne l'auto-toilettage et expose à une infection uro-génitale, avant la mise à mort pour analyser les tissus. Le porteur cherche à imiter dans le greffon un mécanisme de la bactérie Listeria pour échapper au rejet immunitaire, comme alternative aux immunosuppresseurs. Il conclut à la nécessité de la souris, aucun modèle in vitro ne reproduisant selon lui la complexité du rejet de greffe.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de démontrer qu’une alternative aux traitements immunosuppresseurs des patients ayant reçu une greffe d’organe est possible.. Ces traitements à vie présentent des effets secondaires néfastes tels que la sensibilité accrue aux infections et le risque de développement tumoral. Nous proposons d’étudier une stratégie de traitement alternative, consistant à mimer dans le greffon un mécanisme utilisé par la bactérie Listeria monocytogenes pour échapper au système immunitaire. L’induction de cette capacité, de manière localisée au niveau du greffon dans un modèle murin de greffe de peau, devrait permettre de le maintenir à long-terme et d’éviter l’utilisation d’immunosuppresseurs.

Bénéfices attendus

Environ 6.000 patients en France et 130.000 dans le monde reçoivent chaque année une greffe d’organe. De nombreuses autres personnes vivent avec une greffe. Les traitements immunosuppresseurs actuels, indispensables à ces patients, entrainent des effets secondaires importants. Notre projet est une preuve de concept en vue de proposer par la suite une alternative thérapeutique dans laquelle le système immunitaire n’est pas altéré, afin d’améliorer la qualité de vie des personnes greffées.

Procédures

Les souris seront soumises à une greffe de peau au niveau du dos (environ 40 minutes de l’induction de l’anesthésie au placement dans la cage de réveil). Cela implique 2 injections pré-opératoires en sous-cutané de traitements analgésiques (Buprénorphine et Metacam, Lidocaine), une anesthésie par injection intrapéritonéale (Ketamine et Xylazine) et d’éventuelles injections sous-cutanée d’analgésique (Buprenorphine) en cas de persistance des signes de souffrances 3 jours après l’opération. Chaque injection dure 10 secondes environ.

Impact sur les animaux

Les différentes expériences réalisées conduisent à un degré de sévérité modéré. La réalisation de la greffe de peau induit de la douleur chez les animaux. C’est également le cas des injections sous-cutanée ou intra-péritonéales des traitements. La présence du bandage peut aussi être une source de gêne pour l’animal et l’expose à un risque d’infection uro-génitale en empéchant l’auto-toilettage.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever les tissus pour des analyses cytométriques et histologiques.

Remplacement

Ce projet a pour but l’étude des mécanismes immunitaires impliqués dans le rejet de greffes. Il n’existe à l’heure actuelle, aucun modèle in vitro ou ex vivo rendant compte de la complexité de ce mécanisme dans son intégralité. Seuls les animaux, tels que les modèles murins, permettent de comprendre le processus dans sa globalité, avec toutes les interactions que cela implique et c’est pourquoi il est nécessaire d’avoir recours à ces animaux pour atteindre les objectifs de notre projet. De plus, les modèles murins transgéniques utilisés ici permettent d’étudier l’impact d’une voie de signalisation dans le rejet de greffe de façon globale.

Réduction

Les rejets de greffe seront quantifiés par un score entre 0 et 5 et seront comparés entre les groupes à l'aide de tests de comparaison de moyenne. Les effectifs par groupe (n=4) sont associés à des tailles d'effet de 2.05, pour un test de comparaison de 3 moyennes, un risque de 5% et une puissance de 80%. Ceci correspond à des effets forts, compatibles avec la question biologique. Le plan expérimental mis en œuvre est emboîté. Le problème de dépendance statistique des individus appartenant à une même cage sera minimisé lors de l’analyse des données en ayant recours à des modèles statistiques à effets mixtes.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe avec une litière appropriée, à base de cellulose quand les animaux sont greffés, et des matériaux de nidification. Les animaux recevront un traitement antalgique en prévention de la douleur avant l’opération. Ils seront réhydratés par injection en sous-cutané de sérum physiologique, puis auront accès à des gels de réhydratation adaptés. Les animaux seront maintenus au chaud sur une tablette chauffante pendant toute la phase de chirurgie. Celle-ci est réalisée en condition aseptique, et un antispetique en application locale sera utilisée. Les animaux recevront ensuite un antalgique en suspension orale pendant 3 jours après l’opération. Si des signes de souffrance persistent 3 jours après la chirurgie, une injection d’antalgique sous-cutanée, renouvelable si besoin, sera effectuée. Si des signes évidents de souffrance persistent malgré le traitement antalgique, les animaux sont mis à mort. Les animaux sont observés et pesés quotidiennement afin de détecter les signes éventuels de souffrance, vérifier l’intégrité des bandages et nettoyer la partie génitale régulièrement car le bandage empêche l’accès à cet endroit par l’animal pour l’auto-toilettage.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est un modèle de choix pour l’étude de la réponse immunitaire, processus intervenant dans le cadre des rejets de greffes. En effet, un grand nombre d’outils ont été développés pour étudier la réponse immunitaire des souris. Le recours à ces outils permettra de contrôler et de caractériser les processus conduisant au rejet des tissus transplantés de la façon la plus pertinente possible, en prenant en compte les spécificités du modèle murin par rapport à l'homme. De plus, la souris est un modèle qui peut être modifié génétiquement, ce qui nous permet d’étudier l’impact de l’expression de gènes dans le rejet des greffes. Nous utiliserons des souris adultes, d’au moins 8 semaines. Ces animaux sont suffisamment âgés pour avoir un système immunitaire en place mais également pour favoriser la greffe de peau, que ce soit du point de vue de la réalisation de la procédure que de la prise du greffon.

12 rats Wistar vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Quatre plaies cutanées sont créées sur chaque animal sous anesthésie, avec des changements de pansement tous les deux jours sous anesthésie et un écouvillonnage répété, avant la mise à mort pour prélever le tissu cicatriciel. Le projet compare le pouvoir cicatrisant de trois miels régionaux de La Réunion, et le porteur suit la douleur au moyen de la Rat Grimace Scale. Il indique avoir déjà mené des tests in vitro et ex vivo sur explants de peau mais affirme "avoir besoin" d'un animal vivant pour étudier la cicatrisation dans son ensemble.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier l’amélioration du processus de cicatrisation par l’usage de miels de production régionale en application locale sur un modèle de plaies cutanée sur des rats Wistar. Le processus de cicatrisation comporte 4 étapes en condition physiologique : l’hémostase, l’inflammation, la prolifération et le remodelage. Ces étapes se succèdent grâce aux recrutements des cellules immunitaires et la migration de cellules résidentes qui vont sécréter des facteurs permettant d’aboutir à la complète réparation de la lésion cutanée. En situation pathologique, ce processus peut être altéré (infection, maladie métabolique, irradiation…) et entrainer un retard de la cicatrisation et/ou une cicatrisation de moins bonne qualité, avec un risque de réouverture récurrente des plaies qui deviennent alors chroniques. Il est donc important d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur l’utilisation de ressources naturelles ayant des propriétés anti-inflammatoires, antioxydantes et anti-microbiennes. A ce titre les miels très utilisés en médecine traditionnelle pour leur potentiel cicatrisant présentent un intérêt croissant. Cependant il manque encore des données scientifiques pour étayer cela. Dans ce projet, les propriétés cicatrisantes de 3 miels appliqués localement ; avec une composition, des propriétés physico-chimiques et biologiques différentes en comparaison à un sucre analogue, à un miel commercial de référence et à un contrôle sans traitement (miel remplacé par de la vaseline) ; seront évaluées sur un modèle de plaies cutanées sur rat Wistar. Dans un premier temps, nous souhaitons évaluer les propriétés cicatrisantes des miels sur des plaies aigües en condition non pathologique. Nous pourrons ainsi étudier d’une part la potentielle amélioration de la qualité de la cicatrisation (composition du tissu cicatriciel, force, tension, contraction et résistance) et d’autre part la possible accélération du processus de cicatrisation.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent principalement la santé humaine et vétérinaire. Les données scientifiques feront l’objet de publications dans des journaux internationaux permettant ainsi une valorisation de la biodiversité locale. De plus, cette étude participe au développement d’une nouvelle stratégie thérapeutique innovante, dans les cas de plaies chroniques retrouvées dans le cadre de complications associées à des pathologies comme l’obésité et le diabète, qui constitutent de véritables problèmes de santé publique sur le territoire réunionnais.

Procédures

Les différentes interventions réalisées sur les 12 rats de l'étude sont les suivantes : - Procédure chirurgicale sous anesthésie générale volatile (30 min) - Changement de pansement (tous les deux jours) sous anesthésie générale volatile (15 min) avec écouvillonnage des plaies (à J0, J+10, J+20) - Mise à mort des 12 rats à la fin de l'étude sous anesthésie générale volatile

Impact sur les animaux

Les principales nuisances sont celles imputables à la chirurgie à savoir : anesthésie, injections, réalisation des plaies, stress et douleurs. Le suivi des plaies se faisant tous les deux jours sous anesthésie, peut engendrer un stress lié à l’endormissement et au réveil de l’animal. De plus, le positionnement des pansements peut constituer une gène (risque de retrait du pansement, difficultés à se mouvoir). L’isolement des rats en cas d’atteintes de points limites peut également constituer une source de stress.

Devenir

Mise à mort pour récupération du tissu cicatriciel et analyses histologiques et biochimiques.

Remplacement

Des tests préliminaires in vitro de cytotoxicité ont été réalisés préalablement sur un modèle de cellules épithéliales humaines de la peau, afin d’extrapoler la concentration de miel à utiliser sur notre modèle animal. De même, les propriétés anti-inflammatoires et l’impact des miels sur la capacité de migration des cellules ont été évaluées in vitro. Par ailleurs, le potentiel anti-microbien des miels a été démontré sur des micro-organismes fréquemment retrouvés dans les plaies. Pour compléter cela et affiner les critères de séléction des miels, une étude ex vivo a été menée sur des explants de peau de rats, permettant de discriminer trois miels au potentiel cicatrisant remarquable. Afin de répondre à notre objectif scientifique, nous avons besoin d’évaluer les propriétés des miels sur un modèle animal vivant pour étudier le processus cicatriciel dans son ensemble, notamment des phases telles que l’angiogénèse et la réinnervation, avec les contraintes que peut subir la peau au quotidien à savoir étirement, relâchement, inflammation locale.

Réduction

Nous avons pu réduire le nombre de rats grâce à une revue systématique bibliographique et à l’utilisation de l’outil statistique R. De plus, la taille des plaies induites de 6 mm, ainsi que la taille des rats, permettront de réaliser 4 plaies par animal. Enfin, les analyses biochimiques et histologiques pourront être réalisées sur les mêmes plaies permettant de réduire encore le nombre d’animaux.

Raffinement

Notre protocole a été optimisé afin de minimiser au maximum les contraintes subies par les animaux. La procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie avec une couverture analgésique en respectant strictement les règles d’asepsie. Le matériel chirurgical utilisé sera rigoureusement stérilisé au préalable. Les miels utilisés sur les plaies induites auront été soumis à un contrôle microbiologique. Les animaux seront surveillés plusieurs fois par jour et seront observés tous les jours pour détecter tout inconfort lié aux procédures, avec un suivi post-opératoire renforcé dans les premières 48h ainsi que dans les phases de réveil faites en chambre de réveil thermostatée. Nous effectuerons également un scoring de la douleur via l’outil du Rat Grimace Scale.

Choix des espèces

Le modèle du rat WISTAR a été selectionné dans cette étude. Le rat est un modèle largement utilisé dans la recherche pré-clinique en chirurgie. La souche de rat choisie est reputée robuste et elle est peu couteuse. Il s’agit d’un modèle de référence dans les études sur la réparation de lésions cutanées et le modèle expérimental est donc très bien référencé. Par ailleurs, ce modèle possède une architecture de la peau proche de celle retrouvée chez l’Homme ; présence d’épiderme, lame basale, derme, hypoderme et présence de follicules pileux. La taille de l’animal nous permettra de faire plusieurs plaies par rat et donc de réduire notre nombre total d’animaux. Nous travaillerons avec des rats mâles adultes de 8 semaines (300 g en moyenne). Les jeune râts adultes ont une meilleure récupération post-chirurgicale et nous n’ajouterons pas de biais de cicatrisation lié à l’âge de l’animal qui aura une peau plus souple à 8 semaines. Cela permettra d’avoir un processus de cicatrisation optimal.