Bien-être animal

100 chats et 100 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous réutilisés à l'issue. Ils reçoivent le produit testé jusqu'à trois fois par semaine, par voie orale, injectable, nasale ou cutanée, subissent un suivi clinique hebdomadaire avec prise de température rectale et peuvent faire l'objet de quatre prélèvements sanguins dans une même journée, soit douze par semaine. Les effets attendus chez eux comprennent sédation, apathie, vomissements et diarrhée, pour un produit dont la fonction déclarée est de calmer l'animal pendant le trajet jusqu'à la clinique vétérinaire. Le porteur affirme que ces essais ont un caractère de "stricte nécessité" parce que la réglementation impose de les conduire sur l'espèce de destination du produit, et qu'ils alimenteront le dossier d'autorisation de mise sur le marché.

Objectifs

Dans le cadre de la mise au point de nouvelles formulations à usage vétérinaire, le présent projet vise à mener des études d'efficacité conformément aux exigences réglementaires énoncées dans le Règlement (UE) 2019/6 du Parlement européen et du Conseil du 11 décembre. Ces études sont essentielles pour caractériser l'activité ou les effets pharmacologiques attendus des produits vétérinaires et pour définir la posologie efficace. L'objectif principal de ce projet est de déterminer l'efficacité de produits apaisants sur des animaux sains. Pour ce faire, nous réaliserons des études de dose détermination et de dose confirmation. Ces études permettront de déterminer la quantité optimale du produit nécessaire pour obtenir les effets pharmacologiques désirés, tout en assurant la sécurité et le bien-être des animaux participants. Il est important de souligner que seules les études sur des animaux sains seront abordées dans le cadre de cette demande d'autorisation de projet. Cette approche garantit une évaluation précise de l'efficacité des produits vétérinaires sans interférences liées à des conditions médicales préexistantes chez les animaux. En résumé, le projet vise à répondre aux exigences réglementaires en matière d'évaluation de l'efficacité des produits vétérinaires tout en respectant les normes éthiques et en assurant le bien-être des animaux participants. Les résultats obtenus contribueront à la mise sur le marché de nouvelles formulations vétérinaires efficaces et sécuritaires, bénéficiant ainsi à la santé et au bien-être des animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet contribue au développement et à la mise à disposition de produits pharmaceutiques sûrs et efficaces auprès des vétérinaires et des propriétaires d’animaux de compagnie en accord avec les exigences réglementaires pour la mise sur le marché de ces produits. Dans le cadre du développement de nouveaux produits ou amélioration de produits existants sur le marché, les bénéfices envisagés de cette procédure seront: - la meilleure connaissance et compréhension du fonctionnement de ces produits (dose, voie d’administration, adjuvants/excipients, innocuité, efficacité, mécanisme d’action) et - d’améliorer les conditions de transport de l’animal entre son lieu de vie et la clinique vétérinaire et - la réalisation des études nécessaires à la constitution du dossier d'autorisation de mise sur le marché (AMM).

Procédures

La durée maximale d'une étude avec un seul principe actif donné sera de 6 mois, en fonction de la durée de traitement et/ou de son efficacité. En fonction du produit testé, les animaux seront soumis à différentes interventions nécessaires à la bonne évaluation de son efficacité, selon les réglementations en vigueur. L’ensemble des interventions possibles, et variables selon le produit évalué, sont les suivantes : - Des administrations de produits pour toutes les voies avec un maximum de trois administrations par semaine et des périodes de washout (minimum 24h) entre chaque administration : durée environ 5 minutes entre 2 chiens et ou 2 chats Les voies d’administration peuvent être orale (ou per os), parentérale (entre autres sous-cutanée, intramusculaire, ou intraveineuse), nasale, topique (par exemple spot-on, pour-on, collier, patch) - Suivi clinique régulier a minima 1 par semaine et si nécessaire de façon plus rapproché, associé ou non à une prise de température rectale et une pesée, permettant de surveiller et d’évaluer l’état de santé des animaux, - Prélèvements de Sang : - chiens chats : 2 minutes par prélèvement, maximum 4 prélèvements sur une journée si les animaux sont coopératifs (soit maximum de 12 prélèvements de sang par semaine avec 24h heures de récupération entre chaque série de prélèvement)

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir une douleur transitoire aux sites d’injection lors de l’administration du produit testé, d’anesthésique ou de médication, liée à l’introduction d’une aiguille. Suite à l’administration du produit testé, les animaux pourront présenter des signes cliniques liés à l’action de la molécule testée tels que sédation, apathie, diminution de l’activité, des signes digestifs (vomissement, diarrhée) qualifiés d’effets indésirables. Ces nuisances pourront être répétées car plusieurs administrations pourront être réalisées selon la posologie envisagée. Le suivi de la température par voie rectale pourra causer de l’inconfort temporaire. Enfin, lors du suivi régulier des animaux, les nuisances envisagées seront fonction du type de prélèvements réalisés telle qu’une douleur transitoire liée à l’introduction de l’aiguille (ex : prise de sang), le cas échéant.

Devenir

l'ensemble des animaux seront réutilisés

Remplacement

La recherche bibliographique et l’usage de méthodes alternatives in vitro seront considérés afin de limiter autant que possible la réalisation d’études sur animaux. Néanmoins cette procédure a un caractère de stricte nécessité : elle ne peut pas, pour le moment, être remplacée par des méthodes alternatives car elle répond à l’obligation réglementaire ou scientifique d’être conduite sur l’espèce de destination du produit.

Réduction

Le nombre d’animaux en étude sera défini par les lignes directrices en vigueur (textes réglementaires pour les études pivot), ou justifié par des tests statistiques : le nombre maximum d’animaux par groupe sera calculé par le biostatisticien en fonction du design de l’étude, des données préliminaires d’efficacité issues de tests ou de la littérature, de la variabilité du critère de jugement, de la différence minimale qu’il est cliniquement intéressant de mettre en évidence entre les groupes, de la puissance (en général 1- beta 80%) et du risque alpha (5% en situation bilatérale et 2.5% en situation unilatérale) conformément à la procédure interne «Détermination du nombre de sujets nécessaires». Dans tous les cas, le nombre maximal d’animaux par groupe sera de 15 animaux.

Raffinement

Les mesures de raffinement utilisées sont : - Une période d’acclimatation adaptée aux conditions de l’étude - Habituation des chats aux prélèvements de sang sur animaux vigiles. - socialisation des carnivores domestiques à l’aide d’une période de jeu dans une pièce dédiée par du personnel qualifié. - Enrichissement des box afin d’améliorer le confort des animaux (musique, jouets adaptés...). - renforcement positif (récompenses ou caresses) - Observation quotidienne des animaux avec examen/suivi clinique - Mise en place de points limites adaptés et précisément définis qui pourront être réévalués en fonction des observations recueillies.

Choix des espèces

De façon réglementaire, les essais d’efficacité doivent être menés sur la ou les espèces cibles (chat et chien). L’objectif de l’utilisation du produit est de faciliter le transport de l'animal quelque soit son âge jusqu’au vétérinaire. De ce fait, tous les âges, à partir d’un animal sevré, pourront être envisagés

Chacun des 15 360 poulets reçoit, à son arrivée, une dose exacte de bactérie pathogène administrée par une sonde de gavage. Tous relèvent d'un niveau de souffrance modéré, avec pour effets attendus un retard de croissance, une boiterie notée au Gait Score et des fèces plus liquides. L'objet déclaré est de caler un modèle d'infection reproductible chez le poulet de chair à croissance rapide, afin d'y tester des additifs alimentaires censés remplacer les antibiotiques et améliorer les "performances zootechniques". 1 250 oiseaux sont tués pour des biopsies du foie, de la rate et de la moelle osseuse, et les 14 110 autres partent, à 32 jours, dans le circuit alimentaire humain.

Objectifs

L’objectif du projet est d’élaborer un modèle répétable d’inoculation d’une souche pathogène d’E. cecorum, afin d’en préciser et d’en mesurer les effets sur les poulets de chair. Le modèle d’inoculation doit permettre de tester des solutions alternatives à l’utilisation d’antibiotique, en favorisant l’intégrité intestinale dans le but de prévenir la translocation d’E. cecorum.

Bénéfices attendus

L’efficacité des additifs alimentaires apportés dans la ration des poulets de chair vis-à-vis des impacts des pathologies liées à E. cecorum sera évaluée par rapport au lot témoin. On attendons un effet positif sur : - Les performances zootechniques des animaux (poids moyen, gain moyen quotidien, consommation, journalière et l’indice de consommation) - La qualité de l’intégrité intestinale - La qualité du système locomoteur

Procédures

Durée prévue du protocole : 32 jours Mesures prévues : 0/ Les animaux seront infectés par voie orale, à la mise en place. Chaque animal sera inoculé par voie orale de façon individuelle par sonde de gavage, ainsi la quantité réelle administrée correspondra à la dose exacte de bactérie (et sera donc contrôlé et répétable). Soit 1 intervention de 3h en parallèle de la mise en place. 1/ Pesée (4 interventions de 2h) des animaux par case (64 animaux) le jour de leur arrivée, à 10 jours d’âge et 21 jours d’âge, et la veille de leur départ, afin d’établir pour chaque case le poids moyen des poulets, leur croissance et l’indice de consommation. Les éventuels morts seront ramassés chaque jour et pesés individuellement. Ils seront pris en compte dans le calcul des indices. 2/ Des écouvillons cloacaux à 0 et 5 jours d’âge (2 interventions de 2h) pour mesure la qualité d’infection. 3/ Des prélèvements de fèces à 10, 21 et 32 jours d’âge (3 interventions de 1h) : la boite est placée dans chaque case la veille de la récolte. Les fientes prélevées permettront de mesures des facteurs de l’intégrité intestinale. 4/ L’infection d’E. cecorum sera évaluée grâce à des biopsies au niveau du foie, de la rate, et de la moelle osseuse seront réalisées sur un total de 48 oiseaux, à 10 et 21 jours d’âge (2 interventions de 1h). Au total, il y aura 5 interventions à des âges différents, représentant 17h d'intervention : J0 : Pesée + Mise en place + Ecouvillons cloaquaux = 4h ; J5 : Ecouvillons cloaquaux = 2h ; J10 Pesée + Prélèvement fèces + Biopsies = 3h + 1h ; J21 : Pesée + Prélèvement fèces + Biopsies = 3h + 1h ; J32 : Pesée + Prélèvement fèces = 3h.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront montrer les effets indésirables suivants : un retard de croissance, une moindre mobilité des animaux (notation de boiterie via le Gait Score) et un aspect des fèces plus liquide.

Devenir

Procédure 1 : Nombre d'animaux qui seront autopsiés au total sur le projet : 1250 (à différents âges pour des biopsies). Nombre d'animaux gardés en vie (replacés afin d’être valorisés dans le circuit alimentaire humain, étant conforme au paquet hygiène ) : 14110.

Remplacement

Avant de tester un additif sur poulet, des simulations informatiques seront testées afin de mettre en place seulement celles intéressantes nutritivement. De plus, avant de mettre en place des études sur poulets nous travaillons avec des modèles in vitro (analyses en laboratoire) permettant de vérifier l’efficacité de nouvelles plantes, additifs ou matières premières. Seuls ceux efficaces après ces premiers tests seront testés in vivo, afin d’observer leur appétence et leur effet sur les performances et l’immunité des animaux. De plus, compte tenu de notre expérience d’essai (plus de 20 ans de données dans nos fermes de recherche zootechniques), nous avons accès à une très grande quantité de données. Toutes ces data nous permettent de réaliser des tests statistiques avant chaque essai, pour valider que nous aurons une probabilité importante d’obtenir des résultats significatifs avec le plus faible nombre d’animaux possible.

Réduction

Nous utilisons au total 15 360 poulets sur ce projet. L'utilisation d'animaux homogènes sur les plans biologiques et sanitaire, nous permet de réduire la variabilité d'un individu à l'autre et donc d’obtenir un nombre minimum d’individus par lot. Le nombre d’animaux a été déterminé par une approche statistique.

Raffinement

Les poulets seront élevées dans le respect de la réglementation : logées sur aire avec copeaux et auront constamment accès à une eau propre ainsi qu’à l’aliment. Ils vivront en groupe et ne seront pas isolées. La surveillance des animaux se déroulera de manière très rapprochée puisque des prélèvements sont prévus toutes les semaines et une surveillance quotidienne sera faite par l’animalier.

Choix des espèces

Les infections à Enterococcus cecorum provoquent spécifiquement chez le poulet (Gallus gallus) des problèmes locomoteurs associés à une altération du bien être animal, et une baisse des performances zootechniques. Les poulets utilisés auront de 1 à 32 jours d’âge, soit la durée classique d’élevage d’une poulet de chair standard.

Obtenir un foie gras sans gavage : 600 canards de trois génotypes vont être utilisés, tous abattus à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. De l'éclosion à dix-sept semaines, ils subissent six heures par jour à dix degrés sous leur optimum thermique, des variations d'éclairage, deux semaines de restriction alimentaire à -25 %, puis une remise à volonté destinée à les faire manger au-delà de leur besoin. Vingt canards par groupe et par semaine sont saignés au sinus occipital pour doser un marqueur d'engraissement du foie, avant l'abattage et le prélèvement des tissus. Le porteur situe la recherche dans "un contexte d'intensification du questionnement sociétal relatif au bien-être animal" et juge "nécessaire" de porter l'effort sur le canard, l'oie ne représentant que 2 % de la production française.

Objectifs

Aujourd’hui, la production de foie gras repose sur le gavage des animaux. Dans un contexte d’intensification du questionnement sociétal relatif au bien-être animal, des recherches ont été entreprises sur des méthodes alternatives à cette pratique pour la production de foie engraissé. Les premiers travaux concluants ont été réalisés sur l’oie mais celle-ci ne représente que 2 % de la production française de foie gras. Il est donc nécessaire à présent de concentrer les efforts de recherche sur le canard. L’objectif du présent projet est d’utiliser plusieurs leviers physiologiques et métaboliques susceptibles d’induire un engraissement hépatique en les mettant en œuvre de façon précoce, dès le développement embryonnaire, de façon à bénéficier des périodes où l’oiseau présente une grande plasticité d’adaptation métabolique et physiologique et de les tester chez trois génotypes de canards (Barbarie, mulard et Pékin) et les deux sexes. Le canard mulard résulte du croisement d’un mâle Barbarie avec une femelle Pékin. Ces trois génotypes de canard ne présentent pas la même sensibilité aux variations de la photopériode et de la température, la même vitesse de croissance, le même comportement alimentaire, ni la même aptitude à la production de foie gras lorsqu’ils sont gavés. Ce projet a pour objectif d’explorer la réponse de ces génotypes face à une combinaison de différentes modalités de stimulation du développement des organes digestifs, de l’hyperphagie (surconsommation spontanée d’aliment) et/ou de la capacité de synthèse et de stockage des lipides par le foie. En conditions standards d’élevage, la capacité d’engraissement corporel global des femelles est en général supérieure à celle des mâles d’où l’intérêt d’étudier la réponse des canards des deux sexes. Les leviers testés seront l’exposition à une baisse de température au cours de la dernière phase de développement embryonnaire et de la croissance, la composition (ratio énergie/protéines, teneurs en fibres et antioxydants) et les modalités de distribution de l’aliment (durée et fréquence des repas, restriction suivie d’un apport à volonté), la durée et l’intensité de l’éclairage.

Bénéfices attendus

Sur le plan scientifique, ce projet mettra à profit les connaissances récemment acquises sur la programmation thermique embryonnaire et post-éclosion des oiseaux (poulets, canards) et devrait permettre d’enrichir celles portant sur le métabolisme des lipides du canard en croissance et la régulation de son ingéré alimentaire sous l’effet conjugué de différents facteurs, la photopériode (durée et intensité d’éclairage), les modalités de distribution de l’aliment (durée et fréquence des repas, restriction, distribution à volonté) et la composition de l’aliment (ratio énergie/protéines, teneurs en fibres et antioxydants). Ce projet permettra aussi d’enrichir les connaissances sur le comportement alimentaire du canard. L’objectif de ce projet est de chercher une alternative à l’alimentation forcée représentée par l’acte de gavage pour l’obtention d’un foie engraissé. Si la combinaison des leviers précités permet d’atteindre cet objectif, il représentera un changement évident de pratique d’élevage. Il s’agira ensuite de la valider et de l’optimiser puis d’évaluer son impact sur les aspects environnementaux, économiques et sociétaux. Les résultats de ce projet permettront aussi d’ouvrir un large champ d’investigation pour décortiquer les mécanismes comportementaux, physiologiques et métaboliques mis en œuvre chez les animaux aux différents stades de leur croissance et de la phase d’engraissement du foie.

Procédures

A l’éclosion, les canetons seront sexés, pesés et leur aspect visuel et leur vivacité seront évalués. Au cours de la croissance, les canards seront pesés en semaines 1, 2, 4, 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 et 17. Une prise de sang au sinus occipital sera réalisée sur 20 canards vigiles par groupe et par semaine d’abattage lors de la période d’alimentation à volonté de S13 à S17 soit un total de 600 canards. Cela nous permettra de déterminer la concentration plasmatique en chémerine, un marqueur de l’engraissement du foie et de vérifier que ce marqueur reste robuste même si l’engraissement du foie est éventuellement plus modéré que celui obtenu par gavage. Ces canards seront abattus pour évaluer leur composition corporelle et prélever des échantillons de différents tissus. De J1 à J70, les canards seront exposés à une diminution temporaire quotidienne (6h/24h) de la température ambiante de 10°C par rapport à leur optimum thermique, à des variations de l’intensité lumineuse (40-50 lux pendant les repas et 5-10 lux entre les repas) et de la durée d’éclairage (diminution de 24h à 16h d’éclairage de J1 à J21 puis de 16h à 8h de J70 à J78 et augmentation de 8h à 16h à J85) à une restriction alimentaire de -25% par rapport à l’ingéré à volonté de J70 à J84 suivie par une distribution à volonté de l’aliment de J85 à J119.

Impact sur les animaux

L’exposition à une baisse de la température de 10°C pendant 6 h/24 h pourra induire un inconfort thermique en particulier au cours de la première semaine d’élevage (exposition à 20°C au lieu de 30°C), mais dès l’éclosion, les canetons sont capables de maintenir leur température corporelle lorsque la température ambiante ne descend pas au dessous de 20°C. Ce seuil de température ambiante au-dessus duquel les canards sont capables de maintenir leur température corporelle diminue progressivement avec l’âge et la température dans le bâtiment d'élevage diminue également. Les canetons seront élevés en groupe et sur des copeaux de bois qui apportent un confort thermique lorsque les animaux sont couchés. La phase de restriction alimentaire pourra induire une frustration des animaux. L’apport de fibres dans l’aliment et la mise à disposition de grit (mélange de graviers et de coquilles broyées) et de bottes de pailles sur le sol ont pour objectif de ralentir le transit digestif et de favoriser le comportement exploratoire des canards et donc de réduire leur nervosité éventuelle. La diminution de l’intensité lumineuse favorisera aussi une ambiance calme dans le bâtiment. Le prélèvement de sang peut engendrer une réaction de stress lors de la contention et l’animal peut ressentir une douleur modérée lors de la piqûre. Le diamètre des aiguilles qui seront utilisées pour les prélèvements de sang sera adapté au gabarit de l’animal. Il n’y a pas en principe de saignement post-prélèvement et la cicatrisation est très rapide. La prise de sang est réalisée avec du matériel stérile dans un environnement propre pour limiter le risque d’infection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en respectant la règlementation en vigueur (abattage dans des abattoirs agréés) pour évaluer leur composition corporelle, l’engraissement du foie et prélever des échantillons de différents tissus.

Remplacement

Etant donné que cette étude porte sur les alternatives au gavage du canard en utilisant différents leviers physiologiques et métaboliques, l’utilisation de l’animal ne peut pas être remplacée par un modèle d’étude in vitro ou in silico.

Réduction

L’effectif total d’animaux mis en procédure dans cette étude est 600. La concentration du plasma en chémerine (une hormone marqueur de l’engraissement du foie) sera déterminée sur 20 canards par sexe et par génotype qui seront abattus chaque semaine au cours de la dernière période d’élevage (S13-S17) lors de l’alimentation à volonté. Les paramètres de composition corporelle et d’expression tissulaire de la chémerine seront mesurés sur 20 canards par sexe et par génotype. Ces effectifs sont suffisants pour mettre en évidence un effet significatif des conditions d’élevage au regard de l’expérience acquise sur des études précédentes concernant ces différents paramètres.

Raffinement

Les animaux seront élevés en groupe et au sol sur une litière de copeaux de bois dans un bâtiment d’élevage standard. Ils disposeront de mangeoires circulaires pour la première semaine afin de permettre un accès plus facile à l’aliment puis ensuite de mangeoires linéaires qui sont plus hautes pour éviter le gaspillage alimentaire. L’accès à l’eau sera effectué avec des abreuvoirs en cloche. En dehors des repas, l’intensité lumineuse sera réduite à 5-10 lux pour limiter la nervosité des animaux. Le milieu sera enrichi avec des bottes de paille permettant aux animaux d’exercer une activité exploratoire en particulier lors de la période de restriction alimentaire. Les effets des conditions d’élevage sur le comportement et l’activité des animaux seront évalués à 35 jours pour la phase de croissance, à 85 jours pour la phase de restriction alimentaire et à 105 jours pour la phase d’alimentation à volonté à l’aide d’une méthode d’évaluation du bien-être. Cette méthode comporte 3 étapes : un questionnaire regroupant tous les indicateurs de moyens, qui sont liés à l’environnement de l’animal, des mesures de comportement sur un échantillonnage d’animaux et des informations sanitaires. Le comportement des animaux sera suivi quotidiennement afin de détecter tout risque de souffrance ou de mal-être. Une grille d'évaluation (indicateurs physiologiques, comportementaux et d'état corporel) sera mise en place afin d'assurer un suivi quotidien et de détecter précocement toute altération du bien-être des animaux. Toute manifestation de symptômes comportementaux persistants définis par un point limite (animal blessé et/ou prostré plus de 24 h et ayant cessé de s’alimenter et de s’abreuver) entrainera le retrait de l’animal de l’expérimentation pour un placement en infirmerie ou une mise à mort selon l’état corporel de l’animal.

Choix des espèces

L’objectif de ce projet est de tester une combinaison de leviers physiologiques et métaboliques susceptibles d’induire un engraissement du foie chez le canard en croissance. Il n’existe pas de modèle mathématique ni de test in vitro permettant d’atteindre cet objectif. La possibilité d’expérimenter chez l’animal cible du projet (canard) est la plus adaptée. Le canard mulard résulte du croisement d’un mâle Barbarie avec une femelle Pékin. Ces trois génotypes de canard ne présentent pas la même sensibilité aux variations de la photopériode et de la température, la même vitesse de croissance, le même comportement alimentaire, ni la même aptitude à la production de foie gras lorsqu’ils sont gavés. Ce projet a pour objectif d’explorer la réponse de ces génotypes face à une combinaison de différentes modalités de stimulation du développement des organes digestifs, de l’hyperphagie (surconsommation spontanée d’aliment) et de la capacité de synthèse et de stockage des lipides par le foie. Nous élèverons les canards de l’éclosion jusqu’à l’âge de 13 à 17 semaines correspondant à la période de distribution à volonté de l’aliment afin de suivre l'évolution hebdomadaire de l’engraissement du foie. Pour stimuler la surconsommation d’aliment et donc la synthèse de lipides par le foie, les canards vont être soumis au préalable à une période de restriction alimentaire pendant les semaines 11 et 12. Cette restriction alimentaire ne peut pas intervenir trop tôt dans la croissance des animaux afin d’éviter un impact à long terme sur leur développement corporel.

1 600 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries pendant 90 jours avec trois doses d'argile, 1 200 d'entre elles peuvent perdre l'appétit et du poids, et 64 subissent un test de stress consistant en une minute de pourchasse à l'épuisette suivie de cinq minutes de confinement dans un seau, avant d'être tuées trente minutes plus tard. Les truites sont ensuite disséquées pour analyser leur sang, leurs organes, la composition de leur chair et son goût. Le demandeur est un exploitant et vendeur de substances minérales qui cherche une autorisation de mise sur le marché pour une de ses argiles, et présente l'essai comme démontrant à la fois l'innocuité du produit et son bénéfice pour le "bien-être" des poissons, dont il prévoit pourtant la mise à mort intégrale.

Objectifs

Les argiles sont une famille de minéraux d’origine volcanique, ayant une très bonne capacité d’échange d’ions, les rendant intéressants dans de nombreux domaines (industrie, agriculture, médecine...), et notamment en nutrition animale. Dans ce domaine, ils sont utilisés comme agents de liaison et/ou fluidifiant pour la fabrication d’aliment. De plus, ils améliorent l’utilisation des nutriments et par conséquent les performances de croissance des animaux en élevage. Un exploitant et vendeur de substances minérales, souhaite étudier la faisabilité d’une mise sur le marché d’une de ses argiles à la composition différente de celles déjà autorisées dans l’alimentation animale. C’est pourquoi l’objectif de cet essai est double, il vise à mettre en évidence 1) l’innocuité d’une nouvelle argile pour l’alimentation des poissons, ainsi que 2) son effet positif sur la nutrition et le bien-être animal. Cet essai a été mis en place en tenant compte des exigences de l’Autorité Européenne de Sécurité des Aliments (EFSA) afin que les données obtenues puissent servir à l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché en tant qu’additif zootechnique pour l’alimentation des salmonidés. Ainsi, un essai d’une durée de 90 jours va être réalisé sur des truites arc-en-ciel de 15 g, au cours duquel des aliments contenant différentes doses d’argiles seront distribuées. En plus d’un suivi d’élevage traditionnel (rationnement, croissance, mortalité) qui visera à la fois à démontrer l’innocuité et l’intérêt zootechnique de l’additif, des analyses sur le sang et les organes des poissons seront réalisées en fin d’essai afin de confirmer l’innocuité de l’additif, et des études sur la digestibilité de l’aliment, son impact sur le stress des poissons et sur la qualité de la chair (composition et dégustation) seront également menées. La truite arc-en-ciel a été choisie comme modèle d’étude en raison de son importance économique en France et dans le monde, de sa sensibilité aux paramètres environnementaux, et du cahier des charges de l’EFSA pour ce type de test (à réaliser sur truite ou saumon).

Bénéfices attendus

Le premier bénéfice attendu de ce projet est que les quantités d’argile incorporées à l’aliment ne mettent pas en évidence d’effets délétères sur les animaux en essais, contribuant à démontrer que cet additif n’a aucun effet néfaste sur la santé des poissons, et qu’il peut faire l’objet d’une évaluation pour autorisation de mise sur le marché. Le second bénéfice attendu est qu’au moins une des doses d’argile testées mette en évidence un intérêt pour l’élevage de la truite, comme de meilleures performances de croissance, une meilleure digestibilité ou une meilleure résistance au stress. Ces bénéfices pour l’alimentation piscicole seraient à moyen terme, puisqu’ils devront être évalués ensuite par l’EFSA avant d’obtenir une autorisation de mise sur le marché.

Procédures

La pêche à l’épuisette, d’une durée inférieure à la minute, sera réalisée 1 fois sur 1536 poissons (transfert dans bac pour mise à mort), et 2 fois sur 64 poissons (changement de bac, puis test de stress). La procédure expérimentale ‘test de stress’ sera réalisée une fois sur 64 poissons, et durera 6 minutes (1 min de pourchasse dans le bac + 5 min de confinement), et sera suivi 30 min plus tard d’une mise à mort.

Impact sur les animaux

Une inappétence, une croissance moindre et une perte de poids pourront être observées sur les 1200 poissons nourris avec un aliment à base d’argile (3 lots de 400 poissons). Ces nuisances sont considérées comme modérées sur une durée de maximum 7 jours. A l’issu des 90 jours d’alimentation expérimentale, 64 poissons seront soumis à un test de stress aigüe (16 poissons par lot, 4 par bac), nécessitant au préalable un changement de bac, suivi d’une acclimatation de 96h. Les nuisances attendues sont le stress généré par ce transfert qui durera 1 minute (pêche à l’épuisette et changement de bac), puis le test de stress en lui-même qui consiste en une chasse à l’épuisette d’une durée de 1 minute, suivi d’un confinement dans un seau pendant 5 minutes. Afin de limiter la production de déjections et d’éviter une pollution de l’eau, notamment pendant la phase de confinement, les poissons ne seront pas alimentés le jour du test de stress. Cette période de mise à jeun sera inférieure à 24h. Cette nuisance est considérée comme modérée en raison du nombre limité de nuisances et de la durée relativement courte des stress induis.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour la réalisation de différentes analyses (sang, organes, composition nutritionnelle, dégustation).

Remplacement

Il n’existe pas à notre connaissance d’expérimentations déjà décrites dont le but est de montrer l’intérêt de cet argile spécifique. L’objectif de ce projet étant de démontrer que ce produit n’a pas d’effet délétère, et qu’il amène des atouts supérieurs en termes de nutrition et de stress par rapport à d’autres argiles, il n’est pas possible d’en faire abstraction. Pour ce type d’approche, il n’existe pas aujourd’hui de méthodes alternatives à l’expérimentation animale.

Réduction

Il a été choisi en amont de ce test de réaliser 4 répétitions de bac pour chaque régime alimentaire. Ce nombre de répétitions est un bon compromis entre l’effort à réaliser au cours de l’étude (en termes de prélèvements, de matériel, de maintiens des animaux) et la puissance statistique permettant de mettre en évidence des différences significatives. Il a également été décidé de n’intégrer à cette étude, que 100 poissons par bac, permettant d’assurer un comportement normal de truites en élevage et la croissance associée, et un nombre d’animaux suffisant aux analyses post-mortem (30 par bac) et associées au test de stress (4 par bac). Ce nombre d’animaux a été réduit au maximum, en tenant compte du nombre de poissons par bassin pour obtenir un optimum pour le bien-être des animaux, tout en assurant la robustesse statistique de l’analyse de données. Ces données seront étudiées paramètre par paramètre.

Raffinement

La procédure expérimentale a été conçue pour minimiser les dommages causés aux animaux. Les pêches et pourchasses de poissons seront réalisées avec des équipements adaptés (bacs et épuisettes) ne risquant pas de blesser les poissons, et la taille des lots de poissons échantillonnés sera réduite à 10 poissons maximum afin de limiter la compression au sein de l’épuisette. Les poissons impliqués dans les mesures de poids moyens seront préalablement anesthésiés puis, suite à la mesure de poids moyen d’une durée inférieure à la minute, mis à récupérer en eau neuve avant d’être replacé dans leur bac d’origine. Les 16 poissons changés de bacs seront acclimatés pendant 96h avant la réalisation des tests de stress. Lors des phases de confinement des tests de stress, une attention particulière sera portée sur le maintien d’une teneur en oxygène dissous supérieur à 90% dans les seaux, via un bullage faible mais continu d’oxygène. De même, la qualité de l’eau utilisée pour le confinement sera identique à celle des enceintes d’élevage. Tout cela afin que seul le volume restreint et donc la charge plus importante en poissons soit de nature à engendrer un stress.

Choix des espèces

L’espèce truite arc-en-ciel a été choisie comme modèle d’étude en raison de son importance économique en France et dans le monde, et de sa sensibilité aux paramètres environnementaux, et du cahier des charges de l’EFSA pour ce type de test. Les animaux utilisés seront des juvéniles de truites arc-en-ciel de 15 g en début d’essai. Cette taille initiale est demandée par l’Autorité Européenne de Sécurité des Aliments (taille minimale de 10 g en début d’essai pour la truite) dans le cadre d’une étude de tolérance.

200 mulets-porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pêchés dans des eaux saumâtres puis acclimatés à l'eau douce, jusqu'à 96 d'entre eux sont privés de nuit pendant un mois par un éclairage continu, jusqu'à 96 reçoivent une alimentation contaminée par un biocide, et 33 à 48 cumulent les deux. Le porteur reconnaît que les effets du biocide sont difficiles à anticiper faute de littérature, et envisage dans le pire des cas des lésions internes, un arrêt de la prise alimentaire ou une mortalité. 36 poissons sont isolés une heure dans une chambre de choix, ce que le porteur décrit lui-même comme potentiellement très stressant pour une espèce grégaire.

Objectifs

L’objectif général du projet est d’acquérir des connaissances concernant les effets de stress urbains sur le fonctionnement des écosystèmes aquatiques. Plus précisément, il s’agira d’évaluer les impacts de la pollution lumineuse nocturne et d’une pollution par un produit chimique sur le mulet-porc Chelon ramada, un poisson très commun dans les eaux côtières et saumâtres urbanisées européennes (ex : les ports, le long des quais). Le produit chimique, un biocide largement utilisé dans les détergents et produits ménagers en Europe, a été choisi car il est fréquent d’en retrouver dans l’eau. Les poissons que nous allons impliquer seront exposés soit à la pollution lumineuse, soit à la contamination de leur alimentation, soit aux deux, pendant un mois. A l’issue de cette période, nous mesurerons les effets de ces pollutions sur 1) leur niveau de stress via l’hormone « cortisol » que l’on pourra retrouver dans l’eau de leur bac et dans leur sang et via la présence de lipides spéciaux qui témoignent de la dégradation des cellules de l’animal ; 2) l’accumulation du polluant dans les organes des poissons ; 3) la façon dont les poissons se nourrissent et s’ils continuent à acquérir des acides gras qui leur sont essentiels ; 4) quelle(s) zone(s) en fonction de leur luminosité les poissons favorisent. Les résultats obtenus auront une portée internationale, les facteurs de pollution étudiés étant largement répandus.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de l’étude sont, à court terme, de compléter les connaissances en matière de réaction, par le mulet-porc, à un stress lumineux d’une durée d’un mois. A moyen terme, les résultats obtenus permettront d’appréhender les effets singuliers et combinés de deux facteurs de stress urbains sur cette espèce largement répandue dans le monde. A long terme, cette démarche expérimentale qui intègre des analyses sur plusieurs éléments biologiques (biofilms, poissons), permettra d’apporter des éléments de connaissance scientifique robustes sur les effets de la lumière artificielle nocturne et d’une pollution chimique émergente provoquée par le polluant testé et leurs éventuelles interactions, sur le fonctionnement des écosystèmes aquatiques urbains. Ces connaissances permettront de proposer des solutions pour optimiser la gestion des espaces publics en ville, en facilitant notamment l’arbitrage entre suppression, réduction ou mitigation des éléments susceptibles d’avoir des répercussions sur l’environnement.

Procédures

Les mulets-porcs seront pêchés dans des eaux saumâtres impactées par l’urbanisation. Des filets seront maintenus face au courant pendant 5 mn permettant de limiter le risque de les blesser. Ils seront transportés en moins de 2 h dans des sacs adaptés, dans un véhicule agréé, jusqu’au lieu de l’expérimentation où ils recevront un traitement antibiotique contre les pathologies. Les mulets-porcs étant une espèce capable de s’adapter à des changements de salinité, c’est-à-dire pouvant vivre aussi bien en eau douce qu’en eau salée, il faut qu’ils s’acclimatent à l’eau de rivière qui alimentera les dispositifs expérimentaux et qui est d’une salinité inférieure à celle du milieu de capture. Pour cela, des seuils d’acclimatation progressifs seront réalisés, accompagnés d’observations comportementales continues. Les poissons seront nourris avec un aliment commercial dont l’appétence en captivité a été éprouvée lors d’une étude préalablen. Un mois après, les poissons seront répartis en 12 lots de 11 à 16/17 individus (selon la survie des surnuméraires), exposés à des cycles d’éclairage différents (c’est-à-dire à une photopériode normale avec un cycle journalier comprenant des successions jour/nuit et une photopériode altérée avec un éclairage en continu) et à une alimentation saine ou contaminée à une concentration retrouvée dans le milieu naturel (comme dit dans le point 5.5.1). 36 poissons seront ensuite soumis à des tests comportementaux d’une durée d’1 h : une fois placés individuellement dans un dispositif appelé « chambre de choix », ils pourront se déplacer dans des zones plus ou moins éclairées. Ceci permettra d’évaluer l’effet de leur conditionnement précédent (exposition à une photopériode altérée ou normale, alimentation saine ou contaminée), sur leur comportement en matière de choix d’ambiance lumineuse. Tous les poissons seront anesthésiés à diverses étapes pour la réalisation d’une prise de sang par individu, nécessaire à l’évaluation de leur niveau de stress via le dosage du cortisol suite à leur exposition. Ils seront ensuite tous euthanasiés aux diverses étapes du projet (pêche, tests d’éclairage et d’alimentation et des chambres de choix).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à d’éventuelles blessures (écaillage, lésions externes) et à un stress lors de leur capture, puis lors du transport et de la phase d’acclimatation à l’eau de rivière. Une mortalité, faible selon une précédente étude, est possible au cours de ces étapes. Duant le projet, 66 à 96 individus (selon la survie des surnuméraires) seront exposés à une absence totale de nuit pendant un mois. C’est l’effet de ce stress, mimant une exposition à la pollution lumineuse nocturne en milieu urbain, qui sera quantifié par l’expérimentation. Les effets attendus sont d’ordres comportemental (mobilité accrue, frénésie alimentaire) et physiologique (accumulation du cortisol dans le sang et excrétion de cortisol dans l’eau). Dans un deuxième temps, 66 à 96 individus selon la survie des surnuméraires seront exposés, pendant un mois, à une alimentation contaminée par le biocide à des doses similaires à celles que l’on retrouve dans la nature. Des effets physiologiques ou comportementaux pouvant potentiellement affecter l’état de santé des animaux sont là aussi possibles, mais ils sont difficiles à anticiper en raison du faible nombre, voire de l’absence, d’articles scientifiques à leur sujet. On peut toutefois, dans le pire des cas, s’attendre à des lésions internes, une modification du comportement des animaux (arrêt de la prise alimentaire, mobilité accrue ou au contraire comportement de prostration) voire une mortalité (bien que peu probable de par les faibles concentrations de polluant utilisées). Ce sont ces effets qui seront analysés. Enfin, 33 à 48 animaux selon la survie des surnuméraires seront soumis à ces deux facteurs de stress réunis : la pollution lumineuse et la pollution chimique dans l’alimentation. Les effets attendus sont identiques à ceux décrits précédemment, avec une intensité éventuelle plus importante liée au cumul des stress. Enfin, 36 poissons seront transférés individuellement dans les chambres de choix décrites dans le point 5.6.1 où ils seront isolés durant une heure, ce qui peut générer un stress important. Les effets attendus sont dans ce cas d’ordre comportemental (agitation ou prostration) et physiologiques (excrétion et accumulation de cortisol).

Devenir

Les 200 poissons impliqués seront tous euthanasiés pour des analyses de leurs tissus et organes.

Remplacement

L’expression du stress et les réponses comportementales complexes attendues par cette expérimentation ne peuvent pas être abordées par l’usage d’un modèle de remplacement simplifié (par exemple, des cultures cellulaires) en l’état actuel des connaissances. De plus, le choix d’une espèce sauvage très répandue dans les écosystèmes aquatiques urbanisés d’Europe, plutôt que d’un modèle biologique expérimental plus standardisé (poissons zèbres ou medaka par exemple) permettra d’optimiser les résultats du projet à large échelle et dans un contexte appliqué et adapté aux objectifs du projet de recherche.

Réduction

Le nombre total d’animaux utilisé correspond au strict minimum requis pour l’obtention de résultats fiables et interprétables vis-à-vis de la question de recherche abordée. Ce nombre a été contraint pour respecter le principe de réduction en se limitant à tester l’interaction entre absence ou présence d’un à deux facteurs de stress. Les nombres impliqués permettront néanmoins d’obtenir des conclusions statistiques robustes. Chaque lot de poissons impliqués est constitué d’un nombre minimum d’animaux suffisant dont un total de 63 mulets-porcs surnuméraires pour pallier une mortalité éventuelle au cours des étapes de l’expérimentation.

Raffinement

Les animaux ne seront manipulés à l’aide d’épuisettes à mailles fines que lorsque ce sera strictement nécessaire (étapes de capture/transport puis répartition dans les bacs d’accueil). Tous les transferts opérés sur le lieu de l’expérimentation se feront à l’aide d’un pichet avec couvercle, grâce auquel seront évités les émersions et les risques de blessure. Les pêches seront réalisées selon des protocoles utilisés en routine par notre établissement ce qui permettra d’en optimiser l’efficacité. Les poissons seront capturés avec des haveneaux de surface positionnés face au courant (pas de tractage actif) pendant 5 min seulement afin de limiter les dommages causés par le filet. La sélection d’individus immatures juvéniles limitera l’impact des pêches sur les ressources naturelles. Un traitement antibiotique post-pêche sera appliqué pour limiter l’incidence de pathologies pouvant affaiblir les poissons. Une surveillance quotidienne de leur état sanitaire et général sera garantie. Les poissons seront nourris à satiété avec un aliment dont l’appétence a été éprouvée au cours d’une précédente étude. Des mesures continues de température, salinité et oxygène dissous et hebdomadaires des produits azotés garantiront la qualité de l’eau. Les bassins offriront un espace de mobilité confortable aux animaux : en fonction des étapes du projet, la quantité de poissons par bac sera faible et donc garante de leur bien-être. Les poissons seront tout le temps conservés en groupe, ce qui correspond à leur mode de vie habituel, à l’exception d’une durée d’une heure pendant laquelle 36 poissons seront placés dans des chambres de choix comme évoqué précédemment. A l’exception de cette dernière étape, un couvercle transparent sera posé sur chaque bac pour éviter tout échappement (saut) tout en permettant la diffusion de la lumière et le contrôle des poissons par les animaliers sans les perturber. Les bacs seront nus car un abri serait de peu d’intérêt pour le mulet-porc qui est une espèce mobile grégaire se déplaçant dans la colonne d’eau en dehors des activités alimentaires sur le fond. Les bacs seront en matériau opaque de couleur sombre, ce qui permettra de les distinguer visuellement les uns des autres et de produire une ambiance proche de celle du milieu d’origine des poissons.

Choix des espèces

Le mulet-porc Chelon ramada est présent dans la majorité des masses d’eaux saumâtres urbanisées de climat tempéré, ce qui en fait un modèle d’étude pertinent pour aborder l’impact des stress urbains sur les écosystèmes aquatiques. Son statut de conservation est non-préoccupant et c’est l’espèce dominante dans la zone de pêche ciblée si bien que l’impact de sa capture sur les ressources naturelles sera minimisé. Les animaux seront des juvéniles de 10 ± 3 cm de longueur totale, un stade de développement où ils consomment exclusivement du biofilm. Les jeunes mulets constituent ainsi un vecteur essentiel des transferts d’énergie entre compartiments benthique (fond) et pélagique (colonne d’eau) des réseaux alimentaires. Cette caractéristique permet d’appréhender l’effet des stress urbains non seulement sur l’espèce cible mais plus largement sur le fonctionnement des écosystèmes aquatiques urbains où l’espèce est représentée. La sélection d’individus juvéniles limitera également les effets potentiels des captures sur les ressources naturelles. Leur forte capacité d’adaptation à l’eau salée et à l’eau douce permettra de faciliter leur acclimatation à l'eau douce au sein des dispositifs expérimentaux. Enfin, le savoir-faire scientifique et technique de notre équipe, ainsi que ses connaissances de l’espèce cible, permettront d’optimiser l’ensemble des interventions durant le projet.