Bien-être animal

216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une tumeur, reçoivent des injections de cisplatine et, pour 72 d'entre elles, subissent sous anesthésie une lésion musculaire provoquée par le froid. Le projet se présente comme une contribution aux 3R, censé vérifier si des cultures cellulaires pourraient un jour remplacer la souris, mais le porteur précise que les souris ne seront pas remplacées ici et que la comparaison avec le modèle animal reste "nécessaire". Toutes sont tuées pour prélever leurs tissus.

Objectifs

Il est évident que les cellules tumorales sont dans un environnement tridimensionnel dans les organismes vivants, recréer l’architecture correcte de tissu in vitro pour imiter l’effet du microenvironnement tumoral (TME) n’est pas une entreprise simple. Malgrès d'importants efforts qui ont été fait dans la création de modèle 2D et 3D dans ces analyses, ces methodes montrent encore d'importantes limitations. Les lignes directrices actuelles recommandent que les chercheurs qui utilisent l’expérimentation animale doivent se demander si et par quelle configuration alternative les animaux qu’ils envisagent d’utiliser pourraient être remplacés, si et comment leur nombre peut être réduit, et si et comment l’expérimentation animale pourrait être raffinée, c’est-à-dire être plus fiable avec la réduction du stress animale tout en obtenant une meilleure information avec un nombre inférieur d’animaux. Dans le but de fournir des bases empiriques à la recherche épistémologique, nous allons utiliser en parallèle des modèles animaux et cellulaires pour étudier la même question, c.a.d. comment le TME peut influencer la réponse tumorale aux agents chimiothérapiques. Nos resultats permettront de savoir si l'etude du TME des cellules cancereuses fait chez l'animale peut etre remplacer par des études in vitro.

Bénéfices attendus

La pertinence du TME pour les études cliniques et biologiques sur la pathophysiologie tumorale est maintenant établie, bien qu’étant une réalisation récente. En effet, le comportement des tumeurs et leur interaction avec l’hôte, allant de la réponse immunitaire à la cachexie induite par le cancer, sont si profondément affectés par le TME, que les études actuelles sur la progression du cancer et la réponse à la chimiothérapie ne peuvent plus ignorer cette question. Afin d'étudier la reproductibilité des modèles par des cultures cellulaires et tirer des conclusions de la comparaison de résultats issus de modèles in vitro et in vivo, nous avons la nécessité de l’utilisation des modèles animaux. Le but majeur de notre étude est de vérifier si les effets de la cisplatine sur la tumeur sont reproductible d'un modèle in vivo à un modèle in vitro, même en présence d’un microenvironnement tumoral assai réduit ou simplifié in vitro. La comparaison avec le modèle in vivo joue un rôle central dans les conclusions de l’étude et cela est le but premier de notre projet. Cela permettra d'établir des critères plus précis et spécifiques suivant les modalités des 3r, cad le remplacement (total avec le modèle in vitro), la reduction (nombre de souris), et le raffinement.

Procédures

Les souris seront soumis à differents types d'interventions: 1 injection de solution en SC sur animaux vigiles, elle durera 10 secondes. Elle concerne l'ensemble des 216 animaux. 4 injections en IP (à jours 7,11, 14 et 17) sur animaux vigiles, elle durera 10 secondes. Elle concerne l'ensemble des 216 animaux. 1 chirurgie, une blessure par le froid sous anesthesie à jours 14, la chirurgie est estimée à 6 min et le reveil entre 30 et 40 min. Elle concerne 72 animaux.

Impact sur les animaux

Les nuissances attendus chez les souris sont: masse tumorale dans la region dorsale des souris, fatigue et un stress, toxicité de la cisplatine, douleur musulaire suite à la blessure par le froid dans les premiers jour suivant l'intervention. Ces effets indésirables seront surveillés quotidiennement selon nos critères de point limite afin de mieux gérer le bien-etre des animaux.

Devenir

Toute le souris sont mises à mort à la fin de la procédure 1. La mise à mort se fera selon la réglementions européenne en vigueur. Afin de valider l'hypothèse qui est de savoir si les études fait chez l'animale peut être remplacer par des études in vitro dans l’analyse du microenvironnement tumorale(TME) des cellules cancéreuses, l'analyse des diffèrent tissus post mortem obtenu sur ces animaux est nécessaire afin de les comparer aux résultats que nous obtiendrons sur les études de culture cellulaire.

Remplacement

L'objectif général du projet est d'étudier la reproductibilité du modèles souris par rapport au modèle de cultures cellulaire. Nos objectifs spécifiques sont de voir si on peut mesurer les mêmes effets d’un puissant agent chimio thérapeutique, la cisplatine, sur les cellules tumorales in vivo et in vivo, en comparant les résultats obtenus sur un modèle souris porteur de tumeur aux résultats sur une culture de cellules isolées. Pour cela, nous allons développer un système de cultures cellulaires C26 en 2D ainsi que 3D lesquelles permettront de se rapprocher le plus possible au microenvironnement tumoral in vivo. Les souris ne seront pas remplacées dans cette étude. En revanche, les résultats nous dirons si et jusqu’à quel point dans le future nous pourrons remplacer le modele animal, dans des études similaires futures

Réduction

Pour estimer le nombre minimum d'animaux nécessaire, nous avons effectué un calcul statistique réitératif. De plus, nous disposons de l’expérience préalable formalisé dans l’appréciation rétrospective avec ce même modèle animal. De cette approche, nous avions prévu que 18 souris pour chaque condition expérimentale pour un totale de 216 souris, avec un niveau de confiance du 95% et une puissance de 80. Les outils statistiques et informatiques que nous mettons en place sur la base de notre expérience avec ce type de modèle permettront de réduire le nombre de manipulations en exploitant au mieux les données obtenus par chaque expérience.

Raffinement

Pour améliorer les conditions de vie des souris et leur éviter le stress, les pratiques suivantes seront mises en place. Nous avons défini les variables et la méthode d’évaluation quantitative du point limite au-delà duquel les animaux recevront un analgésique ou seront euthanasiés : des intervention différentes (de l’administration d’analgésique jusqu’au l’euthanasie) seront mises en place selon le score obtenue. A savoir que ce modèle expérimental a une cinétique de développent de la pathologie très bien connue, permettant de programmer les expériences de maniere à ne pas arriver aux points limites. Pour des pratiques plus invasives, tel que la génération d’un dommage musculaire afin d’étudier la régénération , l’anesthésie totale sera pratiquée, suivie d’un traitement analgésique. L’expérimentation animale sera effectuée par une équipe entrainée à cette technique. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum) et l'isolement est évité (3 souris par cage minimum). L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de lanières de papier Kraft afin que les souris puissent faire un nid. Afin de diminuer le stress des animaux, une maison en carton sera ajoutée dans la cage. Enfin, les animaux seront manipulés quotidiennement afin de les habituer aux manipulations et ainsi diminuer leurs stress le jour des experimentations.

Choix des espèces

La souche BALB/c est la seule compatible avec la tumeur 26, qui a été sélectionné car non métastatique, et sur cette base nous avons privilégié cette souche.. La connaissance détaillée du modèle nous permet d’une part d’exploiter au maximum les informations expérimentales obtenues et d’autre parte d’avoir une sensibilité particulaire pour évaluer tout signe de souffrance ou malaise de ces souris en présence de tumeur.

40 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est sédaté puis reçoit une injection intramusculaire unique d'un produit vétérinaire au fer, avant mise à mort et prélèvement du muscle pour mesurer l'absorption. Le porteur précise que ce test in vivo est exigé par la Pharmacopée Chinoise pour l'autorisation de produits déjà commercialisés en France, et qu'un de ses objectifs est de démontrer que les contrôles physico-chimiques français suffiraient pour s'en affranchir. Il conclut qu'aucune méthode substitutive n'existe et que le recours au lapin reste "nécessaire", tout en reconnaissant travailler à le rendre inutile.

Objectifs

Les injections de fer sont très souvent utilisées chez les jeunes animaux de rente (porcins, ovins, caprins, bovins…) dans le cadre de la prévention et du traitement de l’anémie ferriprive après la naissance. Dans le cadre de l’élevage porcin, les injections de fer sont presque systématiquement réalisées dans les 3 jours suivant la naissance. La Chine est le 1er producteur de porcs au monde et un marché important pour les industries pharmaceutiques vétérinaires. Ce projet est réalisé dans le cadre de demande d’Autorisation de Mise sur le Marché (AMM) en Chine de produits vétérinaires injectables composés de fer, possédant déjà des AMM en France. A chaque libération d’un nouveau lot de ces produits en France, un contrôle qualité est réalisé à l’aide de différents tests physico-chimiques décrits dans la Pharmacopée Européenne. Pour la commercialisation sur le marché chinois, les autorités chinoises demandent la réalisation d’un test in vivo d’absorption du fer au point d’injection chez le lapin. Ce test fait partie des tests de contrôle qualité réalisés lors de la libération de lots de produits contenant du fer en Chine. Il permet de valider la qualité du lot en analysant l’absorption du fer après une injection unique et de s’assurer que la quantité de fer non absorbée au niveau du point d’injection ne dépasse pas 20% de la quantité injectée. Le but de cette vérification est de s’assurer que chaque lot commercialisé est conforme, et que le produit est sûr, aussi bien pour la santé animale que pour la consommation humaine. Ce projet a donc 2 objectifs : 1) la réalisation du test d’absorption de fer au point d’injection demandé par les autorités chinoises dans le cadre d’une demande d’AMM. 2) démontrer que les contrôles physico-chimiques réalisés en France sont suffisants pour pouvoir s’affranchir de l’utilisation de lapins lors de la libération de chaque lot de produit commercialisé sur le marché chinois.

Bénéfices attendus

1) Obtenir l’autorisation de mise sur le marché en Chine des produits testés. Ainsi, chaque lot commercialisé et autorisé sera conforme et sûr, aussi bien pour la santé animale que pour la consommation humaine. En effet, ce projet va permettre de valider en Chine des produits permettant de lutter contre l’anémie ferriprive rencontrée dans les élevages. 2) Prouver que les contrôles physico-chimiques réalisés en France sont suffisants pour pouvoir s’affranchir de l’utilisation de lapin lors de la libération de chaque lot de produit commercialisé sur le marché chinois.

Procédures

Les animaux utilisés seront sédatés avant de recevoir une injection unique de produit testé. La sédation va permettre de diminuer le stress de l’animal et faciliter sa contention. Ceci facilitera également l’injection qui doit être réalisée précisément dans le muscle vaste médial. Après euthanasie des animaux, des prélèvements du muscle étudié seront réalisés afin d’analyser ce muscle et obtenir les résultats du test d’absorption. Les interventions seront de courte durée et ne seront réalisées qu'une seule fois par animal puisqu'ils seront in fine euthanasiés.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : stress dû à la mise à jeun la veille de la sédation et stress dû à la contention pour la réalisation de la sédation.

Devenir

Les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort afin de pouvoir prélever et analyser le muscle injecté étudié. Ces prélèvements de muscle sont primordiaux pour répondre aux objectifs de ce projet.

Remplacement

Le test d’absorption du fer au point d’injection est une procédure expérimentale in vivo demandée par la réglementation chinoise, dans le cadre de la commercialisation sur le marché chinois de produits vétérinaires composés de fer. L’absorption de fer est un processus dynamique nécessitant le passage de la molécule étudiée du site d’absorption vers le sang pour pénétrer dans la circulation systémique. Ce type d’étude doit se réaliser sur animaux. Cependant, l’un des buts de ces études est de démontrer que les contrôles qualité réalisés en France sont suffisants pour permettre à terme de s’affranchir de l’utilisation d’animaux pour chaque nouvelle libération de lot. Afin de démontrer ceci, l’utilisation d’animaux est ici nécessaire et aucune méthode substitutive n’existe. En effet, l’utilisation des animaux dans le cadre de ce projet, ne peut pas être remplacée par des méthodes alternatives n’impliquant pas l’utilisation d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet a été calculé à partir des directives mentionnées dans la Pharmacopée Chinoise, dans laquelle il est stipulé qu’il faut utiliser 2 animaux par lot testé, et à partir des besoins pour le projet (estimation du nombre de lots à tester sur la durée du projet). Sur deux ans, il a été estimé que 20 lots seraient testés soit 40 lapins au total.

Raffinement

Méthodes de raffinement: 1) Tout au long de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Afin de les maintenir, les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, afin d’augmenter leur bien-être, les animaux seront hébergés collectivement dès que possible et disposeront d’un environnement enrichi (foin/paille, bois à ronger, chaînette, de quoi se cacher et grimper...). Si, selon les besoins, les animaux doivent être hébergés individuellement, ils auront un contact visuel et/ou olfactif avec leurs congénères. 2) Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. L’administration du traitement prescrit devra être réalisée par une personne habilitée. 3) Pour diminuer le stress de l’animal et faciliter la contention pour l’injection, l’animal sera sédaté avec un produit adapté. Il est primordial dans ce projet que l’injection soit réalisée précisément au niveau du muscle vaste médial et pour cela l’animal ne doit pas bouger durant l’injection. 4) Surveillance accrue de l’animal durant la sédation et l’injection. Grâce à ces différentes méthodes, le bien-être de l’animal sera respecté et sa douleur, souffrance et angoisse seront d’abord réduites puis supprimées. Ainsi, la manipulation sera réalisée dans les meilleures conditions possibles.

Choix des espèces

Le lapin a été choisi pour ce projet car c’est cet animal qui est demandé et décrit dans la Pharmacopée Chinoise pour la réalisation de tests d’absorption du fer au site d’injection. Conformément à la Pharmacopée Chinoise, les animaux utilisés seront des adultes pesants entre 1,5 et 2,5 kg.

28 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, gardés vivants puis réutilisés pour des travaux d'enseignement ou proposés à l'adoption. Une inflammation douloureuse est provoquée à la patte par injection de kaolin sous anesthésie, avec un pic de douleur autour de 24 heures, pour tester un candidat vaccin anti-NGF censé soulager les douleurs d'arthrose. Les chiens subissent aussi jusqu'à huit prélèvements sanguins et l'administration du vaccin ou d'un traitement de comparaison. Le porteur affirme que le modèle est "complètement réversible" au bout de huit semaines et justifie l'étude par la "nécessité" de tester la réponse de l'"organisme entier" chez l'espèce cible.

Objectifs

Le NGF (Nerve Growth Factor) est un polypeptide impliqué dans la croissance, la prolifération et la survie des neurones et d'autres cellules. Le NGF semble aussi jouer un rôle important dans la sensiblisation des nocicepteurs après une blessure tissulaire. Il a été montré que l'inhibition par un anticorps monoclonal de la signalisation cellulaire médiée par le NGF permet de soulager les douleurs ostéoarticulaires. Un nouvel anticorps monoclonal, le bedinvetmab, est récemment disponible en médecine vétérinaire pour soulager ces douleurs ostéoarticulaires chez le chien. Un nouveau candidat vaccin est également à l'étude pour sa capacité à favoriser la production d'anticorps anti-NGF endogènes. Les objectifs de notre projet sont: (1) de tester chez le chien, l'efficacité de ce nouveau candidat vaccin sur la réduction de la douleur dans un modèle de douleur inflammatoire au kaolin, (2) de comparer l'efficacité de ce nouveau candidat vaccin à celle du bedinvetmab (Librela®), (3) de quantifier les concentrations en anticorps monoclonaux aux cours du temps après administration du candidat vaccin, (4) de vérifier que l'inhibition de la signalisation cellulaire médiée par le NGF ne perdure pas quand une nouvelle douleur apparait à distance de la vaccination.

Bénéfices attendus

L'arthrose est un maladie dégénérative, incurable et douloureuse dont la prévalence chez le chien est supérieure à 20%. Ce chiffre est par ailleurs en constante augmentation du fait de l'allongement de la durée de vie des animaux et de facteurs aggravants comme l'obésité. Cette pathologie entraine une douleur et un handicap majeur avec perte de mobilité et état dépressif de l'animal. Les premiers résultats des thérapies impliquant des anticorps monoclonaux sont prometteurs quand à l'amélioration de la qualité de vie de nos animaux. Cependant, la nécessité de renouveller les administrations de bedinvetmab régulièrement (en général tous les mois) présente le risque d'une mauvaise observance par le propriétaire de l'animal. Il est intéressant de déterminer ici si la mise en place d'un vaccin permettant l'activation d'anticorps endogènes pourrait permettre de prolonger la durée d'efficacité du traitement et d'espacer les administrations.

Procédures

1) Administration du candidat vaccin ou du placebo à 14 animaux; 2 administrations; 1 minute maximum; 2) Administration du bedinvetmab ou de meloxicam à 14 animaux; 1 seule administration; 1 minute maximum; 3) Prélèvements sanguins pour sérologie; 3 prélèvements sur 14 animaux et 8 prélèvements sur les 14 autres animaux; 1 minute maximum; 4) Administration de kaolin en sous-cutanée sous anesthésie générale; 1 seule fois pour 14 animaux et 2 fois pour les 14 autres animaux; 30 minutes/animal; 5) Pesée hebdomadaire de tous les animaux; 5 à 10 minutes/animal; 6) Mesures des paramètres pharmacodynamiques; 1h/jour/animal au minimum pour chaque jour de mesure.

Impact sur les animaux

Vu les très bons résultats d'innocuité obtenus après administration d'anticorps monoclonaux exogènes, il y a très peu de risque de réaction au vaccin. La nuisance majeure va résider dans la création d'une inflammation à la patte par administration de kaolin en sous-cutanée. Cependant, ce modèle a déjà été utilisé par la passé et présente l'avantage d'induire une inflammation limitée dans le temps et totalement réversible, ce qui permet de replacer les chiens sans sequelles après ce type d'étude. En effet, le pic de douleur survient autour de 24h après l'administration de kaolin. Cette douleur plus aiguë disparaît ensuite rapidement (autour de 48-72h) même lors d'un traitement placebo. Des paramètres moins critiques comme une diminution d'oedème au niveau de la patte (altérant peu les déplacements du chien mais permettant tout de même de mesurer l'efficacité d'un anti-inflammatoire) perdurent ensuite jusqu'à 10-15 jours après l'administration de kaolin. Enfin, le modèle est complétement réversible au bout de 8 semaines sans séquelle pour les chiens. Il est à noter également que le candidat vaccin étant administré avant induction de l'inflammation, le pic de douleur devrait être plus faible pour ce groupe.

Devenir

Les animaux seront gardés en vie à l'issue de la procédure. Ils pourront être réutilisés pour des travaux d'enseignement (procédures légères) après accord du vétérinaire référent de l'Etablissement Utilisateur ou seront proposés à l'adoption. Le modèle étant complétement réversible au bout de 8 semaines sans séquelle pour les chiens, la réutilisation ou le placement des animaux pourra intervenir dès les 2 mois suivant la dernière inflammation au kaolin.

Remplacement

Le but de ce projet étant de tester la réponse de l'organisme entier à un vaccin (efficacité contre une douleur inflammatoire, cinétique d'anticorps, absence de réaction au vaccin), il n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet. Cependant, les études sont menées sur l'espèce cible pour laquelle le vaccin souhaite être mis sur le marché.

Réduction

Nous souhaitons déterminer si le nouveau candidat vaccin est au moins aussi efficace que le bedinvetmab pour réduire une douleur d'origine inflammatoire chez le chien. Pour déterminer le nombre n d'animaux par groupe, un calcul de puissance a été donc effectué à partir de données de la littérature sur l'effet du bedinvetmab sur la réduction de la douleur chez des chiens atteints d'ostéoarthrose. Le calcul de puissance utilisé était le suivant: nA=2x(s2/Δ2)x(za/2-zpuis)2, avec nA le nombre de sujets par groupe, s2 la variance du paramètre à mesurer, Δ la différence minimale attendue pour ce paramètre, zα/2=1.96, zpuis=-0.842. De plus, la résistance à/la sensation de douleur étant un paramètre qui peut être influencé par le sexe, le nombre d'animaux par groupe a été doublé afin d'avoir n mâles et n femelles dans chaque groupe. Enfin, un animal par groupe a été ajouté au cas où un des animaux devrait être exclu de l'étude pour cause de traitement concomitant visant à réduire une douleur trop importante causée par l'administration de kaolin.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés aux conditions du laboratoire puis entraînés aux manipulations pendant 25 jours avant l'administration du vaccin, et le seront aussi entre l'administration du vaccin et la réalisation de l'inflammation. Cela permettra de les habituer en douceur aux différents manipulateurs et d'obtenir des mesures de paramètres fiables tout au long du projet. De plus, les deux principaux expérimentateurs qui seront en charge des animaux tout au long du projet sont formés en éducation canine ainsi qu'aux différentes techniques de medical training. Les animaux seront hébergés en groupe dans des boxs comportant des jouets et auront accès quotidiennement à des courettes extérieures.

Choix des espèces

L'espèce animale choisie est l'espèce cible pour laquelle le vaccin souhaite être mis sur le marché. Les animaux seront âgés de 8 mois à leur arrivée, leur jeune âge facilitant leur capacité d'apprentissage et d'entrainement aux différentes mesures qui seront effectuées. Il ne faut pas d'animaux de moins de 6 mois car leur système immunitaire n'est pas encore totalement mature et différe trop de celui des chiens adultes voire plutôt âgés pour lesquels le vaccin souhaite être développé. L'étude sur des animaux âgés ou souffrant de problèmes ostéoarticulaires sera effectué par la suite en fonction des résultats obtenus au cours de ce projet.