Diagnostic des maladies

Injectés sous la peau, intubés jusqu'à trente minutes, puis opérés du thorax pour reproduire un infarctus du myocarde, 180 rats de huit semaines vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Suivent trois à cinq anesthésies générales d'une heure pour les séances d'imagerie, deux à quatre injections intraveineuses et une injection intrapéritonéale par animal. Le porteur indique que l'opération peut induire une insuffisance cardiaque, une perte de poids et un affaiblissement, et que les examens d'imagerie génèrent eux aussi du stress. Tous sont tués à l'issue pour que leurs tissus soient analysés ex vivo.

Objectifs

Après la phase aiguë d'un infarctus du myocarde, un processus de réparation et de formation de tissu cicatriciel, appelé fibrose, est déclenché pour combler la région endommagée et éviter la rupture du coeur. Cependant la fibrose peut se développer au delà de la zone atteinte par l'infarctus, entraînant une diminution de la force contractile du coeur et conduire à de l'insuffisance cardiaque, source de morbidité et de mortalité. La détection le plus précocement possible de la fibrose, sa localisation et sa quantification précise sont donc essentielles dans la prise en charge des patients post infarctus. Le but de ce projet est la détection précoce par imagerie médicale non invasive de la fibrose cardiaque dans l'infarctus chez le rat.

Bénéfices attendus

Les méthodes testées dans ce projet pourraient émerger comme outils de diagnostique précoce pour le suivi de la fibrose cardiaque et l'évaluation de nouveaux traitements à la fois dans l'infarctus du myocarde, mais aussi pour d'autres pathologies cardiaques.

Procédures

Un premier groupe de rats subira : Injection sous-cutanée (

Impact sur les animaux

Des effets indésirables peuvent être attendus suite aux actes chirurgicaux, telle qu’une douleur modérée et de courte durée liée à l’opération et aux points de suture, bien que ces actes soient menés sous anesthésie générale gazeuse. Suite à l'opération, une insuffisance cardiaque peut être induite et entrainer des effets indésirables comme par exemple une perte de poids et un affaiblissement de l’animal. Au cours des injections intraveineuses, intrapéritonéales et sous cutanées les animaux peuvent ressentir du stress et de l’inconfort lors de la manipulation et une douleur légère et de courte durée au niveau du lieu d’injection. Un stress peut également être généré lors des examens d'imagerie médicale, qui nécessitent manipulation et anesthésie.

Devenir

A l'issue de ce projet, tous les animaux seront mis à mort afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses ex vivo nécessaires au projet.

Remplacement

Il n’existe pas aujourd’hui de modèle alternatif pour tester les méthodes non invasives de détection et de quantification du développement de la fibrose cardiaque suite à un infarctus. Le développement de fibrose musculaire est un processus physiologique global faisant interagir différents types cellulaires, dont certains issues de différents organes. De plus, les méthodes de détection testées dans ce projet sont des méthodes d'imagerie médicale qui ont vocation à être appliquées ensuite chez l'homme. Ce projet ne peut donc pas être réalisé in vitro.

Réduction

Le nombre maximal d'animaux nécessaire a été évalué à l'aide d'un logiciel d'aide à l'expérimentation animale, proposant un outil de calcul statistique. Les groupes ont été établis de façon à ce que les résultats obtenus soient suffisants statistiquement pour conclure sur la bonne détection de la fibrose par des méthodes d'imagerie. Le nombre d'animaux obtenu est cohérent avec les expériences précédentes de protocoles d'imagerie lors desquels des résultats statistiquement significatifs et reproductibles ont pu être obtenus. Les données générées seront ensuite analysées à l'aide de tests statistiques appropriés.

Raffinement

Le suivi quotidien des animaux par un personnel qualifié (zootechniciens et expérimentateurs) avec une surveillance post-opératoire accrue et la mise en place de points limites adaptés permettront d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur, d’abord par l’injection d’antalgiques et par une mise à mort anticipée dans le cas d’atteinte de plusieurs points limites. L'ensemble des chirurgies de ce projet seront réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie pré- et post-opératoire. Les méthodes d'imagerie utilisées dans ce projet sont non invasives et non douloureuses. Elles nécessitent l'anesthésie des animaux afin qu'ils restent immobiles pendant l'examen.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi est le rongeur qui est le modèle le plus courant pour les études de l’ischémie du myocarde. Le rat a été choisi pour la comparaison des études en scintigraphie de la littérature. De plus, la taille du rat et son rythme cardiaque plus lent par rapport à la souris facilitent le succès des études en imagerie cardiaque non invasive. Les infarctus du myorcade affectent principalement les êtres humains à l'âge adulte. Des rats de 8 semaines seront utilisés car c’est l’âge ou les animaux sont de jeunes adultes ayant atteint la maturité.

Jusqu'à quatre-vingt-dix administrations de traitement en trois mois, neuf séances d'imagerie de quatre-vingt-dix minutes sous anesthésie et douze prélèvements sanguins par animal : 3 600 souris et 200 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour prélever sang, tumeur et organes. Certains reçoivent une greffe tumorale, et les séances d'imagerie peuvent être précédées d'une mise à jeun de quinze heures. Le laboratoire vend ces prestations d'imagerie et de radiothérapie interne à des équipes extérieures, en mettant en avant des équipements "équivalents voire supérieurs" à ceux de l'imagerie humaine. Une partie des souris est immunodéprimée pour faciliter la prise des greffes de tumeurs humaines, d'autres sont génétiquement modifiées pour développer les pathologies étudiées.

Objectifs

Le laboratoire prend en charge des projets scientifiques en proposant plusieurs techniques d’imageries expérimentales chez l’animal de laboratoire, avec des performances technologiques équivalentes voire supérieures à celles des équipements correspondants pour l’imagerie humaine. Des agents de contraste ou des radiotraceurs sont utilisables pour chacune des modalités, et se caractérisent notamment par leur capacité à marquer les espaces vasculaires et interstitiels, ou des évènements moléculaires et cellulaires spécifiques de pathologies (cancéreuses, cardiovasculaires, rénales, métaboliques, neurologiques). L’imagerie anatomique de scanner par rayons-X est en général choisie pour sa grande résolution spatiale. Elle apporte des informations structurelles dans les pathologies affectant le squelette. En effet, elle est largement utilisée pour étudier la structure et la densité osseuse chez les rongeurs. L’imagerie nucléaire permet-elle de l’imagerie fonctionnelle moléculaire et cellulaire et présente la sensibilité la plus importante pour détecter des tissus dont les caractéristiques métaboliques ou biologiques sont anormales. Elle permet de mesurer l’activité métabolique ou moléculaire d'un organe ou d’un tissu grâce à un produit radioactif injecté au préalable (traceur). Cette approche d’imagerie est non invasive. Le laboratoire propose également la réalisation d’études théranostiques, c’est-à-dire de diagnostic couplé à la thérapie. En effet, une thérapie spécifique peut être envisagée de type chimiothérapie, immunothérapie, hormonothérapie ou bien encore le radiotraceur peut être thérapeutique (thérapie innovante appelée : radiothérapie interne vectorisée). Les études d’imageries pourront permettre de suivre l’efficacité de ces traitements. L’objectif de ce projet est donc de pouvoir prendre en charge des études nécessitant de l’imagerie anatomique ou nucléaire, couplée ou non à de la thérapie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet sont a) de réaliser des études d'imageries innovantes et non invasives permettant d'utiliser moins d'animaux pour obtenir des résultats fiables b) d'utiliser ces résultats chez l'Homme pour proposer des thérapies classiques adaptées ou des thérapies très innovantes comme la radiothérapie ciblée qui détruit précisément les cellules malades tout en limitant les effets sur les tissus sains.

Procédures

Les animaux pourront avoir une greffe tumorale (sous anesthésie, 1 fois, 10 minutes). Les animaux seront suivis par imagerie non invasive (sous anesthésie, 3 fois par semaine maximum et au total 9 imageries possible sur tout le protocole, 90 minutes maximum). Ces imageries pourront être précédées d'une mise à jeun de 15h maximum. Ils pourront également suivre une thérapie (animal vigile ou anesthésié suivant la voie de thérapie, 90 fois maximum pendant 3 mois pour certaines administrations, quelques minutes, 24 fois maximum pour d'autres) avec un suivi par prélèvement sanguin (animal vigile, 12 fois maximum pendant 3 mois, quelques minutes). En fin d'étude un dernier prélèvement de sang sera réalisé (animal anesthésié, 1 fois, quelques minutes).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront développer un phénotype dommageable pouvant entrainer une sensibilité accrue aux infections, ou des douleurs modérées ou une réduction de la mobilité. Les animaux seront soumis à des anesthésies (greffe, imageries) qui pourront engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Ils pourront également ressentier de la douleur modérée et une perte légère de mobilité suite à la croissance des tumeurs greffées. L'administration des traitements pourront induire un stress aux animaux. Les injections intrapéritonéales et intramusculaires pourront induire une douleur légère au point d'injection. Les injections intraveineuse pourront induire une douleur légère au point d'injection et une irritation de la queue. Les administrations par voie orale pourront induire une irritation de l'oesophage et une fausse route dans de rares cas. Les traitements pourraient induire une perte de poids avec une altération de l'état général des animaux. Les prélèvements sanguins pourront induire une douleur légère de courte durée au point de prélèvement et un hématome dans de rares cas.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de réaliser des prélèvements pour analyse (sang, tumeur, organes).

Remplacement

Pour étudier la cinétique de biodistribution de nouveaux radiotraceurs, il n'existe aujourd'hui aucun modèle non vivant qui pourrait mimer le modèle animal vivant. Nous n'avons donc pas la possibilité de remplacer le modèle vivant utilisé.

Réduction

Ce projet nécessitera 3600 souris et 200 rats maximum sur les 5 ans d'autorisation. Ce nombre permettra de pouvoir conclure sur l'interêt d'un radiotraceur ou d'un traitement dans une certaine pathologie grâce à une bonne puissance statistique. Le nombre d'animaux a été réduit, notamment par l’utilisation de l’imagerie non invasive sous anesthésie qui permet des analyses corps entier en 3D et un recueil de données longitudinales.

Raffinement

Tous les animaux bénéficieront d'une période d'acclimatation à l'animalerie d'au moins 7 jours. Pour minimiser les dommages aux animaux, ils bénéficieront d’un environnement enrichi (outil de nidification, maisonnettes, ou batonnets à ronger) et du maintien de l’interaction sociale en étant groupés, et resteront sous surveillance tout au long du projet. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Plusieurs indicateurs physiologiques et comportementaux permettront de suivre le bien-être de l’animal. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. La douleur et le stress sont limités en apportant une anesthésie gazeuse pour les actes techniques ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

Nous travaillons avec des souris immunodéprimées car les greffes de tumeurs humaines sont facilitées et validées sur ces animaux. Nous utiliserons également des souris avec un système immunitaire actif pour les greffes de tumeurs murines. Nous utiliserons des animaux génétiquement modifiés suceptibles de développer certaines pathologies afin de les étudier grâce à l'imagerie. Nous utiliserons des rats pour réaliser des tests d'imagerie de radiotraceurs et ou produits de contraste sur des plus gros rongeurs. Les rats seront utilisés à l'âge de 12 semaines au stade de jeunes adultes et jusqu'à 17 semaines de vie maximum. Les souris seront utlisées à l'âge de 4 à 5 semaines au stade de jeunes adultes ou entre 1 et 3 mois de vie suivant le développement du phénotype le cas échéant. Le stade jeune adulte pour les rongeurs facilite la prise des greffes. Pour les lignées transgéniques, l'âge sera justifié par le développement du phénotype (entre 1 et 3 mois).

Pour entretenir un élevage de tiques au laboratoire, 20 lapines adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, à raison d'une lapine par repas sanguin, trois à quatre fois par an pendant cinq ans. Chacune est tondue sur un quart de la surface du dos, porte deux capsules collées à la peau et un gilet vétérinaire, puis reste douze jours seule en cage pendant que les tiques la piquent par intermittence. Le porteur décrit un stress thermique le temps que les poils repoussent, une gêne de trois jours due aux capsules, un prurit de cinq à sept jours et un stress d'isolement sur toute la durée. 15 lapines seront proposées à l'adoption et 5 tuées pour prélèvement d'organes, le porteur indiquant qu'un gorgeur artificiel existe mais n'obtient que 25 % de repas réussis, ce qui rend selon lui le recours au lapin "encore nécessaire".

Objectifs

L’objectif de ce projet est l’utilisation de lapins pour entretenir et maintenir un élevage de tiques en laboratoire. Les tiques serviront par la suite à réaliser diverses expériences nécessitant l’utilisation de cet acarien hématophage (qui se nourrit exclusivement de sang). Nous utiliserons les tiques pour réaliser des infections expérimentales avec divers agents pathogènes afin d’analyser leur transmission et comprendre la relation entre l’hôte vecteur et le pathogène, pour développer de nouveaux protocoles d’identification de tiques par biologie moléculaire ou encore pour tester des molécules acaricides ou répulsives. Nous collecterons également du sang sur 5 lapins pour étudier le système immunitaire de ces animaux après un cycle de gorgement des tiques.

Bénéfices attendus

Les lapins qui serviront dans la procédure de ce projet, permettront d’entretenir un élevage de tiques dans le laboratoire. Les tiques sont de très importants vecteurs de micro-organismes pathogènes à la fois pour les animaux et pour l’être humain. Pour lutter contre les tiques il est indispensable de connaitre leur biologie et leur physiologie, ce qui ne peut se faire que grâce à un élevage maintenu en laboratoire. Outre l’acquisition de connaissances, cet élevage permettra aussi de tester de nouvelles molécules acaricides dites « naturelles » pour en évaluer l’efficacité. Enfin, nous utiliserons ces tiques pour mettre en place de nouveaux protocoles d’identification moléculaire des différentes espèces. Du sang sera collecté sur des lapins ayant eu une procédure de gorgement pour étudier l’immunité « anti-tique » développée chez ces lapins.

Procédures

Tonte de 5 minutes pratiquée avec une tondeuse électrique vétérinaire. Pose de deux capsules et d’un gilet (quelques minutes) sur la peau des lapins. Dépôt des tiques sur la peau du lapin, piqures par les tiques (12 jours de contact, piqure par intermittence). Prise de sang (quelques minutes).

Impact sur les animaux

Lors de la procédure expérimentale le lapin pourrait ressentir un stress physique de 5 minutes environ pendant la tonte qui doit être pratiquée avec une tondeuse électrique vétérinaire. Le lapin rasé au niveau du dos (25% de sa surface) pourrait ressentir un stress thermique le temps que les poils repoussent soit environ une douzaine de jours. Les deux capsules, où sont placées les tiques pendant la procédure, collées avec une colle latex non toxique, pourront gêner le lapin pendant environ 3 jours, le temps que l’animal s’habitue. Pour limiter l’accès du lapin aux capsules, il porte pendant la durée de la procédure un gilet vétérinaire qui peut occasionner un stress physique pendant 24 à 48h. Lors du dépôt des tiques sur la peau du lapin, un stress physique de quelques minutes pourra être ressentie. Un prurit pourrait apparaitre lors du repas sanguin des tiques soit environ 5 à 7 jours maximum. Les lapins seront hébergés individuellement le temps de la procédure de repas sanguin qui dure 12 jours, cela pourrait induire un stress d’isolement pendant la durée de cette période. Un stress physique d’environ 5 minutes sera ressenti pendant la prise de sang ainsi qu’une douleur de piqure de sévérité légère de courte durée (3 secondes).

Devenir

15 des 20 lapins seront proposés à l’adoption. 5 lapins seront mis à mort à la fin de la procédure pour récupérer des organes.

Remplacement

Les tiques sont des animaux hématophages stricts : le repas sanguin sur un animal vertébré est donc obligatoire pour leur métamorphose et donc les maintenir en élevage. Un système de repas sanguin artificiel sera utilisé dès que possible afin de ne pas utiliser de lapin. A l’heure actuelle, ce n’est pas un système totalement optimal (on obtient une efficacité de repas sanguin de 25% en moyenne pour les tiques déposées sur le gorgeur artificiel) ce qui ne permet pas d’obtenir suffisamment de tiques pour maintenir une colonie ou lors d’un besoin ponctuel de nombreux individus. Le recours à un lapin est donc encore nécessaire. En revanche le repas sanguin sur ce système artificiel sera utilisé pour les larves (disponible en très grand nombre) et pour les infections expérimentales.

Réduction

Les tiques sont des acariens hématophages pour qui le repas sanguin est obligatoire pour leur métamorphose et donc pour entretenir un élevage Ces repas sanguins sont réalisés au laboratoire tous les 3 - 4 mois sur des lapins. Nous réaliserons donc entre trois et quatre procédures de repas sanguin par an pendant toute la durée de ce projet. Chaque procédure sera réalisée avec 1 lapin. Nous utiliserons donc au maximum pendant les 5 années du projet 20 lapins. Le nombre d’animaux que nous estimons nécessaire repose sur notre expérience de la conception d’études de ce type. Un système de repas sanguin artificiel permet de réduire le nombre de lapin dans ce projet. Pour ce dispositif les tiques sont placées dans un flacon de culture cellulaire percé sur sa face supérieure pour y adapter un gorgeur en verre. Ce gorgeur est fermé à sa base avec une peau de lapin pour que les tiques puissent se fixer et il est rempli de sang de mouton défibriné maintenu à 37°C qui sera changé deux fois par jour, pour que les tiques puissent se nourrir. Nous l’utiliserons pour le nourrissage des larves de tiques et lors des expériences d’infection expérimentales des tiques.

Raffinement

Nous veillerons à ce que la réalisation de ce projet soit conforme aux exigences de raffinement liées à l’expérimentation animale. L’absence d’effets indésirables sera contrôlée au cours de l’expérience et des points limites spécifiques sont mis en place, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis de la procédure. La présence d’un prurit important, une déshydratation, un comportement anormal des lapins seront surveillés comme des indicateurs d’effets indésirables. Si l’un de ces indicateurs est atteint, le lapin sortira de la procédure et le protocole de repas sanguin sera arrêté. La consultation du vétérinaire référent permettra de mettre en place un traitement correctif pour cet animal. Les lapins seront maintenus dans des portoirs conventionnels (le milieu est enrichi avec des jouets et des balles autoclavables, hébergement en cage collective pour éviter les stress d'isolement) permettant ainsi l’interaction entre les individus. Lorsque les lapins arrivent de chez le fournisseur, ils resteront 7 jours minimum dans la pièce d’hébergement avant d’entrer dans la phase d’habituation à la procédure. Le lapin en expérimentation sera séparé du groupe, afin d’éviter que les individus non appareillés viennent défaire le gilet et abîmer les capsules du lapin en expérimentation. Même individualisé, les lapins auront un contact auditif et olfactif avec les autres lapins. Les lapins seront habitués à la manipulation une semaine en amont du repas sanguin pour l’habituer à l’opérateur et à la procédure. Nous ferons fonctionner la tondeuse quelques minutes à proximité du lapin la semaine avant le repas sanguin pour l’habituer au bruit. Nous enfilerons le gilet au lapin 3 ou 4 fois la semaine précédant l’expérimentation. Le lapin le gardera quelques minutes à chaque fois. Nous placerons les animaux qui subiront une prise de sang dans un sac de contention plusieurs fois et pendant 5 minutes la semaine précédant l’expérimentation. Pendant le repas sanguin, nous surveillerons l’apparition d’une réaction allergique ou un des effets indésirables cité au début de ce paragraphe. Une crème anti-démangeaison pourra être appliquée sur recommandation du vétérinaire référent si on constate la présence d’un prurit ou d’une allergie à la piqure des tiques. On limitera le nombre de tiques par lapin au strict minimum pour éviter toute spoliation sanguine des lapins.

Choix des espèces

Nous utiliserons des lapins car les tiques présentent des spécificités d'hôtes relativement strictes et ne peuvent se gorger que sur certains animaux vertébrés. Afin de maintenir un élevage de tiques au laboratoire, il est nécessaire d’obtenir un grand nombre de tiques gorgées pour chaque stade et le lapin permet de nourrir simultanément plusieurs tiques sans lui nuire. L’utilisation de lapins permet d’éviter l’apparition d’anémie compte tenu de la sa taille lors de la procédure expérimentale. Les lapins que nous utiliserons seront des femelles adultes d’environ 6 mois. Ce stade permet de gorger un nombre suffisant de tiques pour maintenir la pérennité de l’élevage de tiques. D’autre part, ce stade relativement jeune, permettra un replacement des animaux après l’expérimentation.

Vingt-quatre souris subissent chacune six gavages, six anesthésies générales pouvant atteindre deux heures et douze injections intraveineuses, une fois leur tumeur greffée développée. 360 souris au total vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses de tissus : 40 reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, 320 une greffe chirurgicale dans le coussin graisseux, et 48 d'entre elles enchaînent trois anesthésies et six injections intraveineuses. Le porteur décrit des nuisances courtes et de faible intensité, hormis l'inflammation modérée au point d'injection des cellules tumorales. Il annonce des protocoles d'imagerie diagnostique transférables aux patients, quand le projet consiste à observer par scintigraphie et échographie comment une tumeur greffée contourne un traitement anti-angiogénique.

Objectifs

Les thérapies anti-cancéreuses dites anti-angiogéniques ont pour but d’arrêter la formation de nouveaux vaisseaux sanguins dans les tumeurs et ainsi empêcher leur croissance. Cependant, une reprise de la croissance des vaisseaux sanguins de la tumeur est observée après quelques mois de traitement dans la majorité des cas. Cette resistance au traitement est également observée dans le modèle de cancer chez la souris que nous développons. Ce projet propose une étude des vaisseaux sanguins et de la consommation de glucose de la tumeur lors du traitement anti-angiogénique. Nous utiliserons pour cela des caméras d’imagerie médicale non invasive, techniques utilisées également chez l'homme en clinique : scintigraphie et échographie. La scintigraphie permet d'acquérir une image révélant la consommation en glucose des tumeurs, paramètre lié à leur croissance et leur agressivité. L'échographie nous permettra d'obtenir une image des vaisseaux sanguins de la tumeur à l'échelle micrométrique. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment les cancers adaptent leurs vaisseaux sanguins et leur façon de se nourrir en réponse aux traitements anti-angiogéniques.

Bénéfices attendus

Cette étude aura pour résultats: (1) de mieux comprendre comment les tumeurs adaptent leur vaisseaux sanguins et leur façon de se nourrir en réponse aux traitements anti-angiogéniques, (2) de développer des protocoles d'imagerie diagnostique permettant de classer les cancers au moment de leur détection entre tumeurs pouvant répondre favorablement aux traitements et tumeurs résistantes, méthodes pouvant in fine être transférée chez les patients, (3) de développer de nouvelles approches thérapeutiques ciblant le métabolisme tumoral en complément de la destruction du réseau vasculaire.

Procédures

40 souris recevront une greffe de cellules par injection sous cutanée sous anesthésie gazeuse. Cette procédure devrait durer moins de 10 minutes. 248 souris auront une contention pour recevoir une dose d’analgésique par injection puis auront une chirurgie pour avoir une greffe dans le coussin graisseux sous anesthésie gazeuse. Cette procédure devrait durer 10 à 15 minutes. 72 animaux auront une contention pour recevoir une dose d’analgésique par injection puis une chirurgie pour avoir une greffe dans le coussin graisseux sous anesthésie gazeuse. Cette procédure devrait durer 10 à 15 minutes. Lorsque leur tumeur se sera développée, 48 de ces souris subiront : Gavage (

Impact sur les animaux

Lors des séances d'imagerie sous anesthésie, les animaux peuvent ressentir du stress et de l’inconfort lors de la manipulation et de la fatigue suite aux anesthésies (nuisances courtes et de faible intensité). A la suite des injections intraveineuses d'agent de contraste d'imagerie sous anesthésie, les animaux peuvent ressentir une douleur légère et de courte durée au site d’injection. La chimiothérapie anti-angiogénique sera administrée par gavage, ce qui peut générer du stress et de l’inconfort de courte durée (nuisance légère). L’injection de cellules tumorales peut provoquer de l’inflammation au niveau de la zone d’injection pouvant induire une irritation (nuisances modérées courtes).

Devenir

A l'issue de ce projet, tous les animaux seront mis à mort afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses ex vivo nécessaires au projet.

Remplacement

Les analyses in vitro ne sont pas suffisantes pour l’étude du lien entre métabolisme et vascularisation tumoraux, ce qui intègre le micro-environnement tumoral. Il est donc très difficile voire impossible de reproduire fidèlement l'ensemble de ces interactions in vitro, dans des modèles de cellules isolées. De plus, les cellules humaines de paragangliomes ne poussent pas en culture in vitro. Il est donc encore nécessaire d’utiliser un modèle de tumeur chez la souris afin de s’approcher au plus des tumeurs humaines. De plus, les méthodes de diagnostique testées dans ce projet sont des méthodes d'imagerie médicale ayant vocation à être appliquées ensuite chez l'homme. Ce projet ne peut donc pas être réalisé in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire a été évalué d'après nos précédentes études d'imagerie sur ce modèle, qui ont fait l'objet de publication. Nous nous aidons de plus d'une plateforme internet qui propose un outil de calcul statistique pour l'expérimentation animale. Les groupes ont été établis de façon à ce que les résultats obtenus soient suffisant statistiquement pour arriver à des conclusions robustes. Les données générées seront ensuite analysées à l'aide de tests statistiques appropriés.

Raffinement

La procédure chirurgicale sera pratiquée après administration en sous-cutané d’un analgésique 30 min avant la chirurgie. Les animaux sont ensuite endormis et maintenus par anesthésie gazeuse sur un tapis chauffant puis surveillés jusqu’à leur réveil. Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été établis pour le suivi de l'état des animaux. Par ailleurs, les animaux seront maintenus en groupes sociaux dans un environnement enrichi.

Choix des espèces

Le choix des souris permet d’avoir accès à des animaux constituant un modèle préclinique particulièrement adapté à la réalisation de greffes de cellules et/ou tumeurs humaines ou de souris. Nos lignées cellulaires sont issues de souris ayant un fonds génétique mixte, rendant préférable l’utilisation d’une souris receveuse afin de minimiser le risque de rejet. Enfin, nous disposons au laboratoire de systèmes d’imagerie du petit animal particulièrement adaptés à la souris. Les animaux seront âgés de 7 à 8 semaines (jeunes adultes ayant atteint la maturité ; cet âge correspond à l’âge médian de développement de la maladie chez l’homme). C'est cet âge qui est le plus souvent rapporté dans la littérature pour ce type d'étude, ce qui nous permettra de confronter nos résultats avec ceux d'autres équipes.

Anesthésiés pour une IRM cérébrale d'une heure, puis réanesthésiés trois à sept jours plus tard pour une ouverture de la boîte crânienne et l'implantation de sondes pendant cinq à sept heures, 20 cochons de moins de 15 kg ne se réveillent pas. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré, alors que la seconde se termine sans réveil. Il s'agit de tester des sondes capables de mesurer le froid ou la lumière délivrés dans le cerveau, pour des dispositifs destinés à l'épilepsie, à la maladie de Parkinson et à l'ablation de tumeurs. Leur cerveau est prélevé pour mesurer les lésions produites, et le porteur indique que 14 animaux suffiraient si les résultats attendus arrivent.

Objectifs

L’utilisation de sondes enregistrant l’activité cérébrale est indispensable dans l’étude de diverses pathologies neurodégénératives, comme la maladie de Parkinson par exemple, mais également dans l’identification des foyers épileptiques pour déterminer la zone à retirer par chirurgie. Actuellement ces sondes sont uniquement munies de capteurs permettant l’enregistrement de l’activité électrique des neurones ou permettant la stimulation pour identifier les zones fonctionnelles impliquées. Concernant les études portant sur l’épilepsie, une nouvelle thérapeutique portant sur l’utilisation de l’effet du froid au niveau du foyer épileptique pour stopper les crises semble émerger. Des équipes ont réussi à arrêter des crises chez les rongeurs en utilisant des électrodes refroidissantes sans pour autant produire de lésions locales. Ces caractéristiques font du refroidissement par sonde une bonne alternative à l’électrostimulation. L’utilisation de froid à des températures cryogéniques (-40°C) est une technique qui consiste à détruire les tumeurs par cryoablation. Ce type de sondes ne dispose pas de capteurs permettant la mesure in vivo de cette température, ce qui permettrait de mieux comprendre comment le froid se propage dans le tissu et ainsi améliorer la délimitation de la zone ciblée Dans la maladie de Parkinson, un essai clinique en cours évalue l’effet de la lumière proche infra-rouge dans le traitement de la maladie, ainsi que la sécurité de l’implant produisant la lumière et l’absence d’effets secondaires dus à cette lumière. Dans ce cas, il s’agit d’une sonde disposant uniquement d’un système émettant de la lumière sans système de mesure de la lumière diffusée dans le cerveau. L’objectif scientifique de notre étude est de proposer de nouvelles sondes multimodales qui devraient permettre d’acquérir plus de données simultanées pour mieux comprendre le fonctionnement de la structure cérébrale visée, la thérapeutique appliquée et également mieux maitriser les doses utilisées (la dose de lumière proche infra-rouge, la dose de froid appliquée en profondeur, mieux définir le foyer épileptique).

Bénéfices attendus

Ce projet vise à développer de nouveaux capteurs et senseurs qui pourraient être intégrés dans des dispositifs implantables chez l'humain pour le traitement de diverses pathologies cérébrales, telles que la maladie de Parkinson, l’épilepsie, le mapping chirurgical et l’ablation de tumeur. Les sondes de refroidissement auront une double utilité : arrêter les crises en refroidissant le foyer épileptique dans le cadre de l’épilepsie ou réaliser l’ablation d’une tumeur à des températures extrêmement basses, bien en dessous de 0 °C, tout en intégrant des fonctionnalités de monitoring permettant de délivrer précisément la dose de froid nécessaire. De plus, les nouveaux implants optiques et biochimiques permettront d'analyser les tissus autour des sondes et d’ajuster les doses de lumière à délivrer en conséquence.

Procédures

Les animaux seront soumis à une imagerie par IRM sous anesthésie générale (injection intramusuclaire pour la sédation et intraveineuse pour le produit de contratse) d'une durée d'environ 1 heure. Entre 3 et 7 jours après, une seconde anesthésie (injection intramusuclaire pour la sédation voir intraveineuse pour l'anesthésie), accompagnée d'analgésie par injection sous cutanée, sera réalisée pour procéder à une chirurgie d'implantation de sondes dans le cerveau après ouverture de la boite cranienne, d'une durée de 5 à 7 heures, sans réveil de l'animal.

Impact sur les animaux

La procédure envisagée a été imaginée pour réduire le plus possible les effets indésirables sur les animaux. Cette procédure en 2 étapes (imagerie puis chirurgie d’implantation sans réveil) se déroulera sur 2 semaines afin de permettre d’avoir une étape de 4 jours d’acclimatation des animaux à leur nouvel environnement lors de leur arrivée suivie d’un délai de 3 à 7 jours avant leur utilisation dans le 2nde protocole. Le protocole 2 étant une chirurgie sans réveil elle sera forcément accompagnée d’effets indésirables telles que la douleur qui est prise en charge par l’utilisation d’analgésiques appropriés. Dans un objectif de réduction de stress pour l’animal, ce protocole 2 sera réalisé pour chaque animal sur plusieurs jours consécutifs afin de ne pas laisser d’animaux seuls plus de 24h.

Devenir

A la fin des expérimentations et à la suite d’une procédure sans réveil, nous devrons euthanasier les animaux afin de prélever leur cerveau pour analyser le degré de lésion produit par les dispositif en vue d’un passage à un dispositif implantable chez l’Homme.

Remplacement

Il n’existe à ce jour malheureusement aucun modèle alternatif in vitro ou in silicone permettant de réaliser de tels tests fonctionnels. Par voie de conséquence, le projet doit être mené sur un modèle animal. Nous utilisons un modèle de mammifères de grande taille afin de nous permettre de tester nos dispositifs adaptés à la taille humaine sans devoir les réduire. Ceci diminuera ainsi une source d’incertitude reconnue dans l’évaluation des dispositifs médicaux lors de l’évaluation de certains dispositifs médicaux humains sur des modèles rongeurs de petite taille et permettra ainsi un transfert rapide à l’homme. Ce choix vient de fait également réduire le nombre d’animaux à utiliser pour mener à bien les tests des dispositifs.

Réduction

Ce projet cherche à évaluer de nouvelles sondes multimodales innovantes, utilisées pour diverses applications médicales. En procédant de cette manière, nous réduisons le nombre total d'animaux nécessaires en évitant de réaliser des tests séparés pour chaque technologie. Pour déterminer combien d'animaux sont nécessaires, nous avons utilisé une méthode statistique rigoureuse, en prenant en compte plusieurs points de mesure dans le cerveau. L'une des stratégies consiste à utiliser l'hémisphère opposé du cerveau comme référence, ce qui nous permet de limiter le nombre d'animaux requis. Selon nos calculs, le nombre maximal d'animaux prévu est de 20 individus, en tenant compte de la complexité des chirurgies. Cependant, nous n'en réaliserons que 14 si nous obtenons les résultats scientifiques attendus.

Raffinement

Les protocoles se dérouleront sous anesthésie et analgésie, et les animaux ne seront pas réveillés après la chirurgie, ce qui minimisera leur inconfort. Une attention particulière sera portée aux animaux pendant la période entre l'IRM et la chirurgie sans réveil. Avant l'IRM, les animaux seront d'abord sédatés, puis placés sous anesthésie, qui sera maintenue pendant toute la durée de l'examen. Pour la chirurgie, une prémédication sera administrée afin de préparer les animaux, et des médicaments seront utilisés pour réduire la salivation et faciliter l'intubation. La veille de la chirurgie, l'animal recevra un anxiolytique modéré pour réduire son stress. Pendant l'opération, une analgésie sera administrée pour contrôler la douleur avant l'incision, avec des doses supplémentaires administrées dès les premiers symptôme de douleurs. L'anesthésie générale sera maintenue tout au long du protocole, complétée par une anesthésie locale.

Choix des espèces

Nous souhaitons utiliser des dispositifs qui soient de la même taille que ceux qui pourraient être utilisés chez l’homme ce qui exclut le recours à un modèle rongeur. Le transfert technologique chez l’homme impose des tests préalables dans un modèle de grands mammifères, au plus près possible des conditions de mise en œuvre clinique. Le porc est un modèle pertinent de par les similitudes anatomiques et constitutives avec le cerveau humain. La physiologie de son système nerveux et ses caractéristiques spatiales sont suffisantes pour faire la preuve de concept des solutions techniques que nous proposons. Pour leur stade de développement, ce projet nécessite de travailler avec des animaux d’un poids inférieur à 15 kg (environ 8 semaines à la réception), afin de permettre l’imagerie des sujets dans l’IRM.

Au 125e jour d'une gestation de 145 jours, des brebis sont opérées pendant environ quatre heures sous anesthésie générale, et leur fœtus est équipé de cathéters vasculaires. 212 moutons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et dès le quatrième jour après la chirurgie, une même brebis est utilisée pour plusieurs expérimentations, avec huit prises de sang sur le fœtus par journée de manipulation. Le projet compare l'effet d'une césarienne, d'une anesthésie générale ou d'une péridurale sur le cœur et le sang du fœtus, en vue d'adapter l'analgésie des femmes qui accouchent. Le porteur écrit qu'à la fin des procédures les moutons sont tués, alors que 20 sont déclarés adoptés. Il ne décrit comme effet indésirable que la douleur modérée de la brebis pendant et après la chirurgie, sans rien dire de ce que subit le fœtus.

Objectifs

La majorité des patientes en salle de naissance bénéficie d’une analgésie devant les douleurs entraînées par les contractions utérines lors du travail. Leur mise en place peut provoquer une instabilité de la fréquence cardiaque et de la tension artérielle maternelle transitoire lors de l’injection des médicaments, et entraîner des anomalies du rythme cardiaque fœtal. L’impact d'une césarienne ou d'une anesthésie générale ou d'une péridurale maternelle sur l’hémodynamique fœtale et le retentissement sur le système nerveux autonome reste peu connu, et sa compréhension est nécessaire afin de diminuer la morbi-mortalité fœtale.

Bénéfices attendus

Nous nous attendons à observer une modification des paramètres fœtaux sanguins et cardiaques plus importante en cas d’analgésie type césarienne par rapport aux autres analgésies. L’impact serait en pratique clinique d’adapter l’analgésie maternelle pour diminuer le risque d’hypoxie foetale et ses complications (lésions cérébrales anoxo-ischémiques). Cette étude permettra également de déterminer l’effet sur le coeur et la tension artérielle des sédations foetales lors d’une réanimation à cordon intact afin d’optimiser la prise en charge des nouveaux-nés vulnérables.

Procédures

Chaque brebis sera soumise à une chirurgie sous anesthésie générale d'une durée d'environ 4 heures, une seconde anesthésie cette fois loco régionale sera réalisée sans objectif d' incision mais uniquement pour les prélèvements sanguins chez le foetus, ces prélèvements serviront pour la vérification des gaz du sang (valeur de pH, quantité d’oxygène et de dioxyde de carbone dans le sang etc), et l’évaluation du retentissement de l’anesthésie effectué. Les quantités prélevées seront de 0,3 ml à raison de 8 prélèvements par journée de manipulation. Chez la brebis ces prélèvements serviront à évaluer le retentissement son état sanguin en comparaison à l'état sanguin de son foetus.

Impact sur les animaux

L'effet indésirable attendu serait la douleur modérée pendant et suite à la chirurgie de la brebis gestante, dont la prise en charge de la douleur est optimisée pendant les manipulations et par un protocole anti douleur après les manipulations durant 3 jours par Buprénorphine.

Devenir

Après une évaluation de l’état général des brebis à l’issue de la chirurgie par l’expérimentateur (sensibilisé au bien-être animal) et les zootechniciens, les animaux ne seront pas euthanasiés en vue de l’expérimentation chronique. Ils seront hébergés dans une animalerie conventionnelle et agréée. après manipulation et si nécessaire, une euthanasie peut être effectué par une injection médicamenteuse des brebis et des agneaux (en cas de signe de souffrance ou d’infection) A la fin de ces procédures expérimentales, les animaux sont euthanasiés.

Remplacement

L’étude du fœtus humain n’est possible qu’en cas d’expérimentation non invasive et après validation des hypothèses au préalable chez l’animal. En effet d’un point de vue éthique, il n’est pas justifié de réaliser une expérimentation qui comporte un risque de perte fœtale (la réalisation de prélèvements sanguins ou la mesure de façon invasive de la pression artérielle moyenne sur le fœtus par abord cordonal est techniquement possible mais avec un risque de perte fœtale de 3 à 10%). Aucun modèle non animal ne pourrait permettre de réaliser ce projet.

Réduction

Plusieurs procédures expérimentales sont incluses dans ce projet. Les fœtus d’agneau seront leur propre témoin ce qui limitera le nombre d’animaux nécessaires pour le protocole. L’étude consistera à comparer l’état de base des paramètres de fréquence cardiaque et pression artérielle des foetus, de leur signal cérébral et des paramètres sanguins à la réponse obtenue lors d’une analgésie et sédation maternelle et fœtale. La réponse des fœtus d’agneau étant habituellement très reproductible d’un animal à l’autre, un effectif faible (environ 8 à 12 animaux par groupe expérimental) est suffisant.

Raffinement

Chaque brebis arrive 10 jours au moins avant la date de la chirurgie afin de s'acclimater à son nouvel environnement. Les brebis sont livrées au minimum par 2 afin de réduire le stress du transport. Les brebis sont hébergées à plusieurs en permanence dans les box et aucune brebis ne sera seule hébergée afin de réduire le stress lié à la solitude. La manipulation sera effectuée sous anesthésie générale avec un protocole spécifique d'anesthésie, d'anti douleur et d'antibiotique préventif. Les expérimentations seront débutées 4 jours après la chirurgie et une même brebis sera utilisée pour plusieurs expérimentations afin d’optimiser au maximum l’utilisation de l’animal.

Choix des espèces

Le modèle animal doit avoir des caractéristiques morphologiques et physiologiques proches du modèle humain. C’est le cas de la brebis, qui est un mammifère avec une gestation de singleton ou de jumeaux, dépendante du placenta et de la circulation foeto-placentaire. Le poids et la circulation du fœtus d’agneau sont proches de ceux du fœtus humain. Sa taille est suffisante pour permettre la pose de cathéters vasculaire, en limitant le risque de perte fœtale liée à la chirurgie. Des études sur plusieurs jours sont possibles chez le fœtus d’agneau instrumenté ce qui permet de limiter le nombre d’animaux par projet. Ce modèle est reconnu par la communauté scientifique comme le modèle animal le plus proche pour étudier la physiologie fœtale, ce qui justifie la pertinence de notre choix. Notre protocole de recherche est sur le foetus. Il est donc nécessaire d’utiliser des brebis gestantes. Notre expéri-mentation aura lieu lors du dernier tiers de la gestation (intervention à 125 jours pour un terme de 145 jours). Cet âge gestationnel est nécessaire pour que le fœtus soit suffisamment gros pour la chirurgie, pour la pose de cathé-ters vasculaires (2500 à 3000 g) et pour limiter les risques de perte fœtale per opératoire.